專利名稱：L-氨基酸的生產方法
技術領域：
本發明涉及使用微生物的L-谷氨酸等L-氨基酸的生產方法。L-谷氨酸 作為調味品原料等，其它L-氨基酸作為動物飼料用添加劑、保健食品成分 或氨基酸輸液等，在產業上是有用的。
背景技術：
為了通過使用微生物的發酵方法來產生目標物質，例如L-氨基酸等， 存在下述方法使用野生型細菌(野生型菌抹)的方法、使用從野生型菌抹 衍生的營養缺陷菌抹的方法、使用從野生型菌抹作為對各種藥物的抗性突 變體菌抹而衍生的代謝調節突變體菌抹的方法、使用同時具有營養缺陷菌 抹和代謝調節突變菌林特征的菌抹等。
例如，L-谷氨酸主要通過使用屬于短桿菌屬(^"ev/6ac&Www)、棒桿菌 屬(Cbo;Me6(3"en'wm)、樣丈桿菌屬(M/cra6a"er/wm)的稱作棒狀桿菌型纟田菌 (coryneform bacteria)的L-谷氨酸生產菌或者它們的突變菌4朱的發酵方法來 生產(參照例如非專利文獻1)。作為通過使用其它菌抹的發酵方法來生產L-谷氨酸的方法，已知有下述方法使用芽孢桿菌屬(^z"7/w力、鏈霉菌屬 (5Yreptowyces)或青霉屬(尸em'"7/^m)屬等微生物的方法(參照例如專利文獻 1),使用假單胞菌屬(尸"i^omo"as)、節桿菌屬(力"/zra6ac er)、沙雷氏菌屬 GS^ra"a)或假絲酵母屬(OmA^)等微生物的方法(參照例如專利文獻2)，使 用芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬或產氣氣桿菌04ero6a"er fl￡rogg"&s)( J見在名為產氣腸#干菌(EVz/er。6"cfe^ "e"oge"es))等4敬生物的方法 (例如參照專利文獻3),使用大腸桿菌的突變菌抹的方法(參照例如專利文獻 4)，等等。此外，還公開了使用屬于克雷伯氏菌屬(K/e6wW/fl)、歐文氏菌屬 (五nWm'a)、泛菌屬(尸awto&a)或腸桿菌屬C&7fero6a"e。的孩i生物的L-谷氨酸 生產方法(參照例如專利文獻5 7)。
近年來，在目的物質的發酵生產中運用了重組DNA技術。例如，通過 增強編碼L-氨基酸生物合成體系酶的基因的表達(專利文獻8、專利文獻9)、
3或者增強碳源向L-氨基酸生物合成體系的流入(專利文獻10),可以改善細 菌的L-氨基酸生產力。
例如，已經有報道稱，對于L-谷氨酸的生產，在棒桿菌屬或短桿菌屬 的纟田菌中引入源自大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌(Cor;/"e6(3"en'wm g/wtom/cww) 的編碼種檬酸合酶的基因，對于棒狀桿菌型細菌的L-谷氨基酸生產能力的 增強是有效的(參照例如專利文獻11)。另外，已經有報道稱，將源自棒狀 桿菌型細菌的檸檬酸合酶基因引入屬于腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏 菌屬、歐文氏菌屬或埃希氏菌屬的腸細菌(enterobacterium)中，有效地增強 了 L-谷氨酸產生能力(參照例如專利文獻12)。
此外，已知通過缺損微生物的a-酮戊二酸脫氬酶(a-KGDH)來生產顯著 量的L-谷氨酸(專利文獻13、專利文獻14、專利文獻15)。
琥珀酸脫氬酶(SDH)是催化由琥珀酸到富馬酸的反應的酶，已知在棒狀 桿菌型細菌中通過缺損該酶的基因，生成微量的L-谷氨酸(專利文獻16)。
另 一方面，已知屬于腸內細菌群的大腸桿菌(^^en'c/z/a co/Z)中也存在琥 珀酸脫氫酶缺損抹(非專利文獻2)，但尚不清楚其與L-谷氨酸生產之間的關 聯。
此外，已知a-酮戊二酸脫氫酶缺損的大腸桿菌呈琥珀酸營養缺陷性， 但若與SDH—起雙重缺損，則琥珀酸營養缺陷性可以恢復(非專利文獻2)。 然而，a-酮戊二酸脫氬酶與琥珀酸脫氫酶的雙重缺損對L-谷氨酸等L-氨基 酸生產的影響尚屬未知。
專利文獻l美國專利第3,220,929號說明書
專利文獻2美國專利第3，563，857號說明書
專利文獻3特公昭32-9393號公報
專利文獻4特開平5-244970號公報
專利文獻5特開2000-106869號公報
專利文獻6特開2000-189169號公報
專利文獻7特開2000-189175號公報
專利文獻8美國專利第5,168,056號說明書
專利文獻9美國專利第5,776,736號說明書
專利文獻10美國專利第5,906,925號說明書
