利用hplc在制備級上純化rna的方法

文檔序號：439347閱讀：3067來源：國知局

專利名稱：利用hplc在制備級上純化rna的方法
技術領域：
本發明涉及利用HPLC在制備級(制備規模)上純化RNA的方法以及多孔反相在該方法中作為固定相的應用。
背景技術：
HPLC ("高效(高壓)液相色語"的縮寫)是一種已建立的用于分離物質的混合物的方法，該方法廣泛用于生物化學、分析化學以及臨床化學中。
在最簡單的情況下，HPLC裝置包括帶有洗脫液儲器(裝有流動相)的泵、加才羊系統、裝有固定相的分離柱、以及沖企測器。此外，還可以4是供流分收集器，利用該流分收集器可以在分離以后分別收集單獨流分，且單獨流分因此可用于進一步的應用中。
從A. Azarani和K.H. Hecker( Nucleic Acids Research, vol. 29, no. 2 e7 )中已知利用離子對反相HPLC進行的RNA分析。其中的固定相由非多孔烷基化聚苯乙烯二乙烯基苯基質構成。用兩種洗脫液的緩沖體系進行洗脫。緩沖液A由0.1 M乙酸三乙銨(TEAA)的水溶液組成(pH 7.0 ),而緩沖液B由0.1 M TEAA的水溶液(pH 7.0 ) 以及25%乙腈組成。利用以下三種梯度體系進行洗脫38-40% B 經1分鐘，至60% B經15分鐘，至66% B經6分鐘，至70% B經 0.5分鐘，至100% B經0.5分鐘，在100% B下保持1分鐘，至38% 經1分鐘，在38% B下保持2分鐘。可替換地，使用以下梯度程序38-60%經30分鐘，至100。/。B經2分鐘，至38% B經3分鐘。以下用作第三梯度程序38-40% B經l分鐘，至60% B經3分鐘，至100% B經1分鐘，在100% B下保持6分鐘，至38% B經1分鐘，在38% B下保持1分鐘。
因此，這種HPLC方法涉及使用相對復雜且昂貴的梯度程序。 jt匕夕卜，這種方法^f又育巨分離和分對斤最多達1000ng (1 j^g或0.001mg) 的分析量的RNA。

發明內容
本發明的目的是改進這種方法，達到使其不再具有現有技術缺點的效果。
根據本發明，通過用于在制備級(制備規模)上純化RNA的方法實現上述目的，該方法的顯著區別在于使用多孔反相作為固定相利用HPLC來純化RNA。因此，在才艮據本發明的方法中，一個重要因素是使用多孔反相。
在本發明的上下文中，術語"利用HPLC"應包括可以用來實施本發明方法的各種HPLC方法以及^氐壓或常壓、液相色^普法。這些 HPLC方法可以包括反相HPLC (RP-HPLC)、色鐠法、尺寸排阻色譜法、凝膠過濾、親和色譜法、疏水作用色譜法或離子對色譜法，其中反相HPLC是優選的。簡言之，反相HPLC包括非極性的固定相和中等才及性的流動相。例如，一種常用的固定相是用i者如 RMe2SiCl處理過的二氧化硅，其中R是諸如(^181137或C8H17的直鏈烷基。因此，對于本身非極性更強的分子，保留時間會更長，從而 4吏得4及性分子更容易洗脫。通過向流動相中加入才及性溶劑可延長寸呆留時間，而加入疏水性更強的溶劑則.可縮短保留時間。然而，上述各種技術是基于疏水作用的原理而操作的，疏水作用是由相對極性的溶劑、相對非極性的分析物、以及非極性的固定
相之間的排斥力而引起的(反相原理)。分析物(RNA分子)結合于固定相的驅動力是分析物分子暴露于溶劑的非才及性部分面積的減少。這種疏水效應受控于自由能的降低(來自與有序分子-極性溶劑界面的極小化有關的熵)。通過向流動相中加入非極性更強的溶劑可以降低疏水效應。這會使分配系凄t發生變化以致分析物經一定時間在流動相中沿柱下移，最終乂人4主洗脫。
作為分析物的特定RNA分子的特性在其保留特性方面可以起到重要作用。通常，具有非極性更強的官能團的分析物導致更長的保留時間，因為它使分子的疏水性提高。然而，非常大的分子會導致4支大分析物表面和烷基鏈之間的不完全相互作用。保留時間隨疏水表面積的增力。而增力。，其中疏水表面積與溶質大小大致成反比。因為總表面積減小，支鏈化合物比它們的相應異構體更快速地被洗脫。
