利用微載體的產(chǎn)后來源的細(xì)胞的體外擴(kuò)增的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號(hào)：595197閱讀：473來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：利用微載體的產(chǎn)后來源的細(xì)胞的體外擴(kuò)增的制作方法
            
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)根據(jù)35 U.S.C.§119(e)要求2006年11月13日提交的美國申請(qǐng)?zhí)?0/865,558的權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用合并在本文中。
            
領(lǐng)域   
            
本發(fā)明一般地涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長和擴(kuò)增。特別是，本發(fā)明涉及利用表面或顆粒，例如微載體顆粒、丸粒或珠子的、哺乳動(dòng)物產(chǎn)后來源的細(xì)胞(PPDCs)的體外生長和擴(kuò)增的方法。
            
 背景   
            
商業(yè)性細(xì)胞治療產(chǎn)品優(yōu)選的是在閉合的無菌系統(tǒng)中生產(chǎn)的。然而，用于商業(yè)性細(xì)胞治療產(chǎn)品的許多細(xì)胞類型的生長是貼壁依賴的。
            
 
            
雖然攪拌罐反應(yīng)器、搖動(dòng)燒瓶、旋轉(zhuǎn)燒瓶、抬升反應(yīng)器等等，對(duì)于在懸浮液中生長的細(xì)胞都是有用的(例如，用于單克隆抗體生產(chǎn)的雜交瘤、用于重組DNA技術(shù)的多種細(xì)胞，以及大多數(shù)昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物)，用于生長和擴(kuò)增貼壁依賴細(xì)胞的選擇是更為有限的。
            
 
            
包括在貼壁依賴細(xì)胞之內(nèi)的有許多正常的二倍體細(xì)胞株，以及大多數(shù)原代細(xì)胞類型。用于這些細(xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)的選擇包括滾瓶、纖維床、空心纖維系統(tǒng)、多平板的或堆疊的平板培養(yǎng)系統(tǒng)、細(xì)胞立方體(cell cube)和微載體，每一種都具有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。
            
 
            
細(xì)胞培養(yǎng)的基于微載體的方法提供了許多優(yōu)點(diǎn)，包括在許多應(yīng)用中下游加工的容易。微載體一般形狀是大略球形，可以是大孔或微孔的，或是實(shí)心的。利用用于細(xì)胞附著的微載體便于使用攪拌罐和相關(guān)的反應(yīng)器用于貼壁依賴細(xì)胞的生長。細(xì)胞附著到容易懸浮的微粒上。對(duì)可懸浮性的要求限制了微載體本身的物理參數(shù)。因而，微載體通常具有50-2000微米范圍內(nèi)的平均直徑。在某些應(yīng)用中，實(shí)心型的微載體從約100到約250微米，而多孔型微載體珠子從約250到約2500微米。這些大小范圍容許選擇足夠大以容納許多貼壁依賴細(xì)胞，同時(shí)足夠小以形成具有適用于攪拌反應(yīng)器中的性質(zhì)的懸浮液的微載體。
            
 
            
多孔和實(shí)心型的微粒載體都是可從供應(yīng)商來商業(yè)上獲得的。商業(yè)上可獲得的微載體的實(shí)例包括Cytodex  
            
     
            
和Cytodex  
            
     
            
其都是來自GE Healthcare Life Sciences的基于葡聚糖的微載體。在售的多孔微載體包括也來自GE Healthcare Life Sciences的Cytoline以及Cytopore產(chǎn)品。Biosilon(NUNC)和Cultispher(Percell Biolytica)也是商業(yè)上可獲得的。
            
 
            
雖然對(duì)于某些類型的細(xì)胞，在高度彎曲的表面上，例如微載體所提供的表面上生長的細(xì)胞的形態(tài)可能是一個(gè)問題，就大規(guī)模的生長而言，一般地微載體提供了許多優(yōu)點(diǎn)，包括易于收獲細(xì)胞，易于從細(xì)胞本身中分離有用的細(xì)胞外產(chǎn)物。本領(lǐng)域需要高效的和高產(chǎn)量的方法，來生長和收獲貼壁依賴細(xì)胞，例如源于臍帶或胎盤的產(chǎn)后細(xì)胞。
            
 概述   
            
本發(fā)明提供了用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長和擴(kuò)增的組合物和方法。提供了方法用于利用表面，例如微載體珠子或多孔的微載體珠子體外生長和擴(kuò)增產(chǎn)后來源的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是貼壁依賴的、產(chǎn)后來源的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，臍來源的細(xì)胞或胎盤來源的細(xì)胞。
            
 
            
提供了培養(yǎng)貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞的方法，其包括提供至少一種貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞，提供用于生長所述產(chǎn)后細(xì)胞的細(xì)胞生長培養(yǎng)基，提供至少一種載體顆粒，其用于所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞的附著，以及在允許所述細(xì)胞的附著和生長的條件下、在存在所述生長培養(yǎng)基的情況下用所述載體顆粒接觸所述貼壁依賴細(xì)胞，從而培養(yǎng)所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞。
            
 
            
培養(yǎng)貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞的方法提供了在至少一種載體顆粒，例如微載體上培養(yǎng)細(xì)胞。所述微載體可以由天然的或合成來源的材料組成。實(shí)例包括基于膠原蛋白的微載體、基于葡聚糖的微載體、或基于纖維素的微載體，以及玻璃、陶瓷、聚合物或金屬。微載體可以是無蛋白質(zhì)的或蛋白質(zhì)包被的，例如，具有膠原蛋白。在進(jìn)一步的方面，所述微載體可以由化合物組成，或包被有化合物，所述化合物增強(qiáng)細(xì)胞與所述微載體的結(jié)合以及增強(qiáng)細(xì)胞從所述微載體上的釋放，包括但不限于，聚(單硬脂酰基甘油酯共-丁二酸)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯、透明質(zhì)酸鈉、膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、賴氨酸、n-異丙基丙烯酰胺、玻連蛋白。實(shí)例進(jìn)一步包括具有微電流的微載體，例如具有產(chǎn)生低水平的生物學(xué)相關(guān)的電流的鋅和銅的顆粒電偶的微載體；或順磁性的微載體，例如順磁性的鈣-藻酸鹽微載體。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了與貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞共培養(yǎng)的第二細(xì)胞類型。
            
 
            
培養(yǎng)貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞的方法提供了培養(yǎng)細(xì)胞來引起在約二十天內(nèi)至少約五次群體倍增。培養(yǎng)貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞的方法提供了培養(yǎng)細(xì)胞來引起在約二十天內(nèi)至少約七次半的群體倍增。
            
 
            
提供了組合物，其包含所述方法培養(yǎng)的貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞，所述方法利用用于附著到細(xì)胞的載體顆粒，例如微載體顆?；蚨嗫椎奈⑤d體顆粒。所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞表型上與在靜態(tài)培養(yǎng)物中生長的細(xì)胞相同，如對(duì)一種或更多種標(biāo)記物CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD117、CD141、PDGFr-α、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ所確定的。在進(jìn)一步的方面中，所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞表型是CD10+、CD13+、CD31-、CD34-、CD44+、CD45-、CD73+、CD90+、CD117-、CD141-、PDGFr-α+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-。提供了包含在載體顆粒上培養(yǎng)的貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞的生物反應(yīng)器。提供了利用載體顆粒上培養(yǎng)的貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞的用于細(xì)胞治療的組合物。
            
 詳細(xì)說明   概述   
            
本發(fā)明提供了用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長和擴(kuò)增的組合物和方法。提供了方法，其用于利用表面，例如微載體珠子或多孔的微載體珠子體外生長和擴(kuò)增產(chǎn)后來源的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是貼壁依賴的、產(chǎn)后來源的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，臍來源的細(xì)胞或胎盤來源的細(xì)胞。
            
 
            
提供了培養(yǎng)貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞的方法，其包括提供至少一種貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞，提供用于生長所述產(chǎn)后細(xì)胞的細(xì)胞生長培養(yǎng)基，提供至少一種載體顆粒，其用于所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞的附著，以及在允許所述細(xì)胞的附著和生長的條件下、在存在所述生長培養(yǎng)基的情況下用所述載體顆粒接觸所述貼壁依賴細(xì)胞，從而培養(yǎng)所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞。
            
 
            
培養(yǎng)貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞的方法提供了在至少一種載體顆粒，例如微載體上培養(yǎng)細(xì)胞。所述微載體可以由天然的或合成來源的材料組成。實(shí)例包括基于膠原蛋白的微載體、基于葡聚糖的微載體、或基于纖維素的微載體，以及玻璃、陶瓷、聚合物(例如聚苯乙烯)或金屬。微載體可以是無蛋白質(zhì)的或蛋白質(zhì)包被的，例如，具有膠原蛋白。在進(jìn)一步的方面，所述微載體可以由化合物組成，或包被有化合物，所述化合物增強(qiáng)細(xì)胞與所述微載體的結(jié)合以及增強(qiáng)細(xì)胞從所述微載體上的釋放，包括但不限于，聚(單硬脂?；视王ス?丁二酸)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯、透明質(zhì)酸鈉、纖連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、賴氨酸、n-異丙基丙烯酰胺、玻連蛋白和膠原蛋白。實(shí)例進(jìn)一步包括具有微電流的微載體，例如具有產(chǎn)生低水平的生物學(xué)相關(guān)的電流的鋅和銅的顆粒電偶的微載體；或順磁性的微載體，例如順磁性的鈣-藻酸鹽微載體。
            
 
            
提供了組合物，其包含所述方法培養(yǎng)的貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞，所述方法利用載體顆粒，例如微載體顆粒、多孔的微載體顆粒、具有微電流的微載體、或順磁性微載體，用于附著到細(xì)胞。所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞表型上與在靜態(tài)T-燒瓶中生長的細(xì)胞相同，如對(duì)一種或更多種標(biāo)記物CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD117、CD141、PDGFr-α、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ所確定的。在進(jìn)一步的方面中，所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞表型是CD10+、CD13+、CD31-、CD34-、CD44+、CD45-、CD73+、CD90+、CD117-、CD141-、PDGFr-α+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞表型是CD13+、CD90+、CD34-和CD117-。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞表型是CD10+、CD13+、CD44+、CD73+、CD90+PDGFr-α+、PD-L2+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+和CD31-、CD34-CD45-、CD80-、CD86-、CD117-、CD141-、CD178-、B7-H2、HLA-G-、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-。
            
 
            
要理解的是，本發(fā)明不限于特定的方法、試劑、化合物、組合物或生物系統(tǒng)，其當(dāng)然地可以變化。還需要理解的是，在此使用的專有名詞僅是用于描述本發(fā)明的特定實(shí)施方式的目的，不意味著限制本發(fā)明。如在本說明書和附隨的權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式“一”和“該(the)”包括了復(fù)數(shù)的指示物，除非該內(nèi)容明確地另外指明。因而，舉例來說，提及“一種細(xì)胞”包括兩種或更多種細(xì)胞的組合，等等。
            
 
            
在此使用的術(shù)語“約”當(dāng)涉及可測(cè)值如數(shù)量、持續(xù)時(shí)間等等時(shí)，意思是包括離指定值±20％或±10％、更優(yōu)選的±5％、再更優(yōu)選的±1％、更加優(yōu)選的±0.1％的變動(dòng)，當(dāng)這種變動(dòng)適合于進(jìn)行所公開的方法時(shí)。
            
 
            
除非另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。雖然類似于或等同于在此描述的那些的任何方法和材料可以被用于實(shí)踐來測(cè)試本發(fā)明，在此描述了優(yōu)選的材料和方法。在描述和主張本發(fā)明時(shí)，將使用以下術(shù)語。
            
 
            
在此處描述的方法中培養(yǎng)的細(xì)胞被稱為“產(chǎn)后來源的細(xì)胞(PPDCs)”或“產(chǎn)后細(xì)胞”。本發(fā)明的細(xì)胞的亞組被稱為“胎盤來源的細(xì)胞(PDCs)”或“人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTCs)”。此外，細(xì)胞可以被描述為干細(xì)胞或祖細(xì)胞，后一術(shù)語廣義地使用。術(shù)語“來源”被用于表明細(xì)胞已經(jīng)從它們的生物學(xué)來源獲得并被體外地生長或進(jìn)行其他操作(例如，在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)來擴(kuò)增群體和/或產(chǎn)生細(xì)胞系)。以下詳細(xì)描述了本發(fā)明的產(chǎn)后來源的細(xì)胞的體外操作和產(chǎn)后來源的細(xì)胞的獨(dú)特特征。
            
 
            
各種術(shù)語被用于描述培養(yǎng)中的細(xì)胞。“細(xì)胞培養(yǎng)物”一般涉及從活有機(jī)體取得并在受控的條件生長的細(xì)胞(“培養(yǎng)中”)?！霸?xì)胞培養(yǎng)物”是在第一次傳代培養(yǎng)之前直接取自有機(jī)體的細(xì)胞、組織或器官的培養(yǎng)物。當(dāng)細(xì)胞置于生長培養(yǎng)基中處在便于細(xì)胞生長和/或分裂的環(huán)境中時(shí)，細(xì)胞被在培養(yǎng)中“擴(kuò)增”，產(chǎn)生細(xì)胞的更大的群體。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)中擴(kuò)增時(shí)，細(xì)胞增殖的速率有時(shí)由細(xì)胞在數(shù)目上倍增所需的時(shí)間量來度量。這被稱為“倍增時(shí)間”。
            
 
            
“細(xì)胞系”是由原代細(xì)胞培養(yǎng)物的一次或更多次移種形成的細(xì)胞群體。每一輪傳代培養(yǎng)被稱為傳代。當(dāng)細(xì)胞被傳代培養(yǎng)時(shí)，它們被稱為已經(jīng)被“傳代”。特定的細(xì)胞或細(xì)胞系的群體有時(shí)稱為或表征為它被傳代的次數(shù)的數(shù)字。例如，傳代十次的培養(yǎng)的細(xì)胞群體可以稱為“P10”培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)物，即，在從組織分離細(xì)胞之后的第一培養(yǎng)物被稱為P0。在第一次傳代培養(yǎng)之后，細(xì)胞被稱為第二培養(yǎng)物(P1或傳代1)。在第二次傳代培養(yǎng)之后，細(xì)胞稱為第三培養(yǎng)物(P2或傳代2)，如此等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，在傳代期間可能有多次群體倍增；因而，培養(yǎng)物的群體倍增的數(shù)目大于傳代數(shù)。在傳代之間時(shí)期的細(xì)胞擴(kuò)增(即，群體倍增的數(shù)目)取決于許多因素，包括但不限于接種密度、底物、培養(yǎng)基和傳代之間的時(shí)間。
            
 
            
“條件培養(yǎng)基”是一種培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)了特定的細(xì)胞或細(xì)胞群體，然后被去除。當(dāng)細(xì)胞被培養(yǎng)在培養(yǎng)基中時(shí)，它們分泌可為其他細(xì)胞提供營養(yǎng)支持的細(xì)胞因子。這些營養(yǎng)因子包括但不限于激素、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、蛋白質(zhì)、泡囊、抗體和微粒。含有細(xì)胞因子的培養(yǎng)基是條件培養(yǎng)基。
            
 
            
一般地，“營養(yǎng)因子”被定義為促進(jìn)細(xì)胞的存活、生長、增殖、成熟、分化和/或維持，或刺激細(xì)胞的提高的活性的物質(zhì)。在此使用的“營養(yǎng)支持”是指促進(jìn)細(xì)胞的存活、生長、增殖、成熟、分化和/或維持，或刺激細(xì)胞的提高的活性的能力。
            
 
            
當(dāng)涉及培養(yǎng)的脊椎動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，術(shù)語衰老(以及“復(fù)制型衰老”或“細(xì)胞衰老”)是指可歸因于有限的細(xì)胞培養(yǎng)的性質(zhì)；即，它們不能生長超過有限數(shù)量的群體倍增(有時(shí)稱為“Hayflick’s限制”)。雖然利用成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞首次描述了細(xì)胞衰老，可以在培養(yǎng)中成功地生長的大多數(shù)正常人細(xì)胞類型經(jīng)歷細(xì)胞衰老。不同細(xì)胞類型的體外壽命是可變的，但是最大壽命一般少于100次群體倍增(這是所有細(xì)胞在培養(yǎng)中變得衰老因而使得培養(yǎng)物不能分裂的倍增次數(shù))。衰老不取決于時(shí)序時(shí)間(chronological time)，而是由培養(yǎng)物已經(jīng)經(jīng)歷的細(xì)胞分裂或群體倍增的次數(shù)來度量。因而，當(dāng)重新引入生長因子時(shí)，通過除去必需的生長因子而變得休眠的細(xì)胞仍然能夠恢復(fù)生長和分裂，此后進(jìn)行與連續(xù)生長的相同細(xì)胞相同次數(shù)的倍增。類似地，當(dāng)細(xì)胞在各種次數(shù)的群體倍增之后在液氮中冷凍然后解凍并培養(yǎng)時(shí)，它們經(jīng)歷與培養(yǎng)中維持不冷凍的細(xì)胞基本上相同的倍增次數(shù)。衰老的細(xì)胞不是死亡的或垂死的細(xì)胞；它們實(shí)際上對(duì)細(xì)胞分裂和程序性細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)有抗性，并可以無限地維持在它們的非分裂狀態(tài)。這些細(xì)胞是非常有活力和代謝活性的，但是它們不分裂。還沒有發(fā)現(xiàn)衰老的細(xì)胞的非分裂狀態(tài)通過任何生物學(xué)、化學(xué)或病毒試劑而是可逆的。
            
 
            
“生長培養(yǎng)基”是指足夠用于產(chǎn)后來源的細(xì)胞的擴(kuò)增的培養(yǎng)基。生長培養(yǎng)基優(yōu)選地含有Dulbecco’s修飾的必需培養(yǎng)基(DMEM)。更優(yōu)選的，生長培養(yǎng)基含有葡萄糖。生長培養(yǎng)基優(yōu)選地含有DMEM-低葡萄糖(DMEM-LG)(Invitrogen，Carlsbad，CA)。生長培養(yǎng)基優(yōu)選地含有約15％(v/v)血清(例如，胎牛血清，規(guī)定的牛血清)。生長培養(yǎng)基優(yōu)選地含有至少一種抗生劑和/或抗真菌劑(例如，青霉素、鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素、制霉菌素；優(yōu)選的，50單位/毫升青霉素G鈉和50微克/毫升鏈霉素硫酸鹽)。生長培養(yǎng)基優(yōu)選地含有2-巰基乙醇(Sigma，St.Louis MO)。最優(yōu)選的，生長培養(yǎng)基含有DMEM-低葡萄糖、血清、2-巰基乙醇和抗生劑。
            
 
            
“標(biāo)準(zhǔn)生長條件”是指包含約5％CO2的標(biāo)準(zhǔn)大氣條件、約35-39℃的溫度，更優(yōu)選的37℃，以及約100％的相對(duì)濕度。
            
 
            
“分離的”是指已經(jīng)從其天然環(huán)境中移出的細(xì)胞、細(xì)胞成分或分子。
            
 
            
“貼壁依賴細(xì)胞”是一些細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其需要附著在表面上，例如組織培養(yǎng)燒瓶表面或微載體顆粒表面，來在組織培養(yǎng)中復(fù)制。
            
 
            
“微載體”是指對(duì)于在培養(yǎng)中貼壁依賴細(xì)胞的附著和生長有用的顆粒、珠子或丸粒。微載體具有以下性質(zhì)(a)它們足夠小以容許它們?cè)趹腋∨囵B(yǎng)物中使用(以不引起對(duì)微載體或細(xì)胞的顯著剪切破壞的攪拌速度)；(b)它們是實(shí)心的，或具有表面上由多孔包被的實(shí)核心；和(c)它們的表面(對(duì)于多孔載體來說外表面和內(nèi)表面)可以是帶正電或負(fù)電的。在一個(gè)方面，所述微載體具有約150到350μm之間的總體粒徑，具有約0.8到2.0meq/g之間的正電荷密度。有用的微載體包括，非限制性地，Cytodex  
            
     
            
Cytodex  
            
     
            
或Cytodex  
            
     
            
(GE Healthcare Life Sciences)。
            
 
            
在另一個(gè)方面，所述微載體是實(shí)心載體。實(shí)心載體特別適合于粘附細(xì)胞，例如貼壁依賴細(xì)胞。所述載體顆粒也可以是多孔的微載體。實(shí)例進(jìn)一步包括具有微電流的微載體，例如具有產(chǎn)生低水平的生物學(xué)相關(guān)的電流的鋅和銅的顆粒電偶的微載體；或順磁性的微載體，例如順磁性的鈣-藻酸鹽微載體。
            
 
            
“多孔的微載體”是指對(duì)于培養(yǎng)中貼壁依賴細(xì)胞的附著和生長有用的顆粒。多孔的微載體具有以下性質(zhì)(a)它們足夠小以容許它們?cè)趹腋∨囵B(yǎng)物中使用(以不引起對(duì)微載體或細(xì)胞的顯著剪切破壞的攪拌速度)；(b)它們具有足夠大小的孔和內(nèi)部空間以容許細(xì)胞遷移到所述顆粒的內(nèi)部空間中，以及(c)它們的表面(外表面和內(nèi)表面)可以是帶正電或負(fù)電的。在一系列的實(shí)施方式中，載體(a)具有約150到350μm之間的總體粒徑；(b)具有為約15到約40μm之間的平均孔開口直徑的孔；以及(c)具有約0.8到2.0meq/g之間的正電荷密度。在某些實(shí)施方式中，所述正電荷由DEAE(N，N，-二乙氨基乙基)基團(tuán)提供。有用的多孔微載體包括，非限制性地，  
            
