用胎盤細胞群治療骨缺損的方法和組合物的制作方法

專利名稱：用胎盤細胞群治療骨缺損的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發明提供了分離的胎盤細胞，例如胎盤灌洗液，貼壁的和非貼壁的
胎盤干細胞，胎盤干細胞群，包含該干細胞的組合物，獲^U亥干細胞的方
法，配制包含該干細胞的組合物的方法，和用該干細胞和組合物治療骨缺 損的方法。
2.
背景技術：
人類干細胞是能夠產生多種成熟的人體細胞系的全能或多潛能前體 細胞。有證據表明，干細胞可以用來再生許多(如果不是所有)組織，并恢 復生理學和解剖學功能。
許多不同類型的哺乳動物干細胞已經得到表征。例如，參見Caplan 等人，美國專利號5，486，359(人間充質干細胞)；Boyse等人，美國專利號 5，004,681(胎兒和新生兒的造血干細胞和祖細胞)；Boyse等人， U.S.5,192，553(同前);Beltrami等人，Cell 114(6):763-766 (2003)(心臟干細 胞)；Forbes等人，J. Pathol. 197(4):510-518 (2002)(肝干細胞)。臍血和取 自臍帶血的總有核細胞已被用于移植，以部分或全部恢復經歷了消融療法 的患者的造血功能。
3. 發明概述
本發明提供了分離的胎盤細胞，例如胎盤灌洗液，貼壁的和非貼壁的 胎盤干細胞，胎盤干細胞群，包含該細胞的組合物，獲得該胎盤細胞的方法，配制該組合物的方法，和用這些細胞治療骨缺損的方法。
本發明提供了分離的干細胞和包含這種干細胞的細胞群，其中該干細 胞存在于胎盤組織(例如羊膜、絨毛膜、胎盤小葉、臍帶等)并可從中分離， 它們在修復骨缺陷中有用。胎盤干細胞表現出干細胞的 一 個或多個特征 (例如表現出與干細胞相關的標記，在培養中以未分化狀態復制至少10-20 次，分化成代表三個胚層的成體細胞等)，并能貼壁到組織培養基質(例如 組織培養塑料，如組織培養皿或多孔板的表面)上。
在一實施方案中，本發明提供了分離的非貼壁胎盤干細胞。在某些實
施方案中，所述分離的千細胞是CD34+的。在某些實施方案中，該分離的 干細胞是CD44—的。在某些實施方案中，該分離的干細胞是CD34+和CD44' 的。在某些實施方案中，該分離的干細胞是CD9+ 、 CD54+ 、 CD90+或CD 166+ 的。在某些實施方案中，該分離的干細胞是CD9+、 CD54+ 、 CD90+和CD 166+ 的。在某些實施方案中，該分離的干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+或 〔0200+的。在某些實施方案中，該分離的干細胞是€031+、。0117+、€0133+ 和CD200+的。在某些實施方案中，該分離的干細胞已經通過酶消化從人 胎盤組織分離。在某些實施方案中，該分離的干細胞已經通過灌洗從人胎 盤中分離。在某些實施方案中，當所述胎盤細胞群在允許礦化基質形成的 條件下培養時，該分離的干細胞有利于在胎盤細胞群中形成礦化基質。
在另一實施方案中，本發明提供了分離的非貼壁胎盤細胞的群。在某 些實施方案中，該細胞群包括CD34+干細胞。在某些實施方案中，該細胞 群包括CD44-干細胞。在某些實施方案中，該細胞群包括CD34+和CD4《 干細胞。在某些實施方案中，該細胞群包括CD9+、CD54+、CD90+或CD166+ 干細胞。在某些實施方案中，該細胞群包括CD9+、 CD54+ 、 CD90+和CD 166+干細胞。在某些實施方案中，該細胞群包括CD31+、 CD117+、 CD133+或 €0200+干細胞。在某些實施方案中，該細胞群包括〔031+、00117+、€0133+ 和CD200+干細胞。在某些實施方案中，該細胞群包括干細胞，其中至少 有大約70%的所述細胞是CD34+和CD44—干細胞。在某些實施方案中，該 細胞群包括干細胞，其中至少有大約90%的所述細胞是CD34+和CD44' 干細胞。在某些實施方案中，該細胞群已經被擴增。在某些實施方案中， 該細胞群已經被傳代至少 一 次。在某些實施方案中，該細胞群已經被傳代 至少5次。在某些實施方案中，該細胞群已經被傳代至少10次。在某些 實施方案中，該細胞群已經被傳代至少20次。在某些實施方案中，當所 述胎盤細胞群在允許礦化基質形成的條件下培養時，該細胞群在胎盤細胞 群中形成或有利于形成礦化基質。
在另一方面，本發明提供了分離的CD34+和CD44—胎盤干細胞的群。 在某些實施方案中，該干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+或CD166+的。在 某些實施方案中，該干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+和CD166+的。在某 些實施方案中，該干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+或CD200+的。在某 些實施方案中，干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+和CD200+的。在某些 實施方案中，至少約70。/o的該干細胞是CD34+和CD44—干細胞。在某些實 施方案中，至少約90。/。的該干細胞是CD34+和CD44-的干細胞。在某些實 施方案中，該細胞群已經被擴增。在某些實施方案中，該細胞群已經被傳 代至少一次。在某些實施方案中，該細胞群已經被傳代至少5次。在某些 實施方案中，該細胞群已經被傳代至少10次。在某些實施方案中，該細 胞群已經被傳代至少20次。在某些實施方案中，當所述胎盤細胞群在允 許礦化基質形成的條件下培養時，該細胞群在胎盤細胞群中形成或有利于形成-;Mt基質。
在一實施方案中，本發明提供了分離的CD200+或HLA-G+胎盤干細胞。 在具體實施方案中，該干細胞是貼壁的。在另一具體實施方案中，所述細胞 是CD200+和HLA-G+的。在具體實施方案中，所述干細胞是CD73+和CD105+ 的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD34—、 CD38—或CD45—的。在另 一具體實施方案中，所述干細胞是CD34'、 CD3K和CD45—的。在另 一具體實 施方案中，所述干細胞是CD34-、 CD38\ CD45_、 CD73+和CD105+的。在另 一具體實施方案中，當所述胎盤細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時，
所述干細胞有利于在包括胎盤干細胞的分離的胎盤細胞的群中形成 一 個或多 個擬胚^本。
在另一實施方案中，本發明提供了包括CD200+、 HLA-G+干細胞的分離 的胎盤細胞的群。在具體實施方案中，所述干細胞是貼壁的。在各種實施方 案中，至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、 至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少在90%、或至少約95%或以上 的所述分離的胎盤細胞是CD200+、 HLA-G+干細胞。在上述細胞群的一具體 實施方案中，所述干細胞是CD73+和CD105+的。在另一具體實施方案中，所 述干細胞是CD3《、CD38、戈CD45H在更具體的實施方案中，所述干細胞 是CD34-、 CD38-、 CD45-、 CD73+和CD105+的。在其他具體實施方案中，所 述細胞群已經被擴增，例如，傳代至少一次、至少3次、至少5次、至少IO 次、至少15次、或至少20次。在另一具體實施方案中，所述細胞群在允許 擬胚體形成的條件下培養時，形成一個或多個擬胚體。
在另一實施方案中，本發明提供了分離的CD73+、 CD105+和CD200+胎 盤干細胞。在具體實施方案中，所述干細胞是貼壁的。在另一具體實施方案
8中，所述干細胞是HLA-G+的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD3《、 CD38—或CD45H在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD34-、 CD38—和 CD45—的。在更具體的實施方案中，所述千細胞是CD34—、 CD38_、 CD45—和 HLA-G+的。在另一具體實施方案中，當所述胎盤細胞群在允許擬胚體形成的 條件下培養時，所述干細胞有利于在包括該干細胞的分離的胎盤細胞的群中
形成一個或多個擬胚體。
在另一實施方案中，本發明提供了包括CD73+、 CD105+、 CD200+干細胞 的分離的胎盤細胞的群。在具體實施方案中，所述干細胞是貼壁的。在各種 實施方案中，至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約 50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少在90%、或至少約95% 的所述分離的胎盤細胞為CD73+、 CD105+、 CD200+干細胞。在所述細胞群的 另一具體實施方案中，所述干細胞是HLA-G+的。在另一具體實施方案中， 所述干細胞是CD34—、 CD38—或CD45—的。在另一具體實施方案中，所述干細 胞是CD3《、CD3&和CD45—的。在更具體的實施方案中，所述干細胞是CD34'、 CD38\ CD45—和HLA-G+的。在其他具體實施方案中，所述細胞群已經被擴 增，例如，傳代至少一次、至少3次、至少5次、至少10次、至少15次、 或至少20次。在另 一具體實施方案中，所述細胞群在允許擬胚體形成的條件 下在培養中形成一個或多個擬胚體。
本發明還提供了 CD200+和OCT-4+的分離的胎盤干細胞。在具體實施方 案中，所述千細胞是貼壁的。在另一具體實施方案中，該干細胞是CD73+和 CD105+的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是HLA-G+的。在另 一具體 實施方案中，所述干細胞是CD34-、 CD38-或CD45—的。在另一具體實施方案 中，所述干細胞是CD34-、 CD38-和CD45—的。在更具體的實施方案中，所述干細胞是CD3《、CD38-、 CD45-、 CD73+、 CD105+和HLA-G+的。在另一具 體實施方案中，當所述胎盤細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時，所述 干細胞有利于在包括胎盤干細胞的分離的胎盤細胞的群中形成一個或多個擬 胚體。
在另一實施方案中，本發明提供了包括CD2()()+、 OCT-4+胎盤干細胞的 分離的胎盤細胞的群。在具體實施方案中，所述干細胞是貼壁的。在各種實 施方案中，至少約10%、至少約20°/。、至少約30%、至少約40%、至少約 50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、或至少約95°/0 的所述分離的胎盤細胞為CD200' 、 OCT-4'干細胞。在上述細胞群的具體實 施方案中，所述干細胞是CD73+和CD105+的。在另一具體實施方案中，所 述干細胞是HLA-G+。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD34'、 CD38' 和CD45H在更具體的實施方案中，所述千細胞是CD3《、CD38\ CD45\ CD73+、 CD105+和HLA-G+的。在其他具體實施方案中，所述細胞群已經被 擴增，例如，已經被傳代至少一次、至少3次、至少5次、至少10次、至少 15次、或至少20次。在另一具體實施方案中，所述細胞群在允許擬胚體形 成的條件下的培養時形成 一 個或多個擬胚體。
在另一實施方案中，本發明4是供分離的CD73+和CD105+胎盤干細胞，當 所述胎盤細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時，其有利于在包括所述干 細胞的分離的胎盤細胞的群中形成 一 個或多個擬胚體。在具體實施方案中， 所述干細胞是貼壁的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD34—、 CD38— 或CD45—的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD3《、CD38'和CD45— 的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是OCT4+的。在更具體的實施方案 中，所述干細胞是OCT4+、 CD34\ CD38和CD45的。
10本發明進一步4是供了包括CD73+、 CD105+胎盤干細胞的分離的胎盤細胞 的群，其中，所述細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時形成一個或多個 擬胚體。在具體實施方案中，所述干細胞是貼壁的。在各種實施方案中，至 少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約 60% 、至少約70% 、至少約80% 、至少約卯％ 、或至少約95%的所述分離的 胎盤細胞為CD73+、 CD105+干細胞。在上述細胞群的具體實施方案中，所述 干細胞是CD3《、CD3^或CD45—的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是 CD34-、 CD38-和CD45—的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是0CT-4+ 的。在更具體的實施方案中，所述干細胞是OCT-4+、 CD34\ CD38—和CD45— 的。在其他具體實施方案中，所述細胞群已經被擴增，例如，已經被傳代至 少一次、至少3次、至少5次、至少10次、至少15次、或至少20次。
本發明還提供了分離的CD73+、 CD105+和HLA-G+胎盤干細胞。在具體 實施方案中，所述干細胞是貼壁的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是 CD34\ CD38-或CD45—的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD34-、 CD38—和CD45—的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是OCT-4+的。在另 一具體實施方案中，所述干細胞是CD200+的。在另一更具體實施方案中，所 述干細胞是CD34-、 CD38'、 CD45_、 OCT-4+和CD200+的。在另一具體實施 方案中，所述干細胞在允許擬胚體形成的條件下培養時有利于在包括胎盤干 細胞的分離的胎盤細胞的群中形成 一 個或多個擬胚體。
