專利名稱：用新融合配偶體生產重組蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及用新融 合配偶體生產重組蛋白的新方法。
背景技術：
隨著遺傳重組新技術的出現，生物學有用蛋白質已經使用原核(大腸桿菌 (Escherichia coli))、酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))和高等生物細胞生產。
這些重組蛋白廣泛用于生物技術工業作為治療劑和其它各種目的的生物制品。特別地， 大腸桿菌是最優選的宿主細胞用于重組蛋白生產，因為其生長速率快以及分子生物學熟 知。鑒于成本、設備及方法操作，使用大腸桿菌的蛋白質生產系統具有優異的經濟 效率，但是其具有一主要問題，其中大部分外來蛋白質在細胞內作為無活性包涵體(IB) 產生，需要重折疊過程以獲得活性折疊結構。為了從IB獲得活性形式，IB應該在高濃 度鹽酸胍(GdnHCl)或尿素中溶解，然后用例如稀釋等方法重折疊成天然結構。重折疊 機制不很清楚，每種蛋白的重折疊方法依賴于蛋白本身的固有和獨特特征。這個固有問 題是低產量、高生產成本和長時間的原因(Lilie，H.et al. (1998) Curr.Opin.Biotechnol.9, 497-501)，很難或者不能重折疊大部分高分子量蛋白，其是工業化應用蛋白的障礙。IB形成特征在于分子內折疊速率和分子間聚集的競爭。當分子內折疊速率慢于 分子間聚集速率時，形成IB形式的聚集體(Mitraki，A.&King, J. (1989) Bio/Technology 7， 690-697)ο本發明使用30%或更高比率負電荷的特異肽序列作為融合配偶體以防止形成聚 集體，因此獲得正確折疊的可溶形式。折疊中間體的聚集由于存在于融合配偶體的負電 荷之間的分子間排斥被有效抑制，由此可以實現生產天然蛋白的顯著改良。當本發明融合配偶體應用于胰島素生產過程時，IB形成被有效消除，在緩沖溶 液中簡單氧化后產生天然胰島素。人胰島素目前在大腸桿菌或酵母中用重組技術生產[Frank，B.H et al. (1981) In Peptides Synthesis-Structure-function(ed.Rich, D.H.Gross, Ε.)pp.729-738, Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. ； Thim, L.et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 6766-6770 ； Markussen, J.et al (1987) Protein Engineering 1, 205-213]。在大腸桿菌中生產人胰島素使用胰島素原(PI) [Frank，B.H et al. (1981)In Peptides Synthesis-Structure-function (ed.Rich, D.H.Gross, E.) pp.729-738, Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Pierce Chemical Co., Rockford, IL.]或者小月夷 島素原(miniproinsulin，mini-Pi) [Chang, S.-G.et al. (1998) Biochem J.329，631-635]作為
前體。首先，融合蛋白形式的PI或者mini-PI作為IB產生，然后IB在變性劑如尿素或 GdnHCl中溶解。PI或者mini-PI作為磺酸化形式通過溴化氰(CNBr)裂解、磺酸化和純 化步驟從融合蛋白分離。磺酸化PI或者mini-PI重折疊成天然形式，胰島素通過胰蛋白酶和羧肽酶B處理隨后一些純化步驟而生產。PI或mini-PI的重折疊產量受重折疊蛋白 的濃度大大影響，在較高濃度顯示較低產量。下游方法包括溶解、CNBr裂解和磺酸化花 費大量成本，導致高生產成本。CNBr裂解特別導致50-60%差產量，被認為是需要克服 的技術。發酵后減少方法步驟的方法是使用酵母細胞，其中在胞外分泌單鏈胰島素衍生 物后胰島素通過一系列下游方法生產(酶反應，酸水解，分離和純化)產生。產量低， 但是酵母系統使純化步驟更容易并且不需要重折疊步驟，這是原核生物中經歷的困難方 法[Thim，L.etal.(1986)Proc.Natl, Acad.Sci, USA83, 6766-6770]。因此，組合大腸桿菌高表達水平及消除酵母系統中的困難的重折疊方法是生產 胰島素方法的優異選擇。
發明內容
本發明提供了用下述式⑴的A-B型融合蛋白生產多肽的方法，其通過培養含有 編碼所述多肽的DNA序列的轉化微生物進行；A-B (I)上式⑴中，A是25或更多個氨基酸殘基的融合配偶體，其中天冬氨酸和谷氨 酸殘基被摻入以具有30%或更多的凈負電荷，B是要生產的靶蛋白。如實施方案中證實，優選⑴中A-B的A是肽，其中所述肽的部分包含具有5 個或更多個負電荷的7個連續氨基酸殘基的序列；還優選⑴中A-B的A是在氨基末端包含MKIEEGKL序列的肽；還優選(I)中A-B的A是下述SEQ ID NO 64-SEQ ID NO 74之一的肽，但
