專利名稱：：使用轉化的貝利不動桿菌adp1作為生物傳感器檢測甲苯和二甲苯的方法
技術領域：
：本發明涉及生物傳感器，尤其是用于檢測污染化合物的生物傳感器，并且涉及生產生物傳感器的方法。本發明還涉及鑒定編碼響應于特定4b合物的調節蛋白的基因和/或啟動子的新方法。
背景技術：
：通常，已知兩種類型的生物傳感器(Belkin(2003)CurrentOpinioninMicrobiol6:206-212)。第一種類型的生物傳感器4夸生物材泮+與孩i電子系統或裝置結合，乂人而可以快速和準確^r測才羊品或環境，如體液、水或者空氣中的特定化合物。這種類型的生物傳感器一4殳依賴于酶與其底物之間的特異性相互作用，或依賴于抗體與抗原之間的iK別，或依賴于輩巴分子乂于其受體的可達〗生(accessibility)，或者依賴于核酸鏈對其互補序列的高度親和性。第二種類型的生物傳感器，也是本發明的關注點之一，使用活的、完整細胞來才企測特定化合物。該系統使得可以檢測發生在細胞中、并且不容易被電子模擬的非常復雜的反應。這種類型的生物傳感器還可以測定生物利用度(bioavailability)和毒性，這不能通過^使用孩i電子系統來^皮可靠地測定。例如，4吏用第一種類型的系統可以確定樣品(比如說水或者土壤)中的化合物的量，但是不能確定生物可利用的4b合物的量。通常，如果4匕合物不是生物可利用的或者為無毒的形式，那么其存在不是問題，生物可利用度和/或毒性只能夠通過^f吏用活的完整細胞來可靠地確定。生物可利用和/或毒性化合物的檢測重要的一個領域是評價地下水玷污或者污染和毒性化合物水平。特別是，研究已經被鑒定為在纟至;齊合4乍暨發展纟且纟只(OrganizationforEconomicCo-operationandDevel叩ment;OECD)2020年環境展望(OECD，2001)的"紅燈(危險警告，redlight)"名單中的化合物。普通的;也下水污染4匕合物包括芳香族溶劑，如苯、曱苯、乙苯和二甲苯異構體(BTEX)，氯化化合物(例如，三氯乙烯(TCE)),硝酸鹽，和來自農業徑流(agriculturalrunoff)的殺蟲劑，力口多王不芳烴(PAH;例i口，萘、熒蒽、芘)和多氯聯苯(PCB)。這些只是在水和陸地生態系統中均發現的有才幾污染物的目錄中的一些。已知這些有積W匕合物具有不同禾呈度的毒性、誘變性或者致癌活性。雖然傳統的分析方法，如質譜、氣相色譜和高壓液相色譜可以4是供污染區域中的化合物的濃度的信息，但是它們不能顯示化合物是否易被活的生物體同化，即它們不能評價化合物的生物利用度和毒性。評價自然中存在形式的化合物的生物利用度是場地修復(siteremediation)的重要考慮因素。傳統的分析方法還需要昂貴的設備和高素質的技術人員。
發明內容才艮據第一方面，本發明提供了生產用于4企測特定化合物的生物傳感器的方法(1)將編碼響應于特定化合物的調節蛋白的基因克隆到第一質粒的第一位置中；(2)將在調節蛋白和特定化合物都存在下^^激活的啟動子克隆到第一質粒的第二位置中或克隆到第二質粒中；(3)將編碼調節蛋白的克隆基因、和克隆啟動子整合到宿主生物體的染色體中，其中啟動子被可操作地連接到用于檢測啟動子的激活的元件(裝置，means)。優選用于才企測啟動子激活的元件產生可4企測到的信號，如-見覺信號、氣味、味道或者機器可檢測信號。檢測啟動子激活的元件可以被稱為報告基因，這兩個術語可交換使用。優選編碼調節蛋白的基因對于宿主生物體是異源的。優選啟動子對于宿主生物體是異源的。優選編碼調節蛋白的基因和啟動子對于宿主生物體都是異源的。在本發明的上下文中，異源采用其通常含義，即啟動子和/或調節基因是來自與宿主生物體不同的、但是可能相關的物種。編碼調節蛋白的基因和/或啟動子可以是已知的序列。可替換;也，編石馬調節蛋白的基因和/或啟動子可以是未知的序列。術語"響應"表示由克隆的基因編碼的調節蛋白在特定化合物存在時，它引起特定啟動子(一般是克隆的啟動子)的激活的情況。啟動子的激活可以通過調節蛋白和/或特定4b合物結合到啟動子來實現。特定化合物可以造成調節蛋白結構的構象變化，這可以使其結合到啟動子并且激活啟動子。可^#換地，啟動子的激活可以通過級聯型反應來發生，其不涉及調節蛋白和/或特定化合物與啟動子之間的直4姿相互作用。編碼調節蛋白的克隆基因，和/或克隆的啟動子，可以直接/人一個或多個質粒被整合到宿主生物體的染色體中。可^弄換地，克隆的基因和/或克隆的啟動子可以通過PCR/人質粒中擴增，然后PCR產物可以^皮克隆到宿主生物體的染色體中。優選編碼調節蛋白的克隆基因、和克隆的啟動子通過同源重組-波整合到宿主生物體的染色體中。優選編碼調節蛋白的克隆基因、和克隆的啟動子，與同源于宿主生物體染色體區域的序列側翼相接，其可以4吏克隆的基因和克隆的啟動子重組到宿主生物體的染色體中。優選，克隆的基因和克隆的啟動子與不同的序列側翼相接，使得克隆的基因和克隆的啟動子會在不同位置整合到宿主染色體。可以實現同源重組的側翼序列可以非常接近克隆的基因和/或克隆的啟動子，即在幾個石威基對之內，或者側翼序列可以在一定3巨離之外，例如幾十個或者幾百個i咸基對之外。側翼序列離克隆的基因和/或克隆的啟動子越遠，會被整合到宿主生物體的染色體中的質粒DNA越多。在一個實施方案中，質粒可以包含可操作地連接到用于檢測啟動子激活的元件(報告基因)的克隆的啟動子，并且克隆的啟動子和用于纟僉測啟動子激活的元件隨后可以#:一起重組到宿主生物體的染色體中。在這個實施方案中，側翼序列可以在一定距離之外，即至少在啟動子和用于檢測啟動子激活的元件的長度之外。在另外一個實施方案中，通過PCR引入用于與宿主生物體的染色體同源重組的側翼序列，并且整合到宿主生物體的染色體中的是PCR產物。如果宿主生物體具有Sal操縱子，側翼序列可以是Sal操縱子的一部分。Sall喿纟從子〗吏生物體可代/謝水楊酸鹽。通過4吏用部分SalA作為編碼調節蛋白的基因的側翼序列，基因可以被整合到宿主生物體的染色體中。SalR是Sal操縱子的調節蛋白，當被表達時，引起SalA的表達。在水楊酸鹽存在下生長的生物體內，SalR是組成性表達的(constitutivelyexpress)。因此，如果編石馬調節蛋白的基因祐:克隆到宿主生物體的SalA基因中，那么宿主生物體在水酸鹽存在下生長，SalR調節蛋白會被表達并且會引起SalA基因和/或被克隆到SalA基因中的編碼調節蛋白的克隆基因的表達。通過使用同源重組來將克隆的基因和克隆的啟動子整合到宿主生物體的染色體DNA中，可以控制整合到染色體中的位點。通過控制整合位點，可以控制克隆的DNA的表達。還可以避免破壞對宿主生物體重要的基因。作為同源重組的^^換方法，克隆的基因和/或啟動子可以通過非常頭見重纟且(illegitimaterecombination)-故引入宿主染色體中。4尤選，-使用的非常規重組方法是"同源性協助的非常少見重組(homologyfacilitatedillegitimaterecombination)，，，其中凈皮整合的一,殳DNA只有一側是與受體基因組同源的(VriesandWackernagel2002PNASvol99no4pg2094-2099)。在宿主生物體的染色體中定位編碼調節蛋白的克隆的基因和克隆的啟動子，該系統是非常穩定的。之前，細菌生物傳感器已經使用質粒負載(或攜帶，borne)的基因來幫助才企測樣品或者環境中的化合物，這樣的生物傳感器要求質粒被細菌保留。質粒的保留需要將選4奪性壓力施加于細菌從而保i正質粒^皮保留；一4殳這是通過將抗生素抗性基因引入到質粒中，然后將抗生素加入到細菌生長培養基中來實現的。這可能成本高，如果細菌生物傳感器要被用于樣品中，如環境樣品，則可能是困難的。如果質粒丟失，生物傳感器就不能工作，并且如果^f吏用者不知道質粒已經丟失，可能造成,i陰性。優選被生物傳感器檢測的化合物是污染物，優選環境污染物。術語"污染物"包括任何可以^皮—見為致污或者污染特定體系的化合物。該體系可以為土壤、地下水、任何水體、空氣、人或非人機體或體液，或者任何其他合適的體系。化合物可以選自包含以下物質的組芳香族溶劑，如苯、甲苯、乙苯和二甲苯異構體(BTEX)，氯化化合物(例如，三氯乙烯(TCE)),硝酸鹽(酯)，和來自農業徑流的殺蟲劑，如多環芳烴(PAH)如萘、熒蒽、芘，以及多氯聯苯(PCB)和任何其他的污染化合物。其他的污染化合物包括燃料、溶劑、推進劑、殺蟲劑的成分和這些化合物的4壬4可降解產物。優選，生物傳感器只4企測生物可利用的化合物。宿主生物體可以是<壬<可合適的感受態宿主(competenthost),即任何可以接受并且重組異源DNA至其染色體的合適宿主。優選，宿主生物體是高度感受性的，并且具有大于10—6的感受性(勝任性，competence)。優選，宿主生物體表玉見出大約0.1%的整合率。舉例來說，大腸桿菌(五.co//)以低于0.001%的比率整合，不是高度感受性的生物體。優選，宿主生物體是細菌或者酵母。優選，宿主生物體是自然感受態(naturallycompetent)。4尤選，宿主生物體能夠重組從而將異源DNA引入到其染色體中。優選，宿主生物體能夠4妻受異源DNA的插入，優選宿主生物體能夠接受大于約lkb異源DNA的插入，優選可以接受大于約2kb的插入，更優選可以4妾受大于約5kb的插入。