本發明還提供了 CD73+、 CD105+和HLA-G+胎盤干細胞的分離的胎盤干 細胞的群。在具體實施方案中，該干細胞是貼壁的。在各種實施方案中，至 少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約 60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、或至少約95%的所述分離的胎盤細胞為CD73+、 CD105+和HLA-G+干細胞。在上述細胞群的具體實施方 案中，所述干細胞是CD3《、CD3^或CD45-的。在另一具體實施方案中，所 述干細胞是CD3《、CD38'和CD45—的。在另一具體實施方案中，所述干細胞 是OCT-4+的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD200+的。在另一更 具體實施方案中，所述干細胞是CD34—、 CD38_、 CD45—、 OCT-4+和CD200+ 的。在另一具體實施方案中，所述細胞群已經被擴增，例如，已經被傳代至 少一次、至少3次、至少5次、至少10次、至少15次、或至少20次。在另 一具體實施方案中，所述細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時形成擬胚 體。
本發明還提供了分離的OCT-4+胎盤干細胞，在允許擬胚體形成的條件下 培養時，其有利于在包括所述干細胞的分離的胎盤細胞的群中形成一個或多 個擬胚^^。在具體實施方案中，所述干細胞是貼壁的。在另一具體實施方案 中，所述干細胞是CD73+和CD105+的。在另一具體實施方案中，所述干細胞 是CD34—、 CD38—或CD45—的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是00200+ 的。在更具體的實施方案中，所述干細胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34'、 CD38和CD45的。
本發明還提供了包括OCT-4+胎盤干細胞的分離的胎盤細胞的群，其中， 所述細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時形成一個或多個擬胚體。在具 體實施方案中，所述干細胞是貼壁的。在各種實施方案中，至少約10%、至 少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約 70%、至少約80%、至少約90%、或至少約95%的所述分離的胎盤細胞為 OCT-4+干細胞。在上述細胞群的具體實施方案中，所述干細胞是CD73+和 CD105+的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD34—、 CD38'或CD45—的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD200+的。在更具體的實施方案
中，所述干細胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34-、 CD38.和CD45.的。 在另一具體實施方案中，所述細胞群已經被擴增，例如，被傳代至少一次、 至少3次、至少5次、至少10次、至少15次、或至少20次。
本發明進一步拔:供了本文所述的貼壁或非貼壁胎盤干細胞的分離群，該 細胞群根據如下方法生成，該方法包括灌洗已經排出了臍血并已經灌洗了 的哺乳動物胎盤以除去殘余血；用灌洗液灌洗所述胎盤；和收集所述灌洗液， 其中灌洗后的所述灌洗液包括包含胎盤干細胞的胎盤細胞群；和從所述細胞 群中分離多種所述胎盤干細胞。在具體實施方案中，該灌洗液流過臍靜脈和 臍動脈，然后在其從胎盤流出后收集。在另一具體實施方案中，所述灌洗液 通過臍靜脈，而從臍動脈收集，或通過臍動脈，而從臍靜脈收集。
本發明進一步^是供了分離的胎盤干細胞或分離的胎盤干細胞的群，如本
文所述，其才艮據如下方法生成，該方法包括用組織裂解酶消化胎盤組織以 獲得包括胎盤干細胞的胎盤細胞群，并從所述胎盤細胞的殘余物中分離多種 胎盤干細胞。在具體實施方案中，所述胎盤組織是整個胎盤、羊膜、絨毛膜、 羊膜和絨毛膜的組合，或上述任意幾項的組合。在其他具體實施方案中，該 組織裂解酶是胰蛋白酶或膠原蛋白酶。
在更具體的實施方案中，本發明提供了分離的胎盤干細胞，其中所述干 細胞相對于骨髓來源的間充質干細胞以可檢測的更高水平表達一個或多個基 因，其中所述一個或多個基因為ACTG2、 ADARB1、 AMIG02、 ATRS-1、 B4GALT6、 BCHE、 Cllorf9、 CD200、 COL4Al、 COL4A2、 CPA4、 DMD、 DSC3、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1、 FLJ10781、 GATA6、 GPR126、 GPRC5B、 ICAM1、 IER3、 IGFBP7、 IL1A、 IL6、 IL18、 KRT18、 KRT8、 LIPG、 LRAP、
13MATN2、 MEST、 NFE2L3、 NUAK1、 PCDH7、 PDLIM3、 PJP2、 RTN1 、 SERPINB9、 ST3GAL6、 ST6GALNAC5、 SLC12A8、 TCF21、 TGFB2、 VTN 和/或ZC3H12A ，并且其中所述骨髓來源的干細胞已經進行過多次培養傳代， 其次數相當于所述胎盤干細胞的傳代次數。在更具體的實施方案中，所述胎 盤干細胞相對于骨髓來源的間充質干細胞以可檢測的更高水平表達ACTG2 、 ADARB1 、 AMIG02、 ATRS-1 、 B4GALT6、 BCHE、 Cl lorf 9、 CD200、 C0L4A1 、 COL4A2、 CPA4、 DMD、 DSC3、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1 、 FLJ10781 、 GATA6、 GPR126、 GPRC5B、 ICAM1、 IER3、 IGFBP7、 IL1A、 IL6、 IL18、 KRT18、 KRT8、 UPG、 LRAP、 MATN2、 MEST、 NFE2U、 NUAK1、 PCDH7、 PDUM3、 PJP2、 RTN1、 SERP躍9、 ST3GAL6、 ST6GALNAC5、 SLC12A8、 TCF21、 TGFB2、 VTN和ZC3H12A。
在更具體的實施方案中，本發明還提供了分離的胎盤干細胞的群，其中 所述干細胞群相對于骨髓來源的間充質干細胞群以可檢測的更高水平表達一 個或多個基因，其中所述一個或多個基因為ACTG2、 ADARB1、 AMIG02、 ATRS-1、 B4GALT6、 BCHE、 Cllorf9、 CD200、 COL4Al、 COL4A2、 CPA4、 DMD、 DSC3、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1、 FLJ10781、 GATA6、 GPR126、 GPRC5B、 ICAM1、 IER3、 IGFBP7、 IL1A、 IL6、 IL18、 KRT18、 KRT8、 LIPG、 LRAP、 MATN2、 MEST、 NFE2L3、 NUAK1、 PCDH7、 PDUM3、 PJP2、 RTN1、 SERPINB9、 ST3GAL6、 ST6GALNAC5、 SLC12A8、 TCF21、 TGFB2、 VTN 和/或ZC3H12A，并且其中所述骨髓來源的干細胞的群已經進行過多次培養 傳代，其次數相當于所述胎盤干細胞的傳代次數，其中所述骨髓來源的干細 胞的群具有與所述分離的干細胞的群相當的細胞數。在更具體的實施方案中， 所述分離的干細胞的群相對于骨髓來源的間充質干細胞群以可檢測的更高水平表達ACTG2、 ADARBl、 AMIG02、 ATRS-1、 B4GALT6、 BCHE、 Cllorf 9、 CD200、 COL4Al、 COL4A2、 CPA4、 DMD、 DSC3、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1、 FLJ10781、 GATA6、 GPR126、 GPRC5B、 ICAM1、正R3、 IGFBP7、 IL1A、 IL6、 IL18、 KRT18、 KRT8、 LIPG、 LRAP、 MATN2、 MEST、 NFE2L3、 NUAK1 、 PCDH7、 PDLIM3 、 PJP2 、 RTN1 、 SERP騰9 、 ST3GAL6 、 ST6GALNAC5、 SLC12A8、 TCF21、 TGFB2、 VTN和ZC3H12A。
本發明還提供了包含一種或多種所述胎盤細胞，例如本發明所提供的胎 盤灌洗液、胎盤灌洗細胞或胎盤干細胞的組合物，其中所述細胞已從胎盤分 離。在優選實施方案中，所述包含胎盤細胞的組合物可用于修復骨缺損。因 此，本發明4是供了包含胎盤灌洗液，或從胎盤灌洗液中分離的細胞，例如來 自胎盤灌洗液的總有核細胞的組合物。
在一方面，本發明^是供了包含胎盤灌洗液或胎盤灌洗細胞，例如來自胎 盤灌洗液的總有核細胞的組合物。
本發明進一步提供了包含胎盤干細胞的組合物，其中所述干細胞是分離 的非貼壁胎盤干細胞。在某些實施方案中，所述干細胞是CD34+的。在某些 實施方案中，所述干細胞是CD44—的。在某些實施方案中，所述干細胞是 CD34+和CD44-的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+ 或CD166+的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+和 CD166+的。在某些實施方案中，所述千細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+或 CD200+的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+和 CD200+的。在某些實施方案中，所述干細胞已通過酶消化從人胎盤中分離。 在某些實施方案中，所述干細胞已通過灌洗從人胎盤分離。在某些實施方案 中，當所述胎盤細胞群在允許礦化基質形成的條件下培養時，所述細胞有
15利于在胎盤細胞群中形成礦化基質。
在另一個方面，本發明才是供了包含胎盤干細胞的組合物，其中所述干細
胞是分離的CD34+和CD44—干細胞。在某些實施方案中，所述干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+或CD166+的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+和CD166+的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+或CD200+的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+和CD200+的。在某些實施方案中，所述干細胞已通過酶消化從人胎 盤中分離。在某些實施方案中，所述干細胞已通過灌洗從人胎盤分離。在某 些實施方案中，當所述胎盤細胞群在允許礦化基質形成的條件下培養時， 所述細胞有利于在胎盤細胞群中形成礦化基質。
在某些實施方案中，所述組合物包含本發明所提供的分離的干細胞和誘 導該干細胞分化成成骨細胞的化合物。在某些實施方案中，該組合物包含本 發明所提供的分離的干細胞或分離的干細胞的群，和誘導所述干細胞群中的 多種干細胞分化成成骨細胞的化合物。在某些實施方案中，這種化合物是地 塞米;^或4元壞血酸。
在某些實施方案中，本發明提供了包含分離的胎盤干細胞的組合物， 其中所述干細胞是CD200+和HLA-G+的。在具體實施方案中，所述干細 胞是貼壁的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD73+和CD105+的。 在另一具體實施方案中，所述千細胞是CD34'、 CD3&或CD45—的。在另一 具體實施方案中，所述干細胞是CD34'、 CD38—和CD45—的。在更具體的實 施方案中，所述干細胞是CD3《、CD38-、 CD45-、 CD73+、 CD105+、 CD200+ 和HLA-G+的。
在另一實施方案中，本發明4是供了包含分離的胎盤干細胞的組合物，其中所述干細胞是CD73+、 CD10夂和CD^0+的。在具體實施方案中，所述干 細胞是貼壁的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是HLA-G+的。在另一 具體實施方案中，所述干細胞是CD3《、CD38、戈CD45'的。在另一具體實施 方案中，所述干細胞是CD3《、CD38—和CDW的。在更具體的實施方案中， 所述干細胞是CD34-、 CD38'、 CD45—和HLA-G+的。
在另一實施方案中，本發明拔J共了包含分離的胎盤干細胞的組合物，其 中所述干細胞是CD200+和OCT-4+的。在具體實施方案中，所述干細胞是貼 壁的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD73+和CD105+的。在另一 具體實施方案中，所述干細胞是HLA-G+的。在另一具體實施方案中，所述 干細胞是CD3《、CD38—或CD45—的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是 CD34\ CD38—和CD45—的。在另一具體的實施方案中，所述干細胞是CD3《、 CD38-、 CD45-、 CD73+、 CD105+和HLA-G+的。
在另一實施方案中，本發明提供了包含分離的CD73+和CD105+胎盤干細 胞的組合物，其中，在允許擬胚體形成的條件下，所述干細胞有利于在包括 所述干細胞的分離的胎盤細胞的群中形成擬胚體。在具體實施方案中，所述 干細胞是貼壁的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD34—、 CD38—或 CD45H在另一具體實施方案中，所述干細胞是OCT-4+的。在另一具體實 施方案中，所述干細胞是CD200+的。在更具體的實施方案中，所述干細胞是 OCT-4+、 CD200+、 CD34-、 CD38.和CD45的。
在又一實施方案中，本發明提供了包含分離的CD73+、 CD 105+和HLA-G+ 胎盤干細胞的組合物。在具體實施方案中，所述干細胞是貼壁的。在另一具 體實施方案中，所述干細胞是CD3《、CD38'或CD45—的。在另 一具體實施方 案中，所述干細胞是OCT-4+的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD200+的。在更具體的實施方案中，所述干細胞是OCT-4+、 CD200+、 CD34一、 CD38—和CD45—的。
在另一實施方案中，本發明才是供了包含分離的OCT-4+胎盤干細胞的組合 物，其中，在允許擬胚體形成的條件下，所述干細胞有利于在包括所述干細 胞的分離的胎盤細胞的群中形成擬胚^^。在具體實施方案中，所述干細胞是 CD73+和CD105+的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD34—、 CD38— 和CD45—的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD200+的。在更具體的 實施方案中，所述干細胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD3《、CD38—和CD45-的。