不限于其。SEQ ID NO 64 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSDMAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 65: MAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 66 MKIEEGKLAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 67: MSEQHAQGAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 68 MKIEEGKLAGDNDDLDLEEALEPDMESEQ ID NO 69 MSEQHAQGAGDNDDLDLEEALEPDMESEQ ID NO 70 MKIEEGKLEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 71: MSEQHAQGEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 72 MKIEEGKLAGDNDDLDLEEALSEQ ID NO 73 MSEQHAQGAGDNDDLDLEEALSEQ ID NO 74 MGSSHHHHHHSSAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQ另外，可以通過將酶裂解位點摻入融合配偶體A的羧基末端而從融合蛋白分離 靶蛋白。另外，本發明提供了根據本發明 生產多肽的方法產生胰島素原(PI)或者類似物 的方法。本發明還提供了生產胰島素的方法，進一步包括在制備PI及其類似物后酶水解 或化學裂解的程序。
本發明提供了包含由本發明方法生產的胰島素及藥物學可接受載體的藥物組合 物。本發明提供了根據本發明生產方法生產粒細胞集落刺激因子(GCSF)或其類似 物的方法。本發明提供了包含由本發明方法生產的粒細胞集落刺激因子(GCSF)及藥物學 可接受載體的藥物組合物。本發明還提供了根據本發明生產方法生產生長激素(GH)或其類似物的方法。本發明提供了包含由本發明方法生產的生長激素(GH)及藥物學可接受載體的 藥物組合物。本發明還提供了根據本發明生產方法生產骨形態發生蛋白2CBMP2)或其類似物 的方法。本發明提供了包含由本發明方法生產的骨形態發生蛋白2CBMP2)及藥物學可接 受載體的藥物組合物。另外，本發明提供了下述式⑴的A-B型融合蛋白；A-B (I)上式⑴中，A是25或更多個氨基酸殘基的融合配偶體，其中天冬氨酸和谷氨 酸殘基被摻入以具有30 %或更多的凈負電荷，B是要生產的靶蛋白。如實施方案中證實，優選⑴中A-B的A是肽，其中所述肽的部分包含具有5 個或更多個負電荷的7個連續氨基酸殘基的序列；還優選⑴中A-B的A是在氨基末端包含MKIEEGKL序列的肽；還優選(I)中A-B的A是下述SEQ ID NO 64-SEQ ID NO 74之一的肽，但
不限于其。SEQ ID NO 64 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSDMAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 65 MAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 66 MKIEEGKLAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 67 MSEQHAQGAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 68 MKIEEGKLAGDNDDLDLEEALEPDMESEQ ID NO 69 MSEQHAQGAGDNDDLDLEEALEPDMESEQ ID NO 70: MKIEEGKLEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 71: MSEQHAQGEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 72 MKIEEGKLAGDNDDLDLEEALSEQ ID NO 73 MSEQHAQGAGDNDDLDLEEALSEQ ID NO 74 MGSSHHHHHHSSAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQ在本發明的實施方案中，優選靶蛋白B是PI(SEQ ID NO: 81)，GCSF(SEQID NO: 82)，GH (SEQ ID NO 83)或 BMP2 (SEQ ID NO : 84)，但不限于其。本發明中上述靶蛋白還包括具有相同功能的它們的突變體、片段和類似物。如實施方案所述，優選PI在生產后被酶水解或化學裂解方 法轉化為胰島素，但 是不限于指定方法。
本發明還提供了表達載體，包括編碼A-B型融合蛋白的基因，其中融合配偶體 A 是 Px，靶蛋白 B 是 PI、GH> GCSF 或 BMP2;其中 χ 是 1，2，3，4，5，6，7，8， 9，10 或 11。本發明包括用上述表達載體轉化的微生物。希望的是本發明的轉化體是大腸桿菌菌株BL21(DE3)，HMS174,或Rosetta DE3，特別是大腸桿菌Rosetta(DE3)(保藏號KCCM 10684P)是最優選的。本發明如下描述。本發明描述了在大腸桿菌中表達可溶形式重組蛋白的技術，其提供A-B型融合 蛋白，其中靶蛋白B連接于融合配偶體A。一種靶蛋白，PI或胰島素前體，作為融合 蛋白表達，融合PI或融合胰島素前體在緩沖溶液中氧化產生正確二硫鍵。融合PI或融 合胰島素前體然后酶水解以釋放天然生物學活性胰島素。本發明的革新是消除許多問題 化學步驟，如變性劑溶解IB，溴化氰裂解和磺酸化。最后本發明通過從常規27個步驟 [Ladisch, M.R. (2001) In Bioseparations Engineering pp.520—521, Wiley-Interscience， N.Y.USA]減少方法步驟至12步驟而生產胰島素。本發明描述的新方法和技術被證實有效適用于任何蛋白和所有蛋白，包括GH、 GCSF、BMP-2,無任何限制。