專利文獻11特公平7-121228號公報專利文獻12特開2000-189175號公才艮 專利文獻13歐州專利申請公開771879號公才艮 專利文獻14歐州專利申請公開0952221號公報 專利文獻15歐州專利申請公開1078989號公報 專利文獻16歐州專利申請公開1106684號公報
非專利文獻1明石邦彥等著，氨基酸發酵，學會出版中心，195~215 頁，1986年
非專利文獻2JGen Microbiol. 1978 Jul; 107(1): 1-13
發明內容
發明所要解決的問題
本發明的課題是提供能夠高效地生產L-谷氨酸等L-氨基酸的細菌， 和使用該細菌高效地生產L-氨基酸的方法。 解決問題的手段
本發明人等為解決上述問題進行了深入研究，結果發現通過對細菌進 行修飾使得琥珀酸脫氫酶活性和a-酮戊二酸脫氫酶活性降低，可以提高L-谷氨酸等L-氨基酸的生產力，從而完成了本發明。
即，本發明如下所述。
(1) . 一種生產L-氨基酸的方法，包括在培養基中培養具有L-氨基酸生 產能力且經過修飾使得琥珀酸脫氪酶活性和a-酮戊二酸脫氫酶活性降低的 微生物，使L-氨基酸在該培養基中或菌體內生成并蓄積，并且從該培養基 或菌體收集L-氨基酸。
(2) .上述方法，其中通過降低琥珀酸脫氫酶編碼基因或a-酮戊二酸脫 氫酶編碼基因的表達量，或者破壞所述基因，來降低琥珀酸脫氫酶活性或a-酮戊二酸脫氬酶活性。
(3) .上述方法，其中，所述琥珀酸脫氫酶編碼基因是選自sdhA基因、 sdhB基因、sdhC基因和sdhD基因中的l種或2種以上的基因。
(4) .上述方法，其中，a-酮戊二酸脫氬酶編碼基因是選自sucA基因、 odhA基因和sucB基因中的1種或2種以上的基因。
(5) .上述方法，其中，所述微生物為屬于腸桿菌科(Enterobacteriacae) 的細菌或者棒狀桿菌型細菌。(6) .上述方法，其中，所述氨基酸為L-谷氨酸或以L-谷氨酸為前體生 物合成的L-氨基酸。
(7) .上述方法，其中，所述L-氨基酸選自L-精氨酸、L-脯氨酸、L-鳥 氨酸、L-瓜氨酸和L-谷氨酰胺。
圖1顯示了輔助質粒RSF-Red-TER的結構。 圖2顯示了輔助質粒RSF-Red-TER的構建。
實施發明的最佳模式
以下，對本發明進行詳細說明。 <1>用于本發明的微生物
本發明的方法是使用具有L-氨基酸生產能力、且經過修飾使得琥珀酸 脫氫酶活性和a-酮戊二酸脫氫酶活性降低的微生物的L-氨基酸生產方法。
用于本發明的微生物可以這樣獲得以具有L-氨基酸生產能力的微生 物為親本菌^^,通過修飾使其琥珀酸脫氫酶和a-酮戊二酸脫氫酶活性降低。 此外，用于本發明的微生物還可以這樣獲得以經過修飾而使得琥珀酸脫 氬酶和a-酮戊二酸脫氫酶活性降低的微生物為親本菌抹，賦予或增強L-氨 基酸生產能力。
用于本發明的微生物可以是本來就具有L-氨基酸生產能力的微生物， 也可以是通過利用突變法、重組DNA技術等的選育而被賦予了 L-氨基酸生 產能力的微生物。
此處，"L-氨基酸生產能力，，是指當在培養基中培養用于本發明的微生
物時，其具有以可從細胞或培養基中回收的水平生產L-氨基酸的能力。優 選具有與在相同條件下培養的野生型菌抹或非修飾菌株相比具有生產更多
量的L-氨基酸的能力。
作為L-氨基酸，可以列舉出L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨 酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-絲氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨 酰胺、L-精氨酸、L-半胱氨酸(胱氨酸)、L-曱硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨 酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸、L-高絲氨酸；優選L-谷氨酸或以L-谷氨酸為前體的L-氨基酸，特別優選L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸。
作為在本發明的生產方法中使用的微生物，可以列舉出細菌，例如埃
希氏菌屬、；乏菌屬、腸4干菌屬等屬于腸4干菌一牛(五"ten96a"en.aceag family) 的4效生物；谷氨酉交斗奉一干菌禾口乳發酵殺豆4干菌(Brevz力a"en'wm /acto/erweWww) 等棒狀桿菌型細菌；和枯草芽孢桿菌(Bacz7/w w^7/力等屬于芽孢桿菌屬的細菌。