優選，宿主生物體是不動桿菌(」c/"e/oZ)""er)物種或者4艮單月包菌(尸^M(iomo"as)物種的細菌，或者是4壬4可其4也的Y細菌物種。Y細菌具有可以t聶取化學品、特別是芳香族化學品的轉運系統，這使它們可用作污染化學品的生物傳感器。更優選宿主生物體是貝利不動4干菌(v4c/weto6a"wZ)";^y/)。宿主生物體可以是自然產生的或通過選4奪性壓力/生長而改造的或者可以已經被遺傳改造。優選，宿主生物體能夠表達克隆的基因。一些細菌遇到的問題是它們不一定能夠表達異源DNA。例如，大腸桿菌(Eco/O經常具有表達來源于其他的細菌的基因的困難，大腸桿菌不能表達dmpR-最初來源于《叚單月包菌(尸化wcfowowas5p.)CF400的苯酚調節蛋白(phenolregulatoryprotein)。優選，宿主生物體是安全和易于操作的。當克隆的啟動子^皮整合到宿主生物體的染色體中時，克隆的啟動子可操作地連接到用于檢測啟動子激活的元件/報告基因上。可操作地連接表示啟動子和報告基因被安排為在啟動子被激活時，報告基因即被表達。優選，當啟動子未被激活時，在宿主生物體中沒有或者基本沒有報告基因的表達。優選，在整合到宿主生物體的染色體之前，在質粒中才艮告基因可l喿作地連接至啟動子。優選，才艮告基因和啟動子一起整合至宿主生物體染色體上。可替換地，報告基因和啟動子可以分別整合到宿主染色體中；如果一旦被整合，它們就凈皮可#:作地連4妾。優選，當由于克隆的啟動子的激活而^皮表達時，才艮告基因產生可才僉測到的信號。可4全測到的信號可以是酶功能、代i射功能或基因表達的改變。優選表達的報告基因的量與樣品中的生物可利用的特定化合物的量相關。優選，報告基因的表達可以通過比色法測量或者光度法測量，例如通過熒光測定法(flourimetery)。才艮告基因可以表達P-半乳糖普酶，其可以通過比色法檢測。可替換地，報告基因可以為螢火蟲熒光素酶基因或者綠色熒光蛋白(GFP)基因中的一種或多種，其表達可以通過光度法測量或者熒光測定法(flourimetrically)測量。優選，凈艮告基因是/wx^、/wxB、/wxC、/wxD和/w:c五中的一種或多種。優選，使用不具有其天然啟動子的報告基因，通過克隆的啟動子來啟動其表達。優選，當被整合到宿主生物的染色體中時，編碼調節蛋白的克隆的基因是組成性表達的。該基因可以在所有生理條件下，或者只在某些條件下(如被用于測試樣品的那些條件下)，是組成性表達的。可操作地連接到調節基因的啟動子可以是與宿主生物體同源或者異源的。定化合物與編碼調節蛋白的克隆的基因的表達產物的結合或者相互作用來工作。優選編碼調節蛋白的克隆的基因的表達產物與特定化合物之間的相互作用導致對克隆的啟動子的誘導，其導致報告基因的表達。優選特定化合物與編碼調節蛋白的克隆的基因的表達產物(調節蛋白)之間形成復合物，并且該復合物激活/誘導克隆的啟動子和引起報告基因的表達。優選克隆的啟動子，和編碼調節蛋白的克隆的基因都來自生物體代;射特定化合物(生物傳感器用于監控A險測該特定化合物)所4吏用的操縱子。某些細菌已經進化了使用污染化合物作為食物來源的能力。產生需要的代謝酶來利用污染化合物通常受控于特定類型的調節蛋白，該調節蛋白通過直4妄的物理相互作用才企測污染化合物。然后，該蛋白-化學品復合物結合到相關的(同源的，cognate)啟動子序列，并且激活編碼所需代謝酶的基因的表達。這種類型的調節蛋白，及其相關的啟動子，可以;故用作本發明的生物傳感器中的污染物檢測組件(成分)。可以設計合適的宿主生物體，使得由調節蛋白激活的可誘導啟動子可操作地連接到才艮告基因，從而污染化合物與調節蛋白的相互作用激活驅使報告基因表達的啟動子。報告基因的表達4是供可測量的信號，其反映了污染化合物的存在，優選污染化合物水平(含量)和報告基因的表達水平之間存在相關性。例如，對污染化合物，如苯酚、曱苯、苯、萘和二曱苯的代"i射所需要的基因進行編碼的操縱子，已經得到透徹的了解，并且對調節蛋白、其相應的基因和來自這些操縱子的可誘導的啟動子可以進4亍改造乂人而用于本發明的方法和傳感器中。本發明中使用的調節蛋白和啟動子將取決于要被檢測的目標化合物。例如，如果目標化合物是曱苯或者二曱苯，那么啟動子可以是Pu啟動子，調節基因可以是xy/R,兩者都來源于惡臭H單月包菌(i^ewdowo"osjw"/a)。如果目標化合物是萘，可以4吏用由nahR蛋白調節的降解操縱子nahG(KingJMHetal.(1990)Science249(4970):778-781)。編碼調節蛋白的克隆的基因，和/或克隆的啟動子可以是天然產生的，或來源于天然產生的基因，或是合成的。例如，編碼調節蛋白的基因，和/或啟動子，可以從天然代謝所關注化合物的細菌中分離。該基因和/或啟動子可以以它們天然產生的形式來^吏用，或者它們可以是變異的或者^皮切割的。例如，該基因和/或啟動子的DNA序列可以經變異從而使其能夠在宿主生物體中起作用或改善其功能，或者改善其整合至宿主生物體中。只要編碼調節基因的克隆的基因，和克隆的啟動子一起工作使得可以檢測宿主生物體中的特定化合物，那么克隆的基因和克隆的啟動子的序列則并不重要。本領域中的普通技術人員會認識到任何合適的(一種或多種)質粒都可以被用于本發明的方法。質粒必須能夠整合和保留克隆的基因和/或啟動子。優選帶有克隆的基因和/或啟動子的質粒可以在細菌宿主中復制以<更繁殖質粒。質粒優選還可以#皮感受態宿主生物體吸收，并且^^f呆留在宿主生物體內，同時發生質粒和宿主生物體的染色體之間的同源重組。所屬領域的普通才支術人員可以在該質粒中加入所有合適的調節序列，如啟動子、終止子、聚腺苦酸化序列、標記基因、用于重組的側翼序列、抗生素篩選基因和任何其他合適的序列。可形成用于本方法的質4立基礎的質并立的實例為可購自PromegaTM的pGEM⑧質斗立和Invitrogen/〉司的TOPOTM質4立。可以使用一種或兩種質粒來實施本發明的方法。如果使用一種質斗立，優選編碼調節蛋白的基因和啟動子^皮克隆到質沖立中分隔的4立置。這可以通過使用不同的限制酶來實現。如果使用兩種質粒，優選編碼調節蛋白的基因，和啟動子被克隆到不同的質粒。在兩種情況下，編碼調節蛋白的基因、和啟動子都優選與可使它們整合到宿主生物體的染色體的不同位點中的不同序列側翼相接。優選通過本發明的方法生產的生物傳感器能夠檢測納摩爾水平(含量)的特定化合物，使它們如同傳統的色譜法或者分光光度法一樣靈敏或者比那些方法更加靈敏。此外，因為沒有背景表達或者只有很低的背景表達，(1)編碼調節蛋白的基因、(2)啟動子和(3)報告基因的染色體整合產生了比質粒負載系統(或質粒介導系統，plasmidbornesystem)更靈敏的系統。在其中有多個基因拷貝，特別是多個報告基因拷貝的質粒系統中，即使可誘導的啟動子只是輕微的"滲漏(leaky)"，報告基因的低水平的背景表達也會產生,支陽性。另夕卜，因為細菌中的質粒數目可以改變，因此很難定量比較不同實驗的結果。質粒拷貝數越多，可檢測信號的水平則可能越高。生產生物傳感器的這種方法提供了一條方<更而有效的途徑乂人而當需要時能夠容易地構建特定物質的生物傳感器。本發明提供了一種使得能夠快速(優選在約2-3天內)構造常規可誘導的(custominducible)細菌生物傳感器的方法(與以前所需的數月和專業遺傳學(specialistgenetics)相對)。可以理解通過參考本發明的第一方面討-論的本發明的所有的優選特征都可以應用于本發明的所有方面。根據另外一個方面，本發明提供了生產用于特定化合物的生物傳感器的方法，包含(1)鑒定特定化合物；(2)獲得DNA池；(3)將來自DNA池的DNA片段克隆到一種或兩種質粒中的第一和第二位點；(4)將克隆的DNA整合到宿主生物體的染色體中，其中質粒中第一位點的DNA在第一位置被整合到染色體中，從而它會在宿主生物體中表達，質粒中第二位點的DNA在第二位置被整合到染色體中，從而克隆的DNA可操作地連接到報告基因；(5)將特定化合物施加至宿主生物體；和(6)對報告基因的表達進行篩選。優選報告基因的表達指示宿主生物體響應于特定化合物的存在，因此該生物體可以被用作該特定化合物的生物傳感器。根據本發明的另一個方面，提供了鑒定(i)編碼響應于特定化合物的調節蛋白的基因和(ii)被調節蛋白和特定化合物激活的啟動子的方法(1)鑒定特定化合物；(2)獲得DNA片段池；(3)將來自DNA池的DNA片4史克隆到一種或兩種質粒的第一和第二位點，使得當質粒被轉化到宿主生物體中時，第一位點的DNA會被表達，第二位點的DNA可操作地連接到報告基因；(4)用該一種或兩種質粒轉化宿主生物體；(5)將特定化合物施加于被轉化的宿主生物體；和(6)對報告基因的表達進行篩選。報告基因的表達顯示宿主生物體正在表達調節基因，并且具有(associatedpromoter)。該生物體可以:故用作該凈爭定4匕合物的生物傳感器。可替換地，通過本發明的這種方法鑒定的基因和啟動子隨后可以被整合到宿主生物體的染色體中從而生產特定化合物的生物傳感器。在本發明的方法的步驟i中，特定4b合物可以是^f壬4可感興趣的化合物，特別是，該特定化合物可以為環境致污物或者污染物。前文討i侖過其實例。優選通過/人樣品，如土i裏、水、空氣或者流體樣品分離DNA來獲得本發明的方法中4吏用的DNA池。優選該才羊品^皮特定化合物所污染。