圖1描繪了質粒pVEX-PxPI的構建；圖2是SDS-PAGE結果，顯示Px-胰島素原(PxPI)表達(M 蛋白大小標記， T總蛋白，S:可溶部分，P:不溶部分)；圖3是PlPI酶處理的RP-HPLC分析圖；圖4是本發明從PlPI產生的胰島素與來自Eli Lilly公司的Humulin之間的比較
結果；圖5顯示本發明從PlPI產生的胰島素的質譜；圖6是SDS-PAGE結果，顯示P3hGCSF的表達；圖7是SDS-PAGE結果，顯示hGCSF的純化和EKL裂解后純化的hGCSF ；圖8是SDS-PAGE結果，顯示P3hGH的表達；圖9是hGH的純化和EKL裂解后P3hGH純化；圖10 是 SDS-PAGE 結果，顯示 PlhBMP2 表達；圖11是通過Ni-NTA柱純化的PlhBMP2的SDS-PAGE結果；圖12是通過EKL裂解PlhBMP2后hBMP2的SDS-PAGE結果；以及圖13顯示hBMP2的生物學活性。
具體實施例以下，參考附圖詳細描述本發明的優選實施例。但是，本文說明書僅是用于舉 例目的的優選實施例，不是意圖限制本發明范圍，因此應理解在不偏離本發明精神和范 圍下可對其進行其它等價和修飾。實施例1 PxPI克隆
PlPI至PllPI的融合配偶體由25個或更長氨基酸殘基組成，其負電荷比率30% 以上，其中7個連續氨基酸殘基的至少5個應含有負電荷天冬氨酸和/或谷氨酸殘基。兩 個陰性對照組被選擇用于比較以證明本發明有效性。一個是同樣大小的融合配偶體(P12 至P14)，但是低負電荷，其他是同樣電荷(負電荷比率超過30%)的融合配偶體，但是 融合配偶體具有更短的肽長度(P15至P17)。實施例1-1 PlPI克隆本發明使用的分子遺 傳學技術基于文獻[Ausubel，F.M.et al. (Ed.), J.Wiley Sons, Curr.Protocols in Molecular Biology, 1997]。用于聚合酶鏈反應(PCR)的引物在 Bioneer Corp.隨機合成，rTag聚合酶購自TaKaRa，PCR根據TaKaRa手冊標準條件進行。用人PI cDNA作為模板，通過PCR擴增編碼RR-PI (RRPI)序列的基因，其在 氨基末端具有兩個精氨酸(RR)，分別在5'末端具有限制酶識別位點SalL在3'末端具 有 BamHI。有義引物(5 ‘ -GTC GAC CGT CGC TTC GTT AAT CAGCAC-3 ‘，SEQ ID NO 56)和反義引物(5 ‘ -GGA TCC TCA GTT ACAATA GTT-3'，SEQ ID NO 57) 用于PCR。1 μ g 擴增的 DNA 片段(SEQ ID NO 18)溶解于 50 μ 1 TE (ρΗ 8.0)溶液，并與 2 單位 SalI(New England Biolabs)和 2 單位 BamHI(New England Biolabs)混合，然后混
合物在37°C反應16小時，獲得DNA片段，其分別在5'末端具有SalI和在3'末端具 有BamHI的限制酶識別位點。以相同方式，通過分別用限制酶SalI和BamHI處理環狀 pT7-7質粒制備線性ρΤ7-7質粒。隨后，20ng DNA片段和20ng線性pT7_7質粒在10 μ 1 TE(ρΗ 8.0)溶液中混合，然后向混合物中加入1單位T4DNA連接酶，在37°C反應16小 時。如此獲得的質粒命名為pVEX-RRPI。隨后，包含編碼用于 Px 的 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSDMAGDNDDLDLEEAL EPDMEEDDDQ (SEQ ID NO 64)和限制酶識別位點5'末端NdeI和3'末端SalI的堿 基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5 ‘ -CATATG GGC AGC AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC AGC GGC CTG GTGCCG CGC GGC AGC GAC ATG GCG GGG GAC AAT GAC GAC CTC GACCTG GAA GAA GCT TTA-3 ‘，SEQ ID NO 22)和反義 引物(5 ' -GTC GAC CTGATC GTC GTC TTC TTC CAT ATC TGG CTC TAA AGC TTC TTC-3 ‘，SEQ IDNO 23)。擴增的DNA片段(SEQ ID NO: 1)用限制酶NdeI和Sail裂解，并與用相同限制 酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-ΡΙΡΙ(見圖1)。實施例1-2 P2PI克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的 MAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQ (序列號65)和限制酶識別位點5 ‘末端NdeI禾口 3'末端SalI的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CATATG GCG GGG GAC AAT GAC GAC CTC GAC CTG GAA GAA GCT-3 ‘，序列號 24)禾口 反義弓 | 物(5 ‘ -GTC GAC CTG ATC GTC GTC TTC TTC CAT ATCTGG CTC TAAAGC TTC TTC-3'，序列號 25)。