     
            
1和  
            
     
            
2(GE Healthcare Life Sciences，PiscatawayN.J.)。
            
 
            
本發(fā)明首次展現(xiàn)了用于來自產(chǎn)后組織包括臍和胎盤的細(xì)胞的分離和培養(yǎng)的方法，其可以在微載體顆?；蚨嗫椎奈⑤d體顆粒上體外擴(kuò)增到大的數(shù)量。貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞能夠分化成中胚層、外胚層或內(nèi)胚層的譜系。
            
 
            
本發(fā)明的貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞具有分化成任何一種或更多種組織類型的能力，所述組織類型包括但不限于，中胚層組織，例如成熟的脂肪組織、骨骼、軟骨、心臟的各種組織(例如，心包膜、心外膜、心肌外膜、心肌、心包膜、瓣組織)、真皮結(jié)締組織、hemangial組織(例如，小體(corpuscles)、心內(nèi)膜、血管上皮)、造血(hematopeotic)組織、肌肉組織(包括骨骼肌、心肌、平滑肌)、泌尿生殖組織(例如，腎臟、前腎、后和中腎管、后腎憩室、輸尿管、腎盂、集合小管)、雌性生殖結(jié)構(gòu)的上皮(特別是輸卵管、子宮和陰道)、中胚層腺組織(例如，腎上腺皮質(zhì)組織)和基質(zhì)組織(例如，骨髓)。當(dāng)然，由于所述產(chǎn)后細(xì)胞可以保持發(fā)育成為成熟細(xì)胞的潛力，也可認(rèn)識(shí)到它通過分化成合適的前體細(xì)胞(例如，前脂肪細(xì)胞、前肌細(xì)胞、前骨細(xì)胞)的發(fā)育表型潛能。
            
 
            
來自它們的產(chǎn)后細(xì)胞可以用于身體的任何組織的組織修復(fù)、再生或增加。此外，本發(fā)明的細(xì)胞可以用于營養(yǎng)支持。
            
 從產(chǎn)后組織分離細(xì)胞   
            
分離和收集PPDCs的方法在共同待決的美國申請(qǐng)?zhí)?0/877,012和10/877,446中描述，通過將它們?nèi)囊脕砗喜⒃诖?。為了收集產(chǎn)后的臍和胎盤用于載體顆粒上細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，在分娩后立即獲取胎盤和臍。舉例來說，而不是為了限制，在除去羊膜之后，胎盤或臍帶(排干血液)或其切片，可以在含有鹽溶液或培養(yǎng)基，例如Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)的無菌容器例如燒瓶、燒杯或培養(yǎng)皿中從出生位置轉(zhuǎn)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室。在組織的收集之前和期間，臍帶優(yōu)選地在無菌條件下維持和操作，另外可以通過用例如70％(體積比)的乙醇的水溶液對(duì)臍帶作簡短的表面處理，隨后用無菌的蒸餾水或等滲的鹽溶液清洗來表面滅菌。在約3℃到約50℃，臍帶可以短暫地保存約1到24小時(shí)。在細(xì)胞的提取之前，優(yōu)選地將組織保存在4℃到10℃，而不是冷凍。抗生素或抗真菌物質(zhì)可以包括在培養(yǎng)基中來降低微生物污染。通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法在無菌條件下從臍帶和胎盤收集細(xì)胞。這些實(shí)例包括用酶例如分散酶、膠原酶、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶來消化，或解剖或切碎。長出細(xì)胞的分離的細(xì)胞或組織碎片可以用于起始細(xì)胞培養(yǎng)。
            
 
            
產(chǎn)后的組織可以使用抗凝血?jiǎng)┤芤豪绺嗡貋砬逑础＝M織可以在用于移植的器官的轉(zhuǎn)移所使用的溶液中轉(zhuǎn)運(yùn)，例如成斯康星大學(xué)溶液或全氟化合物溶液。
            
 產(chǎn)后細(xì)胞的培養(yǎng)   
            
分離的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到無包被的或用細(xì)胞外基質(zhì)或配體如層粘連蛋白、膠原蛋白、明膠包被的無菌組織培養(yǎng)器皿。為了生長，添加細(xì)胞培養(yǎng)基，例如DMEM(高或低葡萄糖)、McCoys 5A培養(yǎng)基、Eagle’s基礎(chǔ)培養(yǎng)基、CMRL培養(yǎng)基、Glasgow最小必需培養(yǎng)基、Ham’sF-12培養(yǎng)基(F12)、Iscove’s改良的Dulbecco’s培養(yǎng)基、Liebovitz L-15培養(yǎng)基、MCDB和RPMI 1640，等等。培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有一種或更多種成分，包括，例如，胎牛血清(FBS)、馬血清(ES)、人血清(HS)、生長因子，例如PDGF、FGF、促紅細(xì)胞生成素以及一種或更多種抗生素和/或抗真菌劑來控制微生物污染，例如，青霉素G、鏈霉素硫酸鹽、兩性霉素B、慶大霉素和制霉菌素，單獨(dú)地或組合地，等等。
            
 
            
處于一定密度以容許細(xì)胞生長的培養(yǎng)容器中的細(xì)胞被置于孵化器中，具有空氣中0到5％(體積比)的CO2，空氣中2到25％的O2，25到40℃。培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基可以是靜態(tài)的或搖動(dòng)的，例如，使用生物反應(yīng)器。細(xì)胞可以是低氧化應(yīng)激下培養(yǎng)(例如，添加谷胱甘肽、維生素C、過氧化氫酶、維生素E、N-乙酰基半胱氨酸)。如在此使用的“低氧化應(yīng)激”是指對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞沒有或具有最小的自由基損害的條件。細(xì)胞也可以在改變的條件下生長，例如，一段時(shí)期的正常氧之后是一段時(shí)期的缺氧。
            
 
            
最合適的培養(yǎng)基、培養(yǎng)基制備和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的選擇方法是本領(lǐng)域公知的，在各種來源中描述了，包括Doyle等，(eds.)，1995，Cell&Tissue CultureLaboratory Procedures，John Wiley&Sons，Chichester；and Ho and Wang(eds.)，1991，Animal CellBioreactors，Butterworth-Heinemann，Boston，通過全文引用將它們合并在此。
            
 
            
在培養(yǎng)分離的細(xì)胞或組織碎片足夠的時(shí)間之后，例如，約10到約12天，外植的組織中存在的產(chǎn)后細(xì)胞將傾向于從組織中長出，作為從中遷移或細(xì)胞分裂的結(jié)果，或兩者共同的結(jié)果。產(chǎn)后細(xì)胞然后移動(dòng)到含有與最初使用的相同或不同類型的新鮮培養(yǎng)基的獨(dú)立培養(yǎng)容器中，在其中細(xì)胞群體可以有絲分裂地?cái)U(kuò)增。
            
 
            
做為選擇，產(chǎn)后組織中存在的不同的細(xì)胞類型被分級(jí)成亞群，從中可以分離產(chǎn)后細(xì)胞。這可以使用用于細(xì)胞分離的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)，包括但不限于，酶處理來將產(chǎn)后組織離解成它的組成細(xì)胞，之后利用形態(tài)學(xué)和/或生物化學(xué)的標(biāo)記物來克隆和選擇特定的細(xì)胞類型，選擇性破壞不需要的細(xì)胞(負(fù)選擇)，根據(jù)混合的群體中與例如大豆凝集素的不同細(xì)胞可凝集性來分離，凍融操作，混合的群體中細(xì)胞的不同粘附性質(zhì)，過濾，常規(guī)的和區(qū)帶離心，離心淘洗(逆流離心)，單位重力分離，逆流分布，電泳，以及熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)。對(duì)于克隆選擇和細(xì)胞分離技術(shù)的綜述，參見Freshney，R.I.，Culture ofAnimal Cells；A Manual of Basic Techniques，4th Ed.，Wiley-Liss，Inc.，New York，2000，通過全文引用將其合并在此。
            
 
            
培養(yǎng)基根據(jù)需要來改變，通過例如使用移液管小心地從平皿吸出培養(yǎng)基，并補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基。如上所述繼續(xù)孵育，直到平皿中足夠數(shù)量或密度的細(xì)胞積累，例如，大約百分之70匯合?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)或使用細(xì)胞刮刀除去原始的外植的組織切片，其余的細(xì)胞被胰蛋白酶消化。在胰蛋白酶消化之后，收集細(xì)胞，移到新鮮培養(yǎng)基中并如上所述的孵育。培養(yǎng)基可以在胰蛋白酶之后24小時(shí)至少改變一次以除去任何漂浮的細(xì)胞。保留在培養(yǎng)物中的細(xì)胞是產(chǎn)后細(xì)胞。
            
 
            
產(chǎn)后細(xì)胞可以利用流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)、基因陣列、PCR、蛋白質(zhì)陣列或本領(lǐng)域已知的其他方法來表征。
            
 
            
產(chǎn)后細(xì)胞可以經(jīng)歷至少10次群體倍增。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠確定細(xì)胞何時(shí)經(jīng)歷群體倍增(Freshney，R.I.Culture of AnimalCellsA Manual of Basic Techniques 4th Ed.，Wiley-Liss，New York，2000)。
            
 
            
雖然產(chǎn)后細(xì)胞可以是分離的，優(yōu)選的它處在細(xì)胞的群體內(nèi)。本發(fā)明提供了產(chǎn)后細(xì)胞的被定義的群體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述群體是異質(zhì)的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述群體是同質(zhì)的。
            
 
            
在又一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)后細(xì)胞的群體可以支持細(xì)胞用于培養(yǎng)其他細(xì)胞。例如，可被PPDC群體支持的細(xì)胞可以包括其他類型的干細(xì)胞，例如，神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)、造血干細(xì)胞(HPC，特別是CD34+干細(xì)胞)、胚胎干細(xì)胞(ESC)和其混合物。在其他實(shí)施方式中，所述群體是基本上同質(zhì)的，基本上由PPDCs組成。
            
 
            
對(duì)于一種或更多種標(biāo)記物CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD117、CD141、PDGFr-α、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ，在微載體顆?；蚨嗫椎奈㈩w粒上培養(yǎng)的貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞已經(jīng)被表型地表征為與靜態(tài)培養(yǎng)物中生長的細(xì)胞相同。在進(jìn)一步的方面中，所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞已經(jīng)被表征為具有包括CD10+、CD13+、CD31-、CD34-、CD44+、CD45-、CD73+、CD90+、CD117-、CD141-、PDGFr-α+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-的表型。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞表型是CD13+、CD90+、CD34-和CD117-。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞表型是CD10+、CD13+、CD44+、CD73+、CD90+PDGFr-α+、PD-L2+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+和CD31-、CD34-CD45-、CD80-、CD86-、CD117-、CD141-、CD178-、B7-H2、HLA-G-、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-。
            
 
            
產(chǎn)后細(xì)胞可以用于在化合物或肽的天然庫或合成庫中篩選引起分化或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子，包括激酶，例如Jak、MAP、Jun、p38Akt、PKC、調(diào)鈣蛋白、酪氨酸激酶、SMAD、ERK、JNK、MEK、ErbB、FAK和PI3。
            
 
            
產(chǎn)后細(xì)胞可以通過利用基因芯片分析或抗體陣列來進(jìn)一步表征。
            
 用于細(xì)胞培養(yǎng)的微載體   
            
微載體培養(yǎng)是一種技術(shù)，其使得貼壁依賴細(xì)胞，例如，貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞的實(shí)際的高產(chǎn)量培養(yǎng)成為可能。微載體已經(jīng)被專門地開發(fā)用于細(xì)胞的培養(yǎng)，例如哺乳動(dòng)物產(chǎn)后細(xì)胞，在從幾毫升到高過一千升的培養(yǎng)體積中。微載體是生物學(xué)惰性的，提供了攪拌的微載體培養(yǎng)物的強(qiáng)的但是非剛性基底。微載體可以是透明的，容許附著的細(xì)胞的顯微鏡檢查。Cytodex  
            
     
            
(GE Healthcare Life Sciences，PiscatawayN.J.)由化學(xué)地偶聯(lián)到交聯(lián)的葡聚糖的基質(zhì)的變性膠原蛋白的薄層組成。Cytodex  
            
     
            
上的變性的膠原蛋白層對(duì)于多種蛋白酶的消化是敏感的，包括胰蛋白酶和膠原酶，提供了從微載體移除細(xì)胞同時(shí)保持最大的細(xì)胞生存力、功能和完整性的能力。
            
 
            
無蛋白的微載體可以用于培養(yǎng)產(chǎn)后細(xì)胞。例如，在生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室或研究用途中使用的、以商品名稱  
            
     
            
(SoloHillEngineering，Inc.，Ann Arbor，MI)銷售的微載體珠子是修飾的聚苯乙烯珠子，具有附著于表面的陽離子三甲基銨來為所述微載體提供帶正電的表面。珠子直徑從直徑約90到約200微米。
            
 
            
細(xì)胞培養(yǎng)的基于微載體的方法提供了許多優(yōu)點(diǎn)，包括在許多應(yīng)用中下游加工的容易。微載體一般形狀是大略球形，可以是多孔的或?qū)嵭牡?。利用微載體用于細(xì)胞附著便于使用攪拌罐和相關(guān)的反應(yīng)器用于貼壁依賴細(xì)胞的生長。細(xì)胞附著到容易懸浮的微粒上。對(duì)可懸浮性的要求限制了微載體的物理參數(shù)。因而，微載體通常具有50-2000微米范圍內(nèi)的平均直徑。在某些應(yīng)用中，實(shí)心型的微載體從約100到約250微米，而多孔型微載體珠子從約250到約2500微米。這些大小范圍容許選擇足夠大以容納許多貼壁依賴細(xì)胞，同時(shí)足夠小以形成具有適用于攪拌反應(yīng)器中的性質(zhì)的懸浮液的微載體。
            
 
            
在利用微載體珠子等等中考慮的因素有附著效力、免疫原性、生物相容性、生物降解的能力、達(dá)到匯合的時(shí)間、附著的細(xì)胞的生長參數(shù)，包括每單位表面積的最大可得密度，需要的解離技術(shù)、解離的效力、培養(yǎng)條件的可測(cè)量性以及在擴(kuò)大條件下培養(yǎng)物的勻質(zhì)性、成功地?cái)U(kuò)大解離過程的能力，和珠子是否將用于植入。這些考慮可以受到微載體珠子的表面性質(zhì)、以及微載體的多孔性、直徑、密度和操作性質(zhì)的影響。
            
 
            
例如，微載體顆?；蛑樽拥拿芏仁且环N考慮。過度的密度可能引起微載體顆?；蛑樽映恋沓鰬腋∫?，或傾向于完全地接近培養(yǎng)容器的底部，因而可能引起反應(yīng)器中細(xì)胞、培養(yǎng)基和氣相的不良的散料混合。另一方面，過低的密度可能導(dǎo)致微載體的過度的漂浮。1.02到1.15g/cm3的密度是許多微載體珠子的典型。
            
 
            
微載體顆粒的小的直徑以及可以添加到反應(yīng)器的顆粒的體積，容許所述微載體貢獻(xiàn)相當(dāng)大的表面積，大大地超過在滾瓶中或生長貼壁依賴細(xì)胞的其他方法，例如在平板上所得到的。多孔的微載體提供了每單位體積或重量甚至更大的表面積。這些多孔的微載體具有大的腔，其對(duì)于貼壁依賴細(xì)胞的生長是可用的。這些腔大大地提高了表面積，可以保護(hù)細(xì)胞免于有害的機(jī)械效應(yīng)，例如剪切應(yīng)力，例如，來自混合或來自氣體噴射的。最大化滾瓶中產(chǎn)后細(xì)胞的生長的方法在2005年12月19日申請(qǐng)的美國申請(qǐng)系列號(hào)60/751,550中描述了，通過全文引用將其合并在此。
            
 
            
微載體表面可以有網(wǎng)紋來增強(qiáng)細(xì)胞附著和增殖。微載體表面網(wǎng)紋可以通過一些技術(shù)，包括但不限于，建模、澆鑄、leeching和蝕刻來實(shí)現(xiàn)。有網(wǎng)紋的表面的特征的分辨率可以在納米級(jí)別。有網(wǎng)紋的表面可以用來誘導(dǎo)微載體表面上的特定細(xì)胞排列。多孔微載體內(nèi)的孔的表面也可以有網(wǎng)紋來增強(qiáng)細(xì)胞附著和增殖?？妆砻婢W(wǎng)紋可以通過一些技術(shù)，例如但不限于，建模、澆鑄、leeching和蝕刻來實(shí)現(xiàn)。
            
 
            
微載體表面可以被血漿包被來為微載體表面賦予特定電荷。這些電荷可以增強(qiáng)細(xì)胞附著和增殖。
            
 
            
在其他實(shí)施方式中，微載體由熱反應(yīng)性聚合物，例如聚-N-異丙基丙烯酰胺組成，或包被有所述物質(zhì)，或具有電機(jī)械性質(zhì)。
            
 
            
微載體可以具有微電流，例如，具有產(chǎn)生低水平的生物學(xué)相關(guān)電流的鋅和銅的顆粒電偶的微載體。微載體可以是順磁性的，例如順磁性的鈣-藻酸鹽微載體。
            
 
            
多孔和實(shí)心型的微粒載體都是可從供應(yīng)商來商業(yè)上獲得的。商業(yè)上可獲得的實(shí)心微載體的實(shí)例包括Cytodex  
            
     
            
和Cytodex  
            
     
            
其都是來自GE Healthcare Life Sciences的基于葡聚糖的微載體。在售的多孔微載體包括也來自GE Healthcare Life Sciences的Cytoline以及Cytopore產(chǎn)品。Biosilon(NUNC)和Cultispher(Percell Biolytica)也是商業(yè)上可獲得的。
            
 
            
載體顆粒還可以含有生物學(xué)活性試劑。載體顆粒還可以含有可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長或功能或者組織環(huán)境的生物學(xué)活性試劑，這些因子可以包括但不限于成纖維細(xì)胞生長因子、促紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子?？梢允褂猛暾囊蜃?、其模擬物或活性片段。
            
 
            
微載體可以用第二細(xì)胞類型接種并與貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞共培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該兩種(或更多種)細(xì)胞類型可以以相等或不等的比例附著到單獨(dú)的微載體上。該兩種或更多種細(xì)胞類型可以同時(shí)接種到微載體上，或它們可以在不同的時(shí)間接種。微載體可以這樣處理，來優(yōu)先地將特定的細(xì)胞類型粘附到微載體的特定區(qū)域上。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，具有附著的單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞類型的微載體可以在培養(yǎng)容器中與懸浮培養(yǎng)的第二細(xì)胞類型共同培養(yǎng)。
            
 
            
第二細(xì)胞類型可以包括，例如，上皮細(xì)胞(例如，口腔粘膜、胃腸道、鼻上皮、呼吸道上皮、陰道上皮、角膜上皮的細(xì)胞)、骨髓細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、干細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞(例如，主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、髂動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞、臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以及內(nèi)皮的祖代細(xì)胞(例如，CD34+、CD34+/CD117+細(xì)胞))、成肌細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、橫紋肌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞，和其他軟組織細(xì)胞或祖細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、胰島細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞，其包括但不限于神經(jīng)元、星形細(xì)胞、施萬(Schwann)細(xì)胞、腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞。
            
 
            
還包括的是軟骨組織、半月板組織、韌帶組織、腱組織、椎間盤組織、牙周組織、皮組織、血管組織、肌肉組織、筋膜組織、骨膜組織、眼組織、嗅覺組織、圍心組織、肺組織、滑液組織、神經(jīng)組織、腎臟組織、骨髓、泌尿生殖組織、腸組織、肝臟組織、胰腺組織、脾臟組織或脂肪組織的細(xì)胞。
            
 
            
根據(jù)當(dāng)前的公開內(nèi)容，其他的實(shí)施方式和用途對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
            
 示范性的實(shí)施方式   實(shí)施例1   葉輪旋轉(zhuǎn)燒瓶生物反應(yīng)器中微載體上的臍組織來源的產(chǎn)后細(xì)胞的生長和收獲   
            
這項(xiàng)工作的目標(biāo)是建立一些方法來在葉輪旋轉(zhuǎn)燒瓶生物反應(yīng)器中的微載體上接種、擴(kuò)增和收獲人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTCs)。微載體上生長的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)展現(xiàn)與利用靜態(tài)T-燒瓶方法培養(yǎng)的細(xì)胞相似的生長動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞表型。作為確定用這些方法培養(yǎng)的細(xì)胞是否保持了它們典型的表型的初步步驟，進(jìn)行了通過流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞表面標(biāo)志物的分析，與T-燒瓶中培養(yǎng)的(hUTCs)所表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)志物相比較。這項(xiàng)工作的另一個(gè)目標(biāo)是降低所述方法中胰蛋白酶-EDTA(動(dòng)物來源的產(chǎn)品)的使用，因而降低傳播病原體的風(fēng)險(xiǎn)。
            