本發明還提供了包含胎盤干細胞群的組合物，該干細胞相對于骨髓來源 的間充質干細胞群以可檢測的更高水平表達一個或多個基因，其中所述一個 或多個基因選自ACTG2、 ADARB1 、 AMIG02、 ATRS-1、 B4GALT6、 BCHE、 Cl lorf 9、 CD200、 C0L4A1、 COL4A2、 CPA4、 DMD、 DSC3、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1、 FLJ10781、 GATA6、 GPR126、 GPRC5B、 ICAM1、 IER3、 IGFBP7、 IL1A、 IL6、 IL18、 KRT18、 KRT8、 LIPG、 LRAP、 MATN2、 MEST、 NFE2L3、 NUAK1 、 PCDH7 、 PDLIM3 、 PJP2 、 RTN1 、 SERP難9 、 ST3GAL6 、 ST6GALNAC5、 SLC12A8、 TCF21、 TGFB2、 VTN和ZC3H12A,并且其中 所述骨髓來源的干細胞的群已經進行過多次培養傳代，其次數相當于所述胎 盤干細胞的傳代次數。在上述組合物更具體的實施方案中，所述干細胞相對 于骨髓來源的間充質干細胞群以可檢測的更高水平表達ACTG2、 ADARB1 、 AMIG02、 ATRS-1 、 B4GALT6、 BCHE、 Cl lorf 9、 CD200、 C0L4A1 、 COL4A2、 CPA4、 DMD、 DSC3、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1、 FLJ10781、 GATA6、 GPR126、 GPRC5B、 ICAM1、 IER3、 IGFBP7、 IL1A、 IL6、 IL18、 KRT18、 KRT8、 LIPG、LRAP、 MATN2、 MEST、 NFE2IJ、 NUAK1、 PCDH7、 PDUM3、 PJP2、 RTN1、 SERP腿9、 ST3GAL6、 ST6GALNAC5、 SLC12A8、 TCF21、 TGFB2、 VTN 和ZC3H12A,其中所述干細胞群與所述骨髓來源的間充質干細胞群具有相同
的細胞數。
在另一具體實施方案中，任何上述組合物均包含基質。在更具體的實施 方案中，所述基質是三維支架。在另一更具體的實施方案中，所述基質包括 膠原蛋白、明膠、層連蛋白、纖連蛋白、果膠、鳥氨酸或玻連蛋白。在另一 更具體的實施方案中，該基質是羊膜或源自羊膜的生物材料。在另一更具體
的實施方案中，所述基質包括細胞外膜蛋白。在另一更具體的實施方案中， 所述基質包括合成化合物。在另一更具體的實施方案中，所述基質包括生物 活性化合物。在另一更具體的實施方案中，所述生物活性化合物是生長因子、 細胞因子、抗體或小于5000道爾頓的有機分子。在某些實施方案中，該基體 是合成的可降解聚合物，例如，聚乳酸和聚羥基乙酸。在某些實施方案中， 該基質是可植入的支架底物。在某些實施方案中，該可植入的支架底物選自 (3-磷酸三4丐底物、(3-磷酸三媽-膠原蛋白底物、膠原蛋白底物、磷酸4丐底物、 礦化人胎盤膠原蛋白底物、透明質酸底物以及陶覺底物。在某些實施方案中， 該可植入的支架底物是P-磷酸三釣底物。在某些實施方案中，該可植入的支 架底物是P-磷酸三鈣-膠原蛋白蛋白底物。在某些實施方案中，該可植入的支 架底物是膠原蛋白底物。在某些實施方案中，該可植入的支架底物是磷酸4丐 底物。在某些實施方案中，該可植入的支架底物是礦化人胎盤膠原蛋白底物。 在另 一實施方案中，本發明還拔—供了包含由以上任何干細胞或以上任何 干細胞群調節的培養基的組合物。在具體實施方案中，任何這樣的組合物包 含不是來自胎盤的干細胞。在更具體的實施方案中，所述干細胞是胚胎干細胞。在另一更具體的實施方案中，所述干細胞是間充質干細胞。在另一更具 體的實施方案中，所述干細胞是骨髓來源的干細胞。在另一更具體的實施方 案中，所述干細胞是造血祖細胞。在另一更具體的實施方案中，所述干細胞 是體細胞干細胞。在另一更具體的實施方案中，所述體細胞干細胞是神經干 細胞、肝臟干細胞、月夷月泉干細胞、內皮干細胞、心臟干細胞或月幾肉干細胞。
在另一方面，本發明提供了包含由本發明所^是供的胎盤干細胞或胎盤干 細胞群調節的培養基的組合物。在某些實施方案中，該組合物包含由細胞群， 如本發明纟是供的干細胞群調節的培養基。
本發明還提供了生產細胞群的方法，該方法包括選擇不貼壁到底物的細 胞，并將所述細胞與其他細胞分離以形成細胞群。在某些實施方案中，該方
法還包括選擇表達CD34而不表達CD44的細胞，并增加例如與其他細胞分 離的所述細胞的濃度，從而形成細胞群。
在某些實施方案中，本發明提供了生成細胞群的方法，該方法包括選擇 如下細胞，其(a)不貼壁到底物，(b)表達CD34而不表達CD44，和(c)當所述 胎盤細胞群在允許礦化基質形成的條件下培養時有利于在胎盤細胞群中 形成礦化基質；和從其他細胞中分離所述細胞以形成細胞群。在某些實施方 案中，所述底物包括纖連蛋白。
在某些實施方案中，所述方法還包括選擇表達CD9、 CD29、 CD54、 CD90、 CD166或上述的組合的的細胞。
在某些實施方案中，所述方法還包括選擇表達CD31、 CD34、 CD117、 CD133、 CD200或上述的組合的細胞。
在某些實施方案中，用抗體進行所述選擇。在某些實施方案中，用流式 細胞儀進行所述選擇。在某些實施方案中，用磁性小珠進行所述選擇。在某些實施方案中，用熒光激活細胞分類術進行所述選擇。在某些實施方案中， 擴增所述細"包群。
在另一方面，本發明提供了非貼壁胎盤干細胞的群，其中，所述細胞已 經被冷藏，且所述細胞群被裝在容器中。在某些實施方案中，所述干細胞
為CD34+和CD44-的。在某些實施方案中，所述細胞被冷藏，且其中所述群 被裝在容器中，和其中所述干細胞在允許礦化基質形成的條件下培養時形 成礦化基質。在某些實施方案中，所述容器是適于靜脈內輸液的袋。在某 些實施方案中，所述細胞群包括lxl()s個所述干細胞。在某些實施方案中， 所述細胞群包括5xl06個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包 括&107個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括5xl(^個所述 干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括1><108個所述干細胞。在某些 實施方案中，所述細胞群包括5xl()s個所述干細胞。在某些實施方案中，所 述細胞群包括lxl(^個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括 5><109個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括1x10'g個所述干 細胞。在某些實施方案中，所述干細胞傳代不超過5次。在某些實施方案 中，所述干細胞傳代不超過10次。在某些實施方案中，所述干細胞傳代不 超過15次。在某些實施方案中，所述干細胞傳代不超過20次。在某些實 施方案中，所述干細胞已經在所述容器內被擴增。在某些實施方案中，所 述細胞群被裝在0.9%NaCl溶液中。
在另一方面，本發明提供了能礦化基質的成骨細胞的生成方法，該方法 包括在所述干細胞分化成成骨細胞的條件下，培養本發明所提供的多種干 細胞或多種干細胞群，所述培養時間為足以使所述成骨細胞產生或有利于 產生可檢測量的富含鈣和/或磷的礦化基質。在某些實施方案中，所述成骨細胞生成骨。
在又一方面，本發明提供了制備基質的方法，該方法包括將本發明所提 供的干細胞群與可植入的支架底物組合。在某些實施方案中，所述干細胞是
非貼壁的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD34+的。在某些實施方案中， 所述干細胞是CD44-的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD34+和CD44' 的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+或CD166+的。 在某些實施方案中，所述干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+和CD166+的。在 某些實施方案中，所述干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+或CD200+的。在 某些實施方案中，所述干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+和CD200+的。在 某些實施方案中，至少大約70%的所述千細胞為CD34+和CD44'干細胞。在 某些實施方案中，至少大約卯％的所述干細胞為CD34+和CD4《干細胞。在 某些實施方案中，所述細胞群包括1><106個所述干細胞。在某些實施方案中， 所述細胞群包括5xl06個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包 括lxl(^個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括5xl(^個所述 干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括lxl()S個所迷干細胞。在某些 實施方案中，所述細胞群包括5xl()S個所述干細胞。在某些實施方案中，所 述細胞群包括lxl(f個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括 5xl(f個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括1"01()個所述干 細胞。在某些實施方案中，所述干細胞已經被傳代至少、大約或不超過5 次。在某些實施方案中，所述干細胞已經被傳代至少、大約或不超過10 次。在某些實施方案中，所述干細胞已經被傳代至少、大約或不超過15 次。在某些實施方案中，所述干細胞已經被傳代至少、大約或不超過20 次。在某些實施方案中，所述細胞群已經;波擴增。在某些實施方案中，所述可植入的支架底物選自(3-磷酸三鈣底物、(3-磷
酸三鈣-膠原蛋白底物、膠原蛋白底物、磷酸鈣底物、礦化人胎盤膠原蛋白底 物、透明質酸底物以及陶瓷底物。在某些實施方案中，所述該可植入的支架 底物是P-磷酸三釣底物。在某些實施方案中，該可植入的支架底物是P-磷酸 三鈣-膠原蛋白底物。在某些實施方案中，該可植入的支架底物是膠原蛋白底 物。在某些實施方案中，該可植入的支架底物是磷酸鈣底物。在某些實施方 案中，該可植入的支架底物是礦化人胎盤膠原蛋白底物。
在又一方面，本發明才是供了配制可注射組合物的方法，該方法包括將胎 盤干細胞群與可注射的透明質酸或膠原蛋白組合。在某些實施方案中，所述
干細胞是非貼壁的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD34+的。在某些 實施方案中，所述干細胞是CD4^的。在某些實施方案中，所述干細胞是 CD34+和CD44-的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD9+、 CD54+、 CD%+ 或CD166+的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+和 CD166+的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+或 CD200+的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+和 CD200+的。在某些實施方案中，至少大約70%的所述干細胞為CD34+和 CD44—干細胞。在某些實施方案中，至少大約90%的所述干細胞為CD34+和 CD4《干細胞。在某些其他實施方案中，所述胎盤干細胞是貼壁的。在某些 具體實施方案中，所述胎盤千細胞是CD200+和HLA-G+的；CD73+、 CD 105+ 和CD200+的；CD200+和OCT-4+的；CD73+、 CD105+和HLA-G+的；CD73+ 和CD105+的，且當所述胎盤細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時，其 有利于在包括所述干細胞的胎盤細胞群中形成 一 個或多個擬胚體；或者 OCT-4+的且當所述胎盤細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時，其有利于在包括所述干細胞的胎盤細胞群中形成 一 個或多個擬胚體；或其任意組合。 在某些非貼壁胎盤干細胞更具體的實施方案中，所述分離的CD200+、
HLA-G+干細胞是CD34-、 CD38\ CD45\ CD73+和CD105+的；所述分離的 CD73+、 CD105+和CD200+干細胞是CD34-、 CD38-、 CD45和HLA-G+的；所 述分離的CD200+、 OCT-4+干細胞是CD34-、 CD38-、 CD45-、 CD73+、 CD105+ 和HLA-G+的；如權利要求1所述的分離的干細胞，其中所述CD73+、 CD 105+ 和HLA-G+干細胞是CD34—、 CD45\ OCT-4+和CD200+的；有利于一個或多 個擬胚體形成的所述分離的CD73+和CD 105+干細胞是OCT-4+ 、 CD34— 、 CD38_ 和CD45'的；和/或所述OCT-4+的且有利于一個或多個擬胚體形成的分離的 干細胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34\ CD38.和CD45'的。在某些實 施方案中，所述胎盤細胞群已經;波擴增。在某些實施方案中，所述組合物 包含可注射透明質酸。在某些實施方案中，所述組合物包含可注射膠原蛋 白。本發明還提供了包含非貼壁干細胞和可注射透明質酸或可注射膠原蛋 白的組合物。
在另一方面，本發明提供了治療個體骨缺損的方法，該方法包括向有此 需要的個體給予包含本發明所提供的干細胞群的可植入或可注射組合物，從 而治療該個體的骨缺損。在某些實施方案中，所述骨缺損是與癌癥有關的 溶骨性損傷、骨折、或脊柱如需要融合的脊柱。在某些實施方案中，所述 溶骨性損傷與多發性骨髓瘤、骨癌或轉移性癌有關。在某些實施方案中， 所述骨折是非聯合性骨折。在某些實施方案中，將包含非貼壁干細胞群的 可植入組合物給予所述個體。在某些實施方案中，可植入組合物通過外科 手術植入，如植入到骨缺損部位。在某些實施方案中，將包含非貼壁干細胞 群的可注射組合物給予所述個體。在某些實施方案中，可注射組合物通過外科手術給予到骨缺損區域。在某些實施方案中，將可注射組合物系統性給藥。
在某些實施方案中，所述干細胞是非貼壁的。在某些實施方案中，所