優選，該才羊品含有已經進化乂人而在該特定^:合物污染的土壤、水、空氣、流體等中存活的生物，并且優選某些這種生物已經進化從而代謝該特定化合物。目標是從可以代謝該特定化合物的生物體中分離可^皮用于生物4專感器中的DNA。優選DNA池含有超過一種的DNA的不同片^殳。更優選，DNA池含有10種或者更多、IOO種或者更多、500種或者更多、1000種或者更多的DNA的不同片段。優選用于產生池的DNA分離自環境樣品，而無需培養樣品中的細菌，這具有可以將在實驗室環境下難以或者不可能培養的細菌的DNA包4舌在該池中的優勢。廣泛i人為，多達99%的細菌在實-驗室條件下不能培養，本發明的方法確保考慮到這樣的細菌的DNA,并且當生產本發明的生物傳感器時被使用。通過使用DNA池，本發明的方法可以被用于克隆來自環境樣品的未知的調節基因和/或啟動子，或調節基因和啟動子的未知組合。不需要事先了解響應于被生物傳感器檢測的特定化學品的調節基因和/或啟動子。優選，可以使用單個DNA池來篩選響應于超過一種化學品的調節基因和/或啟動子。該池中的DNA可以作為總核酸提取過程的一部分來分離，或者只是DNA被提取。21本發明的方法中使用的DNA池可以通過合適的限制酶被消化從而使其能夠被克隆到質粒中。合適的酶可以包括BgIII和/或Sau3A。可替換地，可以^使用平末端(bluntend)連接來將DNA克隆到質粒中。優選DNA4皮隨機插入到一種或者兩種質粒的第一或第二位點中。第一和第二位點都側翼相^妄于可使克隆的DNA同源重組到宿主生物體的染色體中的序列。克隆的DNA可以由一種或多種質斗立被直接整合到宿主生物體的染色體中，或者它可以通過PCR擴增，PCR片4殳可被整合到宿主生物體的染色體中。可^奪4奐;也，可以通過PCR來擴增克隆的DNA，PCR4吏用引物來給克隆的DNA增加側翼序列，側翼序列4吏得可以同源重組到宿主生物體的染色體中。優選，如果克隆的序列被整合到宿主生物體的染色體中，它們是通過同源重組來整合的。在第一位置整合至宿主染色體的、和/或質粒第一位點的DNA，優選被設置為組成性表達(至少在試驗條件下)。希望該整合位置使得編碼調節蛋白的基因能夠被捕獲。在第二位置整合至宿主染色體的、和/或質粒第二位點的DNA優選被設置為位于可操作地連接到報告基因。希望該整合位置使得啟動子序列能夠被捕獲。報告基因可以連接到質粒中的克隆的基因上，或者整合進入到宿主生物體的染色體中。優選，本發明的方法使得可以產生一種生物體，其中已經將編碼調節蛋白的基因和可操作地連接到才艮告基因的啟動子克隆到這樣的生物體中，其中調節蛋白和啟動子在特定化合物的存在下共同工作從而引起報告基因的表達。通過針對才艮告基因的表達來篩選宿主生物體，并且只選4奪響應于特定化合物表達報告基因的那些，可以鑒定用于特定化合物的潛在的調節基因和啟動子組合、以及由此形成的生物傳感器。感器，其中調節操縱子(regulatoryoperon)還沒被分離，或者其中僅分離了部分的操縱子。本發明的方法還可以使調節操縱子涉及的基因得以鑒定和克隆以用于進一步的研究。本發明的這種方法具有的優勢為使用不同的位點來俘獲/捕獲啟動子和調節序列，而不是依賴于一個位點來捕獲兩者。如果序列位于遠距離之外，那么單一位點不能將兩者都捕獲，同樣如果序列以相反的方向取向，那么單一位點捕獲不能使得兩個序列都起作用。根據另外一個方面，本發明提供了鑒定編碼響應于特定化合物的調節蛋白的基因的方法，其包含(1)鑒定特定化合物；(2)獲得DNA池；(3)將來自DNA池的DNA片4殳克隆到質粒中；(4)將克隆的DNA整合到宿主生物體的染色體中，使得克隆的DNA在宿主生物體中被表達，其中染色體已經攜帶可操作地連23接到報告基因的啟動子，并且其中啟動子已知在特定化合物和未知調節蛋白的存在下4皮激活；(5)將特定化合物施加于宿主生物體；和(6)對報告基因的表達進行篩選。根據另一方面，本發明提供了鑒定編碼響應于特定化合物的調節蛋白的基因的方法，其包含(1)鑒定特定化合物；(2)獲得DNA片段池；(3)將來自DNA池的DNA片段克隆到質粒中，從而當質粒被轉化到宿主生物體中時克隆的DNA會被表達；(4)用含有克隆的DNA的質粒轉化宿主生物體，其中宿主生物體攜帶可操作地連接到報告基因的啟動子，并且其中啟動子已知在特定化合物和未知調節蛋白的存在下#1激活；(5)將特定化合物施加于轉化的宿主生物體；和(6)對報告基因的表達進行篩選。在本發明的前述兩個方面中，凈艮告基因的表達都顯示宿主生物體攜帶了整合到宿主染色體中或者質粒上的編碼響應于特定化合物的調節蛋白的基因。這才羊的生物體可以一皮用作特定^f匕合物的生物傳感器。可^齊換地，通過本發明的方法鑒定的編碼調節蛋白的基因，當#皮鑒定的該基因在質粒上，可以隨后^皮整合到宿主生物體的染色體中從而產生特定化合物的生物傳感器。該宿主生物體還必須使可操作地連接到報告基因的啟動子整合到其染色體中，其中該啟動子在調節蛋白和特定化合物的存在下被激活，這樣宿主生物體可以被用作特定化合物的生物傳感器。優選，至少在試l全條件下，克隆的DNA是組成性表達的。生物體，可以鑒定編碼調節蛋白的基因。因此該方法可以用作捕獲編碼調節蛋白的基因的方法，當可諸導啟動子已知時還可以用作生產生物傳感器的方法。根據另外一個方面，本發明提供了鑒定被響應于特定化合物的調節蛋白激活的啟動子的方法，包含(1)鑒定特定化合物；(2)獲得DNA池；(3)將來自DNA池的DNA片萃爻克隆到質粒中；(4)將克隆的DNA整合到宿主生物體的染色體中，使得克隆的DNA可操作地連接到報告基因上，其中染色體已經攜帶編碼響應特定化合物的調節基因的基因；(5)將特定化合物施加于宿主生物體；和(6)對報告基因的表達進行篩選。根據另一方面，本發明提供了鑒定被響應于特定化合物的調節蛋白激活的啟動子的方法，其包含(1)鑒定特定化合物；(2)獲得DNA片段池；(3)將來自DNA池的DNA片段克隆到質粒中，使得克隆的DNA可操作地連接到報告基因；(4)用含有克隆的DNA的質粒轉化宿主生物體，其中宿主生物體攜帶編碼響應于特定化合物的調節蛋白的基因；(5)將特定化合物施加于轉化的宿主生物體；和(6)對報告基因的表達進行篩選。在本發明的前述兩個方面中，報告基因的表達顯示了宿主生物體攜帶了或者整合到染色體中或者在質粒上的可操作地連接到報告基因的啟動子，其響應于特定化合物和調節蛋白被激活。表達報告基因的生物體可以;故用作特定化合物的生物傳感器。可一,換地，如果宿主生物體表達相關的調節蛋白，由本發明的方法所鑒定的攜帶在質粒上的啟動子可以^皮整合到宿主生物體的染色體中從而生產特定化合物的生物傳感器。當施加特定化合物時，編碼調節蛋白的基因必然被表達。優選編碼調節蛋白的基因在宿主生物體中是組成性表達的，至少在實-驗條件下是這樣。主生物體，可以鑒定4皮調節蛋白-敫活的啟動子。因ot匕該方法可以用作捕獲編碼可誘導啟動子的基因的方法，當編碼調節蛋白的基因已知時還可以用作生產生物傳感器的方法。根據另外一個方面，本發明提供了檢測樣品中特定化合物存在與否的方法，其包含(i)將根據本方明的方法制造的生物傳感器與樣品進行接觸；(ii)觀察生物傳感器中的報告基因表達是否升高。根據另外一個方面，本發明提供了用于在樣品中檢測化合物的1吏用i兌明。優選生物傳感器被設置在容器中，該容器將釋放生物傳感器至環境中的風險降低到最低。生物傳感器的使用說明優選表明應怎樣混合生物傳感器和樣品，以及怎樣監控報告基因的表達。的報告基因表達的指示。根據另外一個方面，本發明提供了用于生產生物傳感器的試劑盒，其包含一種或者兩種質粒(具有兩個克隆位點，每種質粒各有一個或者兩個都在一種質粒上)、和使用本發明的方法生產生物傳感器的說明。克隆位點可以為多克隆位點。27主生物體。普通技術人員會了解所談到的關于本發明的僅一個方面的優選特征可以被應用于本發明的所有方面。在這里本發明的優選實施方案會通過實施例參照附圖進行介紹，其中圖1A示意'1"生示出了貝利不動4干菌(^"'w"o6"cter6"y/j/)突變體ADPl_Pu—/wx—xy/R的構建。更確切地/說，圖1A示出了將啟動子Pu和調節基因xy/R整合到貝利不動4干菌ADP1的染色體中以產生菌4朱ADP1—Pujwx一x;;/R所采耳又的四個步驟。圖1B示出了在有或沒有誘導物間-二曱苯的瓊脂培養基上生長的ADPl_Pu—/wx一x少/R,使用的生長培養基是具有10mM葡萄糖的LB。圖2示出了貝利不動桿菌ADPl—Pu_/wx—x_y/R中生長階羊炎相關性(或生長階,殳依賴性，growth-phasedependent)x_y/R/Pu基因調節。加入終濃度500pM的甲苯(A)、間-二甲苯(B)、對-二曱苯(C)或鄰-二甲苯(D)作為誘導物。樣品在28。C振蕩孵育。圖3示出了在補充了50mM葡萄糖或50mM琥珀酸鹽(酯)作為口舉一碳源的基本i咅養基(或最小培養基，minimalmedium)中的ADPl—Pu一/wx—xy/R的相對生物發光表達。圖3A-分別添加終濃度500jaM的甲苯(T)、間-二曱苯(M)、對-二曱苯(P)或鄰-二曱苯(C))作為"^秀導物。樣品在28。C振蕩孵育。圖3B-示出了不同溫度對于Pu活性的影響。于OD600=0.5測量的絕對生物發光。圖4示出了通過RNA印跡;去(Northern雜交，Northernblotting)監控的x_y/R和cj54的mRNA轉錄水平。