 材料和方法   
            
細(xì)胞。來自CBAT lot#050604B傳代8細(xì)胞的細(xì)胞被解凍，在T225燒瓶中擴(kuò)增一次傳代。
            
 
            
微載體。Cytodex  
            
     
            
(GE Healthcare Life Sciences，cat.no，17-0485)微載體珠子在PBS中水化至少3小時(shí)并高壓滅菌。
            
 
            
旋轉(zhuǎn)燒瓶。具有內(nèi)部懸吊承載葉輪組(Internal OverheadBearing Impeller Assembly)的旋轉(zhuǎn)燒瓶，100ml和250ml(Bellco，Inc.)。
            
 
            
匯合。匯合被定義為在代表性的顯微鏡檢查視野中觀察到的大約90％的微載體的超過大約60％的表面積被細(xì)胞覆蓋。
            
 
            
傳代。傳代被定義為用獲自獨(dú)立的旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)物的匯合微載體的整分試樣接種含有新鮮微載體的旋轉(zhuǎn)燒瓶。
            
 
            
接種和培養(yǎng)。通過胰蛋白酶從T225燒瓶收獲細(xì)胞，4.0E+06細(xì)胞整分試樣添加到含有40mL培養(yǎng)基的100ml葉輪或玻璃棒旋轉(zhuǎn)燒瓶中330mg微載體珠子上。在孵育之前燒瓶用5％CO2氣體沖洗1分鐘。接種物轉(zhuǎn)速頻率是每30分鐘里30rpm 2分鐘，持續(xù)8小時(shí)。在八小時(shí)時(shí)，培養(yǎng)基體積增加到100ml，旋轉(zhuǎn)速度設(shè)置為45rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)，在37℃孵育。
            
 
            
傳代。傳代1-(100ml到250ml燒瓶)培養(yǎng)細(xì)胞八天。收集來自100ml燒瓶的所有微載體，容許通過重力從培養(yǎng)基中分離。吸出培養(yǎng)基，微載體重新懸浮在10ml新鮮培養(yǎng)基中。在吸移以確保均勻分布之后，移出具有微載體的5ml培養(yǎng)基，放入250ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中。大約660mg的新鮮水化并高壓滅菌的Cytodex  
            
     
            
微載體和培養(yǎng)基也添加到燒瓶中。培養(yǎng)基體積增加到200ml，在孵育之前燒瓶用5％CO2氣體沖洗1分鐘。旋轉(zhuǎn)速度設(shè)置為45rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)，在37℃孵育。其余的細(xì)胞通過胰蛋白酶消化來收獲，利用Guava PCA儀器(Guava Technologies，Hayward，CA)計(jì)數(shù)。
            
 
            
傳代2-(250ml到250ml燒瓶)培養(yǎng)細(xì)胞六天。收集來自250ml燒瓶的所有微載體，容許通過重力從培養(yǎng)基中分離。吸出培養(yǎng)基，微載體重新懸浮在25ml新鮮培養(yǎng)基中。在吸移以確保均勻分布之后，移出具有微載體的5ml培養(yǎng)基，放入250ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中。大約660mg的新鮮水化并高壓滅菌的Cytodex  
            
     
            
微載體和培養(yǎng)基也添加到燒瓶中。培養(yǎng)基體積增加到200ml，在孵育之前燒瓶用5％CO2氣體沖洗1分鐘。旋轉(zhuǎn)速度設(shè)置為45rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)，在37℃孵育。其余的細(xì)胞通過胰蛋白酶消化來收獲，利用Guava PCA儀器計(jì)數(shù)。
            
 
            
培養(yǎng)基交換。從培養(yǎng)中取下旋轉(zhuǎn)燒瓶，容許微載體靠重力沉淀到燒瓶的底部。通過抽吸除去大約一半的培養(yǎng)基體積，替換為等體積的新鮮培養(yǎng)基。燒瓶用5％CO2氣體沖洗1分鐘，并放回培養(yǎng)。在第1天、第4天進(jìn)行培養(yǎng)基交換。
            
 
            
生存力染色。從燒瓶中取出1ml整分試樣，容許微載體靠重力沉淀。通過抽吸來除去培養(yǎng)基，替換為1ml活/死(Live/Dead)染色溶液(Molecular Probes cat.no.L3224)，在37℃孵育15分鐘。在孵育之后，20微升整分試樣添加到玻璃顯微鏡載玻片，通過熒光顯微鏡檢查來觀察?；畹募?xì)胞染色為綠色，死的細(xì)胞染色為紅色。人工地分析顯微鏡視野來評(píng)估附著于微載體的活的和死的細(xì)胞的分布和比例。評(píng)估至少三個(gè)顯微鏡視野，統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞的近似的百分比。
            
 
            
細(xì)胞收獲。從旋轉(zhuǎn)燒瓶收集微載體，在PBS中洗滌三次，在兩個(gè)50ml錐形管間平均分配。每個(gè)試管在37℃與25ml胰蛋白酶孵育10分鐘。試管用PBS達(dá)到50ml體積，容許微載體靠重力沉淀。含有細(xì)胞的上清液通過抽吸來收集，并轉(zhuǎn)移到預(yù)先填充2.5ml FBS的50ml錐形管中(產(chǎn)生5％FBS溶液來滅活胰蛋白酶)。重復(fù)這個(gè)過程四次，單獨(dú)地收集每個(gè)級(jí)分。所有收獲的細(xì)胞被離心，重新懸浮在含有血清的生長培養(yǎng)基中，通過使用Guava PCA儀器來計(jì)數(shù)。
            
 
            
靜態(tài)T-燒瓶培養(yǎng)。從T225燒瓶收獲的細(xì)胞的整分試樣被用于接種兩個(gè)T225燒瓶，利用美國專利申請(qǐng)No.10/877012中聲明的方法孵育四天。收獲細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。
            
 
            
流式細(xì)胞術(shù)。利用Becton-Dickinson FACSCalibur儀器(Becton Dickinson，San Jose，CA)通過流式細(xì)胞術(shù)分析收獲的細(xì)胞來測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)志物分布。所有抗體購自BD PharMingen(SanDiego，CA)。
            
 結(jié)果   
            
細(xì)胞收獲。表1顯示了在旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)中Cytodex  
            
     
            
微載體上從傳代九到傳代十一擴(kuò)增的臍細(xì)胞系050604B的每次傳代的收獲物級(jí)分、細(xì)胞產(chǎn)量和生存力。
            
 表1      
            
細(xì)胞動(dòng)力學(xué)。表2顯示了在旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)中Cytodex  
            
     
            
微載體上從傳代九到傳代十一擴(kuò)增的臍細(xì)胞系050604B的生長動(dòng)力學(xué)。表格顯示了總體倍增是7.48，每次倍增的平均小時(shí)是69.53(+/-17.52)小時(shí)。
            
 表2      
            
活/死染色?；?死染色的微載體整分試樣的分析顯示了大部分微載體表面覆蓋有綠色染色(活的)細(xì)胞，具有紅色染色的核(死的)的少量的點(diǎn)。細(xì)胞展現(xiàn)了與靜態(tài)條件中培養(yǎng)的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)類似的形態(tài)學(xué)。
            
 
            
流式細(xì)胞術(shù)分析。表3顯示了旋轉(zhuǎn)燒瓶中的微載體珠子收獲的人臍組織來源的細(xì)胞(hUTCs)、對(duì)比從靜態(tài)的T燒瓶中的培養(yǎng)物收獲的hUTCs所表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)志物的結(jié)果(“+陽性”或“-陰性”)。表格顯示了通過兩種方法產(chǎn)生的細(xì)胞所表達(dá)的標(biāo)志物是一致的。
            
 表3在靜態(tài)的T燒瓶中、或在旋轉(zhuǎn)燒瓶系統(tǒng)中Cytodex  
            
     
            
微載體上擴(kuò)增的Umb 050604B細(xì)胞的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的比較，通過流式細(xì)胞術(shù)來分析。
            
   
            
      結(jié)論   
            
人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTCs)在葉輪旋轉(zhuǎn)燒瓶生物反應(yīng)器中的Cytodex  
            
     
            
微載體上培養(yǎng)。細(xì)胞在二十天內(nèi)實(shí)現(xiàn)了7.48次群體倍增，具有69小時(shí)的平均群體倍增時(shí)間。每個(gè)傳代的細(xì)胞生存力從94.4％到99.7％。對(duì)微載體上培養(yǎng)的hUTCs上十三種細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)的分析，與細(xì)胞培養(yǎng)T燒瓶中培養(yǎng)的hUTCs的細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)一致。這項(xiàng)工作提供了初步證據(jù)，表明微載體可以用于在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中接種、擴(kuò)增和收獲hUTCs。
            
 實(shí)施例2   在旋轉(zhuǎn)燒瓶中在MGSA、HA和PLGA微載體上擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTCs)的生長   
            
與無菌地封閉的系統(tǒng)一起使用的微載體可以潛在地生產(chǎn)商業(yè)數(shù)量的擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTC)。無菌地封閉的系統(tǒng)降低了擴(kuò)增和維持商業(yè)的細(xì)胞產(chǎn)品所需的人員操作，因而降低了操作者誤差、污染和監(jiān)測(cè)。與細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶相比，微載體提供了實(shí)質(zhì)上更大的表面積用于細(xì)胞附著，從而產(chǎn)生更高的細(xì)胞產(chǎn)量。
            
 
            
研究了hUTCs附著到由合成的可再吸收生物材料制成的微載體的能力，包括在旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)中維持生存力的能力，以及在重新接種到靜態(tài)培養(yǎng)中時(shí)增殖的能力。擴(kuò)增的hUTCs接種到微載體上，所述微載體由聚-(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、透明質(zhì)酸鈉(HA)和聚(單硬脂酰甘油酯共-丁二酸)(MGSA)材料。商業(yè)上生產(chǎn)的Cytodex  
            
     
            
微載體也在這個(gè)實(shí)例中用作對(duì)照。具有細(xì)胞的材料在旋轉(zhuǎn)燒瓶中培養(yǎng)五天，通過胰蛋白酶消化收獲，重新接種到靜態(tài)培養(yǎng)物中。重新接種的細(xì)胞在靜態(tài)培養(yǎng)中在四天內(nèi)擴(kuò)增，表現(xiàn)了它們的增殖能力的存留。這個(gè)實(shí)施例展現(xiàn)了合成的生物材料用作微載體用于旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)的能力。
            
 材料和方法   表4.微載體      
            
PLGA微球體的制備。PLGA微球體通過超臨界流體加工(SCF)來制備。SCF單元被高壓滅菌或用70％乙醇擦拭，置于層流罩超靜臺(tái)下。在無菌條件下，一克PLGA注入SCF單元的室中。閉合SCF單元，移動(dòng)到普通的通風(fēng)櫥中。將單元連接到具有0.2微米濾器的入口管上。壓力和溫度分別是300巴和35℃。葉片的轉(zhuǎn)速是250rpm。反應(yīng)進(jìn)行15分鐘。在完成加工之后，SCF單元與CO2的入口和出口的管道斷開，移入層流罩超靜臺(tái)中，打開室。產(chǎn)生的材料轉(zhuǎn)移到具有液氮的磨床并研磨。
            
 
            
MGSA微球體的制備。MGSA微球體通過超臨界流體加工來制備。SCF單元被高壓滅菌或用70％乙醇擦拭，置于層流罩超靜臺(tái)下。在無菌條件下，2克MGSA注入SCF單元的室中。閉合SCF單元，移動(dòng)到普通的通風(fēng)櫥中。將單元與具有0.2微米濾器的入口管連接。壓力和溫度分別是150巴和35℃。葉片的轉(zhuǎn)速是250rpm。反應(yīng)進(jìn)行20分鐘。在完成加工之后，SCF單元與CO2的入口和出口的管道斷開，移入層流罩超靜臺(tái)中，打開室。
            
 
            
透明質(zhì)酸鈉加工。稱出五克透明質(zhì)酸鈉(Novamatrix，Pharm 80)，干粉置于Mixer轉(zhuǎn)矩流變儀(Caleva，U.K.)的原尺寸(full size)碗中。在轉(zhuǎn)矩流變儀中以50rpm混合10秒之后，一毫升的乙醇/水(50/50v/v)溶液人工地添加(利用注射器)到粉末混合物中。在添加流體之后，以相同的速率繼續(xù)進(jìn)行另外的10秒混合，添加另一毫升的乙醇/水溶液。繼續(xù)這種模式直到添加了5毫升的溶液。濕物質(zhì)置于臥式螺旋擠壓機(jī)附件中，含有在單個(gè)環(huán)形圖案上等間隔的2.0mm直徑孔洞的壓模置于擠壓機(jī)附件的末端。螺旋速度是50rpm，手持的壓實(shí)器用于將濕的造粒壓入螺旋中。制劑被擠壓成很快地干燥的不連續(xù)的鏈。擠出的鏈用直緣刀片人工地切割成長度2mm的丸粒。
            
 
            
微載體制備。大約1克的每種PLGA微載體懸浮在25mlDulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中一小時(shí)。通過抽吸除去PBS，在接種之前，材料重新懸浮在25ml生長培養(yǎng)基中至少30分鐘。
            
 
            
大約1g的每種MGSA微載體懸浮在25ml 70％乙醇中30分鐘來潤濕材料。通過抽吸除去乙醇，用PBS清洗MGSA三次，在接種之前重新懸浮在25ml的生長培養(yǎng)基中至少30分鐘。
            
 
            
透明質(zhì)酸鈉(260mg)在25ml 70％乙醇中滅菌2小時(shí)。通過抽吸除去乙醇，然后用PBS清洗三次，接種之前重懸浮在25ml的生長培養(yǎng)基中至少30分鐘。
            
 
            
在接種之前一天，775mg的Cytodex  
            
     
            
微載體珠子在40ml PBS中水化至少3小時(shí)并高壓滅菌。接種的當(dāng)天，通過抽吸除去PBS，在接種之前Cytodex  
            
     
            
重新懸浮在生長培養(yǎng)基中至少30分鐘。
            
 表5.使用的微載體數(shù)量。
            
    
            
接種和培養(yǎng)。在實(shí)施例1中使用的材料、細(xì)胞類型、生長培養(yǎng)基、旋轉(zhuǎn)燒瓶、接種和培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基交換、生存力染色和細(xì)胞收獲方法在這個(gè)實(shí)施例中使用。
            
 
            
細(xì)胞收獲。由于在MGSA旋轉(zhuǎn)盤(＜75μm)、MGSA SCF、PLGA 50/50)和HA樣品中大量的生物材料碎屑，以及阻塞儀器的可能性，收獲的細(xì)胞沒有利用Guava PCA來計(jì)數(shù)。所有具有碎屑的收獲的細(xì)胞被重新接種到T225燒瓶中。從重新接種的收獲量回算微載體收獲量。
            
 結(jié)果   
            
微載體產(chǎn)量計(jì)算。根據(jù)39小時(shí)的群體倍增時(shí)間或四天時(shí)間內(nèi)2.46次倍增來計(jì)算微載體產(chǎn)量(靜態(tài)條件中hUTC生長動(dòng)力學(xué)的歷史數(shù)據(jù))。使用方程式倍增＝(Log10(收獲物)-Log10(接種的))/Log10(2)。
            
 表5a.最終的細(xì)胞產(chǎn)量      
            
收獲的細(xì)胞重新接種。從所有材料(除了Cytodex  
            
     
            
)收獲的細(xì)胞以大約5,000細(xì)胞每平方厘米重新接種到T225組織培養(yǎng)燒瓶中。從所有材料收獲的細(xì)胞在重新接種后增殖。
            
 
            
擴(kuò)增的hUTCs接種到PLGA、HA和MGSA材料上，在旋轉(zhuǎn)燒瓶中培養(yǎng)五天，通過胰蛋白酶消化收獲，并重新接種到靜態(tài)培養(yǎng)物中。從合成的微載體收獲的細(xì)胞是超過90％存活的。重新接種的細(xì)胞在靜態(tài)培養(yǎng)中在四天內(nèi)擴(kuò)增，表現(xiàn)了它們的增殖能力的存留。這個(gè)實(shí)施例展現(xiàn)了合成的生物材料用作微載體用于旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)的能力。
            
 實(shí)施例3   在旋轉(zhuǎn)燒瓶中在膠原蛋白包被的MGSA和PLGA微載體上擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTCs)的生長   
            
研究了hUTCs附著到由具有膠原蛋白包被的合成可重吸收生物材料制成的材料的能力，包括在旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)中維持生存力的能力，以及在重新接種到靜態(tài)培養(yǎng)中后增殖的能力。擴(kuò)增的hUTCs接種到膠原蛋白包被的或未包被的聚-(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚(單硬脂酰甘油酯共-丁二酸)(MGSA)微載體。具有細(xì)胞的微載體在旋轉(zhuǎn)燒瓶中培養(yǎng)五天，通過胰蛋白酶消化收獲，重新接種到靜態(tài)培養(yǎng)物中。
            
 材料和方法   表6.微載體      
            
微載體制備。微載體潤濕-大約1g的每種MGSA和PLGA微載體無菌地懸浮在25ml 70％乙醇中30分鐘來潤濕微載體。通過抽吸除去乙醇，然后用PBS清洗微載體三次，重新懸浮在25ml的Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。
            
 
            
膠原蛋白包被。濕潤的微載體(PBS)通過離心來丸?；?，通過抽吸除去PBS，微載體重新懸浮在2.9％膠原蛋白溶液(Vitrogen 1000，Cohesion，Inc.Palo Alto，CA)中。微載體在膠原蛋白中孵育30分鐘。殘余的膠原蛋白通過抽吸來除去，用PBS洗滌膠原蛋白包被的微粒三次。
            
 表7.使用的微載體數(shù)量。
            
    
            
接種和培養(yǎng)。在實(shí)施例1中使用的材料、細(xì)胞類型、生長培養(yǎng)基、旋轉(zhuǎn)燒瓶、接種和培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基交換、生存力染色和細(xì)胞收獲方法在這個(gè)實(shí)施例中使用。
            
 結(jié)果   表7a.細(xì)胞收獲。
            
    
            
收獲的細(xì)胞重新接種。從包被的和未包被的MGSA和PLGA微載體收獲的細(xì)胞以大約5,000細(xì)胞每平方厘米重新接種到T225中。重新接種后四天，從兩種材料收獲的細(xì)胞增殖到超過50％匯合。
            
 
            
擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTCs)接種到膠原蛋白包被的PLGA和MGSA微載體上，在旋轉(zhuǎn)燒瓶中培養(yǎng)五天，通過胰蛋白酶消化收獲，并重新接種到靜態(tài)培養(yǎng)物中。從合成的微載體收獲的細(xì)胞是超過90％存活的。重新接種的細(xì)胞在靜態(tài)培養(yǎng)中在四天內(nèi)擴(kuò)增，表現(xiàn)了它們的增殖能力的存留。這個(gè)實(shí)施例展現(xiàn)了合成的生物材料用作微載體用于旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)的能力。
            
 實(shí)施例4   在旋轉(zhuǎn)燒瓶中在明膠包被的MGSA微載體上擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTCs)的生長   
            
研究了hUTCs附著到由具有明膠包被的合成可重吸收生物材料制成的微載體的能力，包括在旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)中維持生存力的能力，以及在重新接種到靜態(tài)培養(yǎng)中時(shí)增殖的能力。擴(kuò)增的hUTCs接種到明膠包被的或未包被的聚(單硬脂酰甘油酯共-丁二酸)(MGSA)材料上。商業(yè)上生產(chǎn)的Cytodex  
            
     
            
微載體也在這個(gè)實(shí)例中用作對(duì)照。具有細(xì)胞的微載體在旋轉(zhuǎn)燒瓶中培養(yǎng)五天，通過胰蛋白酶消化收獲，重新接種到靜態(tài)培養(yǎng)物中。
            
 材料和方法   表8.微載體      
            
微載體制備。對(duì)于Cytodex  
            
     
            
微載體制備參見實(shí)施例1。對(duì)于MGSA微載體潤濕和制備參見實(shí)施例2。
            
 
            
明膠包被。PBS中未包被的MGSA被離心，通過抽吸除去PBS，重新懸浮在25ml的2％明膠溶液中。微載體在明膠中孵育30分鐘。通過抽吸除去殘余的明膠溶液，明膠包被的微載體用PBS洗滌三次，重新懸浮在25ml PBS中。
            
 
            
在接種之前一天，775mg的Cytodex  
            
     
            
微載體珠子在40ml PBS中水化至少3小時(shí)并高壓滅菌。接種的當(dāng)天，通過抽吸除去PBS，在接種之前Cytodex  
            
     
            
重新懸浮在生長培養(yǎng)基中至少30分鐘。
            
 表9a.使用的微載體數(shù)量。
            
    
            
接種和培養(yǎng)。在實(shí)施例1中使用的微載體、細(xì)胞類型、生長培養(yǎng)基、旋轉(zhuǎn)燒瓶、接種和培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基交換、生存力染色和細(xì)胞收獲方法在這個(gè)實(shí)施例中使用，除了以下例外。接種物轉(zhuǎn)速/頻率是每30分鐘里30rpm 2分鐘，持續(xù)8小時(shí)。在八小時(shí)時(shí)，培養(yǎng)基體積增加到對(duì)于MGSA的100ml和對(duì)于Cytodex  
            
     
            