述干細胞是CD34+的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD44—的。在某些 實施方案中，所述干細胞是CD34+和CD4《的。在某些實施方案中，所述干 細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+或CD166+的。在某些實施方案中，所述干細 胞是CD9+、 CD54+、 CD90+和CD166+的。在某些實施方案中，所述千細胞 是CD31+、 CD117+、 CD133+或CD200+的。在某些實施方案中，所述干細胞 是CD31+、 CD117+、 CD133+和CD200+的。在某些實施方案中，至少大約70% 的所述干細胞為CD34+和CD44-干細胞。在某些實施方案中，至少大約90% 的所述干細胞為CD34+和CD44—干細胞。在某些其他實施方案中，所述胎盤 干細胞是貼壁的。在某些具體實施方案中，所述胎盤干細胞是CD200+和 HLA-G+的;CD73+、 CD105+和CD200+的;CD200十和OCT-4+的;CD73+、 CD105+和HLA-G+的；CD73+和CD105+的，且當所述胎盤細胞群在允許擬胚 體形成的條件下培養時，其有利于在包括所述干細胞的胎盤細胞群中形成一 個或多個擬胚體；或者OCT-4+的且當所述胎盤細胞群在允許擬胚體形成的條 件下培養時，其有利于在包括所述干細胞的胎盤細胞群中形成一個或多個擬 胚體；或其任意組合。在某些非貼壁胎盤干細胞更具體的實施方案中，所述 分離的CD200+、 HLA-G+干細胞是CD34-、 CD38-、 CD45、 CD73^pCD105+ 的；所述分離的CD73+、 CD105+和CD200+干細胞是CD34-、 CD38-、 CD45-和HLA-G+的；所述分離的CD200+、 OCT-4+干細胞是CD34'、 CD38'、 CD45\ CD73+、 CD105+和HLA-G+的；如權利要求1所述的分離的干細胞，其中 所述CD73+、 CD105+和HLA-G+干細胞是CD34-、 CD45\ OCT-4+和CD200+的；有利于一個或多個擬胚體形成的所述分離的CD73+和CD105+干細胞是 0CT-4+、 CD34\ CD38-和CD45—的；和/或所述OCT-4+的且有利于一個或多 個擬胚體形成的分離的干細胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34'、 CD38— 和CD45—的。在某些實施方案中，所述細胞群已經;陂擴增。
在另一個方面，本發明提供了生成細胞群的方法，該方法包括選擇如下 細胞，其a)貼壁到底物，和b)表達CD34而不表達CD44，和從其他細胞中 分離所述細胞以形成細胞群。在某些實施方案中，該方法還包括從其他細胞 中分離所述細胞以形成細胞群。在某些實施方案中，生成細胞群的該方法包 括選擇如下細胞，其(a)貼壁到底物，(b)表達CD34而不表達CD44，和(c)當 所述胎盤細胞群在允許礦化基質形成的條件下培養時，有利于在胎盤細胞 群中形成礦化基質；和從其他細胞中分離所述細胞以形成細胞群。在某些實 施方案中，所述底物包括纖連蛋白。在某些實施方案中，本發明提供了生成 細胞群的方法，該方法包括選擇如下細胞，其a)不貼壁到底物，和b)表達 CD34而不表達CD44，和從其他細胞中分離所迷細胞以形成細胞群。在某些 實施方案中，所述方法還包括從其他細胞中分離所述細胞以形成細胞群。在 某些實施方案中，生成細胞群的該方法包括選擇如下細胞，其(a)不貼壁到底 物，(b)表達CD34而不表達CD44,和(c)當所述胎盤細胞群在允許礦化基質 形成的條件下培養時，有利于在胎盤細胞群中形成礦化基質；和從其他細 胞中分離所述細胞形成細胞群。在某些實施方案中，所述底物包括纖連蛋白。 在某些實施方案中，所述方法包括選擇表達至少以下之一的細胞CD9、 CD29、 CD54、 CD90、 CD166或以上的結合。在某些實施方案中，所述方法 包括選擇表達至少以下之一的細胞CD31、 CD34、 CD117、 CD133、 CD200 或以上的結合。在某些實施方案中，用抗體進行所述選擇。在某些實施方案中，用流式 細胞儀進行所述選擇。在某些實施方案中，用磁性小珠進行所述選擇。在某 些實施方案中，用熒光激活細胞分類法進行所述選擇。在某些實施方案中， 擴增所述細胞群。
在某些實施方案中，所述干細胞為CD34+和CD4《的，其中所述細胞被 冷藏，且其中所述細胞群被裝在容器中。在某些實施方案中，所述細胞被 冷藏，且其中所述細胞群被裝在容器中，和其中所述干細胞在允許礦化基 質形成的條件下培養時形成礦化基質。
在某些實施方案中，所述容器是適于靜脈內輸液的袋。在某些實施方 案中，所述細胞群包括lxl(^個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細 胞群包括5xl(^個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括lx107 個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括5xl(^個所述干細胞。 在某些實施方案中，所述細胞群包括lxl()S個所述干細胞。在某些實施方案 中，所述細胞群包括5xl()S個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群 包括lxl(^個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括5xl(^個所 述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括lxlO'o個所述干細胞。在 某些實施方案中，所述干細胞傳代不超過5次。在某些實施方案中，所述 干細胞傳代不超過10次。在某些實施方案中，所述干細胞傳代不超過15 次。在某些實施方案中，所述干細胞傳代不超過20次。在某些實施方案中， 所述干細胞已經在所述容器內被擴增。在某些實施方案中，所述細胞群被 裝在0.9%NaCl溶液中。
在另一方面，本發明提供了生成成骨細胞的方法，該方法包括在所述干 細胞分化成成骨細胞的條件下，培養多種胎盤干細胞或多種分離的胎盤干利于產生可檢測 量的礦化基質。
在又一方面，本發明提供制備基質的方法，該方法包括將胎盤千細胞群
與可植入的支架底物組合，其中所述干細胞是CD34+和CD44—的。在某些實 施方案中，所述干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+或CD166+的。在某些實施 方案中，所述干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+和CD166+的。在某些實施方 案中，所述干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+或CD200+的。在某些實施方 案中，所述干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+和CD200+的。在某些實施方 案中，至少大約70%的所述干細胞為CD34+和CD44—干細胞。在某些實施方 案中，至少大約90%的所述干細胞為CD34+和CD44—干細胞。在某些實施方 案中，所述干細胞是貼壁的。在具體實施方案中，所述貼壁胎盤干細胞是 CD200+和HLA-G+的；CD73十、CD105+和CD200+的；CD200+和OCT-4+的； CD73+、 CD105+和HLA-G+的；CD73+和CD105+的，且當所述胎盤細胞群在 允許擬胚^^形成的條件下培養時，其有利于在包括所述干細胞的胎盤細胞群 中形成一個或多個擬胚體；或者OCT-4+的且當所述胎盤細胞群在允許擬胚體 形成的條件下培養時，其有利于在包括所述干細胞的胎盤細胞群中形成一個 或多個擬胚體；或其任意組合。在某些非貼壁胎盤千細胞更具體的實施方案 中，所述分離的CD200+、 HLA-G+干細胞是CD34-、 CD38-、 CD45\ CD73十 和CD105+的；所述分離的CD73+、CD105+和CD200+干細胞是CD3《、CD38-、 CD45-和HLA-G+的；所述分離的CD200+、 OCT-4+干細胞是CD34—、 CD38—、 CD45\ CD73+、 CD105+和HLA-G+的；如權利要求1所述的分離的干細胞， 其中所述CD73+、 CD105+和HLA-G+干細胞是CD34-、 CD45-、 OCT-4+和 CD200+的；有利于一個或多個擬胚體形成的所述分離的CD73+和CD105+干細胞是OCT-4+、 CD34-、 CD38—和CD45—的；和/或所述OCT-4+的且有利于一 個或多個擬胚體形成的分離的干細胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34—、 CD38'和CD45—的。在某些實施方案中，所述細胞群包括lx106個所述干細 胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括5xl(^個所述干細胞。在某些實施 方案中，所述細胞群包括lxl(f個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細 胞群包括5xlcT個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括lx108 個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括5xl()S個所述干細胞。 在某些實施方案中，所述細胞群包括lxl(^個所述干細胞。在某些實施方案 中，所述細胞群包括5xl(f個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群 包括lxl(T個所述干細胞。在某些實施方案中，所述干細胞傳代不超過5 次。在某些實施方案中，所述干細胞傳代不超過10次。在某些實施方案中， 所述干細胞傳代不超過15次。在某些實施方案中，所述干細胞傳代不超過 20次。在某些實施方案中，所述細胞群已經被擴增。
在某些實施方案中，上述可植入的支架底物選自P-磷酸三鈣底物、p-磷酸三4丐-膠原蛋白底物、膠原蛋白底物、磷酸鈣底物、礦化人胎盤膠原蛋白 底物和透明質酸底物。在某些實施方案中，該可植入的支架底物是P-磷酸三 鈣底物。在某些實施方案中，該可植入的支架底物是(3-磷酸三鈣-膠原蛋白底 物。在某些實施方案中，該可植入的支架底物是膠原蛋白底物。在某些實施 方案中，該可植入的支架底物是磷酸鈣底物。在某些實施方案中，該可植入 的支架底物是礦化人胎盤膠原蛋白底物和/或支架。
在又一方面，本發明纟是供了配制可注射組合物的方法，該方法包括將胎 盤干細胞群與可注射的透明質酸或膠原蛋白組合，其中所述干細胞是CD3 4+ 和CD44—的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+或CD 166+的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD9+ 、 CD54+ 、 CD90+和CD 166+ 的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133、1CD200+ 的。在某些實施方案中，所述干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+和CD200+ 的。在某些實施方案中，至少大約70%的所述干細胞為CD34+和CD4《干細 胞。在某些實施方案中，至少大約卯％的所述干細胞為CD34+和CD44—干細 胞。在某些實施方案中，所述細胞群已經被擴增。在某些實施方案中，所述 干細胞是貼壁的。在某些實施方案中，所述組合物包含可注射的透明質酸。 在某些實施方案中，所述組合物包含可注射的膠原蛋白。本發明還提供了包 含非貼壁干細胞群和可注射的透明質酸或膠原蛋白的組合物。
在又一方面，本發明還提供了治療個體骨缺損的方法，其包括向有此需
CD34+和CD4傘的，從而治療個體的骨缺損。在某些實施方案中，所述骨缺 損是(a)與癌癥有關的溶骨性損傷，(b)骨折，或(c)需要融合的脊柱。在某 些實施方案中，所述溶骨性損傷與多發性骨髓瘤、骨癌或轉移性癌有關。 在某些實施方案中，所述骨折是非聯合性骨折。在某些實施方案中，將包 含非貼壁干細胞群的可植入組合物給予所述個體。在某些實施方案中，可 植入組合物通過外科手術植入。在某些實施方案中，將包含非貼壁干細胞群 的可注射組合物給予所述個體。在某些實施方案中，可注射組合物通過外 科手術給予到骨缺損區域。在某些實施方案中，將可注射組合物系統性給藥。 在某些實施方案中，所述干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+或CD166+的。 在某些實施方案中，所述干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+和CD166+的。在 某些實施方案中，所述干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+或CD200+的。在 某些實施方案中，所述干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+和CD200+的。在某些實施方案中，至少大約70%的所述干細胞為CD34+和CD4《干細胞。在 某些實施方案中，至少大約90°/。的所述干細胞為CD34+和CD44-干細胞。在 某些實施方案中，所述細胞群已被擴增。
在又一方面，本發明還l是供了治療個體骨缺損的方法，該方法包括向有 此需要的個體給予包含干細胞群的可植入或可注射組合物，其中，所述干細 胞是CD34—的，從而治療個體的骨缺損。在某些實施方案中，所述骨缺損是 (a)與癌癥有關的溶骨性損傷，(b)骨折，或(c)需要融合的脊柱。在某些實 施方案中，所述溶骨性損傷與多發性骨髓瘤、骨癌或轉移性癌有關。在某 些實施方案中，所述骨折是非聯合性骨折。在某些實施方案中，將包含貼 壁干細胞群的可植入組合物給予所述個體。在某些實施方案中，可植入組 合物通過外科手術植入。在某些實施方案中，將包含貼壁干細胞群的可注射 組合物給予所述個體。在某些實施方案中，可注射組合物通過外科手術給予 到骨缺損區域。在某些實施方案中，將可注射組合物系統性給藥。