在本發明中，"棒狀桿菌型細菌，，還包括原來歸類于短桿菌屬、但現在 歸類于棒桿菌屬的細菌(Int. J. Syst. Bacteriol" 41, 255 (1991)),以及與棒桿
菌屬親緣關系非常近的短桿菌屬的細菌。這樣的棒狀桿菌型細菌的實例可 列舉下述
p耆乙酰乙酉吏才奉4干菌(Co^yweZ)acten.ww ac^oac/fifop/n'/ww) 醋谷才奉4干菌(Co^ywe6acfen'wm ace/og7wtom,cwm) 烷醇才奉桿菌(Co^yMe6(3cfe"'wm a/fe3"0/3^/cwm) 美棒軒菌(Co^y"eZ acfen'wm ca〃w"ae) 谷氨酸棒桿菌
百合花才奉4干菌(C07Me6a"en.ww /z7/wm) 才西#唐蜜氺奉才干菌(CoryweZ)ac&"'wm me/oweco/a)
p耆產氨才奉4干菌(Co/^"eZ)acfen.wm Ae^7woam/"oge"&s) (Co^y"e6ac&r/Mm
力士氺奉4干菌(Cory"e6(3cfen.wm /zercw//" 二ji支4豆4干菌(5rev/6acfeWwm A.van.C(^MW) 黃色^豆才干菌(5rev^a"en'ww ^Zavww)
乳發酵4豆沖干菌(6rev/6a"en'wm /actoyb7we"fwm)(谷氨酉臾才奉4干菌)
J文3鬼色-豆4干菌(jBrevAac&Wwm rcwewm)
角竿糖短桿菌(^"ew力a"e
生石克4豆才干菌(5reW6a"en'wm A/ogem'to//"
產氛棒軒菌(萬rev/6a"m'w附amwom'age"as)
p耆氨《效^干菌(Af/cro6acferz.wm a附mom'ap/z〃wm)
7具體地，可以下述菌抹為例 嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870 醋谷棒桿菌ATCC15806 烷醇棒桿菌ATCC21511 美才奉桿菌ATCC 15991
谷氨酸棒桿菌ATCC13020、 ATCC13032、 ATCC13060
百合花棒桿菌ATCC15990
棲糖蜜棒桿菌ATCC17965
嗜熱產氨棒桿菌AJ12340 (FERM BP-1539)
力士棒桿菌ATCC13868
二歧短桿菌ATCC 14020
黃色短桿菌ATCC13826、 ATCC14067
5rev/6acfen.廳/w7附an'op/n7麵ATCC14068
乳發酵短桿菌ATCC13869 (谷氨酸棒桿菌ATCC13869)
玫瑰色短桿菌ATCC13825
解糖短桿菌ATCC14066
生石克短桿菌ATCC19240
產氨才奉桿菌ATCC6871、 ATCC6872
白色短桿菌ATCC15111
^，力acfm'謹化///7應ATCC15112
嗜氨微桿菌ATCC15354
這些菌抹可從例如美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC:地址P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America)通過分售獲得。即，對每種菌林都給予了登錄號，可以 使用這些號碼通過分售獲得菌株(http'. 〃www.atcc.org/)。美國典型培養物 保藏中心的目錄中列出了每種菌株的對應登錄號。根據布達佩斯條約的規 定，將AJ12340菌抹于1987年10月27日保藏在通商產業省工業技術院 生命工學工業技術研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology),(目前為， 獨立行政法人產業技術綜合研究所專利微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology)) (305-5466日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第 6)，登錄號為FERMBP-1539。