的250ml，旋轉(zhuǎn)速度設(shè)置為45rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)，在37℃孵育。
            
 
            
培養(yǎng)基交換。在培養(yǎng)三天后，從攪動(dòng)平板上除下燒瓶，容許微載體沉淀。通過抽吸除去大約一半(50ml和125ml)的培養(yǎng)基體積，替換為等體積的新鮮的生長培養(yǎng)基。
            
 
            
這個(gè)方法被用于MGSA材料，除了以下例外；使用50ml錐形管和10ml胰蛋白酶。
            
 
            
所有收獲的細(xì)胞被離心，重新懸浮在生長培養(yǎng)基中，通過使用Guava PCA儀器來計(jì)數(shù)。
            
 結(jié)果   表9b.細(xì)胞收獲。
            
    
            
收獲的細(xì)胞重新接種。從明膠包被的和未包被的MGSA材料收獲的細(xì)胞以大約5,000細(xì)胞每平方厘米重新接種到T225燒瓶中。重新接種收獲的細(xì)胞后四天，細(xì)胞增殖到超過50％匯合。
            
 
            
擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTCs)接種到具有明膠蛋白質(zhì)包被的MGSA材料上，在旋轉(zhuǎn)燒瓶中培養(yǎng)五天，通過胰蛋白酶消化收獲，并重新接種到靜態(tài)培養(yǎng)物中。從合成的微載體收獲的細(xì)胞是超過80％存活的。重新接種的細(xì)胞在靜態(tài)培養(yǎng)中在四天內(nèi)擴(kuò)增，表現(xiàn)了它們的增殖能力的存留。這個(gè)實(shí)施例展現(xiàn)了明膠包被的合成生物材料用作微載體用于旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)的能力。
            
 實(shí)施例5   基于SoloHill微載體的hUTC培養(yǎng)用于細(xì)胞生產(chǎn)和回收的可行性   
            
擴(kuò)增的hUTCs的生長在SoloHill，Inc.SoloHillEngineering，Inc.(Ann Arbor，MI)生產(chǎn)的微載體上評(píng)估。微載體珠子由SoloHill在它們的目錄中銷售，在此被稱為膠原蛋白包被的(目錄no.C104-1521)、  
            
     
            
II(目錄no.H112-170)和pronectin-包被的(ProNectin F，目錄no.PF104-1521)。
            
 
            
對(duì)于在含血清的培養(yǎng)基中的hUTC生產(chǎn)，評(píng)估了膠原蛋白包被的、pronectin包被的和未包被的  
            
     
            
II微載體的(1)細(xì)胞附著、(2)鋪展、(3)生長、(4)細(xì)胞解離的效率和(5)從微載體的細(xì)胞分離。培養(yǎng)條件與實(shí)驗(yàn)1到5中在接種微載體培養(yǎng)物之前在明膠包被的T-225燒瓶中生長hUTCs所使用的幾乎相同。人工的完整細(xì)胞和細(xì)胞釋放核的計(jì)數(shù)被用于計(jì)算hUTC生長指數(shù)在培養(yǎng)開始時(shí)的細(xì)胞數(shù)量(接種密度(Ni))、在指定時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞收獲(Nh)、以小時(shí)表示的培養(yǎng)時(shí)間(t)、群體倍增水平(PDL)、每24小時(shí)的群體倍增(r)和每次群體倍增的小時(shí)數(shù)(PDT)。
            
 
            
在這些研究中，對(duì)  
            
     
            
II和膠原蛋白包被的微載體的均勻的細(xì)胞附著分別在1小時(shí)和4小時(shí)內(nèi)發(fā)生。Pronectin包被的微載體由于不令人滿意的附著結(jié)果從這個(gè)實(shí)施例中淘汰。類似于在明膠包被的T-225組織培養(yǎng)燒瓶中生長的hUTC，在細(xì)胞附著到  
            
     
            
II和膠原蛋白包被的微載體之后不久發(fā)生鋪展?；贜h和PDT值的生長測(cè)量被用于比較組織培養(yǎng)物和微載體培養(yǎng)物；T-225組織培養(yǎng)燒瓶中的生長的細(xì)胞被用于接種實(shí)驗(yàn)1到5的微載體培養(yǎng)物。對(duì)于T-燒瓶中生長的細(xì)胞，Nh值處在3.5×104/cm2到6.9×104/cm2的范圍內(nèi)，PDT值在26-36的范圍內(nèi)。利用對(duì)微載體培養(yǎng)可行性研究幾乎相同的細(xì)胞培養(yǎng)條件，Nh/PDT范圍基本上相同于T-燒瓶中生長的細(xì)胞。兩個(gè)非正常值看起來與92hr±4時(shí)點(diǎn)相關(guān)，可能表明，細(xì)胞處在穩(wěn)定-死亡期。從  
            
     
            
II和膠原蛋白包被的微載體和T-燒瓶除去細(xì)胞產(chǎn)生了健壯的、單細(xì)胞懸浮液。這些初步的結(jié)果是有前途的，是hUTC的微載體培養(yǎng)規(guī)模擴(kuò)大所需的。從  
            
     
            
II和膠原蛋白包被的微載體分離細(xì)胞產(chǎn)生了72％到146％的回收率。
            
 材料和方法   
            
試劑所有研究   組織培養(yǎng)燒瓶-T-225Corning，lot#13005020   2％豬的明膠-Sigma Corp.   培養(yǎng)基-DMED低葡萄糖，15％FBS，1ppm BME，1％青霉素/鏈霉素   hUTC系Umb 120304 P6   Bellco旋轉(zhuǎn)燒瓶-SoloHill Engineering，Inc.的100到250工作體積的定做(custom)葉輪，Bellco直葉片葉輪。
            
 表10.SoloHill Engineering的微載體     
            
      
            
用于研究的旋轉(zhuǎn)燒瓶體積。如研究1到5中表明的，比例是225cm2/50mls和675cm2/150mls。
            
 
            
縮寫。
            
 Ni＝培養(yǎng)開始時(shí)的細(xì)胞數(shù)量(接種密度)   Nh＝在指定時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞收獲物   t＝以小時(shí)表示的培養(yǎng)時(shí)間   PDL＝群體倍增水平   r＝每24小時(shí)的群體倍增   PDT＝每次群體倍增的小時(shí)數(shù)   微載體初步胰蛋白酶消化方法   
            
燒瓶從孵化器轉(zhuǎn)移到生物學(xué)安全罩，容許  
            
     
            
或膠原蛋白包被的微載體靠重力沉淀。從沉淀的微載體除去培養(yǎng)基。通過以珠子群堆的2×-4×體積的比率向容器添加DPBS徹底地清洗加載了細(xì)胞的微載體，小心不潑灑微載體和逐出細(xì)胞。含有裝載細(xì)胞的微載體的燒瓶然后在40-55rpm、室溫下洗滌15分鐘。除去DPBS，重復(fù)洗滌步驟。在除去DPBS的第二次清洗之后，以微載體群堆的1×-2×體積的比率添加胰蛋白酶(0.05％)。含有裝載細(xì)胞的微載體的燒瓶然后在40rpm-55rpm、室溫下攪動(dòng)15分鐘。利用顯微鏡觀察在50-100ml吸移管中從微載體上除去細(xì)胞。在吸移管中輕輕地上下移動(dòng)微載體來完全地逐出細(xì)胞。容許微載體靠重力沉淀，含有細(xì)胞的上清液通過吸移管收集。
            
 采樣微載體培養(yǎng)物的工藝開發(fā)步驟；采集樣品用于測(cè)試和修改胰蛋白酶消化方案。
            
 
            
培養(yǎng)容器從孵化器轉(zhuǎn)移到生物學(xué)安全罩，將容器置于設(shè)定在60rpm的攪動(dòng)平板上。培養(yǎng)物在攪動(dòng)模式時(shí)，用15mL吸移管獲得10ml整分試樣，吸移管從容器的一個(gè)側(cè)臂延伸到培養(yǎng)物的中心點(diǎn)，并且沒有葉輪組。整分試樣轉(zhuǎn)移到15ml錐形管。(注意對(duì)于細(xì)胞/ml，珠子群堆是從培養(yǎng)物移除的10ml的部分。)。容許微載體靠重力沉淀，通過吸移管除去培養(yǎng)基。裝載細(xì)胞的微載體用5ml的DPBS清洗兩次。在除去DPBS的第二次清洗之后，以微載體群堆的1×-2×體積的比率添加胰蛋白酶(0.05％)，容許沉淀10分鐘。重復(fù)地輕輕地吸移和分配微載體，產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液。容許微載體靠重力沉淀，含有細(xì)胞的上清液通過吸移管收集，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
            
 
            
核釋放方法。用50-60rpm的葉輪旋轉(zhuǎn)采集的1-10ml同質(zhì)的微載體培養(yǎng)物樣品，轉(zhuǎn)移到試管，然后200g離心5分鐘，之后棄去上清液。(注意  
            
     
            
II不需要離心)。團(tuán)化的微載體懸浮在含有0.1％w/v結(jié)晶紫的1ml 0.1M檸檬酸(溶于水中用于低滲效果)中。試管的內(nèi)含物用振動(dòng)混合器混合(1分鐘)，然后在37℃孵育1小時(shí)。試管的內(nèi)含物的蒸發(fā)通過利用濕潤的孵化器或通過用塑料膜密閉試管來避免。在孵育之后，試管的內(nèi)含物用振動(dòng)混合器再次混合，之后用血球計(jì)計(jì)數(shù)釋放的染色的核。樣品中的微載體不會(huì)影響計(jì)數(shù)。樣品可以在4℃保存最長至一周。當(dāng)培養(yǎng)物是均勻地懸浮時(shí)，以及當(dāng)培養(yǎng)條件避免了微載體和細(xì)胞的聚集時(shí)，測(cè)定培養(yǎng)物中細(xì)胞的數(shù)目的這種方法是最精確的。
            
 
            
研究1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是確定在三種類型的SoloHill微載體(  
            
     
            
II(H)、膠原蛋白包被的(c)和Pronectin-包被的(P))之中對(duì)細(xì)胞附著和細(xì)胞的均勻分布的基本培養(yǎng)要求。建立了每組有兩個(gè)旋轉(zhuǎn)燒瓶的三個(gè)微載體組。每個(gè)組中的一個(gè)燒瓶用恒定的攪動(dòng)來起始，每個(gè)組中的第二個(gè)燒瓶用間歇的攪動(dòng)周期(i)來起始。在培養(yǎng)72小時(shí)之后，每個(gè)培養(yǎng)燒瓶的內(nèi)含物準(zhǔn)備用于細(xì)胞核釋放計(jì)數(shù)。
            
 
            
變量   1)微載體。每個(gè)組中  
            
     
            
II(H)、膠原蛋白包被的(C)或Pronectin包被的(PF)。
            
 2)每個(gè)組內(nèi)的攪動(dòng)條件   50-60rpm的恒定攪動(dòng)；或在改變成恒定攪動(dòng)之前50-60rpm攪動(dòng)3分鐘并且停止30分鐘的間歇攪動(dòng)，長達(dá)24小時(shí)。
            
 3)葉輪。定做葉輪用于  
            
     
            
II微載體培養(yǎng)物，Bellco葉輪用于兩個(gè)其他的微載體組。
            
 表11.每225cm2微載體的度量     
            
      
            
開始時(shí)的恒定培養(yǎng)條件   每50ml培養(yǎng)基225cm2總表面積   3.0×106細(xì)胞/225cm2   pH 7.4   37℃/5％CO2   CBAT系列hUTC系120304傳代8   結(jié)果   
            
觀察結(jié)果在恒定攪動(dòng)和間歇的攪動(dòng)/停止周期下，  
            
     
            
II培養(yǎng)物顯示了均勻的細(xì)胞分布和單一的微載體細(xì)胞匯合。在恒定攪動(dòng)下，膠原蛋白包被的微載體培養(yǎng)物顯示了均勻的細(xì)胞分布和單一的微載體細(xì)胞匯合。膠原蛋白包被的微載體間歇周期培養(yǎng)物在前24小時(shí)形成了微載體聚集，圍繞聚集物生長的細(xì)胞顯著地地降低了細(xì)胞計(jì)數(shù)。在兩個(gè)組中，利用這些培養(yǎng)條件，Pronectin包被的微載體培養(yǎng)物是不令人滿意的。
            
 表12.微載體上細(xì)胞附著的結(jié)果     
            
      表13.74小時(shí)后核計(jì)數(shù)的結(jié)果。在培養(yǎng)中(i＝間歇的)     
            
      
            
作為這項(xiàng)研究的結(jié)果，將使用恒定攪動(dòng)起始膠原蛋白包被的和  
            
     
            
II微載體培養(yǎng)。間歇的攪動(dòng)周期不是在含血清培養(yǎng)基中hUTC附著和鋪展所需的。
            
 
            
研究2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。為了確定接種密度對(duì)hUTC生長指數(shù)的影響，開始了每組具有3個(gè)燒瓶的兩個(gè)微載體組。組內(nèi)的3個(gè)燒瓶的每一個(gè)含有不同的接種密度。在培養(yǎng)中第3和4天的一個(gè)時(shí)點(diǎn)，細(xì)胞釋放核計(jì)數(shù)被用作定量分析。
            
 表14.每個(gè)組的hUTC接種密度     
            
      表15.每675cm2的微載體的度量     
            
      
            
開始時(shí)的恒定培養(yǎng)條件   CBAT系列hUTC系120304傳代9   在55-60rpm恒定攪動(dòng)   每150ml Hayflick培養(yǎng)基675cm2(3×225cm2)表面積   37℃/5％CO2   pH 7.4   培養(yǎng)的時(shí)間   用于培養(yǎng)物接種的細(xì)胞懸液庫   在培養(yǎng)中88小時(shí)后細(xì)胞釋放核計(jì)數(shù)和細(xì)胞生長指數(shù)的結(jié)果   表16a.計(jì)數(shù)#1     
            
        
            
      表16b.計(jì)數(shù)#2     
            
      
            
研究3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。這項(xiàng)研究的目的是三個(gè)1)測(cè)定在最長達(dá)96小時(shí)的培養(yǎng)中hUTCs在  
            
     
            
II和膠原蛋白包被的微載體上的生長速度。在指定的時(shí)點(diǎn)，制備實(shí)施例中的燒瓶的內(nèi)含物用于細(xì)胞核釋放(CNR)計(jì)數(shù)。2)測(cè)定胰蛋白酶消化過程在利用74微米篩目從微載體除下單細(xì)胞以及從微載體的細(xì)胞分離的效率。完整的細(xì)胞計(jì)數(shù)被用于測(cè)量結(jié)果。3)比較完整細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞釋放核計(jì)數(shù)的結(jié)果。制備了八個(gè)燒瓶每組四個(gè)(H和C)。在指定的時(shí)點(diǎn)，每個(gè)組中的三個(gè)燒瓶通過CNR分析。每個(gè)組中的一個(gè)燒瓶胰蛋白酶消化，過濾細(xì)胞懸液。
            
 表17.變量     
            
      
            
用于接種燒瓶的細(xì)胞懸液庫   懸浮在具有酚紅的Hayflick培養(yǎng)基中的細(xì)胞   懸浮在沒有酚紅的Hayflick培養(yǎng)基中的細(xì)胞   
            
用于起始的恒定的培養(yǎng)條件   CBAT系列hUTC系120304傳代10   在55-60RPM恒定攪動(dòng)   每50ml完全Hayflick培養(yǎng)基225cm2表面積   37℃/5％CO2   pH 7.4   時(shí)點(diǎn)d2、d3和d4(以起始后的小時(shí)數(shù)表示)   表18.以細(xì)胞釋放核計(jì)數(shù)表示的生長曲線的結(jié)果     
            
      注意不充足的細(xì)胞接種到一個(gè)  
            
     
            
II燒瓶中。在HILLEX  
            
     
            
II組中，第一個(gè)時(shí)點(diǎn)(47小時(shí))未被分析。
            
 表19.以完整細(xì)胞計(jì)數(shù)表示的、培養(yǎng)中73小時(shí)時(shí)T-225cm2細(xì)胞對(duì)照的胰蛋白酶消化的結(jié)果      
            
研究4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。測(cè)定在胰蛋白酶消化加工之后hUTC回收以及從  
            
     
            
II和膠原蛋白包被的微載體的完整細(xì)胞分離的效率。制備了四個(gè)燒瓶每組兩個(gè)燒瓶(H和C)。胰蛋白酶消化的每個(gè)組的一個(gè)燒瓶通過完整細(xì)胞計(jì)數(shù)來分析；每個(gè)組中的第二個(gè)燒瓶通過細(xì)胞核釋放計(jì)數(shù)來分析。
            
 表20.變量     
            
      
            
用于接種燒瓶的細(xì)胞懸液庫   懸浮在具有酚紅的Hayflick培養(yǎng)基中的細(xì)胞   懸浮在沒有酚紅的Hayflick培養(yǎng)基中的細(xì)胞   
            
培養(yǎng)的時(shí)間  
            
     
            
II培養(yǎng)96小時(shí)，膠原蛋白72小時(shí)。
            
 
            
用于起始的恒定的培養(yǎng)條件   CBAT系列hUTC系120304傳代8   每675cm2 9.0×106個(gè)細(xì)胞   在55-60rpm恒定攪動(dòng)   每150mls Hayflick培養(yǎng)基675cm2   37℃/5％CO2   pH 7.4   表21.對(duì)于膠原蛋白在72小時(shí)的完整細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞釋放核計(jì)數(shù)(NRC)的結(jié)果     
            
      表22.從  
            
     
            
II在96小時(shí)的完整細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞釋放核計(jì)數(shù)(NRC)的結(jié)果     
            
      注意在96小時(shí)，根據(jù)高的NRC計(jì)數(shù)所指示的，  
            
     
            
IICBAT培養(yǎng)物是高度匯合的。然而，在胰蛋白酶消化之后，如低的完整細(xì)胞計(jì)數(shù)所表明的，存在的大量粘性材料表明大量死亡的細(xì)胞群體。避開粘性材料的細(xì)胞是具有82％生存力的單細(xì)胞。
            
 
            
研究5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。將評(píng)估CBAT胰蛋白酶消化和從膠原蛋白和  
            
     
            
II微載體的完整細(xì)胞分離的效率。制備八個(gè)培養(yǎng)燒瓶每組四個(gè)相同的燒瓶(H和C)。來自兩個(gè)組的每一個(gè)的一只燒瓶胰蛋白酶消化，細(xì)胞過濾通過74微米篩孔濾器；每個(gè)組的第二個(gè)燒瓶通過細(xì)胞釋放核計(jì)數(shù)來分析。比較完整細(xì)胞計(jì)數(shù)和CRN計(jì)數(shù)的一致性。評(píng)估了兩個(gè)時(shí)點(diǎn)。以更低的接種密度(6.66×103/cm2)接種培養(yǎng)物。
            
 表23.變量     
            
      
            
用于起始的恒定的培養(yǎng)條件   CBAT系列hUTC系120304傳代9   用于接種的細(xì)胞懸液庫   在55-60rpm恒定攪動(dòng)   每50ml具有酚紅的Hayflick培養(yǎng)基225cm2   37℃/5％CO2   pH 7.4   培養(yǎng)的時(shí)間69和92小時(shí)   每225cm2150×104個(gè)細(xì)胞。
            
 表24.在69小時(shí)時(shí)來自膠原蛋白的完整細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞釋放核計(jì)數(shù)(NRC)的結(jié)果     
            
      表25.在69小時(shí)時(shí)來自  
            
     
            
II的完整細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞釋放核計(jì)數(shù)(NRC)的結(jié)果     
            
      注意來自  
            
     
            
II培養(yǎng)物的25ml過濾后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到T-225燒瓶中。這個(gè)培養(yǎng)物代表了所有來自69小時(shí)的  
            
     
            
II培養(yǎng)物的細(xì)胞。次日，細(xì)胞被胰蛋白酶消化和計(jì)數(shù)。假定的是，活細(xì)胞將在復(fù)制之前附著和鋪展，因而，在24小時(shí)拯救的細(xì)胞將與從  
            
     
            
II培養(yǎng)物平板接種的細(xì)胞相等。
            
 表26.用來自  
            
     
            
II培養(yǎng)物的hUTC接種的T-225培養(yǎng)物在24小時(shí)的結(jié)果      表27.在92小時(shí)的完整細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞釋放核計(jì)數(shù)A(NRC)的結(jié)果     
            
      
            
在這些研究中，對(duì)  
            
     
            
II和膠原蛋白包被的微載體的均勻的細(xì)胞附著分別在1小時(shí)和4小時(shí)內(nèi)發(fā)生。Pronectin由于不令人滿意的附著結(jié)果從這個(gè)實(shí)施例中淘汰。類似于在明膠包被的T-225組織培養(yǎng)燒瓶中生長的hUTC，在細(xì)胞附著到  
            
     
            
II和膠原蛋白包被的微載體之后不久發(fā)生鋪展?；贜h和PDT值的生長測(cè)量被用于比較組織培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)；T-225組織培養(yǎng)燒瓶中的細(xì)胞生長被用于接種微載體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)1到5。對(duì)于T-燒瓶中生長的細(xì)胞，Nh值處在3.5×104/cm2到6.9×104/cm2的范圍內(nèi)，PDT值在26-36的范圍內(nèi)。利用與微載體培養(yǎng)可行性研究幾乎相同的細(xì)胞培養(yǎng)條件，Nh/PDT范圍相同于T-燒瓶中生長的細(xì)胞。兩個(gè)非正常值看起來與92hr±4時(shí)點(diǎn)相關(guān)，表明可能細(xì)胞處在穩(wěn)定-死亡期。從  
            