在非貼壁胎盤干細胞的更具體的實施方案中，所述分離的CD200+、 HLA-G+干細胞是CD3《、CD38-、 CD45-、 CD73+和CD105+的；所述分離的 CD73+、 CD105+和CD200+千細胞是CD34-、 CD38-、 CD45和HLA-G+的；所 述分離的CD200+、 OCT-4+干細胞是CD34-、 CD38-、 CD45\ CD73+、 CD105+ 和HLA-G+的；如權利要求1所述的分離的干細胞，其中所述CD73+、 CD 105+ 和HLA-G+干細胞是CD3《、CD45\ OCT-4+和CD200+的；有利于一個或多 個擬胚體形成的所述分離的CD73+和CD105+干細胞是OCT-4+、CD34'、CD38' 和CD45—的；和/或所述OCT-4+的且有利于一個或多個擬胚體形成的分離的 干細胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34-、 CD38'和CD45-的。在某些實 施方案中，所述細胞群包括lxl()S個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括5xl(^個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括1x10' 個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括5xl(^個所述干細胞。 在某些實施方案中，所述細胞群包括lxl()S個所述干細胞。在某些實施方案 中，所述細胞群包括5xl()S個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群
包括lxl(f個所述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括5xl(^個所
述干細胞。在某些實施方案中，所述細胞群包括lxl01Q個所述干細胞。在
某些實施方案中，所述干細胞傳代不超過5次。在某些實施方案中，所述 干細胞傳代不超過10次。在某些實施方案中，所述干細胞傳代不超過15 次。在某些實施方案中，所述干細胞傳代不超過20次。在某些實施方案中， 所述細胞群已經被擴增。
本發明還纟是供了生產哺乳動物胎盤來源的干細胞群的方法。在一 實施方 案中，例如，本發明提供了生產細胞群的方法，該方法包括選擇如下細胞， 其a)貼壁到底物，和b)表達CD200和HLA-G;和從其他細胞中分離所述細 胞以形成細胞群。在另一實施方案中，本發明拔J共了生產細胞群的方法，該 方法包括選擇如下細胞，其(a)貼壁到底物，和(b)表達CD73、 CD105和CD200; 和從其他細胞中分離所述細胞以形成細胞群。在另一實施方案中，本發明提 供了生產細胞群的方法，該方法包括選擇如下細胞，其(a)貼壁到底物，和(b) 表達CD200和OCT-4;和從其他細胞中分離所述細胞以形成細胞群。在另一 實施方案中，本發明提供了生產細胞群的方法，該方法包括選擇如下細胞， 其(a)貼壁到底物，(b)表達CD73和CD105,和(c)當在允許擬胚體形成的條 件下與胎盤細胞群一起培養時，有利于一個或多個擬胚體的形成；從其他 細胞中分離所述細胞以形成細胞群。在另一實施方案中，本發明-提供了生產 細胞群的方法，該方法包括選擇如下細胞，其(a)貼壁到底物，和(b)表達CD73、 CD105和HLA-G;和從其他細胞中分離所述細胞以形成細胞群。本 發明還提供了生產細胞群的方法，該方法包括選擇如下細胞，其(a)貼壁到 底物，(b)表達OCT-4，和(c)當在允許擬胚體形成的條件下與胎盤細胞群一 起培養時，有利于一個或多個擬胚體的形成；和從其他細胞中分離所述細胞 以形成細胞群。在以上任何方法的具體實施方案中，所述底物包括纖連蛋白。 在另一具體實施方案中，該方法包括選擇表達ABC-p的細胞。在另一具體 實施方案中，該方法包括選擇表現出間充質干細胞特有的至少一種特征的 細胞。在更具體的實施方案中，所述間充質干細胞特有的特征是表達 CD29、表達CD44、表達CD90、或者以上組合。在所述方法的另一具體 實施方案中，用抗體進行所述選擇。在另一更具體的實施方案中，用流式細 胞儀進行所述選擇。在另一具體實施方案中，用磁性小珠進行所述選擇。在 另一具體實施方案中，用熒光激活細胞分類法進行所述選擇。在以上方法的 另一具體實施方案中，擴增所述細胞群。
本發明還提供了生產細胞系的方法，該方法包括用編碼生長-啟動蛋白質 的DNA序列轉化干細胞；和將所述干細胞暴露在促進所述生長-啟動蛋白質 生成的條件下。在具體實施方案中，所述生長-啟動蛋白質是v-myc、 N-myc、 c-myc、 p53、 SV40大T抗原、多瘤病毒大T抗原、Ek腺病毒或人乳頭狀瘤 病毒E7蛋白。在更具體的實施方案中，所述DNA序列是可調節的。在更具 體的實施方案中，所述DNA序列可被四環素調節。在另一具體實施方案中， 所述生長-啟動蛋白質具有可調節活性。在另一具體的實施方案中，所述生長 -啟動蛋白質是溫度敏感型突變體。
本發明還提供了冷藏的干細胞群。例如，本發明提供了 CD200+和HLA-G+ 干細胞群，其中所述細胞已經被冷藏，且其中所述細胞群被裝在容器中。本發明還提供了CD73-、 CD105+、 CD200+干細胞群，其中所述干細胞已經被 冷藏，且其中所述細胞群被裝在容器中。本發明還提供了 CD200+、 OCT-4 — 干細胞群，其中所述干細胞已經被冷藏，且其中所述細胞群被裝在容器中。 本發明還提供了 CD73+、 CD105+干細胞群，其中所述細胞已經被冷藏，且 其中所述細胞群被裝在容器中，和其中當所述干細胞在允許擬胚體形成的條 件下與胎盤干細胞群一起培養時，有利于一個或多個擬胚體的形成。本發明 還提供了CD73一、 CD105+、 HLA-G干細胞群，其中所述細胞已經被冷藏， 且其中所述細胞群被裝在容器中。本發明還提供了 OCT-4+干細胞群，其中 所述細胞已經被冷藏，且其中所述細胞群被裝在容器中，和當所述干細胞在 允許擬胚體形成的條件下與胎盤干細胞群一起培養時，有利于一個或多個擬 胚體的形成。在任何上述的冷藏細胞群的具體實施方案中，所述容器是袋。 在各種具體實施方案中，所述細胞群包括大約、至少或最多1\106個所述 干細胞、5xl(^個所述干細胞、lxl(^個所述干細胞、5xl(^個所述干細胞、 1><108個所述干細胞、5xl()S個所述干細胞、1"09個所述干細胞、5xl(f個 所述千細胞、或"101()個所述干細胞。在任何上述冷藏細胞群的其他具體 實施方案中，所述干細胞已經傳代大約、至少或不超過5次，不超過10次， 不超過15次，或不超過20次。在任何上述冷藏細胞群的另一具體實施方案 中，所述干細胞在所述容器中已經被擴增。
本發明還包括制備礦化膠原蛋白基質的方法，該方法包括礦化膠原蛋白 并將該礦化的膠原蛋白基質進行交聯。在某些實施方案中，所述膠原蛋白是 胎盤膠原蛋白。在某些實施方案中，所述膠原蛋白用磷酸媽進行礦化。在某 些實施方案中，所述膠原蛋白用丁二醇二縮水甘油醚進行交聯。在某些實施 方案中，在礦化反應中磷酸鈣與膠原蛋白的比例為5 : 95、 10 : 90、 15 : 85、20 : 80、 25 : 75、 30 : 70、 35 : 65、 40 : 60、 45 : 55、 50 : 50、 55 : 45、 60 :40、 65 : 35、 70 : 30、 75 : 25、 80 : 20、 85 : 15、 90 : 10或95 : 5。
3.1.定義
如本文所用的術語"SH2"是指結合標記CD 105上的抗原決定部位的抗 體。因此，稱作SH2+的細胞是CD105+的。
如本文所用的術語"SH3"和"SH4"是指結合標記CD73上的抗原決定部位 的抗體。因此，稱作SH3+和/或SH4+的細胞是CD73+的。
如本文所用的術語"分離的干細胞"是指基本上與該干細胞所來源的組織 如胎盤的其他非干細胞分離的干細胞。如果從所述干細胞中除去，例如在收 集和/或培養該干細胞時除去了至少大約50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95% 或至少99%的與該干細胞天然相關的非干細胞，則該干細胞是"分離的"。
如本文所用的術i吾"分離的細胞的群"是指基本上與該細胞群所來源的組 織如胎盤的其他細胞分離的細胞的群。如果從所述干細胞中除去，例如在收 集和/或培養該干細胞時除去了至少大約50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%
干細胞是"分離的"。
如本文所用的術語"胎盤干細胞"是指來源于哺乳動物胎盤的干細胞或祖 細胞，不考慮其形態、細胞表面標記或原代培養后的傳代次數。然而，如本 文所用的術語"胎盤干細胞"并不指滋養母細胞。如果細胞具有干細胞的至少 一個特點，則該細胞被認為是"干細胞"，該特點例如與一種或多種干細胞相 關的標記或基因表達圖譜；在培養中復制至少10-40次的能力，分化成三種 胚層細胞的能力；缺少成體(即已分化)細胞的特征等等。術語"胎盤干細胞" 和"胎盤來源的干細胞"可互換使用。如本文所用的術語"胎盤灌洗液，，是指已經流過胎盤如人胎盤的至少一部 分如脈管系統的灌洗液，其包含在灌洗液流過胎盤的過程中所收集的多種細胞。
如本文所用的術語"胎盤灌洗細胞"是指有核細胞，如從或可從胎盤灌洗 液中分離的總有核細胞。
如本文所用，當某個具體標記是可檢測的，則干細胞對于該具體標記來
說為"陽性的"。例如，胎盤干細胞是例如CD73陽性的，因為CD73在胎盤 千細胞上以可檢測的大于背景(與如同型對照相比)的量而可檢測。當標記存 在于所述細胞或;故所述細胞表達且可用于將該細胞與至少另外一種細胞類型 區別開或可用于選擇或分離該細胞時，該細胞對于該標記來i兌是陽性的。
如本文所用，"成骨細胞"是能夠沉積骨的主要成分羥磷灰石或能夠分化 成能沉積鞋磷灰石的細胞的細胞。具體地，"成骨細胞"預期包括通常稱作 成骨細胞或骨細胞的細胞。
如本文所用，"基質"是指三維底物，其特征為具有分散在整個底物中的 空隙。所述空隙適于在基質內例如生長細胞，如干細胞，胎盤來源的貼壁干 細胞和/或成骨細胞。示例性基質包括但不限于(3-磷酸三鈣底物、(3-磷酸三 4丐-膠原蛋白底物、膠原蛋白底物、磷酸4丐底物、礦化人胎盤膠原蛋白底物、 透明質酸底物以及陶瓷底物。優選地，該基質被基質空隙中存在的成骨細 胞礦化。
4.


圖1:來自灌洗液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、羊膜-絨毛膜板(D)或臍帶(E) 的胎盤干細胞的存活力。X軸上的數字表示得到干細胞的胎盤。
圖2:通過FACS Calibur測得的來自灌洗液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、羊膜-絨毛膜板(D)或臍帶(E)的HLA ABC7CD457CD347CD133+細胞的百分 比。X軸上的數字表示得到干細胞的胎盤。
圖3:通過FACS Aria測得的來自灌洗液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、羊 月臭-絨毛膜板(D)或臍帶(E)的HLA ABC7CD457CD347CD133+細胞百分比。X 軸上的數字表示得到干細胞的胎盤。
圖4:從胎盤灌洗液得到的干細胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD卯、CD105、 CD117、 CD200表達。
圖5:從羊膜得到的干細胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200表達。
圖6:從絨毛膜得到的干細胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200表達。
圖7:從羊膜-絨毛膜板得到的干細胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200表達。
圖8:從臍帶得到的干細胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200表達。
圖9:從灌洗液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、羊膜-絨毛膜板(D)或臍帶(E) 得到的干細胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200表達的平均表達。
圖10:本研究中使用的羊膜/絨毛膜(AC)、臍帶(UC)、骨髓來源的干細胞 (BM-MSC)和人皮膚纖維母細胞(NHDF)細胞系的培養時間進程。所有培養均 使用相同的接種和傳代密度進行生長和增殖。圓圈表示培養用于RNA分離。 在即將老化之前收集后期培養。在38-倍增時收集兩個UC培養(UC-38)，以 對比胰蛋白酶作用對基因表達的效果。所有其他培養在RNA分離之前在其
37培養瓶中直接水解。
圖ll:羊膜/絨毛膜(AC)、臍帶(UC)、骨髓來源的干細胞(BM-MSC)和人 皮膚纖維母細胞(DF)中8215個基因的相對表達水平的線圖。X軸上與每個細
胞系名稱相連的數字是指該細胞系在評估基因表達水平之前的培養天數。圖 表由GeneSpring軟件分析的RNA表達數據生成。AC-03用作選才奪條件。
圖12:羊膜/絨毛膜(AC)、臍帶(UC)、骨髓來源的干細胞(BM-MSC)和人 皮膚纖維母細胞(DF)在AC-03中顯示基因過量表達>6倍的所有基因系列的 子集。X軸上與每個細胞系名稱相連的數字是指該細胞系在評估基因表達水 平之前的培養天數。圖表由GeneSpring軟件分析的RNA表達數據生成。 AC-03用作選擇條件。
圖13:羊膜/絨毛膜(AC)、臍帶(UC)、骨髓來源的干細胞(BM-MSC)和人 皮膚纖維母細胞(DF)中通過倍數變化過濾發現的胎盤干細胞特異性或臍帶干 細胞特異性基因。X軸上與每個細胞系名稱相連的數字是指該細胞系在評估 基因表達水平之前的培養天數。圖表由GeneSpring軟件分析的RNA表達數 據生成。AC-03用作選擇條件。
圖14:在兩種不同的培養基配方中培養的胎盤干細胞(圖14A)和間充質 干細胞(圖14B)的堿性磷酸酶活性。
圖15:在兩種不同的培養基配方中培養的胎盤干細胞(圖15A)的礦化。
圖16:在OS培養基而不是Anthro IB培養基中誘導的胎盤干細胞產生 的礦物質沉積。
圖17:在兩種不同的支架上生長的胎盤干細胞和間充質干細胞的生長時 間進程。
圖18:在(3-磷酸三鈣底物上，OS培養基和Anthro IB培養基中生長的胎盤千細胞和間充質千細胞的電子掃描顯微照相(20 X )。
圖19:在p-磷酸三釣底物上，OS培養基和Anthro IB培養基中生長的胎 盤干細胞和間充質干細胞電子掃描顯微照相(5000X)。
圖20:間充質干細胞和從人灌洗胎盤細胞獲得的干細胞的茜素紅染色， 其顯示在OS培養基而不是DMEM中培養后發生鈣礦化
圖21:在P-磷酸三鈣底物存在的條件下，在OS培養基中培養10天后的 間充質干細胞和干細胞的AP活性。
圖22:電子顯微照片，其顯示了膠原原纖維(A行)和礦化膠原原纖維(B行)。
圖23:示意圖，其顯示了交聯的礦化膠原蛋白的最終礦物質/膠原比例與 所輸入的礦物質/膠原蛋白比例接近。
圖24:移植后3周的頭蓋骨缺損的組織切片。在胎盤干細胞-HEALOS 外植體中可看到在缺損內有大量骨沉積。
圖25A-25C:移植后7周的頭蓋骨缺損的X射線分析。圖25A:箭頭所 指為陽性對照外植體BMP-2+HEALOS 。圖25B:箭頭所指為顯示出骨沉積 的胎盤干細胞+HEALOSTM外植體。圖25C:單獨的陰性對照HEALOStm和無 外植體的頭蓋骨缺損。
圖26:通過光密度分析法進行骨形成定量。增加的灰度(Y軸)表示增加 的骨密度/沉積。X軸治療等級。
5.