擴增的DNA片段(SEQ ID NO 2)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限制酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒 命名為pVEX-P2PI。實施例1-3 P3PI克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的MKIEEGKLAGDNDDLD LEEALEPDMEEDDDQ (SEQ ID NO 66)和限制酶識別位點5 ‘末端NdeI和3 ‘末端SalI 的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CAT ATG AAA ATC GAA GAA GGT AAA CTG GCG GGG GACAAT GAC GAC CTC GAC CTG GAA GAA GCT TTA-3 ‘， SEQ ID NO 26)和反義引物(5' -GTC GAC CTG ATC GTC GTC TTC TTC CAT ATC TGG CTC TAAAGC TTC TTC-3 ‘，SEQ ID NO 27)。擴增的DNA片段(SEQ ID NO 3)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限制 酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-P3PI。實施例1-4 P4PI克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的MSEQHAQGAGDNDDLD LEEALEPDMEEDDDQ (SEQ ID NO 67)和限制酶識別位點5 ‘末端NdeI和3 ‘末端SalI 的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CAT ATG TCT GAA CAA CAC GCA CAG GGC GCG GGGGAC AAT GAC GAC CTC GAC CTG GAA GAA GCT TTA-3 ‘， SEQ IDNO 28)和反義引物(5 ‘ -GTC GAC CTG ATC GTC GTC TTC TTC CAT ATC TGG CTCTAA AGC TTC TTC-3 ‘，SEQ ID NO 29)。擴增的DNA片段(SEQ ID NO 4)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限制 酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-P4PI。實施例1-5 P5PI克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的 MKIEEGKLAGDNDDLDLEEALEPDME (SEQ ID NO 68)禾Π 限制酶識別位點 5 ‘末端 NdeI和3'末端SalI的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CATATG AAA ATC GAA GAA GGT AAA CTG GCG GGG GAC AATGAC GAC CTC GAC CTG GAA GAA GCT TTA-3 ‘，SEQ ID NO 30)和反義引物(5 ‘ -GTC GAC TTC CAT ATC TGG CTC TAAAGC TTC TTC-3'，SEQ ID NO 31)。擴增的DNA片段(SEQ ID NO 5)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限制 酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-P5PI。實施例1-6 P6PI克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的 MSEQHAQGAGDNDDLDLEEALEPDME(SEQ ID NO 69)和限制酶識別位點 5'末端 NdeI和3'末端SalI的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CATATG TCT GAA CAA CAC GCA CAG GGC GCG GGG GAC AATGAC GAC CTC GAC CTG GAA GAA GCT TTA-3 ‘，SEQ ID NO 32)和反義引物(5 ‘ -GTC GAC TTC CAT ATC TGG CTC TAAAGC TTC TTC-3 ‘，SEQ ID NO 33)。擴增的DNA片段(SEQ ID NO 6)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限制 酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-P6PI。實施例1-7 P7PI克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的MKIEEGKLEALEPDMEEDDDQ (SEQ ID NO 70)和限制酶識別位點 5 ‘末端NdeI和 3 ‘ 末端SalI的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CATATG AAA ATC GAA GAA GGT AAA CTG GAA GCT TTA GAG CCA GAT—3 ‘，SEQ ID NO 34)和反 義引物(5 ‘ -GTC GAC CTG ATC GTC GTC TTC TTC CATATC TGG CTC-3 ‘，SEQ ID NO 35)。