     
            
II，膠原蛋白包被的微載體和T-燒瓶除去細(xì)胞產(chǎn)生了健壯的、單細(xì)胞懸浮液。這些結(jié)果是有前途的，是hUTCs的微載體培養(yǎng)規(guī)模擴(kuò)大所需的。從HILLEX  
            
     
            
II和膠原蛋白包被的微載體分離細(xì)胞產(chǎn)生了72％到146％的回收率。
            
 實(shí)施例6   在Wave生物反應(yīng)器系統(tǒng)中在Cytodex  
            
     
            
微載體上擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTCs)的生長   
            
與無菌地封閉的系統(tǒng)一起使用的微載體可以潛在地生產(chǎn)商業(yè)數(shù)量的擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTCs)。無菌地封閉的系統(tǒng)降低了擴(kuò)增和維持商業(yè)的細(xì)胞產(chǎn)品所需的人員操作，因而降低了操作者誤差、污染和監(jiān)測(cè)。與細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶相比，微載體提供了實(shí)質(zhì)上更大的表面積用于細(xì)胞附著，從而產(chǎn)生更高的細(xì)胞產(chǎn)量。
            
 
            
當(dāng)前的工作提供了用于在無菌地閉合的Wave Biotech，Inc.生物反應(yīng)器系統(tǒng)(Wave Biotech LLC，Somerset，NJ)中在微載體上hUTCs的擴(kuò)增的初始方法。使用以下的方法，hUTCs首先接種到250ml旋轉(zhuǎn)燒瓶系統(tǒng)中Cytodex  
            
     
            
微載體上，培養(yǎng)五天。具有附著的細(xì)胞的微載體然后轉(zhuǎn)移到含有另外的培養(yǎng)基和沒有細(xì)胞的微載體的Wave系統(tǒng)中，培養(yǎng)七天。細(xì)胞從250ml旋轉(zhuǎn)燒瓶到1L Wave系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移或傳代不利用胰蛋白酶來實(shí)現(xiàn)。這消除了來自細(xì)胞擴(kuò)增過程的動(dòng)物來源的產(chǎn)物。hUTCs在Wave系統(tǒng)中在12天中實(shí)現(xiàn)了3.02次群體倍增。在收獲時(shí)，細(xì)胞在采樣的所有微載體上均勻分布。
            
 材料和方法   
            
細(xì)胞。hUTC系120304傳代9   
            
培養(yǎng)基。Dulbecco’s改良的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)-低葡萄糖、15％胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素(P/S)、β巰基乙醇(BME)   250ml旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)   
            
微載體。Cytodex  
            
     
            
(GE Healthcare Life Sciences，cat.no，17-0485)微載體珠子在PBS中水化至少3小時(shí)并高壓滅菌。
            
 
            
旋轉(zhuǎn)燒瓶。具有內(nèi)部懸吊承載葉輪組(Internal OverheadBearing Impeller Assembly)的旋轉(zhuǎn)燒瓶，250ml(Bellco，Inc.)。
            
 
            
接種和培養(yǎng)。大約70％匯合的細(xì)胞通過胰蛋白酶從T225燒瓶收獲，9.0×106細(xì)胞整分試樣添加到含有80mL培養(yǎng)基的250ml葉輪旋轉(zhuǎn)燒瓶中660mg微載體珠子上。在孵育之前燒瓶用5％CO2氣體沖洗1分鐘。接種物轉(zhuǎn)速頻率是每30分鐘里30rpm 2分鐘，持續(xù)8小時(shí)。在八小時(shí)時(shí)，培養(yǎng)基體積增加到250ml，旋轉(zhuǎn)速度設(shè)置為45rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)，在37℃孵育。
            
 Wave生物反應(yīng)器   
            
微載體轉(zhuǎn)移和設(shè)備加載。具有附著的細(xì)胞的微載體從250ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中收獲，重新懸浮在50ml培養(yǎng)基中。這個(gè)溶液添加到含有1L培養(yǎng)基和2.4g水化和高壓滅菌的無細(xì)胞Cytodex  
            
     
            
微載體的2L Wave生物反應(yīng)器袋(cat.no.CELLBAG2L/S-NU)中。Wave袋加載到Wave Biotech 2/10EH系統(tǒng)上。向Wave袋中利用5％CO2空氣通過廠家的規(guī)格來膨脹。系統(tǒng)的加熱板設(shè)置到37℃。
            
 
            
接種階段。2/10EH系統(tǒng)設(shè)置在2°角，6rpm的搖擺速度大約16小時(shí)(過夜)。
            
 
            
擴(kuò)增階段。2/10EH系統(tǒng)設(shè)置在5°角，10rpm的搖擺速度七天。
            
 
            
生存力染色。1ml整分試樣的培養(yǎng)基和微載體轉(zhuǎn)移到15ml錐形管，容許微載體靠重力分離。通過抽吸來除去培養(yǎng)基，替換為1ml活/死染色溶液(Molecular Probes cat.no.L3224)，在37℃孵育15分鐘。在孵育之后，20微升整分試樣的細(xì)胞懸液添加到玻璃顯微鏡載玻片，通過熒光顯微鏡檢查來觀察?；畹募?xì)胞染色為綠色，死的細(xì)胞染色為紅色。人工地分析顯微鏡視野來評(píng)估附著于微載體的活細(xì)胞的分布。評(píng)估至少三個(gè)顯微鏡視野，統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞的近似的百分比。
            
 
            
細(xì)胞收獲。從wave袋收集微載體到四個(gè)250ml錐形管中，在PBS中洗滌三次，合并到一個(gè)250ml錐形管中。微載體在37℃與25ml胰蛋白酶攪動(dòng)孵育10分鐘。試管用PBS達(dá)到200ml體積，容許微載體靠重力沉淀。含有細(xì)胞的上清液通過抽吸來收集，并轉(zhuǎn)移到預(yù)先填充10ml FBS的250ml錐形管中(產(chǎn)生5％FBS溶液來滅活胰蛋白酶)。用所有合并的級(jí)分重復(fù)這個(gè)過程兩次。所有收獲的細(xì)胞被離心，重新懸浮在含有血清的生長培養(yǎng)基中，通過使用Guava PCA儀器來計(jì)數(shù)。
            
 表28.結(jié)果      
            
細(xì)胞從250ml旋轉(zhuǎn)燒瓶到Wave系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移不利用胰蛋白酶來實(shí)現(xiàn)。這消除了來自細(xì)胞擴(kuò)增過程的動(dòng)物來源的產(chǎn)物。hUTC在Wave系統(tǒng)中在12天中實(shí)現(xiàn)了3.02次群體倍增。在收獲時(shí)，細(xì)胞在采樣的所有微載體上均勻分布。這個(gè)方法表現(xiàn)了擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞從Wave Biotech生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)的微載體上接種、擴(kuò)增和收獲的能力。
            
 實(shí)施例7   在三升生物反應(yīng)器系統(tǒng)中在Cytodex  
            
     
            
微載體上擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTC)的生長   
            
與無菌地封閉的系統(tǒng)一起使用的微載體可以潛在地生產(chǎn)商業(yè)數(shù)量的擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTC)。無菌地封閉的系統(tǒng)降低了擴(kuò)增和維持商業(yè)的細(xì)胞產(chǎn)品所需的人員操作，因而降低了操作者誤差、污染和監(jiān)測(cè)。與細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶相比，微載體提供了實(shí)質(zhì)上更大的表面積用于細(xì)胞附著，從而產(chǎn)生更高的細(xì)胞產(chǎn)量。
            
 
            
當(dāng)前的工作提供了在具有葉輪攪動(dòng)的、無菌地閉合的三升生物反應(yīng)器系統(tǒng)中在微載體上hUTCs的擴(kuò)增的初步方法。在這個(gè)系統(tǒng)中hUTCs實(shí)現(xiàn)了2.88次群體倍增。生物反應(yīng)器中隨著時(shí)間的過去的葡萄糖消耗和乳酸鹽生成是代謝活性的細(xì)胞的表現(xiàn)。在收獲時(shí)，存在的細(xì)胞表現(xiàn)為在采樣的微載體上均勻分布。在重新接種到靜態(tài)培養(yǎng)條件下從生物反應(yīng)器收獲的細(xì)胞擴(kuò)增到匯合，表現(xiàn)了細(xì)胞增殖能力的存留。這個(gè)方法表現(xiàn)了擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞從具有葉輪攪動(dòng)的、無菌地閉合的三升生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)的微載體上接種、擴(kuò)增和收獲的能力。
            
 
            
使用這些的方法，hUTCs首先接種到250ml旋轉(zhuǎn)燒瓶系統(tǒng)中Cytodex  
            
     
            
微載體上，培養(yǎng)五天。具有附著的細(xì)胞的微載體然后轉(zhuǎn)移到含有1L培養(yǎng)基和另外的沒有細(xì)胞的微載體的生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，培養(yǎng)七天。在第七天，另外的2L培養(yǎng)基和另外的無細(xì)胞微載體添加到生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，培養(yǎng)十天。
            
 材料和方法   細(xì)胞。hUTC系Umb 120304，傳代9   
            
培養(yǎng)基。Dulbecco′s改良的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)-低葡萄糖、15％胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素(P/S)、β巰基乙醇(BME)   250ml旋轉(zhuǎn)燒瓶   
            
微載體。Cytodex  
            
     
            
(GE Healthcare Life Sciences，cat.no，17-0485)微載體珠子在PBS中水化至少3小時(shí)并高壓滅菌。
            
 
            
旋轉(zhuǎn)燒瓶。具有內(nèi)部懸吊承載葉輪組的旋轉(zhuǎn)燒瓶，250ml(Bellco，Inc.)。
            
 
            
接種和培養(yǎng)。大約70％匯合的細(xì)胞通過胰蛋白酶從T225燒瓶收獲，9.0E+06細(xì)胞整分試樣添加到含有80mL培養(yǎng)基的250ml葉輪旋轉(zhuǎn)燒瓶中660mg微載體珠子上。在孵育之前燒瓶用5％CO2氣體沖洗1分鐘。接種物轉(zhuǎn)速頻率是每30分鐘里30rpm 2分鐘，持續(xù)8小時(shí)。在八小時(shí)時(shí)，培養(yǎng)基體積增加到250ml，旋轉(zhuǎn)速度設(shè)置為45rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)，在37℃孵育。
            
 生物反應(yīng)器   
            
設(shè)備。使用了具有葉輪攪動(dòng)的三升閉合的生物反應(yīng)器系統(tǒng)。系統(tǒng)參數(shù)(pH值、氧張力、溫度、葉輪rpm)用BioStat B-DCU(B.Braun International)控制。
            
 
            
生物反應(yīng)器前收獲。具有附著的細(xì)胞的微載體從250ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中收獲，重新懸浮在30ml培養(yǎng)基中。移出5ml整分試樣的懸浮液(含有大約100mg或1/6的總微載體)。來自這個(gè)整分試樣的細(xì)胞利用以下列出的方法收獲。
            
 
            
微載體轉(zhuǎn)移-250ml到1L。從250ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中收獲的具有附著的細(xì)胞的剩余500mg微載體，重新懸浮在50ml培養(yǎng)基中。這個(gè)溶液添加到含有1L培養(yǎng)基和2.6g水化和高壓滅菌的無細(xì)胞Cytodex  
            
     
            
微載體的2L Wave生物反應(yīng)器袋(cat.no.CELLBAG2L/S-NU)中。Wave袋然后在進(jìn)入口上無菌地熔接到生物反應(yīng)器，內(nèi)含物通過重力導(dǎo)液來轉(zhuǎn)移。然后啟動(dòng)葉輪，維持在45rpm。
            
 
            
微載體轉(zhuǎn)移-1L到3L。上文列出的波浪袋方法利用含有2L培養(yǎng)基和6克空的微載體的wave袋來使用。
            
 
            
采樣。1ml整分試樣的培養(yǎng)基和微載體轉(zhuǎn)移到15ml錐形管，容許微載體靠重力分離。吸出培養(yǎng)基，替換為1ml活/死染色溶液(Molecular Probes cat.no.L3224)，在37℃孵育15分鐘。在孵育之后，20微升整分試樣的細(xì)胞懸液添加到玻璃顯微鏡載玻片，通過熒光顯微鏡檢查來觀察。活的細(xì)胞染色為綠色，死的細(xì)胞染色為紅色。人工地分析顯微鏡視野來評(píng)估附著于微載體的活細(xì)胞的分布。評(píng)估至少三個(gè)顯微鏡視野，統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞的近似的百分比。
            
 
            
葡萄糖分析。培養(yǎng)基的樣品從培養(yǎng)物獲得，分析葡萄糖和乳酸鹽含量。
            
 
            
收獲。5L Labtainer BioProcess容器(Hyclone，cat.no.SH30640.01)無菌熔接到附著于生物反應(yīng)器的出口上。容器置于生物反應(yīng)器下方，內(nèi)含物靠重力導(dǎo)液來轉(zhuǎn)移。容器的內(nèi)含物然后無菌地轉(zhuǎn)移到(3)750cm2滾瓶(Corning LifeSciences，Corning，NY)中。附著細(xì)胞的微載體用PBS洗滌，合并到單個(gè)滾瓶中。微載體在37℃與100ml胰蛋白酶攪動(dòng)孵育10分鐘。試管用PBS達(dá)到1L體積，容許微載體靠重力沉淀。含有細(xì)胞的上清液通過抽吸來收集，并轉(zhuǎn)移到各自預(yù)先填充10ml FBS的四個(gè)250ml錐形管中(產(chǎn)生5％FBS溶液來滅活胰蛋白酶)。所有收獲的細(xì)胞被離心，重新懸浮在含有血清的生長培養(yǎng)基中，通過使用Guava PCA儀器來計(jì)數(shù)細(xì)胞。
            
 結(jié)果   
            
培養(yǎng)基添加。在第15天，由于低的葡萄糖讀數(shù)，500ml的培養(yǎng)基添加給系統(tǒng)。
            
 
            
3L生物反應(yīng)器細(xì)胞動(dòng)力學(xué)。從250ml旋轉(zhuǎn)燒瓶的總微載體體積的1/5的細(xì)胞收獲物計(jì)算接種的細(xì)胞數(shù)量。
            
 表29.250ml前-3L生物反應(yīng)器      
            
觀察和RPM調(diào)整。在第三天在生物反應(yīng)器容器的底部注意到(總體積1L)微載體沉淀。葉輪速度增加到60rpm。在第10天(在總體積調(diào)整到3L后三天)，再次注意到微載體沉淀。葉輪速度再次提高到85rpm。在收獲物的那天(第17天)，在生物反應(yīng)器容器的底部再次注意到微載體沉淀。
            
 
            
收獲的細(xì)胞重新接種。從生物反應(yīng)器收獲的細(xì)胞以5,000細(xì)胞每平方厘米重新接種到T75燒瓶中，擴(kuò)增到匯合，表明了它們的增殖潛力的存留。
            
 
            
細(xì)胞從250ml旋轉(zhuǎn)燒瓶到生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移、以及在第七天從1L到3L的規(guī)模擴(kuò)大不利用胰蛋白酶來實(shí)現(xiàn)。這消除了來自細(xì)胞擴(kuò)增過程的動(dòng)物來源的產(chǎn)物。在這個(gè)系統(tǒng)中hUTC實(shí)現(xiàn)了2.88次群體倍增。生物反應(yīng)器中隨著時(shí)間的葡萄糖消耗和乳酸鹽生成是代謝活性的細(xì)胞的表現(xiàn)。在收獲時(shí)，存在的細(xì)胞表現(xiàn)為在采樣的微載體上均勻分布。在重新接種到靜態(tài)培養(yǎng)條件下從生物反應(yīng)器收獲的細(xì)胞擴(kuò)增到匯合，表現(xiàn)了細(xì)胞增殖能力的存留。這個(gè)方法表現(xiàn)了擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞從具有葉輪攪動(dòng)的、無菌地閉合的三升生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)的微載體上接種、擴(kuò)增和收獲的能力。
            
 實(shí)施例8   在降低的胎牛血清生長培養(yǎng)基中hUTC的擴(kuò)增   
            
這項(xiàng)研究的目標(biāo)是比較在含有15％胎牛血清(FBS)的標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基中、或含有7.5％FBS的降低的血清生長培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTC)的生長動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞表面標(biāo)志物。在降低的血清培養(yǎng)基中hUTC細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)將通過降低動(dòng)物來源的產(chǎn)品的使用來提高產(chǎn)品安全性。降低的血清培養(yǎng)基的使用還降低了生產(chǎn)成本，并降低了在氣體噴射生物反應(yīng)器中的起泡沫可能性。
            
 
            
在標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基中和降低的血清培養(yǎng)基中，hUTC微量培養(yǎng)板形式的增殖分析產(chǎn)生的數(shù)據(jù)表明，hUTC在降低的血清培養(yǎng)基中活躍地增殖。作為這些增殖數(shù)據(jù)的結(jié)果，評(píng)估了組織培養(yǎng)燒瓶條件下多次傳代過程的hUTC的生長動(dòng)力學(xué)和表面蛋白質(zhì)表達(dá)表型。低溫保存的hUTC分離物120304被解凍，用于立即接種含有標(biāo)準(zhǔn)或降低的血清培養(yǎng)基的T75燒瓶，連續(xù)培養(yǎng)多次傳代。從每個(gè)培養(yǎng)基收獲的細(xì)胞的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)通過流式細(xì)胞術(shù)來分析。另外，低溫保存的hUTC分離物120304被解凍，用于立即接種含有Hillex II微載體、含有標(biāo)準(zhǔn)或降低的血清培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)燒瓶，連續(xù)培養(yǎng)多次傳代。
            
 
            
低溫保存的hUTC分離物120304被解凍，在具有降低的血清生長培養(yǎng)基的雙份T75燒瓶中擴(kuò)增十一次傳代。每個(gè)復(fù)本T75燒瓶的每次群體倍增的小時(shí)數(shù)在傳代與傳代之間是一致的，表明了穩(wěn)定的對(duì)數(shù)性生長。每次群體倍增的小時(shí)數(shù)的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)通過單向ANOVA的統(tǒng)計(jì)分析，與標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基對(duì)照相比，對(duì)于所有數(shù)據(jù)點(diǎn)沒有顯示hUTC生長動(dòng)力學(xué)方面的顯著差異(p＝0.821)。在降低的血清培養(yǎng)基中擴(kuò)增的hUTC的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)與在標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基中擴(kuò)增的hUTCs一致。
            
 
            
另外，低溫保存的hUTC分離物120304被解凍，在含有Hillex II微載體的旋轉(zhuǎn)燒瓶中、用降低的血清生長培養(yǎng)基擴(kuò)增三次傳代。每個(gè)旋轉(zhuǎn)燒瓶的每次群體倍增的小時(shí)數(shù)在傳代與傳代之間是一致的，表明了穩(wěn)定的對(duì)數(shù)性生長。每次群體倍增的平均小時(shí)數(shù)的雙樣品t-測(cè)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析顯示了，在兩種測(cè)試的培養(yǎng)基之間的hUTC生長動(dòng)力學(xué)沒有顯著差異。(p＝0.424)。
            
 
            
這些數(shù)據(jù)表明，hUTC利用降低的血清培養(yǎng)基在靜態(tài)T燒瓶中或微載體培養(yǎng)系統(tǒng)中以穩(wěn)定的、一致的方式擴(kuò)增多次傳代、同時(shí)保持表型的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的能力。這項(xiàng)研究的目標(biāo)是比較在含有15％胎牛血清(FBS)的標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基中、和含有7.5％FBS的降低的血清生長培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTC)的生長動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞表面標(biāo)志物。在降低的血清培養(yǎng)基中hUTC細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)將通過降低動(dòng)物來源的產(chǎn)品的使用來提高產(chǎn)品安全性。另外，通過降低材料的消耗和降低噴氣生物反應(yīng)器中培養(yǎng)期間起泡沫的可能性，利用降低的血清培養(yǎng)基將提高生產(chǎn)效率。
            
 
            
在微量培養(yǎng)板形式分析中hUTC的增殖表明了在降低的血清的條件下連續(xù)培養(yǎng)的潛力。這個(gè)分析起初包括以96孔形式在標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)生長培養(yǎng)基中、以及在可選擇的降低的血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中從15％到0％的FBS連續(xù)稀釋。在培養(yǎng)96小時(shí)之后，發(fā)現(xiàn)的是，對(duì)于兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，hUTC增殖在含有15％、7.5％和3.75％FBS的培養(yǎng)基中是最好的。結(jié)果，以24孔形式建立了第二次微量培養(yǎng)板分析，對(duì)于兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型僅使用三種主要的FBS濃度。根據(jù)24孔形式中觀察到的增殖，對(duì)于具有15％FBS的標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基和具有7.5％FBS的可選擇的基礎(chǔ)生長培養(yǎng)基，開始了hUTC生長動(dòng)力學(xué)的比較。
            
 
            