Pu活性與cj54轉錄水平相關。圖4A描述了樣品的生長曲線，圖4B示出了mRNA的RNA印跡和Pu活性的比較。圖5示出了石友和氮對于貝利不動桿菌ADPl_Pu—/wx_x_y/R的Pu活性的影響。圖5A示出了OD600的讀凄t，圖5B示出了5種處理的相對生物發光。圖6示意性示出了從分離自地下水樣品的DNA中捕獲編碼調節蛋白的基因和啟動子的方法。圖7示出了貝利不動桿菌的salR基因的部分序列，以及從該基因去除4個石咸基和減少該基因的;參漏表達(leakyexpression)的突變的詳細'清況。圖8是可以-坡用于將DNA序列整合到宿主生物體的染色體中的salA片段的序列表。序列包括側翼相接卡那霉素基因的2個SalA片段，片段1和2。該序列可以被用于整合和捕獲編碼調節蛋白的潛在基因(potentialgene)。提供的序列反映了圖1A中的部分的psalA-Km序歹'J。圖9是可以^皮用于將DNA序列整合到宿主生物體的染色體中的salA和salR片段的序列表。該序列可以被用于整合和捕獲潛在的啟動子。提供的序列反映了圖1A中在整合lux基因之前的部分pSaIR-lux序歹'J。圖IO是用于產生具有突變salR基因的突變不動桿菌菌才朱的方法的示意圖。圖11描述了通過實施例3的捕獲方法產生的陽性轉化4朱(transformant)A,其中sal操縱子在水楊酸鹽的存在下祐:激活，以及通過實施例3的方法產生的陰性轉化株B，其中sal操縱子在水楊酸鹽的存在下未^皮激活。通過生物發光來^正明sal揭j從子的激活。在所描述的圖Y象中，左手邊的圖Y象是黑暗中的^f羊品，其i正明陽性轉化林A是生物發光的，這是因為連接于salA啟動子的lux基因的表達所致。右手邊的圖像是光照中的樣品并且證明生長了比生物發光更多的轉化林菌落。左邊的平板中含有LB+tet+水楊酸鹽，右手邊的平板中含有LB+tet。圖12是DNA分離凝膠，示出了可以從不動桿菌AsalR突變體的陽性轉化株提取攜帶了捕獲的salR調節基因的pRK415質粒。具體實施例方式實施例1-生產對二曱^/甲苯^^應的細菌生物傳感器4吏用本發明的方法來生產對二甲苯/甲苯反應的細菌生物傳感器。為了生產這樣的生物傳感器，惡臭假單胞菌的TOL質粒、pWWO的x_y/R基因和Pu啟動子^皮整合到細菌宿主貝利不動桿菌ADP1的染色體中。更確切地r說，通過^l尋x少/R、Pu和/wxCDABE融合到貝利不動桿菌ADP1(A.baylyiADP1)的染色體中乂人而構建不動桿菌菌才朱ADPWH—Pu—/wx_Jc_y/R。通過測定生物發光升高的水平(由于可操作地連接Pu啟動子的/wx基因的表達所致)，來監控Pu啟動子的活性。惡臭，支單月包菌的TOL質粒、pWWO的矽/R基因編碼感應曱苯/二甲苯的調節蛋白Pu是cjS"-依賴型啟動子，其通過Xy/R的結合而,皮;敫5舌(Casesetal(1996)MolecularMicrobiology19:7-17)。Pu啟動子調節系統是復雜的并且受到多個因素的控制(Casesetal(2005)NatureReviewsMicrobiology3:105-118)。首先，通常見察到Pu啟動子的活性取決于細菌的生長階段。在指lt生長期，Pu活性一皮抑制(指凄t沉默，exponentialsilencing),而當進入到穩-定階段它被快速激活。已經顯示a"的性能和整合宿主因子(IHF)是生長階段依賴型的，雖然在某些宿主，如惡臭假單胞菌中的a54的水平在不同的生長階^殳是穩定的。其次，容易一皮利用的石灰源，如葡萄糖的存在引起分解代謝阻遏(catabolicrepression),從而在々i單胞菌和大腸桿菌宿主中抑制Pu活性。已經證明中間代謝物，6-磷酸葡萄糖脫氫酶和/或6-磷酸葡萄糖酸內酯酶作為惡臭假單胞菌中的Pu才中制的^[言號起4乍用(Velazquezetal(2004)JournalofBacteriology186:8267-8275)。其他的因素，如報警素(或警報子，alarmone)(p)ppGpp和溫度也可以影響Pu活性。但是，不能完全理解為什么Pu活性在穩定階段突然升高或者什么因素在調節中起到關鍵作用。通過將xj/R/Pu調節系統克隆到另一宿主中，在這種情況下快速產生二甲苯的良好細菌生物傳感器貝利不動桿菌。最近被分類到貝利不動桿菌ADP1的不動桿菌ADP1是具有利用寬范圍碳源的能力的土壤細菌(Youngetal(2005)AnnualReviewofMicrobiology59)。不動4干菌和々I單月包菌屬于同一屬(genus),貝利不動桿菌ADP1的基因組大小是3.6Mb,并且具有的GC含量是40%，與之相比假單胞菌具有大約5.4Mb的基因組和平均62%的GC含量。對于ADPWH—Pu—/wx—xj/R的研究顯示，與在其原始宿主惡臭假單胞菌中的性能相似，Pu啟動子的活性可以被曱苯，鄰-、間-、對-二曱苯誘導。這些研究還證明異源啟動子和編碼調節蛋白的異源基因可以被整合到不動桿菌中并且具有功能。材料和方法所有的實驗一式三份地進行。4b學品、細菌菌林和培^^基^f匕學品都/人Sigma-Aldrich7>司獲4尋。本研究所^吏用的細菌菌才朱和質并立在表1中列出。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>除非另有說明，所有的化學品都從Sigma-Aldrich公司獲得并且是分才斤級"i式劑(analyticalgradereagent)。4吏用Luria-Bertani(LB)培養基或者基本培養基(MM)來培養合適的細菌。當需要的時候，使用2.5mM的水楊酸鹽(鈉鹽)作為唯一碳源來制備水楊酸鹽瓊脂培養基(SAA),并且在含1.4%純化瓊脂(nobleagar)的基本培養基中固化。當合適的時候，使用終濃度分別為100[ag/ml和50|ig/ml的氨節青霉素(Amp)或卡那霉素(Km)用于大腸桿菌，加入10pg/ml的卡那霉素用于貝利不動桿菌ADP1。質粒構建^^建pS""及^"jwx(圖1A,步驟1)使用(未示出)從PUC2剪切Pu啟動子片段(320bp)并且與五coiI部分消化的pSalAR—/欲連4秦(圖1A，步驟1)。連接_后，通過熱激(heatshock)將該質粒l爭到大腸4干菌感受態細月包JM109中(PromegaTMCo.廠商i兌明)然后涂布在LBAmp(100(ig/ml)上進行選4奪。隨機選擇16個菌落，使用引物sa/A—end_for和/"xC—rev(表2)通過PCR進4亍擴增，在95°C起始變性5min,然后94°Clmin，58°Clmin，和72。Clmin進4亍35個循環，最后再在72。C下維持10分4t來結束延伸。在PCR擴增之后，將lOpl的PCR產物加樣在1%的瓊脂4唐凝"交上。/人凝"交上切下四個理想的PCR片4史(大約53%p),純化(QiagenTM凝月交清洗試劑盒，gelcleaningkit)并測序(CEQ2000XL，BeckmanLtd.)。才艮才居這些序列的結果，選擇在與/wxCDABE同一方向上含有Pu的菌落，將所攜帶的質粒命名為pSalAR_pu—/wx(圖1A，步驟1)。構建pSalA一km一;^/R重疊jE^f申PCR(OEP)產生P艮制切割位點如前所述，通過重疊延伸PCR在s"/A基因中產生EcoRI和5awHl卩艮制^f立點(Huang,W.E.etal.，(2005)EnvironmentalMicrobiol.7,1339-1348)。更詳細地i井，進4亍PCR擴增，在95°C進4亍5min的初始變性，然后94°Clmin，58°Clmin,和72°Clmin進行35個循環，最后再在72°C維持10min來結束延伸。使用引物對5"/A—flank一for-s"/A—BE_rev和sa/A—BE—fwd-sa/A—revH(表2)通過菌落PCR來分別擴增兩個m/A片段(m/A1和m/A2)。表2引物序列(5，—3，)備注■ya/A—flank—forCCAGCTGATCAGTTGTAGAATG在jfl/A基因之外■ya/A—EB_forGATGCTATTTTAGGGAGAATTCCACGGA產生的和5a附/ZI^f立,存、TCCAGTGTAAGTsa/A—EB—revACTTACACTGGATCCGTGGAATTCTCCCTAAAATAGCATC產生的￡coiI和SamM位點.■sa/A—revHAACAGGTTGTATTGCTGCTCGCSa/A與5fl/R之間的位點/i/xC—revGAGAGTCATTCAATATTGGCAGG在/mxC基因內GACCTGAGTATGCCCGGTAG/wxE—forTGGTTTACCAGTAGCGGCACG在/wxE基因內:>qy/Rl—forTGGATTTCAGTTAATCAATTGGT正向側翼連4婁x_y/R_revCTATCGGCCCATTGCTTTCAC反向側翼連接Sigma54—forATGAAGTTATCTGTTGGATTGAAAGTCGSigma54_revCACGATATTTTGCAACGGTTCTAC根據廠商說明(QIAquickTM凝膠提取試劑盒，QiagenTM公司)，從1%瓊脂糖凝膠分離PCR產物，清洗并且純化。為了融合兩種m/A片段，進行PCR擴增(使用與上面相同的反應條件，除了延伸時間是72。