對于用于本發明的屬于腸桿菌科的微生物沒有特殊限制，只要它們屬 于埃希氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、歐文氏 菌屬、沙門氏菌屬、摩根氏菌屬(#0^^^/^)等屬，具有L-氨基酸生產能 力即可。具體地說，可以使用按照NCBI (美國國家生物技術信息中心， National Center for Biotechnology Information)數據庫中記載的分類屬于腸 4干菌牙牛的纟田菌(http: 〃www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=l&srchmode=l&unlock)。作為腸桿菌科 的親本菌抹，尤其優選使用埃希氏菌屬細菌、腸桿菌屬細菌或泛菌屬細菌。
對于埃希氏菌屬細菌的親本菌抹，沒有特別限制，具體而言，可以使 用 Neidhardt等的著4乍(Neidhardt et al. ■Esc/zer/c/z/a and Sa/mo"e〃i3 T^/7/z/ww/畫,American Society for Microbiology, Washington D.C.， 1029表 l)列出的細菌。在這些細菌中，例如可列舉大腸桿菌。作為大腸桿菌，具 體地可列舉源自原型野生型K12菌株的大腸桿菌W3110 (ATCC 27325)和 大腸桿菌MG1655 (ATCC 47076)。
特別地，泛菌屬細菌、歐文氏菌屬細菌和腸桿菌屬細菌是分類為Y-變 形細菌Cy-Proteobacteria)的細菌，它們在分類學上的親緣關系非常近(J Gen Appl Microbiol 1997 Dec; 43(6) 355-361 、 International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, pi061-1067)。近年來，依據DNA-DNA雜交實驗 等，屬于腸桿菌屬的細菌中，有些被重新分類為成團泛菌(尸a"toea ogg/畫era—或等(International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989; 39(3).p.337-345)。此外，屬于歐文氏菌屬的細菌中， 有些#皮重新分類為a"a"w 、 斯氏泛菌(尸(3"tog(3 WewaW/)(參月褒 International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993; 43(1).p.162-173)。
腸4干菌屬纟田菌的實例包4舌成團腸4干菌(五"fero6acfer agg7omeraws)和產 氣腸桿菌CE"tera6acfer aerogeMM)。具體地，可以使用歐州專利申請公開 952221號說明書示例的菌抹。作為腸桿菌屬的代表性菌抹，可以列舉出成 團腸桿菌ATCC12287抹。
作為泛菌屬細菌的代表性菌4朱，可以列舉出Pantoea ananatis 、斯氏泛菌、 成團泛菌、尸朋toeac^ea。具體地，可以列舉下述菌才朱。a"awafe AJ13355 4朱(FERM BP-6614)(歐洲專利申請公開 0952221號說明書)
fl"朋a^ AJ13356抹(FERM BP-6615)(歐洲專利申請公開 0952221號說明書)
而且，這些菌抹在歐洲專利申請7>開0952221號說明書中記載為成團 腸桿菌，但現在，如上文所述，依據16SrRNA核苷酸序列分析將其重新分 類為。
作為歐文氏菌屬細菌，可以列舉出解淀粉歐文氏菌(五rw/m'a 胡蘿卜軟腐歐文氏菌(五rWw'a carotovora);作為克雷伯氏菌屬細菌，可以列 舉出植生克雷伯氏菌(^^^^//0尸/^&0/0)。具體地，可以列舉出下述菌抹。
解淀粉歐文氏菌ATCC15580抹
胡蘿卜軟腐歐文氏菌ATCC15713抹
植生克雷伯氏菌(K/eZwW/a pfe""co/a) AJ13399抹(FERM BP-6600)(歐 洲專利申請公開955:368號說明書)
植生克雷伯氏菌(A7e&zW/a ; /a""co/a) AJ13410株(FERM BP-6617)(歐 洲專利申請公開955368號說明書)
<1-1>匸氨基酸生產能力的賦予或增強
以下，說明對如上所述的微生物賦予L-氨基酸生產能力的方法，或增 強如上所述的微生物的L-氨基酸生產能力的方法。