低溫保存的hUTC分離物120304被解凍，用于立即接種含有標(biāo)準(zhǔn)或降低的血清培養(yǎng)基的T75燒瓶，連續(xù)培養(yǎng)多次傳代。從每個(gè)培養(yǎng)基收獲的細(xì)胞的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)通過流式細(xì)胞術(shù)來分析。另外，低溫保存的hUTC分離物120304被解凍，用于立即接種含有HillexII微載體、含有標(biāo)準(zhǔn)或降低的血清培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)燒瓶，連續(xù)培養(yǎng)多次傳代。
            
 材料和方法   
            
細(xì)胞。低溫保存的擴(kuò)增的人類臍帶組織細(xì)胞(hUTC)分離物12034群體倍增(PD)12。
            
 
            
生長培養(yǎng)基(Hayflick)。Dulbecco’s改良的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)-低葡萄糖(Gibco；Grand Island，NY)，15％胎牛血清(FBS)(HyClone；Logan，UT)，青霉素/鏈霉素(P/S)(Gibco；Grand Island，NY)，β巰基乙醇(BME)(Sigma；St.Louis，MO)。
            
 
            
降低的血清培養(yǎng)基(Adv.DMEM/F12)。改進(jìn)的DMEM/F12(Gibco；Grand Island，NY)，7.5％胎牛血清(FBS)，青霉素/鏈霉素(P/S)，4.0mM GlutaMAX(Gibco；Grand Island，NY)   
            
多孔微量培養(yǎng)板。包被有明膠(Sigma；St.Louis，MO)的組織培養(yǎng)96孔和24孔微量培養(yǎng)板(Corning，Inc.；Corning，NY)   
            
組織培養(yǎng)燒瓶。包被有明膠的T75燒瓶(Corning Inc.；Corning，NY)。
            
 
            
微載體。Hillex II微載體(Solo Hill；Ann Arbor，MI)在DI水中水化至少30分鐘并高壓滅菌。Hillex II微載體以12g/L的濃度使用。
            
 
            
旋轉(zhuǎn)燒瓶。100ml和500ml單一用途、一次性的旋轉(zhuǎn)燒瓶(Corning，Inc.；Corning，NY)用作培養(yǎng)容器。
            
 
            
在96孔微量培養(yǎng)板中的接種和培養(yǎng)。低溫保存的hUTC小瓶被解凍，洗滌并重懸浮在生長培養(yǎng)基中。利用Hayflick和Adv.DMEM/F12制備生長培養(yǎng)基，其補(bǔ)充有15％、7.5％、3.75％、1.88％、0.94％或0％FBS。5.00×103hUTC每孔添加到每種條件的兩個(gè)孔中。每個(gè)孔含有250μl生長培養(yǎng)基。平板在5％CO2、37℃組織培養(yǎng)孵化器中培養(yǎng)96小時(shí)。
            
 
            
來自96孔微量培養(yǎng)板的細(xì)胞的收獲和計(jì)數(shù)。含有細(xì)胞的96孔微量培養(yǎng)板從孵育中取出，通過無菌的抽吸除去培養(yǎng)基。細(xì)胞用100μl PBS每孔來洗滌；通過無菌抽吸除去PBS，添加75μl TrypLESelect(Gibco；Grand Island，NY)。細(xì)胞在37℃孵育5分鐘，之后，輕輕地敲打平板來移去細(xì)胞。向每個(gè)孔添加75μl的合適的培養(yǎng)基。向每個(gè)孔添加50μl的計(jì)數(shù)試劑。計(jì)數(shù)試劑是合適的生長培養(yǎng)基+2％Guava ViaCount Flex(Guava Technologies；Hayward，CA)+2％二甲亞砜(Guava Technologies；Hayward，CA)的溶液。產(chǎn)生的細(xì)胞懸液無菌地轉(zhuǎn)移到超低簇96孔微量培養(yǎng)板中用于在Guava EasyCyte儀器(Guava Technologies；Hayward，CA)中計(jì)數(shù)。
            
 
            
在24孔微量培養(yǎng)板中的接種和培養(yǎng)。低溫保存的hUTC小瓶被解凍，洗滌并重懸浮在生長培養(yǎng)基中。利用Hayflick和Adv.DMEM/F12制備生長培養(yǎng)基，其補(bǔ)充有15％、7.5％和3.75％。1.00E+04hUTC每孔添加到每種條件的四個(gè)孔。每個(gè)孔含有1ml生長培養(yǎng)基。平板在5％CO2、37℃組織培養(yǎng)孵化器中培養(yǎng)96小時(shí)。
            
 
            
來自24孔微量培養(yǎng)板的細(xì)胞的收獲和計(jì)數(shù)。含有細(xì)胞的24孔微量培養(yǎng)板從孵育中取出，通過無菌的抽吸除去培養(yǎng)基。用1mlPBS每孔來洗滌細(xì)胞；通過無菌抽吸來除去PBS，添加500μl TrypLESelect。細(xì)胞在37℃孵育5分鐘，之后，輕輕地敲打平板來移去細(xì)胞。細(xì)胞懸液吸移幾次，然后轉(zhuǎn)移到含有500μl Guava ViaCount試劑(Guava Technologies，Haywood，CA)的1.5mL Eppendporf試管用于在Guava PCA儀器(Guava Technologies，Haywood，CA)中計(jì)數(shù)。
            
 
            
在T75燒瓶中的接種和培養(yǎng)。低溫保存的hUTC的小瓶被解凍，洗滌并重懸浮在生長培養(yǎng)基中。3.75E+05hUTC添加到含有15ml培養(yǎng)基的T75燒瓶中。燒瓶在5％CO2、37℃組織培養(yǎng)孵化器中培養(yǎng)三到四天。
            
 
            
來自T75燒瓶的細(xì)胞的收獲和傳代。含有細(xì)胞的T75燒瓶從孵育中取出，通過無菌的抽吸除去培養(yǎng)基。細(xì)胞用5mLPBS洗滌；通過無菌抽吸除去PBS并替換為1ml TrypLE Select。細(xì)胞在37℃孵育5分鐘，之后，輕輕地敲打燒瓶來移去粘附的細(xì)胞。5ml的培養(yǎng)基添加給每個(gè)燒瓶，細(xì)胞懸液通過吸移管轉(zhuǎn)移到錐形管中。細(xì)胞在300rcf離心5分鐘，倒出上清液，細(xì)胞重懸浮在生長培養(yǎng)基中，為細(xì)胞計(jì)數(shù)獲取整分試樣。在計(jì)數(shù)之后，獲得了被計(jì)算含有3.75E+05細(xì)胞的整分試樣，被用于接種含有新鮮培養(yǎng)基的新的T75燒瓶。
            
 
            
在100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中的接種和培養(yǎng)。低溫保存的hUTC小瓶被解凍，洗滌并重懸浮在生長培養(yǎng)基中。3.1E+06hUTC添加到含有100ml培養(yǎng)基的100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中的1.2g的Hillex II(5.0×103個(gè)細(xì)胞每cm2)，并置于設(shè)置到60rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)盤上。旋轉(zhuǎn)盤上的旋轉(zhuǎn)燒瓶置于5％CO2、37℃組織培養(yǎng)孵化器中，孵育三到四天。
            
 
            
100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)物向500旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)物的傳代。100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶從它的旋轉(zhuǎn)盤上取下，容許微載體沉淀。上清液培養(yǎng)基通過抽吸來除去，其余的具有粘附細(xì)胞的微載體堆重懸浮在20ml新鮮的生長培養(yǎng)基中。具有粘附細(xì)胞的微載體然后通過吸移管無菌地轉(zhuǎn)移到含有480ml新鮮生長培養(yǎng)基和4.8g Hillex II微載體(6g最終的微載體內(nèi)含物或12g/L的最終微載體濃度)的500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中。旋轉(zhuǎn)燒瓶然后置于設(shè)置到60rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)盤上。旋轉(zhuǎn)盤上的旋轉(zhuǎn)燒瓶置于5％CO2、37℃組織培養(yǎng)孵化器中，孵育三到四天。
            
 
            
一個(gè)500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)物向五個(gè)500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)物的傳代。500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶從它的旋轉(zhuǎn)盤上取下，容許微載體沉淀。上清液培養(yǎng)基通過抽吸來除去，其余的具有粘附細(xì)胞的微載體堆重懸浮在50ml新鮮的生長培養(yǎng)基中。具有粘附細(xì)胞的10ml整分試樣的微載體然后通過吸移管無菌地轉(zhuǎn)移到每個(gè)含有490ml新鮮生長培養(yǎng)基和4.8g Hillex II微載體(6g最終的微載體內(nèi)含物或12g/L的最終微載體濃度)的五個(gè)獨(dú)立的500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中。旋轉(zhuǎn)燒瓶然后置于設(shè)置到60rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)盤上。旋轉(zhuǎn)盤上的旋轉(zhuǎn)燒瓶置于5％CO2、37℃組織培養(yǎng)孵化器中，孵育三到四天。
            
 
            
附著到Hillex II微載體的細(xì)胞的收獲。旋轉(zhuǎn)燒瓶從它的旋轉(zhuǎn)盤上取下，容許具有粘附的細(xì)胞的微載體靠重力沉淀。上清液培養(yǎng)基無菌地吸出。等于旋轉(zhuǎn)燒瓶的工作體積的體積的PBS添加到旋轉(zhuǎn)燒瓶中，容許微載體靠重力沉淀。在微載體的沉淀時(shí)，無菌地吸出PBS，等于工作體積的1/5體積的TrypLE Select添加到旋轉(zhuǎn)燒瓶中。旋轉(zhuǎn)燒瓶然后在旋轉(zhuǎn)盤上以60rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)孵育10分鐘。從它的旋轉(zhuǎn)盤上取下旋轉(zhuǎn)燒瓶，容許微載體靠重力沉淀。利用25ml的血清吸移管，微載體/TrypLE Select溶液通過上下地吸移～10次來從微載體上離解殘余的粘附細(xì)胞。含有細(xì)胞的上清液通過重復(fù)地吸移來收集并轉(zhuǎn)移到填充有100μm細(xì)胞滲濾器的多個(gè)錐形管。在收集細(xì)胞懸液之前用5mlPBS填充試管。在收集細(xì)胞懸液之后，試管以300rcf離心5分鐘，倒出上清液，細(xì)胞重懸浮在生長培養(yǎng)基中。
            
 
            
生存力染色。1ml整分試樣的培養(yǎng)基和微載體轉(zhuǎn)移到15ml錐形管，容許微載體靠重力沉淀。通過無菌抽吸來除去培養(yǎng)基，替換為1ml活/死染色溶液(Molecular Probes cat.no.L3224；Carlsbad，CA)在37℃孵育15分鐘。在孵育之后，20μl整分試樣施加到玻璃顯微鏡載玻片上，通過熒光顯微鏡檢查來觀察活細(xì)胞染色為綠色，非活細(xì)胞染色為紅色。人工地分析顯微鏡視野來評(píng)估附著于微載體的活細(xì)胞的分布。評(píng)估至少三個(gè)顯微鏡視野，統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞的近似的百分比。
            
 
            
培養(yǎng)物細(xì)胞計(jì)數(shù)-TrypLE Select分析。5ml(100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶)或10ml(500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶)整分試樣的同質(zhì)的微載體懸浮液從旋轉(zhuǎn)燒瓶容器中獲取，轉(zhuǎn)移到15ml試管。容許微載體重力分離，通過無菌抽吸除去上清液培養(yǎng)基。微載體用10ml PBS洗滌一次，容許微載體重力分離，通過無菌抽吸除去PBS上清液。微載體在TrypLESelect中在37℃孵育十分鐘。在孵育之后，添加5ml的PBS，容許微載體重力分離。含有細(xì)胞的上清液通過重復(fù)吸移來收集，轉(zhuǎn)移到預(yù)先用1ml FBS加載的多個(gè)錐形管中。試管以300rcf離心5分鐘，倒出上清液，細(xì)胞重懸浮在生長培養(yǎng)基中，整分試樣用于利用Guava PCA儀器(Guava Technologies，Haywood，CA)測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)。
            
 
            
流式細(xì)胞術(shù)。使用US2004877012A中聲明的方法，利用Becton-Dickinson FACSCalibur儀器(Becton Dickinson，San Jose，CA)通過流式細(xì)胞術(shù)分析收獲的hUTC來確定細(xì)胞表面標(biāo)志物分布。所有抗體購自BD PharMingen(San Diego，CA)。
            
 結(jié)果   表30.在96孔微量培養(yǎng)板形式增殖分析中來自hUTC分離物120304的每個(gè)孔的平均細(xì)胞。使用的培養(yǎng)基是具有連續(xù)稀釋的FBS的Hayflick和具有連續(xù)稀釋的FBS的改進(jìn)的DMEM/F 12+4.00mMGlutaMAX。
            
   
            
      表31.在24孔微量培養(yǎng)板形式增殖分析中來自hUTC分離物120304的每個(gè)孔的平均細(xì)胞。使用的培養(yǎng)基是具有3.75％，7.5％或15％的FBS的Hayflick或改進(jìn)的DMEM/F12+4.00mM GlutaMAX。
            
   
            
      表32.在改進(jìn)的DMEM/F12+4.0mM GlutaMAX+7.5％FBS中在T75(燒瓶1)上hUTC分離物120304的連續(xù)培養(yǎng)。
            
 改進(jìn)的DMEM/F12+4.00mM GlutaMAX+7.5％FBS-燒瓶1      表33.在改進(jìn)的DMEM/F12+4.0mM GlutaMAX+7.5％FBS中在T75(燒瓶2)上hUTC分離物120304的連續(xù)培養(yǎng)。
            
 改進(jìn)的DMEM/F12+4.00mM GlutaMAX+7.5％FBS-燒瓶2      表34.在改進(jìn)的DMEM/F12+4.0mM GlutaMAX+7.5％FBS中在T75(燒瓶3)上hUTC分離物120304的連續(xù)培養(yǎng)。
            
 改進(jìn)的DMEM/F12+4.00mM GlutaMAX+7.5％FBS-燒瓶3      表35.在生長培養(yǎng)基中在T75(燒瓶1)上hUTC分離物120304的連續(xù)培養(yǎng)   生長培養(yǎng)基-燒瓶1      表36.在生長培養(yǎng)基中在T75(燒瓶2)上hUTC分離物120304的連續(xù)培養(yǎng)   生長培養(yǎng)基-燒瓶2      表37.在生長培養(yǎng)基中在T75(燒瓶2)上hUTC分離物120304的連續(xù)培養(yǎng)   生長培養(yǎng)基-燒瓶3      表38.在改進(jìn)的DMEM/F12+4.0mM GlutaMAX+7.5％FBS中在旋轉(zhuǎn)燒瓶中hUTC分離物120304的連續(xù)培養(yǎng)   在旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)中的改進(jìn)的DMEM/F12+4.00mM GlutaMAX+7.5％FBS      表39.在生長培養(yǎng)基中在旋轉(zhuǎn)燒瓶中hUTC分離物120304的連續(xù)培養(yǎng)   在旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)中的生長培養(yǎng)基      表40.在改進(jìn)的DMEM/F 12+4.0mM GlutaMAX+7.5％FBS或生長培養(yǎng)基中擴(kuò)增的hUTC的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的比較。
            
    
            
低溫保存的hUTC分離物120304被解凍，在具有降低的血清生長培養(yǎng)基的雙份T75燒瓶中擴(kuò)增十一次傳代。每個(gè)復(fù)本T75燒瓶的每次群體倍增的小時(shí)數(shù)在傳代與傳代之間是一致的，表明了穩(wěn)定的對(duì)數(shù)性生長。每次群體倍增的小時(shí)數(shù)的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)通過單向ANOA的統(tǒng)計(jì)分析對(duì)于所有數(shù)據(jù)點(diǎn)沒有顯示hUTC生長動(dòng)力學(xué)方面的顯著差異(p＝0.821)。在降低的血清培養(yǎng)基中擴(kuò)增的hUTC的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)與在標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基中擴(kuò)增的hUTCs一致。
            
 
            
同樣，低溫保存的hUTC分離物120304被解凍，在具有降低的血清生長培養(yǎng)基、含有Hillex II微載體的旋轉(zhuǎn)燒瓶中擴(kuò)增三次傳代。每個(gè)旋轉(zhuǎn)燒瓶的每次群體倍增的小時(shí)數(shù)在傳代與傳代之間是一致的，表明了穩(wěn)定的對(duì)數(shù)性生長。每次群體倍增的平均小時(shí)數(shù)的雙樣品t-測(cè)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析顯示了在兩種測(cè)試的培養(yǎng)基之間的hUTC生長動(dòng)力學(xué)沒有顯著差異(p＝0.424)。
            
 
            
該數(shù)據(jù)表明，hUTC利用降低的血清培養(yǎng)基在靜態(tài)T燒瓶中或微載體培養(yǎng)系統(tǒng)中以穩(wěn)定的、一致的方式擴(kuò)增多次傳代，并保持它的表型細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的能力。
            
 實(shí)施例9   在3L生物反應(yīng)器中Hillex II微載體上hUTC的擴(kuò)增   
            
這項(xiàng)研究的目標(biāo)是在小試規(guī)模(bench scale)生物反應(yīng)器中擴(kuò)增附著到Hillex II微載體的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTC)多次群體倍增。在小試規(guī)模生物反應(yīng)器中在Hillex II上擴(kuò)增hUTC多次群體倍增的能力將提供模型的生物處理系統(tǒng)，來擴(kuò)大到用于細(xì)胞治療應(yīng)用的hUTC的大規(guī)模生產(chǎn)。在500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中在Hillex II微載體上擴(kuò)增到大約70％匯合的hUTC分離物CNTO 2476被用于接種含有另外的培養(yǎng)基和Hillex II微載體的3L生物反應(yīng)器。細(xì)胞在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)五天，采集整分試樣來計(jì)算運(yùn)行中期細(xì)胞計(jì)數(shù)。
            
 
            
hUTC在五天內(nèi)實(shí)現(xiàn)了大約六次群體倍增。每次群體倍增的小時(shí)數(shù)是穩(wěn)定的對(duì)數(shù)生長的指示。通過CO2空氣覆蓋而不用鼓泡，系統(tǒng)的pH值被成功地維持在7.0。通過氧氣空氣覆蓋而不用鼓泡，系統(tǒng)的DO被成功地維持在40％。
            
 
            
這個(gè)數(shù)據(jù)展現(xiàn)了hUTC在小試規(guī)模生物反應(yīng)器中在Hillex II上擴(kuò)增的能力。這個(gè)模型的生物加工系統(tǒng)可以被擴(kuò)大，用于細(xì)胞治療應(yīng)用的hUTC的大規(guī)模生產(chǎn)。
            
 
            
這項(xiàng)研究的目標(biāo)是在小試規(guī)模生物反應(yīng)器中擴(kuò)增附著到Hillex II微載體的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTC)多次群體倍增。在小試規(guī)模生物反應(yīng)器中在Hillex II上擴(kuò)增hUTC多次群體倍增的能力將提供模型的生物處理系統(tǒng)，來擴(kuò)大到用于細(xì)胞治療應(yīng)用的hUTC的大規(guī)模生產(chǎn)。在500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中在Hillex II微載體上擴(kuò)增到大約70％匯合的hUTC分離物CNTO 2476被用于接種含有另外的培養(yǎng)基和Hillex II微載體的3L生物反應(yīng)器。細(xì)胞在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)五天，采集整分試樣來計(jì)算運(yùn)行中期細(xì)胞計(jì)數(shù)。
            
 材料和方法   
            
細(xì)胞。使用了低溫保存的擴(kuò)增的人類臍帶組織細(xì)胞(hUTC)分離物CNTO 2476 lot 25126078 PD 7。
            
 
            
生長培養(yǎng)基。Dulbecco′s改良的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)-低葡萄糖沒有酚紅(Gibco-Grand Island，NY)，15％胎牛血清(FBS)(HyClone-Logan，UT)，4.0mM GlutaMAX(Gibco-Grand Island，NY)。
            
 
            
收獲試劑。1x TrypLE Select(Gibco-Grand Island，NY)，10x TrypLE Select(Gibco-Grand Island，NY)。
            
 
            
微載體。Hillex II(SoloHill Inc.-Ann Arbor，MI)微載體在DI水中水化至少30分鐘并高壓滅菌。Hillex II微載體以12g/L的濃度使用。
            
 
            
生物反應(yīng)器。具有B-DCU控制器(Sartorius BBI，Bethlehem，PA)的3L夾套生物反應(yīng)器(Applikon，Inc.，F(xiàn)osterCity，CA)。
            
 
            
生物反應(yīng)器接種。從500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶產(chǎn)生的、具有大約70％匯合的附著細(xì)胞的6g微載體無菌地轉(zhuǎn)移到含有30g Hillex II和大約2L生長培養(yǎng)基的3L生物反應(yīng)器中。然后添加其他生長培養(yǎng)基得到最終體積3L。
            
 
            
生物反應(yīng)器設(shè)置。生物反應(yīng)器葉輪被設(shè)置為85-100PRM。pH設(shè)置點(diǎn)是7.0，用CO2添加來控制。溶解氧(DO)被容許從100％降到40％DO設(shè)置點(diǎn)，通過氧添加來維持?？諝飧采w被設(shè)置為50ccm，不使用鼓泡。
            
 
            