C2分鐘)，其含有稀釋(1:100)的sa/Al(907bp)和sa/A2(924bp)片段和引物m/A—flank_for和sa/A—revH(表2)各1^1。才艮據制造商說明(QIAquickTM凝膠提取試劑盒，Qiagen公司)純化帶有五coiI和SamHI限制位點的新sa/A片段的PCR產物，然后克隆到pGEM-T(PromegaTM/^司)中，該質粒被命名為pSalA—BE(圖IA)。構建pSalA—Km一"況(圖1,步驟3)35用禾口5"wHI消4匕pSalA—BE。通過五coiI和5"mHI乂人pRMJ2(未示出)切割卡那霉素基因(1472bp)并且融合到pSalAR—BE中從而產生pSalA—Km(圖1A)。將連接混合物轉化到感受態細胞(大腸桿菌JM109)中并且^f吏用具有Amp(100pg/ml)和Km(50pg/ml)的LBA選擇平才反(或選擇培養基，selectionplate)來獲得轉化林(transformant)。用五coRI消4bpSalA—Km。通過乂人p:c;;/R(未示出)切割"/R基因片段(2399bp)并且融合到pSalAR—KM中從而產生pSalA—KM—x_y/R(圖1A,步驟3)。將連接混合物轉到感受態細胞(大腸桿菌JM109)中并且使用具有Amp(100jig/ml)和Km(50昭/ml)的LB瓊脂(LBA)選擇平板來獲得轉化林。使用引物對:^/Rl_for和x_y/R—rev(表2)來進4亍菌落PCR乂人而確定x少/R已經融合到質粒中。進行PCR擴增，在95。C初始變性5min，然后94。Clmin，50°Clmin，和72°C2min進4亍35個循環，最后再在72°C維持10min來結束延伸。基因轉化按照Palmenetal.1993.JournalofGeneralMicrobiology139:295-305所描述的，進行不動桿菌ADP1感受態細胞的制備。簡單來說，以不動桿菌菌林ADPW67或ADPl_pu—/wx作為受體，在5mlLB于30。C,以200rpm振蕩培養(或生長，grow)過夜。然后將二百微升的培養物稀釋在5ml的新鮮LB培養基中，并且孵育2小時從而4吏細月包成為感受態。為了轉化，將2(ig的pSalARjpu—/wx或SalA—Km—xj/R質粒力口入到0.5ml的感受態細胞(109個細月包/ml)并且孵育2小時。隨后將培養物涂布在合適的培養基上用于篩選轉化林。產生不動桿菌ADPl_pu_/x(圖1A,步驟2)36在圖1A中示出了整合Pu啟動子的方法。不動桿菌菌才朱ADPW67具有插入到m/A基因的卡那霉素基因，它不能在才是供水楊酸鹽作為唯一碳源的SAA平板上生長。在整合之后，故Km基因中斷的m/A基因被提供功能性s"/A基因的pSalAR_pu—/wx取代，乂人而4吏轉化4朱能夠在SAA上生長。為了確定Pu啟動子和/wxCDABE整合到不動4干菌ADP1的染色體中，從SAA平板(plate)隨機選擇16個菌落，使用染色體側翼引物和內部引物來進行PCR反應。更詳細地講，flank—for//wxC_rev引物〉寸用于Pu，sa/AR—rev〃MxE—Rvd(表2)引物乂于用于/wxCDABE。通過菌落PCR來檢測轉化林，隨后進行凝月交清洗(gelcleaning)和測序，命名為不動桿菌菌4朱ADP_pu_/wx。產生不動桿菌ADPI_pu_/x—xy/R(圖1A,步驟4)為了將x_y/R和Km基因整合到不動桿菌ADP_pu—的染色體中，如上所述將質粒pSalAJCm—x_y/R與不動桿菌ADPl_pu—/wx感受態細胞混合。混合物在30°C孵育2小時，涂布在具有10pg/ml卡那霉素的LB瓊脂平4反上用于篩選。^吏用引物刈-xy/Rl_for和x少/R—rev(表2)來進行PCR從而確定"/R整合到ADPl_pu—/wx中。核苦酸測序和序列t^才斤所有的DNA沖羊品(PCR產物或質并立)在應用生物系統(Applied(dyeterminatorsequencing)進4亍測序。4吏用Blastn來進4亍DNA序列分析從而確定序列同源性。隨后，使用BioEditTM(TomHall,樣t37生物系，北卡羅來納州立大學(TomHall,DepartmentofMicrobiology,NorthCarolinaStateUniversity)沐比對和編輯DNA序列從而確定正確的插入。質粒pSalAR_Km—"/R已經被完全測序并且提交至美國國家生物技術信息中心(NCBI),登錄號是DQ202262。監控和研究不動桿菌ADPl_Pu_/^—j^/Ri秀導的方法監控細菌生長和生物發光通過測量相對生物發光(由OD600分出(divide)的生物發光)來監控Pu啟動子活性。對于每一測量，在每個時間點在黑色、透明底96微孔板(FisherScientific)的孔中一式三份地分析lOOjal的樣品。于OD600，4吏用SynergyHT多功能酶才示4義(SynergyHTMulti-DetectionMicroplateReader)(Bio-TekTM)來測量生4勿發光。不同的i秀導物和溫度不動4干菌ADPl_pu—/wx—a:j;/R的單菌落^皮分別接種在30ml的磁璃通用管中的5mlLB培養基中。將曱苯，鄰-、間-或對-二甲苯，苯酚，苯，萘，2-、3-或4-羥基苯曱酸、苯曱酸鹽或兒茶酚加入到LB(100iiM)中從而測-驗Pu的資導。在20、28、30、34或37。C下以150rpm振蕩孵育樣品。在孵育的30小時中，樣品反復加入到黑色96微孔板用于生物發光和OD600測量。在以葡萄糖或琥珀酸鹽作為唯一碳源的J^^養基中生長為了檢驗分解代謝阻遏的影響，將不動桿菌ADPl_pu—/wx_x_y/R接種在30ml玻璃通用管中的添加50mM葡萄糖或琥珀酸鹽作為唯一碳源的5mlMM中。在培養基中分別加入曱苯，鄰-、間-、對-二甲苯(500(iM)作為誘導物。細菌樣品在28°C的振蕩器中以150rpm振蕩孵育。為了鑒定Pu阻遏的信號分子，在不動桿菌ADP1_pu_/wx—x;;/R的生物發光凈皮間-二曱苯最大考呈度地i秀導之后，在MM-葡萄糖培養基中以O.l、1、10、30、60或300pM的終濃度加入6-磷酸葡萄糖酸三鈉鹽(Sigma-Aldrich公司)，其被認為是阻遏的信號分子。對于每一個處理進行三個重復。取樣，每30分鐘測量生物發光和OD600。碳氮比對Pu活性的影響為了檢測碳和氮對Pu活性的影響，將不動桿菌ADP1_pu_/wx_x_y/R分別接種在五種不同的培養基中(1)只是1:2稀釋的lb培養基；(2)具有500kM間-二曱苯的1:2稀釋的lb培養基；(3)具有500(iM間-二甲苯和19mMNH4C1的1:2稀釋的LB培養基；(4)具有500pM間-二曱苯和20mM葡萄糖的1:2稀釋的LB培養基；(5)具有500pM間-二甲苯、20mM葡萄糖和19mMNH4Cl的1:2稀釋的LB培養基。細菌樣品在28。C、150rpm振蕩孵育。在25小時的孵育中，將樣品重復加入黑色96孔孩t孔才反來進4亍生物發光和OD600測量。RNA斑點印跡法(Northern斑點雜交，Northerndotblotting)使用RNA斑點印跡法來^r測在誘導過程中不動桿菌ADP1—Pu__/wx-x_y/R中的x_y/R和o54RNA轉錄水平。不動桿菌ADPLPu」wx-:c;;/R在LB中28°C、150rpm振蕩孵育。在LB培養基中加入間-二甲苯(500|aM),并且在4、8、14和22小時取樣。進4亍三個重復。在每個時間點，才艮據廠商i兌明(QiagenTMRNA/DNA小試劑盒)從取出的1ml試樣中4是取總細胞RNA。對于引物對xy/Rl一for-x少/R—rev和sigma54—for-sigma54_rev(表2),x少/R禾口a54的PCR產物用作DNA模板。x_y/R和a54的PCR產物用作才莫板并且分別標39記(Ambion7^司)。簡單來i兌，將lpl的10mMEDTA加入到具有9fxlDNA產物(100ng4il)的PCR管中。3尋PCR管方文置于沸7jc浴中10min,然后通過干冰迅速冷卻從而產生單鏈DNA4果針。隨后在每個管中迅速加入1ja1補骨脂素-生物素，徹底混合，然后轉移到96孑L板中，其^皮迅速轉移到黑暗中。在365nmUV光下標記4果針45分鐘。最后使用試劑盒(AmbionTM的非同位素標記試劑盒)4是供的方法來純化探針，并且在-80。C冷凍器中儲藏。BrightStar-PlusTM帶正電尼龍膜(AmbionCo.)^皮用于斑點印記法(斑點雜交)。將每個樣品的相同量的總RNA上樣于膜上，并且在80。C固定15分鐘。在膜已經預雜交30分鐘后，通過在NorthemMaxTM雜交》爰沖、液(Ambion)中加入30ng/ml的變性探針并在42°C下孵育12-20小時來進行雜交。以2xSSC和0.5。/。SDS清洗雜交膜兩次30分鐘，然后才艮據廠商i兌明(BrightStarBioDetectTMAmbionCo.)沖企測。在黑暗中將該月莫方丈入到裝有Kodak-牛學成{象月交片(scientificimagingfilm)(Kodak/>司)的盒中。該月交片曝光一'J、時，手工沖洗，并且在室溫下干燥。