擴增的DNA片段(SEQ ID NO 7)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限制 酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-P7PI。實施例1-8 P8PI克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的 MSEQHAQGEALEPDMEEDDDQ (SEQ ID NO 71)和限制酶識別位點 5 ‘末端 NdeI 和 3 ‘末端SalI的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5 ‘ -CATATG TCT GAA CAA CAC GCA CAG GGC GAA GCT TTA GAG CCA GAT—3，SEQ ID NO 36)和 反義引物(5 ‘ -GTC GAC CTG ATC GTC GTC TTC TTCCAT ATC TGG CTC-3 ‘，SEQ ID NO 37)。擴增的DNA片段(SEQ ID NO 8)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限制 酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-P8PI。實施例1-9 P9PI克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的 MKIEEGKLAGDNDDLDLEEAL (SEQ ID NO 72)和限制酶識別位點 5 ‘末端 NdeI 和 3 ‘ 末端SalI的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CATATG AAA ATC GAA GAA GGT AAA CTG GCG GGG GAC AAT GAC GACCTC GAC CTG GAA-3 ‘，SEQ ID NO 38)和反義引物(5 ‘ -GTC GAC TAA AGCTTC TTC CAG-3 ‘，SEQ ID NO 39)。擴增的DNA片段(SEQ ID NO 9)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限 制酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-P9PI。實施例1-10 PlOPI 克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的 MSEQHAQGAGDNDDLDLEEAL (SEQ ID NO 73)禾Π 限制酶識別位點 5 ‘末端 NdeI 和3'末端SalI的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CATATG TCT GAA CAA CAC GCA CAG GGC GCG GGG GAC AAT GAC GACCTC GAC CTG GAA-3 ‘，SEQ ID NO 40)和反義引物(5 ‘ -GTC GAC TAA AGCTTC TTC CAG-3 ‘， SEQ ID NO 41)。擴增的DNA片段(SEQ IDNO 10)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限 制酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-PlOPI。實施例1-11 PllPI 克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的MGSSHHHHHHSSAGD NDDLDLEEALEPDMEEDDDQ (SEQ ID NO 74)和限制酶識別位點 5 ‘末端 NdeI 和 3 ‘ 末端SalI的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CATATG GGCAGC AGC CAT CAT CAT CAT CAT CACAGC AGC GCG GGG GAC AAT GAC GAC CTC GACCTG GAA GAA GCT-3 ‘，SEQ IDNO 42)和反義引物(5 ‘ -GTC GAC CTG ATC GTC GTC TTC TTC CATATC TGG CTC TAAAGC TTC TTC-3 ‘，SEQ ID NO 43)。擴增的DNA片段(SEQ IDNO 11)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限 制酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-Pl 1PI。實施例1-12 P12PI 克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的 MKIEEGKLAGDNVLLDLILALAPIME (SEQ ID NO 75)和限制酶識別位點 5'末端 NdeI 和3'末端SalI的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CAT ATG AAA ATC GAA GAA GGT AAA CTG GCG GGG GAC AAT GTCCTC CTC GAC CTG ATC TTA GCT TTA GCG-3 ‘，SEQ ID NO 44)和反義引物(5' -GTC GAC TTC CAT AAT TGG CGC TAA AGC TAA-3 ‘，SEQ ID NO 45)。