除流動相疏水性之外，才艮據本發明，其他流動相改性劑也會影響分析物(RNA分子)的保留。例如，認為加入無機鹽會引起水溶液表面張力的線性增加，并且由于分析物-溶劑界面的熵受控于表面張力，所以鹽的加入傾向于使保留時間增加。根據本發明可以使用的另一個重要因素是pH，因為這能夠改變分析物的疏水性。為此，可以-使用緩沖劑，如石岸酸鈉或其他常用緩沖劑來控制pH。可以向流動相中加入有機酸，例如曱酸或最常用的三氟乙酸。上述改性可以出于多種目的它們控制pH，中和在固定相上的4壬4可殘余暴露材泮+上的電荷以及作為離子配對劑(ion pairing agent)來中和分才斤物上的電荷。這種效應依賴于應用而不同{旦通常會改進色i普法。
針對本發明的目的，術語"純化"應理解為意指將樣品中所期望的RNA分離出來和/或與其中存在的雜質分開。因此，與HPLC純化以前最初引入的含RNA的樣品相比，HPLC純化以后，RNA 以更純的形式存在。含RNA的樣品中的不期望的成分(因此其需要被分離)具體而言可以是降解的片段或由于提前終止轉錄而產生的片段、或過長的轉錄本(如果質粒未被完全線性化)。此外，可以將雜質，如酶(例如核糖核酸酶和聚合酶)以及核苷酸，分離出來。
利用根據本發明的方法，使RNA得到純化，純化后的RNA比原料具有更高的純度。在這方面人們希望純度盡可能地接近100%。以這種方式可以達到大于70%、特別地80%、非常特別地90%以及最有利地99%或更大的純度。
根據本發明的方法導致制備型RNA純化。這不同于在上述現有技術中(Azarani & Hecker )描述的分析型HPLC法。與制備型 HPLC法相比，分析型HPLC法引入和分離明顯更少的量。在現有技術描述的方法中，引入的量為8 ng至1000 ng。相比之下，制備型HPLC法應理解為是指其中相7于大量的RNA ^皮純4匕的HPLC方法。這種相對大量例如是0.5 mg或更多，特別地1.0 mg至1000 mg 或更多，非常特別地大約1.5 mg或更多，甚至增加到kg范圍也是可能的。因此以上陳述應理解為是指這些量涉及單次HPLC運行。如果實施多次HPLC運行，則該量與HPLC運行的次數成正比地增力口。
才艮據本發明的方法，尤其是下文詳細描述的優選實施方式，具有一系列優點利用根據本發明的方法，與現有技術已知方法的可能情況相比，可以分離明顯更大量的RNA 。利用根據本發明的方法，可以以高純度獲得這些相對大量的RNA。可以分離降解片#爻或過長片段或由于提前終止轉錄所產生的片段。此外，可以較好地分離 RNA樣品中存在的其他雜質，如酶(例如核糖核酸酶和聚合酶)以及核香酸。可以在數分鐘內回收這些相對大量的RNA，甚至是從具有非常高度的雜質污染的樣品中進行回收。RNA回收可以可靠地進行，即，以較高的可靠性回收高純度的RNA。
在才艮據本發明的方法中，可以實現高水平的分離度 (resolution )。另外，根據本發明的方法可以容易地自動操作。因此它最適合用于制備級的RNA的常規純化。在才艮據本發明的方法的條件下RNA是穩定的，即，避免在HPLC純化過程中降解成RNA 片,殳并由此產生新的雜質、以及所期望的RNA的產率降^f氐。因此可以以簡單、快速、廉價的方式來精確地實施才艮據本發明的方法，并產生可靠的結果。在HPLC分離以后，可以簡單地用流分收集器進行RNA的分離，即，可以非常簡單地實現RNA的回收，同樣也可以直4妄只于RNA實施進一步處理。最后可以非常靈壽文;也進^f于枱r測。
可用才艮據本發明的方法純化的"RNA"是4壬4可類型的核^唐核酸。 RNA特別優選選自tRNA、 rRNA、 mRNA或全細月包RNA。此夕卜， RNA還可以包括適體和核酶。要分離的RNA可以是單鏈或雙鏈的。單鏈RNA可以可選地通過重折疊而形成二級結構，要分離的RNA 通常是單鏈的。RNA可以是未標記的或(用熒光標記或i丈射性標記或抗體表位)標記的。標記RNA的一個實例是地高辛標記的P-月幾動蛋白RNA。