結果和討論4吏用前述的方法和材沖牛，通過在貝利不動4干菌ADP1的染色體中插入xy/R和pu-/wxCDABE來產生曱苯/二曱苯生物傳感器。受體貝利不動^f菌ADP1細月包4妻受凈果異源DNA并且通過同源重組將其整合到染色體中。貝利不動桿菌ADP1染色體上的s"/A啟動子能夠轉錄位于s"/A與s"/R之間的大的插入片段(insert)(>5.8kb)。表明s"/A與^/R的表達不受插入片段的存在的影響。攜帶插入片段的突變抹能夠在SAA平板(plate)上生長，其中水楊酸鹽用^f乍口眷一的碳源(Huangetal(2005)EnvironmentalMicrobiology7:1339-1348)。在這個實施例中，Pu啟動子凈皮融合到pSalARjia:中從而產生質粒pSalAR—j)u—/wx(圖1A,步驟1)。pSalAR_pu—/wx具有Pu-/wxCDABE側翼的m/A和s"/R同源片,殳，其用作DNA供體。受體不動桿菌突變林ADPW67(其含有由于卡那霉素基因插入而被中斷的s"/A)不能在SAA平^反上生長。在轉化之后，通過與pSalAR_Pu_/"x同源重組，ADPW67的#皮中斷的m/A基因#1恢復，轉化林獲得在SAA上生長的能力。同時，在不動桿菌ADPl一Pu一/w的m/A和m/R之間引入Pu-Zw;cCDABE(圖1A,步驟2)。為了在染色體中引入xy/R，構建質粒pSalA—Km_x_y/R(圖1A,步驟3),并且x_y/R_km側翼連接s"/A的兩個同源片段。使用PSalA_Km—x_y/R作為DNA供體，使用不動桿菌ADPl_pu—/wx作為受體來進行基因轉化。通過在具有10|ig/mlKm的LB上生長來篩選轉化林，并且命名為不動桿菌ADP1—Pu—/wx—xy/R(圖1A,步驟4)。在"/R和Km基因之間引入Km插入片|殳(insert)的終止子，防止RNA聚合酶讀過整個/wxCDABE而不激活Pu啟動子。通過PCR和測序來確定不動桿菌插入片段的染色體結構響應于曱^/二甲苯的不動桿菌ADP1_pu_/wx_jcj;fll惡臭布i單胞菌(pp^,vfe)的TOL質粒的矽/R/Pu調節系統在異源宿主貝利不動桿菌ADP1中起作用。圖IB示出當其被二曱苯氣體(vapor)i秀導時，不動4干菌ADP1—Pu_/wx—;c少/R表現出強烈的生物發光，而未被誘導的細胞仍保持黑暗，顯示了Pu-矽/R調節系統在宿主不動4干菌菌才朱ADP1—Pu—/wx—矽/R中的成功的轉化和功負fe。也就是說，不動桿菌ADP1—Pu—/wx—x少/R可以被i人為是曱苯和二甲苯的生物傳感器。已經發現大量的調節分解代謝途徑的調節系統，它們的基因構成通常包4舌啟動子和調節基因(CasesandLorenzo(2005)NatureReviewsMicrobiology3:105-118;TropelandvanderMeer(2004)MicrobiologyandMolecularBiologyReviews68:474-)。貝禾ll不動才干菌ADP1可以沒有困難地表達異源基因。41普通技術人員會i人識到，通過取4、啟動子和調節基因，所描述4也細菌生物傳感器。以這種方法，該系統可以:帔用于構建寬范圍的可誘導的生物傳感器。與其原始的宿主惡臭假單胞菌相似，不管誘導物是否存在，菌林ADP1—Pu_/mx—x_y/R中的Pu活性只在穩定階段中^皮激活，證明為指凌史沉,默才莫式(圖2)(CasesanddeLorenzo.(2001)EMBOJournal20:1-11and(2005)NatureReviewsMicrobiology3:105-118)。但是，這與以前報道的大腸桿菌(Escherichiacoli)系統形成對比，在大腸桿菌系統中，在細胞暴露于二甲苯之后不久Pu啟動子即被誘導，不會經歷指凄t沉,默(Willardsonetal(1998)AppliedandEnvironmentalMicrobiology64:1006-1012)。與tod系纟克(Applegateetal(1998)AppliedandEnvironmentalMicrobiology64:2730-2735)不同，在30小時的孵育之后，不動桿菌ADPl一Pu一/wx—xy/R的Pu啟動子不能祐L苯酚、苯、萘、2-羥基苯曱酸(水楊酸)、3-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、苯甲酸鹽或兒茶酚誘導。這表明Pu-w/R系統特異性地響應于曱苯、二曱苯或者它們的類似物。苯環的曱基對于誘導;^/R蛋白的正確構象(conformation)可能是重要的。不動桿菌ADP1—PuJwx一j^很的分解^R謝阻遏在它們的自然生境中，當多種碳源可用時，細菌優先利用有利的底物從而節省細胞新陳代謝。細菌通過碳源分解代謝阻遏(CCR)來實現這種調節。在某些(有利)碳源(一般是葡萄糖)的存在下，細菌會阻遏吸收其他的易分解性專交差的石友源所需要的才幾制(BrucknerandTitgemeyer(2002)FemsMicrobiologyLetters209:141-148.)。先前的報道已經證實葡萄糖抑制假單胞菌(尸wwdowowoyw.)和大腸才干菌(五.co//.)的Pu活性(Casesetal(1999)JournalofBiologicalChemistry274:15562-15568)。在該研究中，不動桿菌ADPl—Pu—/mx—xy/R^皮接種于具有50mM葡萄糖或琥珀酸鹽作為唯一碳源、以及曱苯、間-,對-或鄰-二甲苯作為誘導物的基本培養基(MM)中。在該體系中，葡萄糖沒有抑制Pu活性，而琥珀酸鹽抑制了(圖3A)。Case等顯示破壞編碼(磷酸轉移酶系統(PTS)的)IIANtr蛋白的pstN,使惡臭假單胞菌喪失調節葡萄糖阻遏的能力。與假單胞菌和大腸桿菌相反，貝利不動桿菌ADPl不含葡萄糖轉運磷酸轉移酶系統。葡萄糖不能進入貝利不動桿菌ADPl的細胞質，只是在周質中氧化。葡萄糖吸收的這個特性可能造成在不動桿菌ADPl中葡萄糖不能對分解代謝阻遏做出響應(圖3A)。這表明葡萄糖可能直接參與分解代謝阻遏。不動桿菌ADPl不編碼6-磷酸葡萄糖脫氬酶或6-磷酸葡萄糖酸內酯酶的基因。Velazquez等認為6-磷酸葡萄糖酸鹽和/或2-脫氫-3-脫氧磷酸葡萄糖酸鹽可能是惡臭假單胞菌中的Pu抑制的信號分子。在該研究中，特意向菌4朱ADPl_Pu—/wx一xj^R中加入6-石岸酸葡萄庫唐酸鈉鹽沒有影響Pu活性(數據未示出)。這個發現^提示6-磷酸葡萄糖酸鹽單獨不足以抑制Pu活性，它可能幫助縮小Pu抑制的信號分子的候選物。因為基因容易操作的優勢，通過敲除基因和插入新的功能基因，貝利不動桿菌ADP1會使得能夠鑒定介導Pu啟動子調節的信號分子。不動桿菌ADP1和x_y/R/Pu原始宿主惡臭^f艮單力包菌的最適溫度是30。C。在該研究中發現Pu啟動子活性的最佳溫度是28。C,其比在20、34或37°C下高2-54咅(圖3B)。不動桿菌系統中的Pu/jcj很的轉錄調節在不同時間點通過RNA印跡法來檢測不動桿菌菌才朱ADPl_Pu—/wx—xy/R中的"/R和a54mRNA水平(圖4)。雖然，開始時在LB培養基中加入間-二甲苯，但Pu活性保持沉默直到細胞43進入穩定階段(圖4)。如同以前的^L察一樣(Juradoetal(2003)JournalofBacteriology185:3379-3383:Ramosetal(1997)AnnualReviewofMicrobiology51:341-373),RNA印跡法i正實在生長階^:中ADPl一Pu—/m:—x_y/R中的x;;/R的mRNA轉錄水平是組成性(或持續性)轉錄的(圖4B)。但是，cr"的mRNA水平在不同的時間點不同。在8小時，生長曲線(圖4A)顯示細胞開始進入穩定階^a，在這個時間點x_y/R的mRNA水平已經達到與14小時或者22小時時間點相同的水平(圖4B)。與之不同，cr"轉錄水平和Pu活性與14小時或者22小時時間點相比相對4^f氐(圖4B)。在14小時，a"的mRNA水平升高，Pu活性達到其最高水平(圖4B)。這表明，如Cases等在惡臭假單胞菌宿主中發現的，表達、Pu活性和生長階段之間存在直接聯系(Casesetal(1996)MolecularMicrobiology19:7-17.)。實施例2-從水樣品捕獲編碼調節蛋白的基因和啟動子從而產生特定化合物的生物傳感器的方法圖6示意性示出了從水樣品捕獲編碼調節蛋白的基因和啟動子乂人而產生特定化合物的生物傳感器的方法。首先，從7ml的地下7]C樣品中提取總DNA從而提供大于10kb的DNA。從地下水樣品中提取核酸的方法如下，該方法可以依比例調整從而適合使用的地下水的量。首先，50ml地下水經過0.22^im過濾器。然后該過濾器祐j丈置于BIO-101TM管(Q-biogeneTM)中。然后在管中加入1ml的DNA提取緩沖液，并且在65。C的水浴中孵育30min。DNA!是取纟爰沖液含有lOOmMTris—HC1[pH8.0]、100mMEDTA鈉[pH8.0]、100mM磷酸鹽緩沖液[pH8.0]、1.5MNaCl、1%CTAB和水。然后該管核:放置于Fast-prepTM珠磨式組織研磨器(beadbeater),于速度5.5進4亍30秒/人而石皮碎(或裂解，lyse)細胞。