擴增的DNA片段(SEQ IDNO 12)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限 制酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-P12PI。實施例1-13 P13PI 克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的 MKIEEGKLEALVPIMVADVAQ (SEQ ID NO 76)和限制酶識別位點 5 ‘末端 NdeI 和 3 ‘ 末端SalI的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CATATG AAA ATC GAA GAA GGT AAA CTG GAA GCT TTA GTG CCA ATT ATGGTA GCA GAC-3 ‘，SEQ ID NO 46)和反義引物(5 ‘ -GTC GAC CTG AGC GACGTC TGC TAC CAT AAT-3 ‘， SEQ ID NO 47)。擴增的DNA片段(SEQ ID NO 13)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限 制酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-P13PI。實施例1-14 P14PI 克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的 MKIEEGKLAGDNVLLDLILAL (SEQ ID NO 77)和限制酶識別位點 5 ‘末端 NdeI 和 3 ‘ 末端SalI的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CATATG AAA ATC GAA GAA GGT AAA CTG GCG GGG GAC AAT GTC CTCCTC GAC CTG ATC-3 ‘，SEQ ID NO 48)和反義引物(5 ‘ -GTC GAC TAA AGCTAA GAT CAG-3 ‘，SEQ ID NO 49)。擴增的DNA片段(SEQ ID NO 14)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限 制酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-P14PI。實施例1-15 P15PI 克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的 MKIEEGKLEALEPDMEE(SEQ ID NO 78)和限制酶識別位點5'末端NdeI和3'末端 SalI的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CAT ATGAAA ATC GAA GAA GGT AAA CTG GAA GCT TTA GAG CCA GAT-3 ‘，SEQID NO 50)和反義引物 (5 ‘ -GTC GAC TTC TTC CAT ATC TGG CTC TAA-3 ‘，SEQ IDNO 51)。擴增的DNA片段(SEQ ID NO 15)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限 制酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-P15PI。
實施例1-16 P16PI 克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的 MKIEEGKLAGDNDDLDLE(SEQ ID NO 79)和限制酶識別位點5 ‘末端NdeI和3'末端 SalI的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CAT ATG AAA ATC GAA GAA GGT AAA CTG GCG GGG GAC AAT GAC GAC CTC—3 ‘ ，SEQ ID NO 52)禾口反義 引物(5 ‘ -GTC GAC TTC CAG GTC GAG GTC GTC—3 ‘，SEQ ID NO 53)。擴增的DNA片段(SEQ ID NO 16)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限 制酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-P16PI。實施例1-17 P17PI 克隆根據實施例1-1中所述相同程序，包含編碼用于Px的 MSEQHAQGAGDNDDLDLE(SEQ ID NO 80)和限制酶識別位點 5'末端 NdeI 和 3'末 端SalI的堿基序列的DNA片段經PCR擴增，使用有義引物(5' -CAT ATGTCT GAA CAA CAC GCA CAG GGC GCG GGG GAC AAT GAC GAC CTC-3 ‘，SEQ ID NO 54)和反義 引物(5 ‘ -GTC GAC TTC CAG GTC GAG GTC GTC—3 ‘，SEQ ID NO 55)。擴增的DNA片段(SEQ ID NO 17)用限制酶NdeI和SalI裂解，并與用相同限 制酶制備的pVEX-RRPI連接，所得質粒命名為pVEX-P17PI。