附著到Hillex II微載體的細(xì)胞的收獲。生物反應(yīng)器葉輪被關(guān)閉，容許具有粘附細(xì)胞的微載體靠重力沉淀。培養(yǎng)基上清液通過位于沉淀的微載體上方的滴管來泵出。將3L PBS泵入生物反應(yīng)器中，容許微載體靠重力沉淀。PBS上清液通過位于沉淀的微載體上方的滴管來泵出。然后將500ml的1×TrypLE select和50ml的10×TrypLEselect泵入生物反應(yīng)器。打開生物反應(yīng)器葉輪65rpm 10分鐘。葉輪被關(guān)閉，容許微載體靠重力沉淀。含有細(xì)胞的上清液通過位于沉淀的微載體上的滴管泵出到用少量FBS預(yù)先加載的轉(zhuǎn)移容器。然后將1L PBS泵入生物反應(yīng)器來重懸浮任何剩余的細(xì)胞。含有細(xì)胞的上清液通過位于沉淀的微載體上的滴管泵出到用FBS預(yù)先加載的轉(zhuǎn)移容器。所有的含細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移到多個(gè)500ml錐形管中。試管以300rcf離心5分鐘，倒出上清液，細(xì)胞重懸浮在生長培養(yǎng)基中，為細(xì)胞計(jì)數(shù)獲取整分試樣。
            
 
            
培養(yǎng)中細(xì)胞計(jì)數(shù)-TrypLE分析。5ml(100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶)或10ml(500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶)整分試樣的同質(zhì)的微載體懸浮液從旋轉(zhuǎn)燒瓶容器中獲取，轉(zhuǎn)移到15ml試管。容許微載體重力分離，通過抽吸除去上清液。微載體用10ml PBS洗滌一次，容許微載體重力分離，通過抽吸除去PBS上清液。微載體在TrypLE Select中在37℃孵育十分鐘。在孵育之后，添加5ml的PBS，容許微載體重力分離。含有細(xì)胞的上清液通過重復(fù)吸移來收集，轉(zhuǎn)移到預(yù)先用1ml FBS加載的多個(gè)錐形管中。試管以300rcf離心5分鐘，倒出上清液，細(xì)胞重懸浮在生長培養(yǎng)基中，使用整分試樣確定細(xì)胞計(jì)數(shù)。
            
 結(jié)果   表41.hUTC分離物CNTO 2476在Hillex II微載體上的連續(xù)培養(yǎng)。
            
 在Hillex II上的CNTO 2476      
            
以70％匯合附著到6g的Hillex II上的hUTC分離物CNTO 2476被用于接種3L生物反應(yīng)器。通過CO2空氣覆蓋而不用鼓泡，系統(tǒng)的pH值被成功地維持在7.0。通過氧氣空氣覆蓋而不用鼓泡，系統(tǒng)的DO被成功地維持在40％。hUTC在五天內(nèi)實(shí)現(xiàn)了大約六次群體倍增。每次群體倍增的小時(shí)數(shù)是穩(wěn)定的對(duì)數(shù)生長的指示。這個(gè)數(shù)據(jù)展現(xiàn)了hUTC在小試規(guī)模生物反應(yīng)器中在Hillex II上擴(kuò)增的能力。這個(gè)模型的生物加工系統(tǒng)可以被擴(kuò)大，用于細(xì)胞治療應(yīng)用的hUTC的大規(guī)模生產(chǎn)。
            
 實(shí)施例10   hUTC以12-24克/升濃度在Hillex II微載體上的擴(kuò)增   
            
這項(xiàng)研究的目標(biāo)是在旋轉(zhuǎn)燒瓶中在多種微載體濃度下連續(xù)地培養(yǎng)附著到Hillex II微載體的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTC)。在各種的微載體濃度的微載體上擴(kuò)增hUTC的能力將提供用于細(xì)胞治療應(yīng)用的hUTC的大規(guī)模生產(chǎn)的更大的靈活性和選擇。低溫保存的hUTC分離物120304被解凍，立即用于接種含有濃度為12、16、20或24g/L Hillex II微載體的旋轉(zhuǎn)燒瓶，連續(xù)培養(yǎng)多次傳代。
            
 
            
群體倍增12.8時(shí)低溫保存的hUTC分離物120304能夠被解凍，在Hillex II微載體上擴(kuò)增七次傳代。每種微載體濃度的每次群體倍增的小時(shí)數(shù)在傳代與傳代之間是一致的，表明了穩(wěn)定的對(duì)數(shù)性生長。每次群體倍增的小時(shí)數(shù)的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)通過單向ANOA的統(tǒng)計(jì)分析對(duì)于所有測(cè)試的條件沒有顯示hUTC生長動(dòng)力學(xué)方面的顯著差異(p＝0.277)。這個(gè)數(shù)據(jù)表明了hUTC以穩(wěn)定的、一致的方式在微載體上擴(kuò)增七次傳代的能力。
            
 
            
這項(xiàng)研究的目標(biāo)是在旋轉(zhuǎn)燒瓶中在多種微載體濃度下連續(xù)地培養(yǎng)附著到Hillex II微載體的擴(kuò)增的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTC)。在各種的微載體濃度的微載體上擴(kuò)增hUTC的能力將提供用于細(xì)胞治療應(yīng)用的hUTC的大規(guī)模生產(chǎn)的更大的靈活性和選擇。低溫保存的hUTC分離物120304被解凍，立即用于接種含有濃度為12、16、20或24g/L Hillex II微載體的旋轉(zhuǎn)燒瓶，連續(xù)培養(yǎng)多次傳代。
            
 材料和方法   
            
細(xì)胞。低溫保存的擴(kuò)增的人類臍帶組織細(xì)胞(hUTC)分離物12034群體倍增(PD)12。
            
 
            
生長培養(yǎng)基。Dulbecco’s改良的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)-低葡萄糖(Gibco-Grand Island，NY)，15％胎牛血清(FBS)(HyClone-Logan UT)，青霉素/鏈霉素(P/S)(Gibco-Grand Island，NY)，β巰基乙醇(BME)(Sigma-St.Louis，MO)。
            
 
            
微載體。Hillex II微載體在DI水中水化至少30分鐘，高壓滅菌。Hillex II微載體以12、16、20和24g/L的濃度使用。(1gHillex II＝515cm2表面積)。
            
 
            
旋轉(zhuǎn)燒瓶。使用100ml和500ml單一用途、一次性的旋轉(zhuǎn)燒瓶(Corning，Inc.；Corning，NY)。
            
 
            
在100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中的接種和培養(yǎng)。100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶用100ml生長培養(yǎng)基和合適濃度的微載體加載，來實(shí)現(xiàn)每升12、16、20或24克Hillex II。低溫保存的hUTC小瓶被解凍，洗滌并重懸浮在生長培養(yǎng)基中。合適數(shù)量的細(xì)胞添加到每個(gè)100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中來實(shí)現(xiàn)5.0×103個(gè)細(xì)胞每cm2。加載細(xì)胞的旋轉(zhuǎn)燒瓶置于設(shè)置到60rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)盤上。旋轉(zhuǎn)盤置于5％CO2、37℃組織培養(yǎng)孵化器中，孵育三到四天。
            
 
            
從一個(gè)100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶到一個(gè)500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶的培養(yǎng)物的傳代。從旋轉(zhuǎn)盤上取下100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶，容許微載體沉淀。培養(yǎng)基上清液通過抽吸除去。具有粘附細(xì)胞的剩余的微載體堆重懸浮在20ml新鮮的生長培養(yǎng)基中。具有粘附細(xì)胞的微載體然后通過吸移管無菌地轉(zhuǎn)移到含有480ml新鮮生長培養(yǎng)基和4.8g Hillex II微載體(6g最終的微載體含量)或1.2g Cytodex 1(1.5g的最終微載體含量)的一個(gè)500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中。旋轉(zhuǎn)燒瓶然后置于設(shè)置到60rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)盤上。旋轉(zhuǎn)盤置于5％CO2、37℃組織培養(yǎng)孵化器中，孵育三到四天。
            
 
            
從一個(gè)100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶到一個(gè)100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶的培養(yǎng)物的傳代。從旋轉(zhuǎn)盤上取下100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶，容許微載體沉淀。培養(yǎng)基上清液通過抽吸除去。具有粘附細(xì)胞的剩余的微載體堆重懸浮在50ml新鮮的生長培養(yǎng)基中。具有粘附細(xì)胞的微載體的10ml整分試樣然后通過吸移管無菌地轉(zhuǎn)移到獨(dú)立的100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中，所述旋轉(zhuǎn)燒瓶各自含有90ml新鮮的生長培養(yǎng)基和0.96g Hillex II(1.2g最終的微載體含量)。旋轉(zhuǎn)燒瓶然后置于設(shè)置到60rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)盤上。旋轉(zhuǎn)盤置于5％CO2、37℃組織培養(yǎng)孵化器中，孵育三到四天。
            
 
            
附著到Hillex II微載體的細(xì)胞的收獲。從旋轉(zhuǎn)盤上取下旋轉(zhuǎn)燒瓶，容許具有粘附細(xì)胞的微載體靠重力沉淀。培養(yǎng)基上清液通過抽吸除去。等于旋轉(zhuǎn)燒瓶的工作體積的體積的PBS添加到旋轉(zhuǎn)燒瓶中，容許微載體靠重力沉淀。等于工作體積的1/5的體積的TrypLEselect體積添加到旋轉(zhuǎn)燒瓶中。旋轉(zhuǎn)燒瓶然后在旋轉(zhuǎn)盤上在60rpm孵育10分鐘。從旋轉(zhuǎn)盤上取下旋轉(zhuǎn)燒瓶，容許微載體靠重力沉淀。利用25ml的血清吸移管，微載體-TrypLE Select溶液通過上下地吸移～10次來攪拌，以從微載體上離解殘余的粘附細(xì)胞。含有細(xì)胞的上清液通過重復(fù)地吸移來收集，轉(zhuǎn)移到用5ml FBS預(yù)先加載的多個(gè)錐形管中，在試管開口處插入100μm過濾單元。試管在300rcf離心5分鐘，倒出上清液，細(xì)胞重懸浮在生長培養(yǎng)基中。
            
 
            
生存力染色。1ml整分試樣的培養(yǎng)基和微載體轉(zhuǎn)移到15ml錐形管，容許微載體靠重力分離。通過抽吸來除去培養(yǎng)基，替換為1ml活/死染色溶液(Molecular Probes cat.no.L3224)，在37℃孵育15分鐘。在孵育之后，20μl整分試樣添加到玻璃顯微鏡載玻片，通過熒光顯微鏡檢查來觀察?；畹募?xì)胞染色為綠色。人工地分析顯微鏡視野來評(píng)估附著于微載體的活細(xì)胞的分布。評(píng)估至少三個(gè)顯微鏡視野，統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞的近似的百分比。
            
 
            
培養(yǎng)中細(xì)胞計(jì)數(shù)-TrypLE分析。5ml(100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶)或10ml(500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶)整分試樣的同質(zhì)的微載體懸浮液從旋轉(zhuǎn)燒瓶容器中獲取，轉(zhuǎn)移到15ml試管。容許微載體重力分離，通過抽吸除去上清液。微載體用10ml PBS洗滌一次，容許微載體重力分離，通過抽吸除去PBS上清液。微載體在TrypLE Select中在37℃孵育十分鐘。在孵育之后，添加5ml的PBS，容許微載體重力分離。含有細(xì)胞的上清液通過重復(fù)吸移來收集，轉(zhuǎn)移到預(yù)先用1ml FBS加載的多個(gè)錐形管中。試管在300rcf離心5分鐘，倒出上清液，細(xì)胞重懸浮在生長培養(yǎng)基中，整分試樣用于利用Guava PCA儀器(Guava Technologies，Haywood，CA)測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)。
            
 結(jié)果   表42.hUTC分離物120304在12g/L Hillex II微載體上的連續(xù)培養(yǎng)。
            
 12g/L Hillex II      表43.hUTC分離物120304在16g/L Hillex II微載體上的連續(xù)培養(yǎng)。
            
 16g/L Hillex II      表44.hUTC分離物120304在20g/L Hillex II微載體上的連續(xù)培養(yǎng)。
            
 20g/L Hillex II      表45.hUTC分離物120304在24g/L Hillex II微載體上的連續(xù)培養(yǎng)。
            
 24g/L Hillex II      
            
群體倍增12.8時(shí)低溫保存的hUTC分離物120304能夠被解凍，在Hillex II微載體上擴(kuò)增七次傳代。每種微載體濃度的每次群體倍增的小時(shí)數(shù)在傳代與傳代之間是一致的，表明了穩(wěn)定的對(duì)數(shù)性生長。每次群體倍增的小時(shí)數(shù)的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)通過單向ANOA的統(tǒng)計(jì)分析對(duì)于所有測(cè)試的條件沒有顯示hUTC生長動(dòng)力學(xué)方面的顯著差異(p＝0.277)。這個(gè)數(shù)據(jù)表明了hUTC以穩(wěn)定的、一致的方式在微載體上擴(kuò)增七次傳代的能力。
            
 實(shí)施例11   在連續(xù)旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)中微載體上hUTC的擴(kuò)增   
            
這項(xiàng)研究的目標(biāo)是在旋轉(zhuǎn)燒瓶中連續(xù)地培養(yǎng)附著到商業(yè)微載體的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTC)多次群體倍增。在微載體上擴(kuò)增hUTC多次群體倍增的能力將提供模型系統(tǒng)，來擴(kuò)大到用于細(xì)胞治療應(yīng)用的hUTC的大規(guī)模生產(chǎn)。評(píng)估了兩種hUTC分離物，120304-分離的、擴(kuò)增的和在研究條件下低溫保存的，以及CNTO 2476-分離的、擴(kuò)增的和在GMP條件下低溫保存的。還評(píng)估了商業(yè)的微載體Cytodex 1或Hillex II。低溫保存的細(xì)胞被解凍，用于立即接種旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)物。細(xì)胞連續(xù)地培養(yǎng)多次傳代，直到細(xì)胞達(dá)到大約群體倍增30。還在T225燒瓶中靜態(tài)地培養(yǎng)hUTCs作為對(duì)照。
            
 
            
群體倍增12.8的低溫保存的hUTC分離物120304能夠被解凍，在Cytodex 1和Hillex II微載體上分別擴(kuò)增到群體倍增28.6和28.7。每次群體倍增的小時(shí)數(shù)在傳代與傳代之間是一致的，表明了穩(wěn)定的對(duì)數(shù)性生長，與T燒瓶生長動(dòng)力學(xué)一致。群體倍增22.6的低溫保存的hUTC分離物CNTO 2476能夠被解凍，在Cytodex 1和Hillex II微載體上分別擴(kuò)增到群體倍增33.2和31.0。每次群體倍增的小時(shí)數(shù)在傳代與傳代之間是一致的，表明了穩(wěn)定的對(duì)數(shù)性生長，也與T燒瓶生長動(dòng)力學(xué)一致。每次群體倍增的小時(shí)數(shù)的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)通過單向ANOA的統(tǒng)計(jì)分析對(duì)于所有測(cè)試的條件沒有顯示hUTC生長動(dòng)力學(xué)方面的顯著差異(p＝0.988)。同樣，對(duì)于所有測(cè)試的條件，在最終收獲物時(shí)細(xì)胞表面蛋白表達(dá)保持一致。
            
 
            
這個(gè)數(shù)據(jù)展現(xiàn)了hUTC以維持細(xì)胞表面蛋白質(zhì)表型的穩(wěn)定的、一致的方式在微載體上擴(kuò)增到大約30次群體倍增的能力。這個(gè)模型系統(tǒng)可以被擴(kuò)大用于細(xì)胞治療應(yīng)用的hUTC的大規(guī)模生產(chǎn)。
            
 
            
這項(xiàng)研究的目標(biāo)是在旋轉(zhuǎn)燒瓶中連續(xù)地培養(yǎng)附著到商業(yè)微載體的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTC)多次群體倍增。在微載體上擴(kuò)增hUTC多次群體倍增的能力將提供模型系統(tǒng)，來擴(kuò)大到用于細(xì)胞治療應(yīng)用的hUTC的大規(guī)模生產(chǎn)。評(píng)估了兩種hUTC分離物，120304分離的、擴(kuò)增的和在研究條件下低溫保存的，以及CNTO 2476，分離的、擴(kuò)增的和在GMP條件下低溫保存的。評(píng)估了商業(yè)的微載體Cytodex1或Hillex II。低溫保存的細(xì)胞被解凍，用于立即接種旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)物。細(xì)胞連續(xù)地培養(yǎng)多次傳代，直到細(xì)胞達(dá)到群體倍增30。還在T225燒瓶中靜態(tài)地培養(yǎng)hUTCs作為對(duì)照。
            
 材料和方法   
            
細(xì)胞。使用了低溫保存的擴(kuò)增的人類臍帶組織細(xì)胞(hUTC)分離物12034群體倍增(PD)12和hUTC分離物CNTO 2476lot 25126078 PD 22。
            
 
            
生長培養(yǎng)基。Dulbecco’s改良的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)-低葡萄糖(Gibco-Grand Island，NY)，15％胎牛血清(FBS)(HyClone-Logan UT)，青霉素/鏈霉素(P/S)(Gibco-Grand Island，NY)，β巰基乙醇(BME)(Sigma-St.Louis，MO)。
            
 
            
微載體。Cytodex 1(GE Health Sciences-Piscataway，NJ)微載體在PBS中水化至少3小時(shí)并高壓滅菌。Cytodex 1微載體以3g/L的濃度使用。Hillex II(SoloHill Inc.-Ann Arbor，MI)微載體在去離子水中水化至少30分鐘高壓滅菌。Hillex II微載體以12g/L的濃度使用。
            
 
            
旋轉(zhuǎn)燒瓶。使用100ml和500ml單一用途、一次性的旋轉(zhuǎn)燒瓶(Corning，Inc.；Corning，NY)。
            
 
            
在100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中的接種和培養(yǎng)。低溫保存的hUTC小瓶被解凍，洗滌并重懸浮在生長培養(yǎng)基中。6.6×106hUTC添加到含有100ml培養(yǎng)基的100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中的3000mg cytodex 1(5.0×103細(xì)胞每cm2)，置于37℃組織培養(yǎng)孵化器中，孵育三到四天。旋轉(zhuǎn)盤設(shè)置為60rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)。3.1×106個(gè)hUTC添加到含有100ml培養(yǎng)基的100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中的1.2g的Hillex II(5.0×103個(gè)細(xì)胞每cm2)，并置于設(shè)置到60rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)盤上。旋轉(zhuǎn)盤置于5％CO2中。
            
 
            
從一個(gè)100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶到一個(gè)500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶的培養(yǎng)物的傳代。從旋轉(zhuǎn)盤上取下100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶，容許微載體沉淀。培養(yǎng)基上清液通過抽吸除去。具有粘附細(xì)胞的剩余的微載體堆重懸浮在20ml新鮮的生長培養(yǎng)基中。具有粘附細(xì)胞的微載體然后通過吸移管無菌地轉(zhuǎn)移到含有480ml新鮮生長培養(yǎng)基和4.8g Hillex II微載體(6g最終的微載體內(nèi)含物)或1.2g Cytodex 1(1.5g的最終微載體內(nèi)含物)的一個(gè)500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中。旋轉(zhuǎn)燒瓶然后置于設(shè)置到60rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)盤上。旋轉(zhuǎn)盤置于5％CO2、37℃組織培養(yǎng)孵化器中，孵育三到四天。
            
 
            
從一個(gè)500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶到五個(gè)500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶的培養(yǎng)物的傳代。
            
 從旋轉(zhuǎn)盤上取下500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶，容許微載體沉淀。培養(yǎng)基上清液通過抽吸除去。具有粘附細(xì)胞的剩余的微載體堆重懸浮在50ml新鮮的生長培養(yǎng)基中。具有粘附細(xì)胞的微載體的五個(gè)獨(dú)立的10ml整分試樣然后通過吸移管無菌地轉(zhuǎn)移到各自含有490ml新鮮生長培養(yǎng)基和4.8g Hillex II(6g最終的微載體內(nèi)含物)或1.2g Cytodex 1(1.5g的最終微載體內(nèi)含物)的五個(gè)獨(dú)立的500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中。旋轉(zhuǎn)燒瓶然后置于設(shè)置到60rpm持續(xù)旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)盤上。旋轉(zhuǎn)盤置于5％CO2、37℃組織培養(yǎng)孵化器中，孵育三到四天。
            
 
            