然后管在冰上冷卻，并且以14,000rpm離心5分鐘(冷凍)。提:取水相并且加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，充分混合。該管以14,000rpm離心5分鐘。^是耳又上層，通過加入0.6體積的異丙醇(或30%PEG6000/1.6MNaCl)并且充分混合來沉淀DNA。-使該管在實驗臺上于室溫直立力文置1-2小時，然后14,000rpm離心10min。倒4卓上清夜，用200nl的70%乙醇清洗沉淀(pellet)。然后，該管再于14，000rpm離心10min,倒4卓乙醇，留下沉淀在真空裝置中干燥或風干。將該沉淀重新懸浮在50(ilTE纟爰沖液或者水中。隨后使用Sau3AI將從水中分離的DNA部分消化，并且連接到合適的捕獲質粒(trappingplasmid)。4吏用兩種捕獲質粒。第一種質粒，命名為才喿縱子捕獲體(operontrapper,OT)質粒，含有才艮告基因，被設計用于捕獲啟動子。第二種質粒，命名為調節子捕獲體(regulatortrapper，RT)質粒，祐j殳計用于捕獲編碼調節蛋白的基因。兩種質粒都含有貝利不動桿菌ADP1的同源DNA片段。宿主生物體優選是貝利不動桿菌ADP1,優選宿主菌林是AsalR突變林。在AsalR突變抹中，不動桿菌突變株的m/R基因被部分缺失，這4吏其不能在含有水楊酸鹽作為唯一-友源的基本瓊脂(MM)平氺反上生長(Huangetal.,(2005)AnalChem76，4452-4458)。Sau3Al消化的DNA浮皮克隆到OT或RT質粒中，然后通過將質粒轉到大腸桿菌中來擴增質粒，或者更簡z使地通過應用長PCR來擴增(圖6B和6C)。為了將克隆的DNA整合到宿主生物體中，將質粒或PCR產物與不動桿菌菌抹AsalR的感受態細胞混合。整合需要兩個步驟(1)通過水楊酸鹽生長的恢復選擇的潛在啟動子整合；和(2)通過抗生素抗性如卡那霉素選擇的潛在調節基因整合(圖6D)。一旦整合到不動桿菌的染色體中，為編碼調節蛋白的基因(其是來源于RT質粒的DNA)的DNA片段組成性地表達。OT質粒中的克隆的DNA此時被整合到可操作地連接到報告基因的不動桿菌染色體中。隨后將具有兩個整合的DNA序列的不動桿菌暴露于目標化合物。如果細胞含有調節蛋白和在調節蛋白和目標化合物的存在下被激活的啟動子，則會表達報告基因。可以針對報告基因的表達(通過FACS(熒光活化細胞分揀器)用于GFP、或者通過菌落挑取儀用于/wx生物發光、或者通過X-Gal^r測用于lacZ)來篩選細胞。然后可以選擇并分析任何表達報告基因的細胞。使用該方法，可以捕獲編碼調節蛋白的基因和相應的啟動子，產生生物傳感器。可以應用以下方法產生不動才干菌AsalR突變才朱，其中不動^干菌的s"/R基因的一部分已經被缺失，致使其不能在含有水楊酸鹽作為唯一碳源的基本瓊脂(MM)平板上生長(Huangetal.，2005.AnalChem76,4452-4458)。重疊延伸PCR(OEPCR)被用于產生具有所需的限制位點的AsalR融合(在Huangetal.,(2005)AnalChem76,4452-4458中描述了合適的方法)。然后AsalR融合體3皮克隆到pGEM-T載體(PromegaTM)/人而產生pAsalR。隨后用BamHI來消^f匕pAsalR。用BamHI/人pRMJl切下的Km-SacB沖匡(Km-SacBcassette)(JonesandWilliams,AppliedandEnvironmentalMicrobiology69(9):5627-5635Sep2003)然后#L插入到pAsalR從而產生pAsalR—SacB—Km。然后，4要照Huangetal.(2005)AnalChem76,4452-4458中所描述的將pAsalR—SacB—Km轉至不動桿菌ADPWH_/wx，并JU吏用含有10|ig/ml卡那霉素的LB來選4奪突變林。選擇出的突變4朱命名為不動桿菌AsalR_SacB_Km。然后pAsalR轉至不動扦菌AsalR—SacB—Km，并且使用具有50g/L蔗糖的LB篩選突變林，被篩選的突變抹被命名為不動桿菌AsalR。46實施例3-由從萘污染地點分離的DNA池生產與水楊酸鹽反應的細菌生物傳感器在本實施例中，質粒被用于從取自萘污染地點的樣品中提取的DNA池捕獲編碼水楊酸鹽調節基因的基因。然后可將該基因克隆到不動桿菌的突變抹的染色體中，其中salA啟動子可操作地連接到報告基因從而產生水楊酸鹽或萘的生物傳感器。該實施例證明可以由/人環境才羊品回收的DNA;也中分離調節基因。構建不動桿菌AsalR突變林從環境樣品分離水楊酸鹽調節基因的第一步是產生不表達功能性水楊酸鹽調節基因的不動桿菌ADP1突變林。這使用以下步驟來實現1.如前所述(Huangetal.,2005EnvironmentalMicrobiology7:1339-1348)，^吏用重疊延伸PCR(OEPCR)來產生具有所需限制位點的AsalR融合；2.然后將AsalR基因克隆到pGEM-T載體中乂人而產生質粒pAsalR;3.然后用BamHI來消化質粒pAsalR;4.用BamHI,人pRMJl分離Km陽SacB才匡(cassette)(JonesandWilliams,2003AppliedandEnvironmentalMicrobiology69:5627-5635)然后克隆到pAsalR質粒乂人而產生pAsalR—SacB—Km;5.然后，如前所述將質粒pAsalR_SacB—Km轉至不動桿菌ADPWH一/wx(Huangetal.,2005EnvironmentalMicrobiology7:1339-1348),并且使用含有10嗎/mlKm的LB來篩選突變林。該突變才朱凈皮命名為不動4干菌AsalR—SacB—Km。在不動#干菌ADPWH—/wx和不動桿菌AsalR_SacB_Km中，m/A基因可操作地連接到報告基因/wxCDABE;6.然后將pAsalR轉至不動桿菌AsalR—SacB—Km，并且在具有50g/L蔗糖的LB上篩選陽性轉化4朱，產生的突變4朱纟皮命名為不動桿菌AsalR。得到的菌林是^/R基因的突變林，但是攜帶了可操作地連接到/wx報告基因的m/A啟動子。該菌4朱可以用于篩選編碼水楊酸鹽調節蛋白的基因。實際上，步驟1中對^/R基因進行的突變包括在s"/R基因中缺失4個石咸基，并且引入BglII限制酶位點，如下所示基因)CG----AGATCTCTACCGGGCATACTCAGGTC(缺失4bp并具有BglII位點的AsalR)在m/R基因中缺失4個石咸基造成石皮壞的水楊酸鹽調節蛋白，其不能響應于水楊酸鹽，因此不動桿菌的5""/A啟動子不被激活，在水楊酸鹽的存在下/wx基因不表達。在圖10中示出了m/R基因的失活的效果。但是，如果在不動桿菌突變抹中存在起作用的m/R基因，那么在水楊酸鹽的存在下，s"/R調節蛋白可以激活s"/A啟動子并JU秀導可操作地連接到^/A啟動子的報告基因的表達。在本實施例中，報告基因是生物發光基因/wxCDABE。通過使用生物傳感器的生物發光，可以原位快速(一般少于15min)鑒定陽性克隆。GFP可替才灸地4皮才艮告，4旦是在可#皮才全測前，它需要更多的時間成熟(mature)。創建環境DNA的克隆文庫在分離水楊酸鹽調節的第二階段是從環境樣品獲得DNA池。在這種情況中，從英國(UK)的萘污染地下水地點提取DNA池。使用實施例2中介紹的方法/人水中提取DNA。分離的DNA用Sau3AI部分消化，并克隆到"捕獲質粒"pRK415中。然后通過電穿孔將pRK415轉化到不動4干菌AsalR突變4朱中。pRK415能夠在不動桿菌ADP1中復制并且可以表達任何克隆到其中的基因。通過涂布在添加了6lag/ml四環素和2mM水楊酸鹽的LB上來篩選不動桿菌AsalR轉化才朱。在可替換的實施方案中，克隆的DNA可在這個階段被整合到宿主的染色體中，這可以通過引入與宿主染色體同源的側翼序列來實現。篩選"捕獲"xM^酸鹽調節基因的轉化林然后才艮據生物發光表達來篩選生長在添加了6(xg/ml四環素和2mM7jc楊酸鹽的LB上的不動桿菌AsalR轉化抹。理論是，能夠在水楊酸鹽的存在下顯示生物發光，即能夠激活可4喿作地連接到不動桿菌AsalR的/wx基因上的salA啟動子的轉化林必定表達m/A的調節蛋白。在本實施例中，調節蛋白由質粒表達。在產生的多于4000個轉化抹中發現有3個生物發光陽性轉化林。圖11示出陽性轉化林(轉化抹A)的生物發光表達和陰性轉化林(轉化林B)沒有生物發光。證明轉化;昧A在水楊酸鹽的存在下，發生生物發光，顯示轉化林A已經從環境樣品提取的DNA池捕獲了水楊酸鹽調節基因，其能夠補償不動桿菌AsalR攜帶的^/R基因突變。沒有任何的生物發光，證實突變株B(其是4000個陰性突變林之一)不能被水楊酸鹽激活，顯示轉化抹B沒有攜帶捕獲的水楊酸鹽調節基因。質粒提取和DNA測序為了證實轉化林A,以及實際上另外兩個陽性轉化林，已經捕獲了水楊酸鹽調節基因，使用煮沸裂解法來從三個生物發光陽性轉化林提取pRK415捕獲質粒(Sambrooketal.,1989M/簡/arc/畫'"g:"/"Zor",o^yw"ww"/:ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y)。