實施例2 大腸桿菌轉化體制備大腸桿菌代表性菌株BL21 (DE3)，HMS 174 (DE3)或Rosseta (DE3)分別用 實施例1制備的表達質粒pVEX-PxPI之一轉化，選擇氨芐青霉素抗性菌落[Hanahan， D. (1985)DNA Cloning vol.1 (Ed.D.M.Glover) 109-135，IRS press]。用表達載體pSSU_P3PI(與pVEX_P3PI相同)轉化的菌株大腸桿菌Rosseta(DE3) 被選擇并根據布達佩斯條約在2005年10月12日保藏于國際保藏機構，韓國微生物培 養中心(KCCM, #361-221 Yurim Building, Hongje—l—dong, Seodaemun—gu, Seoul, Republic of Korea)，保藏號 KCCM-10684P。實施例3 大腸桿菌轉化體培養及PxPI表達用上述實施例1的重組表達載體pVEX-PxPI轉化的大腸桿菌菌株接種并培養于 含有氨芐青霉素(50-100 μ g/ml)或者氨芐青霉素和氯霉素(各38-50 μ g/ml)的LB液體 培養基(胰胨10g，酵母提取物10g，NaCl 5g，1升)。重組大腸桿菌菌株在含有液體培養基相同組分的固體培養基中培養，所得菌落 在Iml含有氨芐青霉素(50-100 μ g/ml)或者氨芐青霉素和氯霉素(38-50 μ g/ml)的液體 培養基中培養12小時，然后培養液懸浮于15%甘油中，-70°C保存備用。儲存在-70°C的重組大腸桿菌菌株涂布于上述相同組成的固體培養基上，37°C 培養16-18小時。所得菌落接種20ml液體培養基，37°C培養，同時200rpm旋轉速度攪 拌。16-17小時培養完成時，所得培養液接種400ml液體培養基，37°C、pH7.0培養， 同時200rpm旋轉速度攪拌。當重組大腸桿菌接種生長至600nm光密度0.4-0.6時，將 異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)加入培養液至終濃度0.5-1.0mM，培養液繼 續在20-25°C培養4小時，同時200rpm旋轉速度攪拌以誘導融合蛋白表達。所得培養液 6000rpm離心10分鐘以獲得大腸桿菌沉淀，沉淀懸浮于20ml 50mM Tris緩沖液和50mM 甘油緩沖溶液(PH8.0-10.0)中，然后超聲裂解。細胞裂解物13000rpm、4°C離心10分鐘以從沉淀分離上清，然后在SDS-PAGE上確定可溶和不溶級分中分離的融合蛋白的量。 結果，PxPI融合蛋白的大部分以可溶形式過表達，而大多數陰性對照組以不溶沉淀表達 (見圖2和表1)。表1
蛋白質Px長度Px中負電荷37°C表達率(％)(氨基酸數)比率(％)可溶不溶PlPI4831>95<5P2PI2850>95<5P3PI3546>95<5P4PI3543>95<5P5PI3040>95<5P7PI2544>95<5P8PI2540>95<5P9PI2536>95<5PlOPI2532>95<5PllPI3936>95<5陰P12PI30201882性P13PI25202582對P14PI25202080昭 乂、、、P15PI31381090組P16PI22364356P17PI2236595實施例4 從PxPI生產胰島素實施例3中經超聲制備的裂解的大腸桿菌細胞懸浮液在13000rpm、4°C離心10分 鐘以分離上清和沉淀。向上清中加入半胱氨酸和胱氨酸(0-3mM半胱氨酸和I-IOmM胱 氨酸)后，溶液在室溫反應15小時，向溶液中加入胰蛋白酶和羧肽酶B以便終濃度保持 在PxPI 胰蛋白酶比率=500 1及PxPI 羧肽酶B比率=300 1。溶液pH調整至 pH8.0,反應在15°C進行。酶處理期間，間隔取樣并用分析C8柱在280nm經反向HPLC 分析(圖3)。實施例5 從PxPI制備的樣品胰島素與商品胰島素比較實施例4中純化的樣品胰島素與商品胰島素(humulin)比較。實施例5-1 反相HPLC和質譜
用反相HPLC使用分析C8柱證實本發明制備的樣品胰島素與商品胰島 素(humulin)相同(圖4)。根據質量分析，本發明制備的樣品胰島素分子量為 5806.43士0.6Da，其與誤差范圍內的理論值5807.19Da相同(圖5)。實施例5-2 胰島素活性測量為測量實施例4制備的胰島素活性，體重200_250g的8周雄性 Sprague-Dawley (SD)大鼠皮下注射0. lml/1 OOg體重胰島素，其溶于磷酸鹽緩沖液(8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4 和 0.24g NaH2PO4)，濃度 4-80 μ g/0.lml。以 30 分鐘、 1、2、3和4小時間隔從尾靜脈取血樣，確定降血糖作用，表示為ED5tl值(表2)。ED5tl 值代表皮下施用后1或2小時給出半數最大降血糖活性的胰島素劑量。表權利要求
1.用編碼A-B型融合蛋白的基因轉化的微生物制備多肽的方法， A-B (I)其中，A是25或更多個氨基酸殘基的融合配偶體，其包含天冬氨酸和谷氨酸殘基， 其中所述融合配偶體的總負電荷超過30%，B是要生產的靶蛋白。
2.權利要求1的制備多肽的方法，其中，所述融合配偶體A的一部分包含具有5個或 更多個負電荷的7個連續氨基酸殘基的序列。
3.權利要求1的方法，其中，所述融合配偶體A是在氨基末端包含MKIEEGKL的肽。