要純化的RNA可以是天然的或非天然的RNA。優選使用天然 RNA,其利用例如細月包或體外表達系統而制備。然后分離RNA并利用根據本發明的方法進行分離純化。可選地，也可以利用根據本發明的方法純化化學合成的RNA。不i侖如4可，RNA還可以包含非天然核苷酸，其中化學修飾可存在于RNA的骨架中，例如硫代磷酸酯(phosphorthioate );可存在于核苷酸石咸基結構中，例如次黃嘌，冷、二氫尿嘧咬、邗i尿嘧，定、2-石克尿嘧，定、4-石克尿嘧口定、5-氨基尿嘧啶、5-(Cl-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧咬、5-(羥曱基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-(Cl-C6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、 N〈2〉-二曱基鳥噤呤、2,4-二氨基嘌呤、8-氮雜嘌呤、取代的7-去氮 "票呤(優選7-去氮-7-取代的嘌呤和/或7-去氮-8-取代的嘌呤)、5-羥甲基胞嘧啶、N4-烷基胞嘧啶(例如N4-乙基胞嘧啶)、5-羥基脫氧胞苷、5-羥曱基脫氧胞苷、N4-烷基脫氧胞苷(例如N4-乙基脫氧胞苷)、6-硫代脫氧鳥苷、以及硝基p比咯的脫氧核糖核苦酸、C5-丙炔基嘧啶，以及二氨基嘌呤(例如2，6-二氨基嘌呤)、肌苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基。票呤、2-氨基-6-氯嘌呤；或者也存在于糖殘基中。修飾核苷酸的其他實例是2-氨基-6-氯嘌呤-核苷-5'-三磷酸、2-氨基腺香_5'-三磷酸、2-硫代胞苷-5'-三磷酸、2-石克代尿苷-5'-三磷酸、4-硫代尿苷-5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸、5-溴尿苷-5'-三磚酸、5-碘胞苷-5'-三磷酸、5-碘尿苷-5'-三磷酸、5-曱基胞苷-5'-三磷酸、5-曱基尿苷-5'-三磷酸、6-氮雜胞苷-5'-三磷酸、6-氮雜尿苷-5'-三磷酸、6-氯嘌呤-核苷-5'-三磷酸、7-去氮腺苷-5'-三磷酸、7-去氮鳥苷-5'-三磷酸、8-氮雜腺苷-5'-三磷酸，8-疊氮腺苷-5'-三磷酸、苯并咪唑-核苷-5'-三磷酸、Nl-甲基腺苷-5'-三磷酸、Nl-甲基鳥苷-5'-三磷酸、N6-甲基腺普 -5'-三磷酸、06-曱基鳥苷-5'-三磷酸、假尿苷-5'-三磷酸、嘌呤霉素 -5'-三石粦酸、黃芬-5'-三^粦酸。
在根據本發明的方法的一種優選實施方式中，要分離的RNA 的大小為多達約15000個核苷酸(作為單鏈RNA分子)或》咸基對 (作為雙鏈RNA分子)，特別地100至10000個，更優選500至10000 個核苷酸或^威基^",甚至更伊C選800至5000個核普酸或》咸基對并且甚至更優選800至2000個核苷酸或堿基對。對于這樣大小的 RNA,已證明對于RNA的純化可以獲得非常好的結果，因為根據本發明的方法特別好地適合于這樣大小的RNA。然而，可選地，也可以以此方式分離更小的RNA片段，例如長度為30-1000、 50-1000 或100-1000或20-200、 20-100、 20-50或20-30個一亥普酉吏。
如果要分離的RNA是mRNA,將優選編碼蛋白，特別是那些具有抗原特性的蛋白，以及例如所有重組產生的或天然存在的蛋白，其是本領域技術人員根據現有技術已知的并且用于治療、診斷或研究目的。特別地，抗原是腫瘤抗原或病原體的抗原，病原體例如是病毒、細菌或原生生物。