附著到Cytodex 1微載體的細(xì)胞的收獲。從旋轉(zhuǎn)盤上取下500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶，容許具有粘附細(xì)胞的微載體靠重力沉淀。培養(yǎng)基上清液通過抽吸除去。將500ml PBS添加到旋轉(zhuǎn)燒瓶中，容許微載體靠重力沉淀。PBS上清液通過抽吸除去。500ml DMEM-低葡萄糖添加到旋轉(zhuǎn)燒瓶中。旋轉(zhuǎn)燒瓶然后在旋轉(zhuǎn)盤上以60rpm孵育20分鐘。從旋轉(zhuǎn)盤上取下旋轉(zhuǎn)燒瓶，容許微載體靠重力沉淀。通過抽吸除去DMEM-低葡萄糖上清液。500ml的PBS添加到旋轉(zhuǎn)燒瓶中。旋轉(zhuǎn)燒瓶然后在旋轉(zhuǎn)盤上以60rpm孵育20分鐘。從旋轉(zhuǎn)盤上取下旋轉(zhuǎn)燒瓶，容許微載體靠重力沉淀。PBS上清液通過抽吸除去。向旋轉(zhuǎn)燒瓶添加250ml TrypLE select。旋轉(zhuǎn)燒瓶然后在旋轉(zhuǎn)盤上以60rpm孵育10分鐘。從旋轉(zhuǎn)盤上取下旋轉(zhuǎn)燒瓶，容許微載體靠重力沉淀。利用50ml的血清吸移管，微載體-TrypLE Select溶液通過上下地吸移～10次來攪拌，以從微載體上離解殘余的粘附細(xì)胞。然后將250ml PBS添加到旋轉(zhuǎn)燒瓶中，容許微載體靠重力沉淀。含有細(xì)胞的上清液通過重復(fù)的吸移來收集，轉(zhuǎn)移到用5ml FBS預(yù)先加載的多個(gè)錐形管中，100μm的過濾單元插入到試管開口中。試管以300rcf離心5分鐘，倒出上清液，細(xì)胞重懸浮在生長培養(yǎng)基中。
            
 
            
附著到Hillex II微載體的細(xì)胞的收獲。從旋轉(zhuǎn)盤上取下500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶，容許具有粘附細(xì)胞的微載體靠重力沉淀。培養(yǎng)基上清液通過抽吸除去。將500ml PBS添加到旋轉(zhuǎn)燒瓶中，容許微載體靠重力沉淀。向旋轉(zhuǎn)燒瓶添加100ml TrypLE select。旋轉(zhuǎn)燒瓶然后在旋轉(zhuǎn)盤上以60rpm孵育10分鐘。從旋轉(zhuǎn)盤上取下旋轉(zhuǎn)燒瓶，容許微載體靠重力沉淀。利用25ml的血清吸移管，微載體-TrypLE Select溶液通過上下地吸移～10次來攪拌，以從微載體上離解殘余的粘附細(xì)胞。含有細(xì)胞的上清液通過重復(fù)的吸移來收集，轉(zhuǎn)移到用5ml FBS預(yù)先加載的多個(gè)錐形管中，100μm的過濾單元插入到試管開口中。試管以300rcf離心5分鐘，倒出上清液，細(xì)胞重懸浮在生長培養(yǎng)基中。
            
 
            
生存力染色。1ml整分試樣的培養(yǎng)基和微載體轉(zhuǎn)移到15ml錐形管，容許微載體靠重力分離。通過抽吸來除去培養(yǎng)基，替換為1ml活/死染色溶液(Molecular Probes cat.no.L3224)，在37℃孵育15分鐘。在孵育之后，20μl整分試樣施加到玻璃顯微鏡載玻片上，通過熒光顯微鏡檢查來觀察?；畹募?xì)胞染色為綠色。人工地分析顯微鏡視野來評(píng)估附著于微載體的活細(xì)胞的分布。評(píng)估至少三個(gè)顯微鏡視野，統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞的近似的百分比。
            
 
            
培養(yǎng)中細(xì)胞計(jì)數(shù)-核釋放分析。5ml(100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶)或10ml(500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶)整分試樣的同質(zhì)的微載體懸浮液從旋轉(zhuǎn)燒瓶容器中獲取，轉(zhuǎn)移到15ml試管。容許微載體重力分離，通過抽吸除去上清液。微載體用10ml PBS洗滌一次，容許微載體重力分離，通過抽吸除去PBS上清液。微載體在核釋放溶液(含有0.1％w/v結(jié)晶紫(Sigma-St.Louis，MO)的0.1M檸檬酸(Sigma-St.Louis，MO))中在37℃孵育1小時(shí)。在孵育之后，含有核釋放溶液的100μl整分試樣的微載體添加到100μl PBS中。10μl整分試樣的這種溶液然后加載到血球計(jì)中，對(duì)釋放的核計(jì)數(shù)。
            
 
            
培養(yǎng)中細(xì)胞計(jì)數(shù)-TrypLE分析。5ml(100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶)或10ml(500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶)整分試樣的同質(zhì)的微載體懸浮液從旋轉(zhuǎn)燒瓶容器中獲取，轉(zhuǎn)移到15ml試管。容許微載體重力分離，通過抽吸除去上清液。微載體用10ml PBS洗滌一次，容許微載體重力分離，通過抽吸除去PBS上清液。微載體在TrypLE Select中在37℃孵育十分鐘。在孵育之后，添加5ml的PBS，容許微載體重力分離。含有細(xì)胞的上清液通過重復(fù)吸移來收集，轉(zhuǎn)移到預(yù)先用1ml FBS加載的多個(gè)錐形管中。試管以300rcf離心5分鐘，倒出上清液，細(xì)胞重懸浮在生長培養(yǎng)基中，整分試樣用于利用Guava PCA儀器(Guava Technologies，Haywood，CA)測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)。
            
 
            
靜態(tài)T-燒瓶培養(yǎng)。低溫保存的hUTC小瓶被解凍，洗滌并重懸浮在生長培養(yǎng)基中。使用US2004877012A中聲明的方法在T225中靜態(tài)地培養(yǎng)細(xì)胞多次傳代。
            
 
            
流式細(xì)胞術(shù)。使用US2004877012A中聲明的方法，利用Becton-Dickinson FACSCalibur儀器(Becton Dickinson，San Jose，CA)通過流式細(xì)胞術(shù)分析收獲的hUTC來確定細(xì)胞表面標(biāo)志物分布。所有抗體購自BD PharMingen(San Diego，CA)。
            
 結(jié)果   表46.hUTC分離物120304在Cytodex 1微載體上的連續(xù)培養(yǎng)。
            
 120304-Cytodex 1      表47.hUTC分離物120304在Hillex II微載體上的連續(xù)培養(yǎng)。
            
 120304-Hillex II      表48.hUTC分離物CNTO 2476在Cytodex 1微載體上的連續(xù)培養(yǎng)。
            
 CNTO 2476-Cytodex 1      表49.hUTC分離物CNTO 2476在Hillex II微載體上的連續(xù)培養(yǎng)。
            
 CNTO 2476-Hillex II      表50.hUTC分離物120304在T225燒瓶中的連續(xù)培養(yǎng)。
            
 120304-T225燒瓶      表51.通過流式細(xì)胞術(shù)分析的在微載體和T-燒瓶中擴(kuò)增的hUTC的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的比較。
            
    
            
群體倍增12.8的低溫保存的hUTC分離物120304能夠被解凍，在Cytodex 1和Hillex II微載體上分別擴(kuò)增到群體倍增28.6和28.7。每次群體倍增的小時(shí)數(shù)在傳代與傳代之間是一致的，表明了穩(wěn)定的對(duì)數(shù)性生長，與T燒瓶生長動(dòng)力學(xué)一致。群體倍增22.6的低溫保存的hUTC分離物CNTO 2476能夠被解凍，在Cytodex 1和Hillex II微載體上分別擴(kuò)增到群體倍增33.2和31.0。每次群體倍增的小時(shí)數(shù)在傳代與傳代之間是一致的，表明了穩(wěn)定的對(duì)數(shù)性生長，也與T燒瓶生長動(dòng)力學(xué)一致。每次群體倍增的小時(shí)數(shù)的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)通過單向ANOA的統(tǒng)計(jì)分析對(duì)于所有測(cè)試的條件沒有顯示hUTC生長動(dòng)力學(xué)方面的顯著差異(p＝0.988)。同樣，對(duì)于所有測(cè)試的條件，在最終收獲時(shí)細(xì)胞表面蛋白表達(dá)保持一致。這個(gè)數(shù)據(jù)展現(xiàn)了hUTC以維持細(xì)胞表面蛋白質(zhì)表型的穩(wěn)定的、一致的方式在微載體上擴(kuò)增到大約30次群體倍增的能力。這個(gè)模型系統(tǒng)可以被擴(kuò)大用于細(xì)胞治療應(yīng)用的hUTC的大規(guī)模生產(chǎn)。
            
 實(shí)施例12   在3L生物反應(yīng)器中Cytodex 1微載體上hUTC的擴(kuò)增   
            
這項(xiàng)研究的目標(biāo)是在小試規(guī)模生物反應(yīng)器中擴(kuò)增附著到Cytodex 1微載體的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTC)多次群體倍增。在小試規(guī)模生物反應(yīng)器中在cytodex 1上擴(kuò)增hUTC多次群體倍增的能力將提供模型的生物處理系統(tǒng)，來擴(kuò)大到用于細(xì)胞治療應(yīng)用的hUTC的大規(guī)模生產(chǎn)。在500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中在Cytodex 1微載體上擴(kuò)增到大約70％匯合的hUTC分離物CNTO 2476被用于接種含有另外的培養(yǎng)基和Cytodex 1微載體的3L生物反應(yīng)器。細(xì)胞在生物反應(yīng)器培養(yǎng)六天，在第3天采集整分試樣來計(jì)算運(yùn)行中期細(xì)胞計(jì)數(shù)。
            
 
            
hUTC在六天內(nèi)實(shí)現(xiàn)了大約三次群體倍增。通過CO2空氣覆蓋而不用鼓泡，系統(tǒng)的pH值被成功地維持在7.0。通過氧氣空氣覆蓋而不用鼓泡，系統(tǒng)的DO被成功地維持在40％。培養(yǎng)物從第0天到第3天的增殖指示了穩(wěn)定的指數(shù)生長。從第4天到第6天所見的降低的增殖速率很可能由于培養(yǎng)基中提高的細(xì)胞群對(duì)營養(yǎng)物(即，葡萄糖)的耗盡。
            
 
            
這個(gè)數(shù)據(jù)展現(xiàn)了hUTC在小試規(guī)模生物反應(yīng)器中在Cytodex 1上擴(kuò)增的能力。這個(gè)模型的生物加工系統(tǒng)可以被擴(kuò)大，用于細(xì)胞治療應(yīng)用的hUTC的大規(guī)模生產(chǎn)。
            
 
            
這項(xiàng)研究的目標(biāo)是在小試規(guī)模生物反應(yīng)器中擴(kuò)增附著到Cytodex 1微載體的人類臍組織來源的細(xì)胞(hUTC)多次群體倍增。在小試規(guī)模生物反應(yīng)器中在Cytodex 1上擴(kuò)增hUTC多次群體倍增的能力將提供模型的生物處理系統(tǒng)，來擴(kuò)大到用于細(xì)胞治療應(yīng)用的hUTC的大規(guī)模生產(chǎn)。在500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中在Cytodex 1微載體上擴(kuò)增到大約70％匯合的hUTC分離物CNTO 2476被用于接種含有另外的培養(yǎng)基和Cytodex 1微載體的3L生物反應(yīng)器。細(xì)胞在生物反應(yīng)器培養(yǎng)六天，在第3天采集整分試樣來計(jì)算運(yùn)行中期細(xì)胞計(jì)數(shù)。材料和方法   
            
細(xì)胞。使用了低溫保存的擴(kuò)增的人類臍帶組織細(xì)胞(hUTC)分離物CNTO 2476 lot 25126078 PD 7。
            
 
            
生長培養(yǎng)基。Dulbecco′s改良的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)-低葡萄糖沒有酚紅(Gibco-Grand Island，NY)，15％胎牛血清(FBS)(HyClone-Logan，UT)，4.0mM GlutaMAX(Gibco-Grand Island， NY)。
            
 
            
收獲試劑。1×TrypLE Select(Gibco-Grand Island，NY)，10×TrypLE Select(Gibco-Grand Island，NY)。
            
 
            
微載體。Cytodex 1(GE Health Sciences-Piscataway，NJ)微載體在PBS中水化至少3小時(shí)并高壓滅菌。Cytodex 1微載體在3g/L的濃度使用。
            
 
            
生物反應(yīng)器。具有B-DCU控制器(Sartorius BBI，Bethlehem，PA)的3L夾套生物反應(yīng)器(Applikon，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)。
            
 
            
生物反應(yīng)器接種。從500ml旋轉(zhuǎn)燒瓶產(chǎn)生的、具有大約70％匯合的附著細(xì)胞的1.5g微載體無菌地轉(zhuǎn)移到含有7.5g Cytodex 1和大約2L生長培養(yǎng)基的3L生物反應(yīng)器中。然后添加其他生長培養(yǎng)基得到最終體積3L。
            
 
            
生物反應(yīng)器設(shè)置。生物反應(yīng)器葉輪為65PRM。pH設(shè)置點(diǎn)是7.0，用CO2添加來控制。溶解氧(DO)被容許從100％降到40％DO設(shè)置點(diǎn)，通過氧添加來維持?？諝飧采w被設(shè)置為25-150ccm，不使用鼓泡。
            
 
            
附著到Cytodex 1微載體的細(xì)胞的收獲。生物反應(yīng)器葉輪被關(guān)閉，容許具有粘附細(xì)胞的微載體靠重力沉淀。培養(yǎng)基上清液通過位于沉淀的微載體上方的滴管來泵出。將3L PBS泵入生物反應(yīng)器中，容許微載體靠重力沉淀。PBS上清液通過位于沉淀的微載體上方的滴管來泵出。3L的DMEM-低葡萄糖泵入到生物反應(yīng)器中。打開生物反應(yīng)器葉輪為65rpm 30分鐘。然后葉輪被關(guān)閉，容許微載體靠重力沉淀。DMEM-低葡萄糖上清液通過位于沉淀的微載體上方的滴管來泵出。然后將3L的PBS泵入到生物反應(yīng)器中。打開生物反應(yīng)器葉輪為65rpm 20分鐘。然后葉輪被關(guān)閉，容許微載體靠重力沉淀。PBS上清液通過位于沉淀的微載體上方的滴管來泵出。然后將1L的1×TrypLEselect和50ml的10×TrypLE select泵入生物反應(yīng)器。打開生物反應(yīng)器葉輪為65rpm 20分鐘。葉輪被關(guān)閉，容許微載體靠重力沉淀。含有細(xì)胞的上清液通過位于沉淀的微載體上的滴管泵出到用少量FBS預(yù)先加載的轉(zhuǎn)移容器。然后將1.5L PBS泵入生物反應(yīng)器來重懸浮任何剩余的細(xì)胞。含有細(xì)胞的上清液通過位于沉淀的微載體上的滴管泵出到用FBS預(yù)先加載的轉(zhuǎn)移容器。所有的含細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移到多個(gè)500ml錐形管中。試管以300rcf離心5分鐘，倒出上清液，細(xì)胞重懸浮在生長培養(yǎng)基中，為細(xì)胞計(jì)數(shù)獲取整分試樣。
            
 
            
培養(yǎng)中細(xì)胞計(jì)數(shù)-核釋放分析。從旋轉(zhuǎn)燒瓶容器獲取同質(zhì)的微載體懸浮液的整分試樣，轉(zhuǎn)移到15ml試管中。容許微載體重力分離，通過抽吸除去上清液。微載體用10ml PBS洗滌一次，容許微載體重力分離，通過抽吸除去PBS上清液。微載體在核釋放溶液(含有0.1％w/v結(jié)晶紫(Sigma-St.Louis，MO)的0.1M檸檬酸(Sigma-St.Louis，MO))中在37℃孵育1小時(shí)。在孵育之后，將含有核釋放溶液的100μl整分試樣的微載體添加到100μl PBS中。然后將這種溶液的10μl整分試樣裝入血球計(jì)中，對(duì)釋放的核計(jì)數(shù)。
            
 結(jié)果   表52.hUTC分離物CNTO 2476在Cytodex 1微載體上的連續(xù)培養(yǎng)。
            
 在Cytodex 1上的CNTO 2476      
            
以70％匯合附著到1.5g的Cytodex 1上的hUTC分離物CNTO 2476被用于接種3L生物反應(yīng)器。通過CO2空氣覆蓋而不用鼓泡，系統(tǒng)的pH值被成功地維持在7.0。通過氧氣空氣覆蓋而不用鼓泡，系統(tǒng)的DO被成功地維持在40％。hUTC在六天內(nèi)實(shí)現(xiàn)了大約三次群體倍增。培養(yǎng)物從第0天到第3天的增殖指示出穩(wěn)定的對(duì)數(shù)生長。從第4天到第6天所見的降低的增殖速率很可能由于培養(yǎng)基中提高的細(xì)胞群對(duì)營養(yǎng)物(即，葡萄糖)的耗盡。
            
 
            
這個(gè)數(shù)據(jù)展現(xiàn)了hUTC在小試規(guī)模生物反應(yīng)器中在Cytodex 1上擴(kuò)增的能力。這個(gè)模型的生物加工系統(tǒng)可以被擴(kuò)大，用于細(xì)胞治療應(yīng)用的hUTC的大規(guī)模生產(chǎn)。
            
權(quán)利要求
            
1.一種培養(yǎng)貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞的方法，包括，
            
提供至少一種貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞；
            
提供用于生長所述產(chǎn)后細(xì)胞的細(xì)胞生長培養(yǎng)基；
            
提供至少一種用于所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞的附著的載體顆粒；和
            
在存在所述生長培養(yǎng)基的情況下在允許所述細(xì)胞的附著和生長的條件下使所述貼壁依賴細(xì)胞與所述載體顆粒接觸，
            
從而培養(yǎng)所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞。
            
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是臍來源的細(xì)胞。
            
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是胎盤來源的細(xì)胞。
            
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述載體顆粒含有生物學(xué)活性試劑。
            
5.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括與所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞共同培養(yǎng)的第二細(xì)胞類型。
            
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述載體顆粒是微載體。
            
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述微載體由選自膠原蛋白、葡聚糖、纖維素、玻璃、陶瓷、金屬、聚苯乙烯、聚(單硬脂酰甘油酯共-丁二酸)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯和透明質(zhì)酸鈉的材料組成。
            
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述微載體是無蛋白的。
            
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述微載體包被有聚(單硬脂酰甘油酯共-丁二酸)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯、透明質(zhì)酸鈉、纖連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、賴氨酸、N-異丙基丙烯酰胺、玻連蛋白或膠原蛋白。
            
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述微載體包含有網(wǎng)紋的或血漿包被的表面。
            
11.權(quán)利要求6的方法，其中所述微載體具有微電流或是順磁性的。
            
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述載體顆粒是多孔的微載體。
            
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述多孔的微載體由選自膠原蛋白、葡聚糖、纖維素、玻璃、陶瓷、金屬、聚苯乙烯、聚(單硬脂酰甘油酯共-丁二酸)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯和透明質(zhì)酸鈉的材料組成。
            
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述多孔的微載體是無蛋白的。
            
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述多孔的微載體包被有聚(單硬脂酰甘油酯共-丁二酸)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯、透明質(zhì)酸鈉、纖連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、賴氨酸、N-異丙基丙烯酰胺、玻連蛋白或膠原蛋白。
            
16.權(quán)利要求1121的方法，其中所述多孔的微載體包含有網(wǎng)紋的或血漿包被的表面。
            
17.權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)于一種或更多種標(biāo)記物CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD117、CD141、PDGFr-α、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ，所述細(xì)胞表型上相同于在靜態(tài)培養(yǎng)物中生長的細(xì)胞。
            
18.權(quán)利要求17的方法，其中對(duì)于標(biāo)記物CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD117、CD141、PDGFr-α、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ的每一種，所述細(xì)胞表型上相同于在靜態(tài)培養(yǎng)物中生長的細(xì)胞。
            
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述細(xì)胞的表型包括CD10+、CD13+、CD31-、CD34-、CD44+、CD45-、CD73+、CD90+、CD117-、CD141-、PDGFr-α+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-。
            
20.權(quán)利要求1的方法，其在約二十天內(nèi)產(chǎn)生至少約五次群體倍增。
            
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述群體的倍增時(shí)間低于約100小時(shí)。
            
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述群體的倍增時(shí)間低于約70小時(shí)。
            
23.權(quán)利要求1的方法，其中允許所述貼壁依賴產(chǎn)后細(xì)胞的附著和生長的條件包括約37℃的溫度。
            
24.權(quán)利要求23的方法，其中條件進(jìn)一步包括旋轉(zhuǎn)燒瓶或生物反應(yīng)器。
            
25.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基包含約7％到約15％的血清濃度。
            
26.包含根據(jù)權(quán)利要求1的方法生長的產(chǎn)后來源的細(xì)胞的組合物。
            
27.權(quán)利要求26的組合物，其中所述細(xì)胞的表型包括CD10+、CD13+、CD31-、CD34-、CD44+、CD45-、CD73+、CD90+、CD117-、CD141-、PDGFr-α+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-。
            
28.包含權(quán)利要求26的細(xì)胞的生物反應(yīng)器。
            
29.包含權(quán)利要求26的細(xì)胞的用于細(xì)胞治療的組合物。
            
30.包含根據(jù)權(quán)利要求6的方法生長的人類臍組織來源的細(xì)胞的組合物。
            
全文摘要
            
本發(fā)明提供了用于培養(yǎng)中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長和擴(kuò)增的組合物和方法。特別是，提供了利用表面例如微載體珠子的產(chǎn)后來源的細(xì)胞體外生長和擴(kuò)增的方法。
            
文檔編號(hào)C12N5/074GK101611139SQ200780049422 
            
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2007年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月13日
            
發(fā)明者A·M·哈蒙, L·S·K·洪, A·J·金, A·戈西夫斯卡 申請(qǐng)人:伊西康公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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