4.權利要求1的制備多肽的方法，其中，所述融合配偶體A是包含下述SEQID NO: 64至74之一的肽，SEQ ID NO 64 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSDMAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 65 MAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 66 MKIEEGKLAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 67 MSEQHAQGAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 68 MKIEEGKLAGDNDDLDLEEALEPDMESEQ ID NO 69 MSEQHAQGAGDNDDLDLEEALEPDMESEQ ID NO 70 MKIEEGKLEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 71 MSEQHAQGEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 72 MKIEEGKLAGDNDDLDLEEALSEQ ID NO 73 MSEQHAQGAGDNDDLDLEEALSEQ ID NO 74 MGSSHHHHHHSSAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQ
5.根據權利要求1-4任一項制備胰島素原或其類似物的方法。
6.制備胰島素的方法，進一步包括在根據權利要求5生產胰島素原或其類似物后酶或 化學裂解的方法。
7.根據權利要求6制備的胰島素和藥物學可接受載體的藥物組合物。
8.根據權利要求1-4制備粒細胞集落刺激因子(GCSF)或其類似物的方法。
9.根據權利要求8制備的GCSF和藥物學可接受載體的藥物組合物。
10.根據權利要求1-4制備生長激素(GH)或其類似物的方法。
11.根據權利要求10制備的GH和藥物學可接受載體的藥物組合物。
12.根據權利要求1-4制備骨形態發生蛋白(BMP)_2或其類似物的方法。
13.根據權利要求12制備的BMP-2和藥物學可接受載體的藥物組合物。
14.根據權利要求1-4制備多肽的方法，其中所述方法進一步包括通過將酶或化學裂 解位點摻入融合配偶體的羧基末端而從融合蛋白獲得靶蛋白。
15.A-B型融合蛋白， A-B (I)其中，A是包含25或更多個氨基酸殘基的融合配偶體，其包含天冬氨酸和谷氨酸殘 基，其中所述融合配偶體的總負電荷超過30%，B是要生產的靶蛋白。
16.權利要求15的融合蛋白，其中，所述融合配偶體A是包含具有5個或更多個負電荷的7個連續氨基酸殘基的序列的肽。
17.權利要求16的融合蛋白，其中，所述融合配偶體A是在氨基末端包含 MKIEEGKL 的肽。
18.權利要求17的融合蛋白，其中，所述融合配偶體A是包含下述SEQIDNO: 64 至74之一的肽，SEQ ID NO 64 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSDMAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 65 MAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 66 MKIEEGKLAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 67 MSEQHAQGAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 68 MKIEEGKLAGDNDDLDLEEALEPDMESEQ ID NO 69 MSEQHAQGAGDNDDLDLEEALEPDMESEQ ID NO 70 MKIEEGKLEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 71: MSEQHAQGEALEPDMEEDDDQSEQ ID NO 72 MKIEEGKLAGDNDDLDLEEALSEQ ID NO 73 MSEQHAQGAGDNDDLDLEEALSEQ ID NO 74 MGSSHHHHHHSSAGDNDDLDLEEALEPDMEEDDDQ
19.權利要求15的融合蛋白，其中，所述靶蛋白B是胰島素原，生長激素，粒細胞集 落刺激因子或者骨形態發生蛋白_2。
20.權利要求19的融合蛋白，其中，所述胰島素原經酶或化學裂解轉化為胰島素。
21.—種表達載體，其包含編碼A-B型融合蛋白的基因，其中融合配偶體A是Px， 靶蛋白B是胰島素原，生長激素，粒細胞集落刺激因子或者骨形態發生蛋白_2;其中 χ 是 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 或 11。
22.用權利要求21的表達載體轉化的微生物。
23.權利要求22的微生物，其中，所述微生物是大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21 (DE3)，HMS174 (DE3)或 Rosetta (DE3)。
24.權利要求23的微生物，其中，所述微生物是大腸桿菌Rosetta(DE3)(保藏號 KCCM 10684P)。
全文摘要
本發明提供了使用下式(I)的A-B型融合蛋白生產多肽的方法，提供培養包含編碼所需多肽的DNA序列的轉化的微生物進行；A-B(I)。上式(I)中，A是25或更多個氨基酸殘基的融合配偶體，其中摻入天冬氨酸和谷氨酸殘基以具有30％或更高的凈負電荷，B是要生產的靶蛋白。所述靶蛋白可以通過使用在融合配偶體羧基末端的酶裂解位點等從融合蛋白分離。
文檔編號C12N15/62GK102016043SQ200780102316
公開日2011年4月13日 申請日期2007年12月24日 優先權日2007年12月24日
發明者宋享度, 尹基勛, 張承煥, 樸然嬉, 玄惠蘭, 申杭澈, 金孝珍, 金明煥, 高恩惠 申請人:營養萃取科技株式會社