具體實施例方式
5.1.胎盤干細胞和胎盤干細胞群
胎盤干細胞是可從胎盤或其部分中獲得的干細胞，其貼壁到組織培養的 底物并能分化為非胎盤細胞型。胎盤干細胞可以來源于胎兒，也可以來源于母體(也就是說，可以具有母親或胎兒的基因型)。胎盤千細胞群或包括胎盤 干細胞的細胞群可包括完全來源于胎兒或母體的胎盤干細胞，也可包括來源 于胎兒和母體的混合胎盤干細胞。胎盤干細胞和包括胎盤干細胞的細胞群可 通過在下文討論的形態、標記和培養特征進行識別和挑選。5.1.1. 物理學和形態學特征本發明提供的非貼壁的CD34+干細胞在原代培養或細胞培養中培養時， 通常不貼壁到組織培養底物。培養中的非貼壁干細胞通常呈現圓形，與從骨 髓或外周血得到的CD34+干細胞類似。本發明提供的貼壁胎盤干細胞在原代培養或細胞培養中培養時，貼壁到 組織培養底物，例如組織培養容器表面(例如組織培養塑料)。培養中的胎盤 干細胞通常認為呈成纖維細胞樣星狀外觀，并具有許多從中央細胞體延伸出 的細胞質突起。然而，所述胎盤干細胞從形態學上與相同條件下培養的成纖 維細胞不同，因為該胎盤干細胞比成纖維細胞具有更多的這種突起。胎盤干 細從胞形態學上也與造血干細胞不同，培養中的造血干細胞通常認為是更圓 的或鵝卵石形形態。5.1.2. 細胞表面、分子和基因標記車/^e烴產f勿應.'在一實施方案中，本發明提供了分離的非貼壁胎盤干細胞。在某些實施方案中，所述分離的干細胞是CD34+的。在某些實施 方案中，該分離的干細胞是CD44—的。在某些實施方案中，該分離的干細 胞是CD34+和CD44'的。在某些實施方案中，該分離的干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+或CD166+的。在某些實施方案中，該分離的干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+和CD166+的。在某些實施方案中，該分離的干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+或CD200+的。在某些實施方案中，該分離的干 細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+和CD200+的。在某些實施方案中，該分 離的干細胞已經通過灌洗，或通過物理或生物化學裂解如酶消化胎盤組織 從人胎盤中分離。在某些實施方案中，該分離的干細胞已經通過灌洗從人 胎盤中分離。在某些實施方案中，當所述胎盤細胞群在允許礦化基質形成 的條件下培養時，該分離的干細胞有利于在胎盤細胞群中形成礦化基質。 在另一實施方案中，本發明提供分離的非貼壁胎盤細胞的群。在某些實 施方案中，該細胞群包括CD34+干細胞。在某些實施方案中，該細胞群包 括CD44'干細胞。在某些實施方案中，該細胞群包括CD34+和CD44'干細 胞。在某些實施方案中，該細胞群包括CD9+、 CD54+、 0090+或€0166+ 干細胞。在某些實施方案中，該細胞群包括CD9+、 CD54+ 、 CD90+和CD 166+ 干細胞。在某些實施方案中，該細胞群包括CD31+、 CD117+、 CD133+或 00200+干細胞。在某些實施方案中，該細胞群包括0031+、€0117+、00133+ 和CD200+干細胞。在某些實施方案中，該細胞群包括干細胞，其中至少 有大約70。/。的所述細胞是CD34+和CD4^干細胞。在某些實施方案中，該 細胞群包括干細胞，其中至少有大約90。/o的所述細胞是CD34+和CD44-干細胞。在另一方面，本發明提供了分離的CD34+和CD44—胎盤干細胞的群。 在某些實施方案中，該干細胞是CD9+、 CD54+、 CD卯+或CD166+的。在 某些實施方案中，該干細胞是CD9+、 CD54+、 CD90+和CD166+的。在某 些實施方案中，該干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+或CD200+的。在某 些實施方案中，干細胞是CD31+、 CD117+、 CD133+和CD200+的。在某些 實施方案中，至少約70。/。的該干細胞是CD34+和CD4^干細胞。在某些實施方案中，至少約90%的該干細胞是CD34+和CD44-的干細胞。i壘i^J"干勿^:本發明提供的貼壁胎盤干細胞和胎盤干細胞群表達多 種可用來識別和/或分離所述干細胞或包括所述干細胞的細胞群的標記。本發 明提供的貼壁胎盤干細胞和干細胞群(即兩個或兩個以上的胎盤干細胞)包括 直接從胎盤或其任何部分(例如羊膜、絨毛膜、胎盤小葉、臍帶等)獲得的干 細胞和含有干細胞的細胞群。胎盤干細胞群還包括培養中的貼壁胎盤干細胞 群(即兩個或兩個以上)，以及容器如袋中的細胞群。然而，胎盤干細胞不是 滋養母細胞。本發明提供的貼壁胎盤干細胞通常表達標記CD73、 CD105、 CD200、 HLA-G和/或OCT-4，而不表達CD34、 CD38或CD45。胎盤干細胞也表達 HLA-ABC(MHC-1)和HLA-DR。這些標記可用于識別胎盤干細胞，并將胎盤 干細胞與其他類型的干細胞區別開來。因為所述胎盤干細胞能表達CD73和 CD105，因此它們可有間充質干細胞樣特征。然而，因為所述胎盤干細胞可 表達CD200和HLA-G，胎兒特異性標記，因此它們可與既不表達CD200也 不表達HLA-G的間充質干細胞，如骨髓來源的間充質干細胞區別開來。同 樣地，因為不表達CD34、 CD38和/或CD45,因此將所述胎盤干細胞鑒定為 非造血干細胞。然而，胎盤干細胞的某些亞類可表達例如CD34，其仍被認 為是本發明所提供的胎盤干細胞。因此，在一實施方案中，本發明提供了分離的CD200+或HLA-G+貼壁胎 盤干細胞。在具體實施方案中，所述干細胞是胎盤干細胞。在具體實施方案 中，該干細胞是CD200+和HLA-G+的。在具體實施方案中，所述干細胞是 CD73+和CD105+的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD34-、 CD38_ 或CD45-的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD34-、 CD3K和CD45-的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD34'、 CD38'、 CD45_、 CD73+ 和CD105+的。在另一具體實施方案中，所述CD200+或HLA-G+干細胞在允 許擬胚體形成的條件下有利于在包括所述干細胞的胎盤細胞群中形成擬胚體。在另一實施方案中，本發明還提供從多種胎盤細胞中選擇胎盤干細胞的 方法，該方法包括選擇CD200或HLA-G胎盤細胞，因而所述細胞為胎盤干 細胞。在具體實施方案中，所述選擇包括選擇CD200+和HLA-G十的胎盤細 胞。在具體實施方案中，所述選擇包括也選擇CI)73+和CI:)105+的胎盤細胞。 在另一具體實施方案中，所述選擇包括還選擇CD34-、 CD38—或CD45—的胎盤 細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包括也選擇CD34-、 CD38—和CD45— 的胎盤細胞。在另 一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、 CD38—、 CD45\ CD73+和CD1()5'的胎盤細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包 括選擇在允許擬胚體形成的條件下還有利于在包括所述千細胞的胎盤細胞群 中形成擬胚體的胎盤細胞。在另一實施方案中，本發明提供包括分離的CD200+、 HLA-G+胎盤干細 胞的分離細胞群。在具體實施方案中，所述細胞群是胎盤細胞群。在另一具 體實施方案中，該細胞群是分離的C:D2()(r、 HLA-G"胎盤干細胞群。在各種 實施方案中，至少大約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、 至少大約50%、或至少大約60%的所述細胞為CD200+、 HLA-G+干細胞。優 選地，至少大約70%的所述細胞為CD2()()+、 HLA-G+干細胞。更優選地，至 少大約90%、 95°/。、或99%的所述細胞為CD2()0'、 HLA-G"干細胞。在所述 分離細胞群的具體實施方案中，所述干細胞還是CD73+和CD105+的。在另 一具體實施方案中，所述干細胞還是CD3《、CD38'或CD45—的。在一更具體實施方案中，所述干細胞還是CD34-、 CD38-、 CD45-、 CD73+和CD105的。 在另一實施方案中，所述分離細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時產生 一個或多個擬胚體。在另一實施方案中，本發明4是供從多種胎盤細胞中選擇胎盤干細胞群的 方法，該方法包括選擇胎盤細胞群，其中至少大約10%、至少大約20%、至 少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、 至少大約80%、至少大約90%、或至少大約95%的所迷細胞是CD20(f、 HLA-G'干細胞。在具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD73+和 CDI()5'的干細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、 CD3&或CD45—的干細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是 CD34\ CD38-、 CD45-、 CD73'和CD105+的干細胞。在另一具體實施方案中， 所述選擇還包括選擇在允許擬胚體形成的條件下培養時產生一個或多個擬胚 體的胎盤干細胞群。在另一實施方案中，本發明提供了分離的CD73+、 CD105+和CD200+干 細胞。在具體實施方案中，所述分離的干細胞是分離的貼壁胎盤干細胞。在 另一具體實施方案中，所述干細胞是HLA-G"的。在另一具體實施方案中， 所述干細胞是CD34-、 CD38-或CD45-的。在另一具體實施方案中，所述干細 胞是CD3《、CD38-和CD45-的。在更具體的實施方案中，所述干細胞是CD3《、 CD38\ CD45-和HLA-G+的。在另一具體實施方案中，當所述胎盤細胞群在 允許擬胚體形成的條件下培養時，所述分離的CD73+、 CD105+和CD200+干 細胞有利于在包括所述干細胞的胎盤細胞群中形成 一 個或多個擬胚體。在另一實施方案中，本發明才是供了從多種胎盤細胞中選擇胎盤千細胞的 方法，該方法包括選擇CD73+、 CD105+和CD200+胎盤細胞，因而所述細胞是胎盤干細胞。在具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是HLA-G+的胎盤細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD3《、CD38-或CD45— 的胎盤細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、 CD38— 和CD45—的胎盤細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、 CD38\ CD45'和HLA-G+的胎盤細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包 括選擇還是CD73+、 CD105+和CD200+的干細胞，當所述胎盤細胞群在允許 擬胚體形成的條件下培養時，其有利于在包括所述干細胞的胎盤細胞群中形 成一個或多個擬胚4本。在另一實施方案中，本發明提供了包括CD73'、 CD105和CD200+干細 胞的分離細胞群。在具體實施方案中，所述干細胞是胎盤干細胞。在另一具 體實施方案中，所述細胞群是分離的CD73、 CD105+和CD20(T胎盤干細胞 的群。在各種實施方案中，至少大約10%、至少大約20%、至少大約30%、 至少大約40%、至少大約50%、或至少大約60%的所述細胞為CD73+、CD105— 和CD20(T干細胞。在另一實施方案中，在所述細胞群中至少大約70%的所 述細胞為CD73'、 CD105+、 CD200+干細胞。在另一實施方案中，在所述細 胞群中至少大約90%、 95%或99%的所述細胞為CD73+、 CD105'、 CD200二 干細胞。在所述細胞群的具體實施方案中，所述干細胞是HLA-G+的。在另 一具體實施方案中，所述干細胞是CD34—、 CD38'或CD45—的。在另一具體實 施方案中，所述干細胞是CD3《、CD38'和CD45'的。在更具體的實施方案中， 所述干細胞是CD34'、 CD38_、 CD45'和HLA-G，的。在另一具體實施方案中， 所述細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時產生一個或多個擬胚體。在另 一實施方案中，本發明拐—供了從多種胎盤細胞中選擇胎盤干細胞群 的方法，該方法包括選擇胎盤細胞群，其中至少大約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%、至少大約 70%、至少大約80%、至少大約90%、或至少大約95%的所述細胞是CD73+、 CD105+和CD200'干細胞。在具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是 HLA-G+的干細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34-、 CD38-或CD45—的干細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是 CD34\ CD38—和CD45'的干細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包括選 擇還是CD34-、 CD38-、 CD45—和HLA-G+的干細胞。