為了賦予L-氨基酸生產能力，可以使用在棒狀桿菌型細菌或埃希氏菌 屬細菌等氨基酸生產菌的選育中沿用至今的方法，如獲取營養缺陷突變 體、L-氨基酸類似物抗性菌林或代謝調節突變菌抹，創建L-氨基酸生物合 成系統酶表達增強的重組菌抹等等(參見《氨基酸發酵》，(抹)學會出版中 心，1986年5月30日初版發行，第77-100頁)。這里，在L-氨基酸生產 菌的選育中，被賦予的營養缺陷性、類似物抗性或代謝調節突變等性質可 以是單獨一種，也可以是兩種或者三種以上。此外，表達被增強的L-氨基 酸生物合成系統酶可以是單獨一種，也可以是兩種或三種以上。另外，可 以將營養缺陷突變、類似物抗性或代謝調節突變等性質的賦予與生物合成 系統酶的增強組合進行。
具有L-氨基酸生產能力的營養缺陷突變體菌抹、類似物抗性菌抹或代 謝調節突變菌抹可如下獲得對親本菌抹或野生型菌株施以常規突變處理，即X-射線或UV照射或用誘變劑例如N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍等
處理；其后，從所得的突變菌抹中選擇顯示營養缺陷性、類似物抗性或代 謝調節突變并且還具有L-氨基酸生產能力的菌抹。此外，L-氨基酸產生菌 還可以通過基因重組增加L-氨基酸生物合成系統酶的活性來進行。
以下，對賦予L-氨基酸生產能力的方法和賦予了 L-氨基酸生產能力的 微生物進行示例。
作為通過選育來賦予或者增強L-谷氨酸生產能力的方法，可以列舉例 如通過修飾使得編碼L-谷氨酸生物合成相關酶的基因的表達增強的方法。 L-谷氨酸生物合成相關酶的實例包括谷氨酸脫氫酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶 (glnA)、谷氨酸合酶(gltAB)、異檸檬酸脫氫酶(icdA)、烏頭酸水合酶(acnA， acnB)、檸檬酸合酶(citrate synthase; gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、 丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶(aceEF， lpdA)、丙酮酸激酶(pykA， pykF)、磷 酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油變位酶(pgmA, pgml)、 磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapA)、丙糖磷酸異構酶(tpiA)、 果糖二磷酸醛縮酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA， pfkB)、葡糖磷酸異構酶(pgi) 和曱基檸檬酸合酶(prpC)等等。此外，酶名稱后的括號內為基因名稱(以下 同)。
作為增強這些基因的表達的方法，可以這樣來實現導入擴增質粒， 所述擴增質粒是將包含這些基因的DNA片段導入適當的質粒，例如至少包 含負責質粒在微生物內的復制增殖功能的基因的質粒載體而形成的；或者， 通過接合、基因轉移等使這些基因在染色體上多拷貝化；抑或在這些基因 的啟動子區域導入突變(參照國際公開小冊子W095/34672號)。
當向上述擴增質粒或者染色體上導入目的基因時，用于表達這些基因 的啟動子可以是能夠在棒狀桿菌型細菌中發揮功能的任何啟動子，可以是 所使用的基因自身的啟動子，也可以是經修飾的啟動子。也可以通過適宜 地選擇在棒狀桿菌型細菌中強力發揮功能的啟動子，或者通過使啟動子的 -35、 -10區域與共有序列接近，來進行基因表達量的調節。作為通過如上所 述的方法進行修飾從而增強了檸檬酸合酶基因、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸 脫氫酶基因和/或谷氨酸脫氫酶基因的表達的微生物，可以例舉WO00/18935 號小冊子、歐洲專利申請公開1010755號說明書等中記載的微生物。
為了賦予L-谷氨酸生產能力的修飾可以通過降低或缺損下述酶的活性來進行，所述酶催化從L-谷氨酸生物合成途徑分支出來而產生其它化合物 的反應。作為催化從L-谷氨酸生物合成途徑中分支出來而生成L-谷氨酸以
外的化合物的反應的酶，可以列舉出異檸檬酸裂合酶、乙酰羥酸合酶、 乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰轉移酶、乳酸脫氪酶、谷氨酸脫羧酶、1-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶(1-匕°口 U 乂一 5 —力^求年、>^一卜f匕K、口y于一if)、乙酰 CoA水化酶(WO2006/057450)等。