圖12中示出了瓊脂糖凝膠上跑出的提取的質粒DNA樣品。提取的質粒的測序可以被用于證實被克隆的基因確實是水楊酸鹽調節基因。總之，本實,瞼證明不動桿菌ADP1的突變4朱可以被成功地用于從環境樣品捕獲基因。在本實施例中，使用基于質粒的系統捕荻/克隆了由水楊酸鹽激活的調節基因，4旦是可以用相同的原理來克隆其他的調節基因，和/或克隆感興趣的啟動子。一旦纟皮捕獲，調節基因和/或感興趣的啟動子可以^皮整合到不動桿菌的染色體DNA中從而產生生物傳感器。在本實施例中，捕獲的調節基因可以^皮整合到不動桿菌AsalR的染色體中(如前所述)乂人而取4戈突變的salR基因，伊乙選^皮:沒計為其^L成性:l也表達/人而產生用于4企測水楊酸鹽的生物傳感器。權利要求1.一種生產用于特定化合物的生物傳感器的方法，包括(a)鑒定所述特定化合物；(b)獲得DNA池；(c)將來自所述DNA池的DNA片段克隆到一種或兩種質粒中的第一和第二位點；(d)將所述克隆的DNA整合到宿主生物體的染色體中，其中來自所述質粒中的所述第一位點的DNA在第一位置被整合到所述染色體中，使得它將在所述宿主生物體中被表達，并且來自所述質粒中的所述第二位點的DNA在第二位置被整合到所述染色體中，使得所述克隆的DNA被可操作地連接至報告基因；(e)將所述特定化合物施加至所述宿主生物體；和(f)對所述報告基因的表達進行篩選。2.—種鑒定(i)編碼響應于特定化合物的調節蛋白的基因和(ii)由所述調節蛋白和所述特定化合物激活的啟動子的方法(a)鑒定所述特定化合物；(b)獲得DNA池；(c)將來自所述DNA池的DNA片4殳克隆到一種或兩種質粒中的第一和第二位點，使得當所述質粒凈皮轉化到宿主生物體中時在所述第一位點的DNA將被表達，并且在所述第二位點的DNA被可操作地連接至報告基因；(d)用所述一種或兩種質粒轉化宿主生物體；(e)將所述特定化合物施加至所述壽爭4b的宿主生物體；和(f)對所述報告基因的表達進行篩選。3.—種鑒定編碼響應于特定化合物的調節蛋白的基因的方法，包括(a)鑒定特定化合物；(b)獲得DNA池；(c)將來自所述DNA池的DNA片革殳克隆到質粒中；(d)將所述克隆的DNA整合到宿主生物體的染色體中，寸吏得所述克隆的DNA將在所述宿主生物體中^皮表達，其中所述染色體已經攜帶可操作地連接至報告基因的啟動子，并且其中已知所述啟動子在所述特定化合物和未知調節蛋白的存在下#1激活；(e)將所述特定化合物施加至所述宿主生物體；和(f)對所述報告基因的表達進行篩選。4.一種鑒定編碼響應于特定^:合物的調節蛋白的基因的方法，包括(a)鑒定所述特定化合物；(b)獲得DNA片段池；(c)將來自所述DNA池的DNA片段克隆到質粒中，使得當所述質粒被轉化到宿主生物體中時，所述克隆的DNA將被表達；(d)用含有所述克隆的DNA的所述質4立轉化宿主生物體，其中所述宿主生物體攜帶可操作地連接至報告基因的啟動子，并且其中已知所述啟動子在所述特定化合物和未知調節蛋白的存在下^皮激活；(e)將所述特定化合物施加至所述轉化的宿主生物體；和(f)對所述報告基因的表達進行篩選。5.一種鑒定由響應于特定化合物的調節蛋白激活的啟動子的方法，包4舌(a)鑒定特定化合物；(b)獲得DNA池；(c)將來自所述DNA池的DNA片,爻克隆到質粒中；(d)將所述克隆的DNA整合到宿主生物體的染色體中，《吏得所述克隆的DNA^皮可4喿作地連"I妄至才艮告基因，其中所述因；'-；、'、。工、、(e)將所述特定化合物施加至所述宿主生物體；和(f)對所述報告基因的表達進行篩選。6.一種鑒定由響應于特定化合物的調節蛋白激活的啟動子的方法，包括(a)鑒定所述特定化合物；(b)獲得DNA片段池；(c)將來自所述DNA池的DNA片,殳克隆到質粒中，使得所述克隆的DNA^皮可才喿作地連4妄至凈艮告基因；(d)用含有所述克隆的DNA的所述質4立轉化宿主生物體，其中所述宿主生物體攜帶編碼響應于所述特定化合物的調節蛋白的基因；(e)將所述特定化合物施加至所述轉化的宿主生物體；和(f)對所述報告基因的表達進行篩選。7.—種生產用于檢測特定化合物的生物傳感器的方法，包括(a)將編碼響應于所述特定化合物的調節蛋白的基因克隆到第一質粒中的第一位置；(b)將在所述調節蛋白和所述特定化合物存在下被激活的啟動子克隆到所述第一質粒中的第二位置或第二質粒中；(c)將編碼所述調節蛋白的所述克隆的基因和所述克隆的啟動子整合到宿主生物體的染色體中，其中所述啟動子可操作地連4妄至用于4企測所述啟動子的激活的元件。8.—種生產生物傳感器的方法，包4舌將通過4又利要求2、4或6中任一項所述的方法鑒定的基因和/或啟動子整合到宿主生物體的染色體中的步驟。9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述特定化合物是環境致污物或污染物。10.根據權利要求1至6或8中任一項所述的方法，其中通過從被所述特定化合物污染的樣品中分離DNA而獲得所述DNA池。11.根據權利要求1至6、8或9中任一項所述的方法，其中從土:泉、地下水、任何水體、空氣、人或非人機體或體液的樣品，或任何其他合適的樣品獲得所述DNA池。12.4艮據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述克隆的DNA一皮整合到所述宿主生物體的染色體中，其中所述DNA直4妄/人一種或多種質粒被整合到所述染色體中，或者它通過PCR被擴增且所述PCR片賴j皮整合到所述染色體中。13.根據權利要求12所述的方法，其中通過同源重組將所述克隆的序列整合到所述宿主生物體的染色體中。14.根據權利要求l、2或7所述的方法，其中在所述第一位置整合到所述宿主染色體中或所述質并立中的所述第二位點的DNA^皮i殳計成在所述宿主生物體中組成性地表達。15.根據權利要求l、2或7所述的方法，其中在所述第二位置整合到所述宿主染色體中或所述質粒中的所述第二位點的DNA被設計成可操作地連接至報告基因進行定位。16.根據權利要求3或4所述的方法，其中所述克隆的DNA在所述宿主生物體中組成性地表達。17.根據權利要求5或6所述的方法，其中至少在試驗條件下，編碼所述調節蛋白的所述基因在所述宿主生物體中組成性地表達。18.才艮據前述任一項4又利要求所述的方法，其中編碼所述調節蛋白的所述基因、和/或所述啟動子，對于所述宿主生物體是異源的。19.根據權利要求9所述的方法，其中所述化合物選自包括芳香族溶劑、氯化化合物、硝酸鹽和來自農業徑流的殺蟲劑、燃料、溶劑、推進劑、殺蟲劑的成分，以及這些化合物的任何降解產物或它們的組合的組。20.根據權利要求1或8所述的方法，其中所述生物傳感器只檢測生物可利用的化合物。21.才艮據前述任一項4又利要求所述的方法，其中所述宿主生物體具有大于10—6的感受性。22.才艮據前述任一項纟又利要求所述的方法，其中所述宿主生物體顯示約0.1%的整合率。23.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述宿主生物體是不動桿菌物種或假單胞菌物種的細菌，或任何其他的y細菌物種的細菌。24.根據權利要求23所述的方法，其中所述宿主生物體是貝利不動桿菌。25.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中用于檢測所述啟動子的激活的元件或所述報告基因是表達(3-半乳糖苷酶的基因，或是一種或多種螢火蟲熒光素酶基因，或是綠色熒光蛋白(GFP)基因。26.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述克隆的啟動子和/或編碼所述調節蛋白的所述克隆的基因源自生物體代謝所述特定化合物所使用的操縱子。27.根據權利要求l、7或8所述的方法，其生產能夠檢測納摩爾水平的特定4b合物的生物傳感器。28.—種才企測樣品中是否存在特定化合物的方法，包括(a)使根據權利要求1、7或8中任一項所述的方法制得的生物傳感器接觸所述樣品；(b)觀察所述報告基因的表達/所述用于4企測所迷啟動子的激活的元件的表達在所述生物傳感器中是否升高。29.—種用于檢測樣品中的化合物的試劑盒，包含根據權利要求1至8中4壬一項所述的方法制得的生物傳感器和4吏用所述生物傳感器的說明書。30.根據權利要求29所述的試劑盒，其中所述生物傳感器設置在容器中，所述容器將釋放所述生物傳感器到環境中的機會降到最低。31.—種用于生產生物傳感器的試劑盒，包含具有兩個克隆位點的一種或兩種質粒，每個質粒上一個位點或一個質粒上兩個^f立點，以及利用權利要求1至27中任一項所述的方法的說明書。32.根據權利要求31所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括宿主生物體。33.利用4又利要求1至27中任一項所述的方法生產的生物傳感器。全文摘要本發明涉及用于生產用來檢測特定化合物的生物傳感器、用于鑒定編碼響應于特定化合物的調節蛋白的基因以及用于鑒定編碼響應于特定化合物的調節蛋白的基因的新方法。文檔編號C12N15/09GK101605888SQ200780049145公開日2009年12月16日申請日期2007年11月7日優先權日2006年11月7日發明者安德魯·懷特利,巍黃申請人:自然環境研究委員會