在另一具體實施方案中， 所述選擇還包括選擇在允許擬胚體形成的條件下培養時產生一個或多個擬胚 體的胎盤細胞群。本發明還提供分離的CD200+和OCT-4+干細胞。在具體實施方案中，該 干細胞是CD73二和CD 105+的。在具體實施方案中，該干細胞是胎盤干細胞。 在另一具體實施方案中，所述干細胞是HLA-G+的。在另一具體實施方案中， 所述干細胞是CD3《、CD3&或CD45H在另一具體實施方案中，所述干細 胞是CD34-、CD38-和CD45H在更具體的實施方案中，所述干細胞是CD34—、 CD38—、 CD45—、 CD73+、 CD105'和HLA-G1的。在另一具體實施方案中，當 所述胎盤細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時，該干細胞有利于在包括 所述干細胞的胎盤細胞群中產生 一 個或多個擬胚體。在另一實施方案中，本發明提供了從多種胎盤細胞中選擇胎盤干細胞的 方法，該方法包括選擇CD200+或OCT-4+胎盤細胞，因而所述細胞為胎盤干 細胞。在具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是HLA-G+的胎盤細胞。在 另一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、 CD38—或CD45—的胎盤 細胞。在另 一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、 CD38—和CD45— 的胎盤細胞。在另 一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34-、 CD38—、CD45—、 CD73—、 CD105+和HLA-G+的胎盤細胞。在另一具體實施方案中，所 述選擇包括選擇在所述胎盤細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時還有利 于在包括所述干細胞的胎盤細胞群中形成一個或多個擬胚體的胎盤干細胞。本發明還提供了包括CD200+、 OCT-4+干細胞的分離細胞群。在具體實 施方案中，所述干細胞為胎盤干細胞。在另一具體實施方案中，所述細胞群 為CD200'、 OCT-4'干細胞群。在各種實施方案中，至少大約10%、至少大 約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、或至少大約60%的 所述細胞為CD200+、 OCT-4+干細胞。在另一實施方案中，至少大約70%的 所述細胞為所述CD200+、 OCT-4'干細胞。在另 一實施方案中，至少大約90%、 95%或99%的所述細胞為所述CD200+、 OCT-4+干細胞。在所述分離細胞群 的具^f本實施方案中，所述干細胞是CD73'和(:Dl()5+的。在另一具體實施方 案中，所述干細胞為HLA-G+的。在另一具體實施方案中，所述干細胞為 CD34\ CD3&和CD45H在更具體的實施方案中，所述干細胞是CD34'、 CD38-、 CD45-、 CD73+、 CDl()5+和HLA-G+的。在另一具體實施方案中，所 述細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時產生一個或多個擬胚體。在另一實施方案中，本發明提供了從多種胎盤細胞中選擇胎盤干細胞群 的方法，該方法包括選擇胎盤細胞群，其中至少大約10%、至少大約20%、 至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%,至少大約 70%、至少大約80%、至少大約90%、或至少大約95%的所述細胞是CD200+、 OCT-4+干細胞。在具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD73'和CD105+ 的干細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是HLA-G+的胎盤 細胞。在另 一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34'、 CD38'和CD45' 的干細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、 CD38—、CD45—、 CD73+、 CD105和HLA-G+的干細胞。本發明還提供了分離的CD73+、 CD105+和HLA-G'干細胞。在具體實施 方案中，所述干細胞為胎盤干細胞。在另一具體實施方案中，所述干細胞是 CD34\ CD3K或CD45—的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD3《、 CD38—和CD45H在另一具體實施方案中，所述干細胞是OCT-4+的。在另 一具體實施方案中，所迷干細胞是CD200+的。在更具體的實施方案中，所述 干細胞是CD34\ CD38_、 CD45_、 OCT-4+和CD200+的。在另一具體實施方 案中，當所述胎盤細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時，所述干細胞有 利于在包括所述干細胞的胎盤細胞群中形成擬胚體。在另一實施方案中，本發明還提供了從多種胎盤細胞中選擇胎盤干細胞 的方法，該方法包括選擇CD73"、 CD105——和HLA-G+的胎盤細胞，因而所述 細胞為胎盤干細胞。在具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、CD3K 或CD45,胎盤細胞。在另 一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、 CD3&和CD45—的胎盤細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是 OCT-4+的胎盤細胞。在另 一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是00200+ 的胎盤細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、 CD38—、 CD45\ OCT-4+和CD200+的胎盤細胞。在另一具體實施方案中，所述選擇包 括選擇當所述胎盤細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時還有利于在包括 所述干細胞的胎盤細胞群中形成一個或多個擬胚體的胎盤細胞。本發明還提供了包括CD73+、 CD105+和HLA-G+干細胞的分離細胞群。 在具體實施方案中，所述干細胞為胎盤干細胞。在另一具體實施方案中，所 述細胞群為CD73+、 CD105+和HLA-G+干細胞群。在各種實施方案中，至少 大約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、或至少大約60%的所述細胞為CD73+、 CD105—和HLA-G+干細胞。在另一實 施方案中，至少大約70%的所述細胞為所述CD73+、 CD105"和HLA-G+的。 在另一實施方案中，至少大約90%、 95%或99%的所述細胞為所述CD73+、 CD105+和HLA-G+干細胞。在上述細胞群的具體實施方案中，所述干細胞是 CD34\ CD3&或CD45H在另一具體實施方案中，，所述干細胞是CD34—、 CD3&和CD45H在另一具體實施方案中，所述干細胞為OCT-4+的。在另 一具體實施方案中，所述干細胞為CD200+的。在更具體的實施方案中，所述 干細胞是CD3《、CD38_、 CD45\ OCT-4+和CD200+的。在另一實施方案中， 本發明提供了從多種胎盤細胞中選擇胎盤干細胞群的方法，該方法包括選擇 其中大部分所述細胞為CD7:T、 CD105+和HLA-G—的胎盤細胞群。在具體實 施方案中，所述大部分細胞還是CD3《、CD38—或CD45-的。在另 一具體實施 方案中，所述大部分細胞還是CD3《、CD3&和CD45-的。在另 一具體實施方 案中，所述大部分細胞還是CD200+的。在另一具體實施方案中，所述大部 分細胞還是CD3《、CD38—、 CD45—、 OCT-4+和CD200+的。在另一實施方案中，本發明提供包括分離的CD73—和CD105+干細胞， 當所述胎盤細胞群在允許擬胚體形成的條件下培養時，其有利于在包括所述 干細胞的分離的胎盤細胞的群中形成一個或多個擬胚體。在具體實施方案中， 所述干細胞是CD34—、 CD3&或CD45—的。在另一具體實施方案中，所述干細 胞是0034-、0038-和0045^。在另一具體實施方案中，所述干細胞是0(:丁-4+ 的。在更具體的實施方案中，所述干細胞是OCT-4+、 CD34\ CD38^pCD45-的。本發明還提供了包括CD73+、 CD105+干細胞的分離的胎盤細胞的群，其 中所述細胞群在允許擬胚^^形成的條件下培養時形成一個或多個擬胚^^。在具體實施方案中，所述干細胞為胎盤干細胞。在另一具體實施方案中，所述細胞群為CD73+、 CD105"詒盤干細胞的群，其中所述細胞群在允許擬胚體形 成的條件下培養時形成一個或多個擬胚體。在各種實施方案中，至少大約 10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少 大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%或至少大約95%的 所述分離的胎盤細胞為CD73+、 CD105'干細胞。在上述細胞群的具體實施方 案中，所述干細胞是CD34-、 CD38—或CD45-的。在另一具體實施方案中，所 述千細胞為CD3《、CD38-和CD45'的。在另一具體實施方案中，所述干細胞 為0CT-4+的。在更具體的實施方案中，所述干細胞是OCT-4+、 CD34—、 CD3& 和CD45—的。在其它具體實施方案中，所述細胞群已經被擴增，例如已經被 傳代至少一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或至少20次。本發明還提供分離的OCT-4+干細胞，其在允許擬胚體形成的條件下培養 時有利于在包括所述干細胞的分離的胎盤細胞的群中形成一個或多個擬胚 體。在具體實施方案中，所述干細胞為CD73+和CD105+的。在另一具體實 施方案中，所述干細胞為CD3《、CD3&或CD45—的。在另 一具體實施方案中， 所述干細胞為CD200+的。在更具體的實施方案中，所述干細胞為CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34、 CD38和CD45的。本發明還提供了包括OCT-4'干細胞的分離的胎盤細胞的群，其中所述細 胞群在允許擬胚^f本形成的條件下培養時形成一 個或多個擬胚體。在具體實施 方案中，所述干細胞為胎盤千細胞。在另一具體實施方案中，所述細胞群為 胎盤干細胞群，該胎盤干細胞是OCT-4+干細胞，其中所述細胞群在允許擬胚 體形成的條件下培養時形成一個或多個擬胚體。在各種實施方案中，至少大 約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40°/。、至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%或至少大約95% 的所述分離的胎盤細胞為OCT-4+干細胞。在上述細胞群的具體實施方案中， 所述干細胞是CD73'和CD105+的。在另一具體實施方案中，所述干細胞為 CD34\ CD3K和CD45—的。在另一具體實施方案中，所述干細胞為CD200+ 的。在更具體的實施方案中，所述干細胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34—、 CD38—和CD45'的。在另一具體實施方案中，所述細胞群已經被擴增，例如已 經被傳代至少一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或至少20 次。本發明還才是供了通過酶消化(參見第5.2.3部分)或灌洗(參見第5.2.4部分) 而得到的胎盤干細胞。例如，本發明提供根據以下方法產生的胎盤干細胞的 分離群，該方法包括灌洗已經排出了臍血并已經灌洗了的哺乳動物胎盤以 除去殘余血；用灌洗液灌洗所述胎盤；和收集所述灌洗液，其中灌洗后的所 述灌洗液包括包含胎盤干細胞的胎盤細胞群；和從所述細胞群中分離多種所述胎盤干細胞。在具體實施方案中，該灌洗液流過臍靜脈和臍動脈，然后在 其從胎盤流出后收集。通過這種方法產生的胎盤干細胞群通常包括胎兒和母 體細胞的混合。在另一具體實施方案中，所述灌洗液通過臍靜脈，而從臍動 脈收集，或通過臍動脈，而從臍靜脈收集。通過這種方法產生的胎盤干細胞群通常基本上完全來源于胎兒，也就是說，如所述細部群中大于90%、 95%、 99%或99.5%的胎盤干細胞是來源于胎兒。在各種實施方案中，從胎盤灌洗液中獲得的細胞群所包含的胎盤干細胞 占所述胎盤細部群的至少大約50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%或 至少99.5%。在另一具體實施方案中，通過灌洗收集的胎盤干細胞包括胎兒 和母體細胞。在另一具體實施方案中，通過灌洗收集的胎盤干細胞至少大約50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%或至少99.5%為胎兒細胞。在另一具體實施方案中，本發明提供了包括通過灌洗收集的分離的胎盤 干細胞的群的組合物，其中所述組合物包括至少部分用于收集所述胎盤干細 胞的灌洗液。本發明還提供了本文所描述的胎盤干細胞的分離群，其根據以下方法產 生，該方法包括用組織裂解酶消化胎盤組織以獲得包括胎盤干細胞的胎盤 細胞群，并從所述胎盤細胞的殘余物中分離多種胎盤干細胞。可消化整個或 部分胎盤以獲得胎盤干細胞。在具體實施方案中，例如，所述胎盤組織是整 個胎盤、羊膜、絨毛膜、羊膜和絨毛膜的組合，或上述任意幾項的組合。 