降低或者缺損上述酶的活性，可以按照與后述的降低琥珀酸脫氫酶活 性和a-酮戊二酸脫氪酶活性相似的方法來進行。
而且，作為在棒狀桿菌型細菌中賦予L-谷氨酸生產能力的方法，還可 以采用下述方法擴增yggB基因(NCgl 1221; NP—600492. Reports small-conductance...[gi: 19552490])的方法，導入在編碼區內導入突變而得 到的突變型yggB基因的方法(W02006/070944)。
此外，作為提高L-谷氨酸生產能力的方法，可以列舉導入編碼D-木酮 糖-5-磷酸磷酸酮醇酶(D-xylulose-5-phosphate phosphoketolase)和/或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶(fructose-6-phosphate phosphoketolase)(這里合稱磷酸酮醇酶) 的基因的方法。例如，作為磷酸酮醇酶活性提高的微生物，可以列舉以下 微生物(W02006/016705)。
乳發酵短桿菌ATCC13869AsucA(pVK9-xfp)、
乳發酵短桿菌ATCC13 869AsucA(pVK9-PS2—xpkA)
L-谷氨酸生產能力可以通過增強6-磷酸葡糖酸脫水酶活性、或2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶活性、或者這兩者的活性來賦予。作為6-磷酸葡 糖酸脫水酶活性、2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶活性提高的微生物，可 以列舉出特開2003-274988公開的微生物。此外，L-谷氨酸生產能力還可以 通過擴增作為L-谷氨酸分泌基因的yhfK基因來賦予(W02005/085419)。
此外，作為用于本發明的L-谷氨酸生產微生物，可以使用具有于酸性 條件下培養時在液體培養基中蓄積超過L-谷氨酸飽和濃度的量的L-谷氨酸 之能力(以下也稱為酸性條件下的L-谷氨酸蓄積能力)的微生物。例如，按照 歐洲公開公報1078989號記載的方法，通過獲取在低pH環境下對L-谷氨酸 的抗性提高的菌林，能夠賦予蓄積超過飽和濃度的量的L-谷氨酸的能力。
作為本來具有酸性條件下的L-谷氨酸蓄積能力的微生物，具體地可以 列舉出Pa"toeaAJ13355林(FERM BP-6614)、 AJ13356抹(FERMBP-6615)、 AJ13601抹(FERM BP-7207)(以上，參照歐洲專利申請公開 0952221號說明書)、SC17sucA抹、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB抹、NP106 抹和NA1株等。
Pa"toea AJ13355抹是作為低pH下能夠在含L-谷氨酸和碳源 的培養基中增殖的菌林從靜岡縣磐田市的土壤中分離出來的菌抹。AJ13356 為AJ13355抹的aKGDH-El亞基基因(sucA)缺損而得到的菌抹。
AJ13355抹和AJ13356株已于平成10年(1998年)2月 19日保藏于通產省工業技術院生命工學工業技術研究所(現名稱為產業技 術綜合研究所專利生物保藏中心，地址郵政編碼305-8566茨城縣筑波市 東1 丁目1番地1中央第6),保藏號分別為FERM P-16644和FERM P-16645, 并于平成11年(1999年)1月11日轉為基于布達佩斯條約的國際保藏，并給 予保藏號FERMBP-6614和FERMBP-6615。而且，這些菌抹在分離時被鑒 定為成團腸才干菌CE"fera6acfer agg/omera"力，并當作成團腸桿菌AJ13354、 AJ13355進行了保藏。但是，近年來，基于16SrRNA核苷酸序列分析等， 它們4皮重新分類為戶awtoea (參照后述實施例)。而下文所述的
AJ13601同樣也是在上述保藏機構中作為成團腸桿菌保藏的，而在本說明書 中表述為朋a"afe。 AJ13601已于1999年8月18日保藏于工業技 術院生命工學工業技術研究所(現名稱為產業技術綜合研究所專利生物保藏 中心，地址郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6), 保藏號為FERM P-17156，并且于2000年7月6日轉為基于布達佩斯條約 的國際保藏，并給與保藏號FERM BP-7207。