在其它具體實施方案中，所述組織裂解酶是胰蛋白酶或膠原蛋白酶。在各種實施方案中，從消化的胎盤中獲得的細胞群所包含的胎盤干細胞占所述胎 盤細胞群的至少大約50%、 60°/。、 70%、 80%、 90°/。、 95%、 99°/。或至少99.5%。 基因圖譜證實分離的貼壁胎盤干細胞和分離的胎盤干細胞的群可以與其 他細胞如間充質干細胞，如骨髓來源的干細胞相區分。本文所述的貼壁胎盤 干細胞可以基于一個或多個基因的表達與間充質干細胞相區分，該基因的表 達與骨髓來源的間充質千細胞相比特異于胎盤干細胞或臍帶干細胞。具體地， 貼壁胎盤干細胞可以基于一個或多個基因的表達與間充質干細胞相區分，該 基因在胎盤干細胞中的表達顯著高于在間充質干細胞中的表達(至少高2倍)， 其中該一個或多個基因是ACTG2、 ADARB1 、 AMIG02、 ATRS-1 、B4GALT6、 BCHE、 Cllorf9、 CD200、 COL4Al、 COL4A2、 CPA4、 DMD、 DSC3、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1、 FLJ10781、 GATA6、 GPR126、 GPRC5B、 ICAM1、 IER3、 IGFBP7、 IL1A、 IL6、 IU8、 KRT18、 KRT8、 LIPG、 LRAP、 MATN2、 MEST、 NFE2L3、 NUAK1、 PCDH7、 PDLIM3、 PJP2、 RTN1、 SERP麵9、 ST3GAL6、52ST6GALNAC5、 SLC12A8、 TCF21、 TGFB2、 VTN、 ZC3H12A或以上任意 組合，其中當所述干細胞在相同條件下生長時，這些基因在胎盤干細胞或臍 帶干細胞中的表達顯著高于在骨髓來源的干細胞中的表達。在具體實施方案 中，該胎盤干細胞特異性或臍帶干細胞特異性基因是CD200。這些基因的表達水平可用于證實胎盤細胞群的身份，以鑒定細胞群包括 至少多種胎盤干細胞等。身份得到確認的胎盤干細胞群可以是克隆的，如從 單個胎盤干細胞擴增形成的胎盤干細胞群，或者混合的干細胞群，如包括從 多個胎盤干細胞擴增的單種胎盤干細胞的細胞群，或包括胎盤干細胞和至少 一種其他類型的細胞的細胞群。這些基因的表達水平可用來選擇貼壁胎盤干細胞群。例如，如果細胞群 樣品中一個或多個這些基因的表達顯著高于同等的間質干細胞群，則選擇這 種細胞群如克隆擴增細胞的細胞群。這種選擇可以是針對多種胎盤千細胞群、 多種身份未知的細胞群等細胞群。與所述一個或多個基因在間充質干細胞對照中的表達水平相比，貼壁胎 盤干細胞可基于一個或多個這種基因的表達水平進行選擇。在一實施方案中， 所述一個或多個基因在包括相當量間充質干細胞的樣品中的表達水平用作為 對照。在另一實施方案中，在一定條件下檢測的胎盤干細胞的對照是代表所上述貼壁或非貼壁胎盤干細胞的分離群和胎盤干細胞群一般可包括大 約、至少或不超過lx105、 5xl05、 lx106、 5xl06、 lx107、 5xl07、 lxio8、 5xl08、 lx109、 5xl09、 lx1010、 5xl010、 lx1011個或更多個胎盤干細胞。5.1.3.生長培養本文所述的胎盤干細胞的生長，對于任何哺乳動物細胞，在某種程度上。在最佳條件下，胎盤干細胞的數量通 常在3-5天增加一倍。在培養中，本發明^是供的胎盤干細胞在培養中貼壁到 底物上，例如，組織培養容器的表面(例如，組織培養皿塑料，纖維涂層塑料 等)，并形成單層。包括本發明所4是供的胎盤干細胞的分離的貼壁胎盤細胞的群在適當條件 下培養時形成擬胚體，也就是在貼壁干細胞層頂部生長出三維細胞集群。擬胚體內的細胞表達與早期干細胞相關的標記，例如OCT-4、 Nanog、 SSEA3 和SSEA4。擬胚體內的細胞通常不貼壁到培養底物上，如本發明所述的胎盤 干細胞，但在培養中仍然會附著到貼壁細胞上。擬胚體細胞的生存依賴于貼 壁胎盤干細胞，因為在沒有貼壁干細胞的情況下就不會形成擬胚體。因此， 貼壁胎盤干細胞有利于在包括該貼壁胎盤干細胞的胎盤細胞群中生長出一個 或多個擬胚體。不受理論約束，認為擬胚體的細胞在貼壁胎盤干細胞上生長 如同胚胎干細胞在飼養層細胞上生長一樣。間充質干細胞，如骨髓間充質干 細胞在培養中不會形成擬胚體。5.2.得到胎盤干細胞的方法 5.2.1.干細胞收集組合物本發明還提供了收集和分離胎盤干細胞的方法。 一般地，用生理學上可 接受的溶液，如干細胞收集組合物從哺乳動物胎盤獲得干細胞。干細胞收集 組合物在2005年12月29日提交的、題為"收集胎盤干細胞和保存器官的改 進培養基"的相關美國臨時申請60/754,969中有詳細描述。所述干細胞收集組合物可包括適于收集和/或培養干細胞的任何生理學 上可接受的溶液，例如鹽溶液(例如磷酸鹽緩沖液、Kreb's溶液、改良的Kreb's 溶液、Eagle's溶液、0.9%氯化鈉等)、培養基(如DMEM、 H.DMEM等)等等。所述干細胞收集組合物可包括旨在保存胎盤干細胞，也就是從收集時間 到培養時間內防止胎盤干細胞死亡或延遲胎盤干細胞死亡、減少細胞群中胎 盤干細胞的死亡數量等的 一 種或多種成分。這些成分可以是例如細胞凋亡抑
制劑(如Caspase抑制劑或JNK激酶抑制劑)、血管擴張劑(例如疏酸鎂、抗高 血壓藥物、心房利鈉肽(ANP)、促腎上腺皮質激素、促腎上腺皮質激素釋放 激素、硝普鈉、肼屈喚、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸鎂、磷酸二酯 酶抑制劑等)、壞死抑制劑(如2-(lH-吲哚-3-基)-3-戊基氨基馬來酰亞胺、吡咯 烷二硫代氨基甲酸鹽、或氯硝西泮)、TNF-a抑制劑和/或攜氧全氟化碳(例如 過氟辛基溴化物、過氟辛基溴化物等)。
所述干細胞收集組合物可以包括 一 種或多種組織降解酶，如金屬蛋白酶、 絲氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、RNA酶或DNA酶等。這些酶包括但不限于膠 原酶(如膠原酶I、 II、 III或IV，溶組織梭狀芽孢桿菌的膠原酶等)、分散酶、 嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、胰蛋白酶、LIBERASE、透明質酸酶等。
所述干細胞收集組合物可以包括殺菌或抑菌有效量的抗生素。在某些非 限制性實施方案中，該抗生素是大環內酯類抗生素(如妥布霉素)、頭孢菌素(如 頭孢氨,、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢丙雄、頭孢克羅、頭孢克將或頭孢羥 氨千)、克拉霉素、紅霉素、青霉素(如青霉素V)或喹諾酮類藥物(如氧氟沙星、 環丙沙星或氟哌酸)、四環素、鏈霉素等。在特定的實施方案中，所述抗生素 是對革蘭氏(+)和/或革蘭氏(-)細菌例如綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌等有活性 的。
所述干細胞收集組合物也可以包括一種或多種如下化合物腺苷(約1 mM至約50mM); D-葡萄糖(約20 mM至約100mM);鎂離子(約1 mM至約 50mM);分子量大于20,000道爾頓的大分子，在一實施方案中，以足以維持內皮完整性和細胞生存的量存在(例如，合成或天然產生的膠體，多糖如右旋
糖酐或聚乙二醇，大約25g/L至約100g/L或約40g/L至60g/L);抗氧化劑 (如叔丁對甲氧酚、丁基化羥基甲苯、谷胱甘肽、維生素C或維生素E，大 約25 |iM至約100 pM);還原劑(例如N-乙酰半胱氨酸，約0.1 mM至約5 mM); 防止鈣進入細胞的試劑(如維拉帕米，約2 (iM至25 |iM);竭酸甘油(例如約 0.05 g/L至約0.2g/L);抗凝血劑，在一實施方案中，以足以幫助防止殘余血 液凝固的量存在(如肝素或水蛭素，以約1000單位/L至約100,000單位/L的 濃度存在)；或含有阿米洛利的化合物(例如阿米洛利、乙基異丙基阿米洛利、 環己烷阿米洛利、二甲基阿米洛利或異丁基阿米洛利，約1.0pM至約5nM)。
5.2.2.胎盤收集和處理
一般來說，在出生排出后立即回收人胎盤。在一個實施方案中，在知會 同意并獲取患者的完整病史且將該病史與所述胎盤關聯后，從患者回收胎 盤。優選地，在分娩后繼續記錄病史。這種病史可用于協調胎盤或從其收 集的干細胞的后續使用。例如，根據病史，人胎盤干細胞可用作與該胎盤相 關聯的嬰兒，或該嬰兒的父母、兄弟姐妹或其他親屬的個性化藥物。
回收胎盤干細胞之前，除去臍帶血和胎盤血。在某些實施方案中，在分 娩后，回收胎盤中的臍血。可對胎盤進行常規的臍帶血回收處理。通常情況 下使用針或套管，在重力的幫助下從胎盤抽血(見例如Anderson的美國專利 號5,372,581; Hessel等人的美國專利號5,415,665)。該針或套管通常置于臍 靜脈處，并輕輕按摩胎盤，以幫助從胎盤排出臍血。這種臍血回收可進行商 業操作，如LifeBank USA, Cedar Knolls ， N.J. ， ViaCord, Cord Blood Registry andCryocell。優選地，胎盤通過重力排干，而不需要其他操作，以盡量減少 臍血回收期間對組織的損傷。通常情況下，胎盤會從分娩室或出生室運送到另一位置，例如實驗室以 通過例如灌洗或組織分離回收臍血和收集干細胞。胎盤最好使用無菌熱絕緣
運輸設備運輸(維持胎盤溫度在20-28。C之間)，例如夾緊胎盤臍帶近端，將胎
盤置于無菌封口塑料袋中，然后放在絕緣容器中。在另一實施方案中，胎盤
用臍帶血收集試劑盒運輸，該臍帶血收集試劑盒基本如2005年9月19號提 交的未決美國專利申請11/230,760中所述。優選地，胎盤在分娩后四至二十 四小時送到實驗室。在某些實施方案中，在回收臍帶血之前夾緊臍帶近端， 優選夾緊插入到胎盤盤的4-5 cm(厘米)處。在其他一些實施方案中，在回收 臍血后進一步處理胎盤前夾緊臍帶近端。
在干細胞收集之前，可以將所述胎盤保存在無菌條件和室溫或5至25"C (攝氏)下。在灌洗胎盤以除去任何剩余臍帶血前，胎盤可被保存超過48小時， 優選四至二十四小時。該胎盤優選5至25。C(攝氏)保存在抗凝血劑溶液中。 合適的抗凝血劑溶液是本領域公知的。例如，可以使用肝素或華法林鈉溶液。 在優選實施方案中，該抗凝血劑溶液包含肝素的溶液(如在1: 1000溶液中 l%w/w)。在收集胎盤干細胞之前，抽干血的胎盤優選保存不超過36小時。
哺乳動物的胎盤或其部分， 一旦如上所述被常規地收集和制備，可以用 任何已知的方式處理，例如可以灌洗或裂解，例如用一個或多個組織裂解酶 消化，以獲取干細胞。
5.2.3.胎盤組織的物理裂解和酶消化
在一實施方案中，干細胞從哺乳動物胎盤通過物理裂解，如酶消化所述 器官收集。例如，該胎盤或其部分可以被如碾、剪、絞、切、剁、浸等，同 時與本發明所提供的干細胞收集組合物接觸，并隨后用一種或多種酶消化該 組織。該胎盤或其部分也可被物理裂解，并用一種或多種酶消化，然后將得到的材料浸泡在或混合到干細胞收集組合物中。任何物理裂解方法都可以使 用，只要該裂解方法使多種、優選大多數、更優選所述器官中的至少60%、
70%、 80%、 90%、 95%、 98%或99%的細胞保持存活，這可通過例如臺盼藍 不相容法測定。
在物理裂解和/或酶消化和干細胞回收之前，可以將所述胎盤解剖成部 分。例如，胎盤干細胞可從羊膜、絨毛、臍帶、胎盤小葉、或其任何組合中 得到。優選地，胎盤干細胞從包括羊膜和絨毛膜的胎盤組織獲得。通常情況 下，胎盤干細胞可以通過小塊胎盤組織裂解得到，例如，約1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、卯、100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900或約1000立方毫米體積的胎盤組織塊。
優選的干細胞收集組合物包含一種或多種組織裂解酶。酶消化優選采用 酶的組合，如基質金屬蛋白酶和中性蛋白酶的組合，例如膠原酶和分散酶的 組合。在一實施方案中，胎盤組織的酶消化使用基質金屬蛋白酶、中性蛋白 酶和消化透明質酸的粘液溶解酶的組合，如MJf、酶、分散酶和透明質酸酶的 組合，或LIBERASE (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.)和透明質 酸酶的組合。可以用來裂解胎盤組織的其他酶包括木瓜蛋白酶、去氧核糖核 酸酶、絲氨酸蛋白酶如萬夷蛋白酶、糜蛋白酶、或彈性蛋白酶。絲氨酸蛋白酶 可被血清中的a2微球蛋白抑制，因此用于消化的培養基通常不含血清。EDTA 和DNA酶常用于酶消化過程中提高細胞回收的效率。消化產物優選被稀釋， 以避免干細胞陷入粘稠的消化物中。
可以使用組織消化酶的任意組合。組織消化酶的典型濃度包括例如 50-200 U/mL的膠原酶I和膠原酶IV、 1-10 U/mL的分散酶和10-100 U/mL 的彈性蛋白酶。可組合使用蛋白酶，也就是說，可以在相同消化反應中使用兩種或兩種以上的蛋白酶，或順序#_用，以;降出胎盤干細胞。例如，在一實
施方案中，胎盤或其一部分首先用2 mg/mL適量的膠原酶I消化30分鐘， 接著用0.25Q/o的胰蛋白酶37。C下消化10分鐘。優選地在使用其它酶后再使 用絲氨酸蛋白酶。
在另一個實施方案中，通過向含有干細胞的干細胞收集組合物中，或 者在用干細胞收集組合物分離干細胞前向解離和/或消化組織的溶液中添 加螯合劑(例如，乙二醇雙(2-氨基乙醚)-N， N, N，， N，-四乙酸(EGTA)或乙二 胺四乙酸(EDTA))，以進一步解離組織。
可以理解，當整個的胎盤或胎盤的 一 部分同時含有胎兒和母體細胞 (例如，胎盤的一部分包含絨毛膜或絨毛小葉)時，收集的胎盤干細胞將同 時包含來源于胎兒和母體的胎盤干細胞的混合物。當胎盤的部分不含有或 只含有可忽略量的母體細胞時(例如，羊膜)，收集的胎盤干細胞將幾乎只 含有胎兒的胚胎干細胞。
5.2.4.胎盤灌洗
胎盤干細胞也可通過灌洗哺乳動物胎盤得到。灌洗哺乳動物胎盤以獲得 干細胞的方法在例如Hariri的美國申請
發明者克利斯登·S·拉巴左, 倩 葉, 王佳倫, 羅伯特·J·哈黎里, 薩沙·道恩·阿布拉門遜, 詹姆士·W·愛丁格, 馬里安·佩雷拉 申請人:人類起源公司