此外，作為Pa"/oea的L-谷氨酸生產菌，可以列舉出a-酮戊二 酸脫氫酶(aKGDH)活性缺損、或者aKGDH活性降低的屬于泛菌屬的細菌。 作為這樣的菌抹有前述的AJ13356林，以及從AJ13355抹中作為粘液質 低生產突變菌林選擇出來的SC17抹衍生的sucA基因缺損抹SC17sucA (美 國專利第6,596,517號)。SC17sucA抹的內部編號為AJ417抹，已于2004 年2月26日保藏于產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(地址郵政編碼 305-8566茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6),保藏號FERM BP-08646。
此外，上述SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株是在SC17sucA抹中導入包 含大腸桿菌來源的檸檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppsA)和谷氨酸脫氫酶基因(gdhA)的質粒RSFCPG,以及包含乳發酵短桿菌來源的 檸檬酸合酶基因(gltA)的質粒pSTVCB而得到的菌抹。AJ13601抹是從該 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB抹中作為低pH下顯示出對高濃度L-谷氨酸的 抗性的菌抹而選擇出的菌抹。此外，NP106林是如實施例所述那樣，質粒 RSFCPG+pSTVCB從AJ13601抹脫落而得到的菌林。
作為賦予或者增強L-谷氨酸生產能力的其它方法，還可以列舉賦予 對有機酸類似物、呼吸鏈抑制劑等的抗性的方法，和賦予對細胞壁合成抑 制劑的敏感性的方法。例如賦予單氟乙酸抗性的方法(特開昭50-113209 )、 賦予腺噪呤或胸腺嘧啶抗性的方法(特開昭57-065198)、削弱脲酶的方法(特 開昭52-038088)、賦予丙二酸抗性的方法(特開昭52-038088)、賦予苯并吡 喃酮或萘醌抗性的方法(特開昭56-1889)、賦予HOQNO抗性的方法(特開昭 56-140895)、賦予a-酮丙二酸抗性的方法(特開昭57-2689)、賦予胍抗性的 方法(特開昭56-35981)和賦予青霉素^:感性的方法(特開平4-88994)，等等。 作為這樣的抗性菌的具體例子，可以列舉出下述菌林 黃色短桿菌AJ3949(FERMBP-2632;參見特開昭50-113209) 谷氨酸棒桿菌AJ11628 (FERMP-5736;參見特開昭57-065198) 黃色短桿菌AJU355 (FERMP-5007;參見特開昭56-1889號公報) 谷氨酸棒桿菌AJ11368 (FERMP-5020;參見特開昭56-1889號公報) 黃色短桿菌AJ11217(FERMP-4318;參見特開昭57-2689號公報) 谷氨酸棒桿菌AJ11218 (FERMP-4319;參見特開昭57-2689號公報) 黃色短桿菌AJ11564(FERMP-5472;參見特開昭56-140895號公報) 黃色短桿菌AJ11439 (FERMP-5136;參見特開昭56-35981號公報) 谷氨酸棒桿菌H7684 (FERM BP-3004;參見特開昭04-88994號公報) 乳發酵短桿菌AJ11426 (FERMP-5123;參見特開昭56-0488卯號公報) 谷氨酸棒桿菌AJ11440 (FERM P-5137;參見特開昭56-048890號公報) 乳發酵短桿菌AJ11796 (FERMP-6402;參見特開昭58-158192號公報)。 具有L-谷氨酰胺生產能力的微生物的優選例子是谷氨酸脫氫酶活性 增強的細菌，谷氨酰胺合成酶(glnA)活性增強的細菌，和谷氨酰胺酶基因 被破壞的細菌(歐洲專利申請公開第1229121號和歐洲專利申請公開 1424398號)。谷氨酰胺合成酶的活性增強也可以通過谷氨酰胺腺苷酰轉移 酶基因(glnE)的破壞、PII調控蛋白(glnB)的破壞來實現。另外，作為優選
14的L-谷氨酰胺生產菌的例子，可列舉具有如下所述的突變型谷氨酰胺合成 酶的、屬于埃希氏菌屬的細菌，所迷突變型谷氨酰胺合成酶中谷氨酰胺合
成酶第397位的酪氨酸殘基被其它氨基酸殘基取代(美國專利申請
發明者中村純, 仁志蘭子, 原吉彥, 泉井裕 申請人:味之素株式會社