并不限于此，這樣的蛋白質尤其包括生長激素或生長因子，例如用于在(轉基因)活生物體內促進生長，例如TGF和IGF ("胰島素樣生長因子")；影響代謝作用和/或造血作用的蛋白，例如(a-l)-抗胰蛋白酶、LDL受體、促紅細胞生成素(EPO)、胰島素、GATA-1 等；或如凝血系統的因子VIII和XI的蛋白質，等等。這樣的蛋白質進一步包括酶，如半乳糖苷酶(lacZ )、 DNA限制性內切酶類(例如EcoRI、 HindIII等)、溶菌酶類等，或蛋白酶類，如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、角蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酵素(;疑乳酶)、suizyme、 nortase等，以及蛋白酶4中制劑(例力口用于治療HIV感染)，如選自由AG1776、氨普那韋(141W94或VX-478 )、阿扎那韋(BMS-232632 )、組織蛋白酶S蛋白酶抑制劑、D1927、 D9120、一畐沙、刃卩韋(GW畫433908或VX-175 )、 GS 9005、 GW640385 (VX-385 )、 HCV蛋白酶抑制劑、茚地那韋(MK-639 )、 L-756 423、 Levoprin-ZG、洛匹那韋(ABT-378 )、洛匹那韋/利托那韋(LPV ABT-378/r )、 MK-944A、莫折那韋(DMP450 )、奈非那韋(AG-1343 )、麗RT1、 P畫1946、 PL隱IOO、普淋司4也、利4乇那韋(ABT-538)、 RO033-4649、 TMC114、 ^少查刃卩韋(Ro-31-8959 )、 NRT1、替4立刃卩韋(PNU-140690)、 TLK 19781、 TMC畫114、 vertex 385、 VX-950組成的組中的蛋白酶抑制劑。由根據本發明分離的RNA編碼的蛋白同樣可以包括刺激或抑制細胞信號傳輸的蛋白，例如細胞因子等。
12因此這樣的蛋白質還包括例如I型細胞因子家族的細胞因子，其包
含4個位置保守的半胱氨酸殘基(CCCC)和一個保守序列基元(或基序)Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS),其中X表示非保守氨基酸。I型
細胞因子家族的細胞因子包括GM-CSF亞家族，例如IL-3、 IL-5、 GM-CSF; IL-6亞家族，例如IL-6、 IL-ll、 IL-12;或IL-2亞家族，例如IL-2、 IL-4、 IL-7、 IL-9、 IL-15等，或細月包因子IL-1、 IL-1、 IL-10等。同樣，這樣的蛋白質還可以包括II型細胞因子家族(干擾素受體家族)的細胞因子，其同樣包含4個位置保守的半胱氨酸殘基(CCCC)，但沒有保守序列基元Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS)。 II 型細胞因子家族的細胞因子包括例如IFN-a、 IFN-P、 IFN-y等。由分離的RNA編碼的蛋白還可以另外包括腫瘤壞死家族的細胞因子，包4舌例如TNF-a、 TNF-p、 CD40商己體、Fas配體等，或趨4匕因子家族的細胞因子，尤其是干4尤素、白細胞介素、集落刺激因子和腫瘤壞死因子，并且與G蛋白相互作用，例如IL-8、 MIP-1、 RANTES、 CCR5、 CXR4等。這樣的蛋白質還可以選自凋亡因子或凋亡相關蛋白或凋亡關聯蛋白，其包括AIF 、 Apaf(例如Apaf-1, Apaf-2, Apaf-3 )、或APO-2(L)、 APO-3(L)、凋亡素(apopain )、 Bad、 Bak、 Bax、 Bcl國2、 Bc1畫Xl、 Bcl-xs、 bik、 CAD、 4丐蛋白酶、半胱天冬蛋白酶類(caspases ) 例如半胱天冬蛋白酶-1、半胱天冬蛋白酶-2、半胱天冬蛋白酶-3、半胱天冬蛋白酶-4、半胱天冬蛋白酶-5、半胱天冬蛋白酶-6、半胱天冬蛋白酶-7、半胱天冬蛋白酶-8、半胱天冬蛋白酶-9、半胱天冬蛋白酶-10、半胱天冬蛋白酶畫ll、 ced-3、 ced-9、 c-Jun、 c國Myc、 crm A、細月包色素C、 CdRl、 DcRl、 DD、 DED、 DISC、 DNA-PKCS、 DR3、 DR4、 DR5、 FADD/MORT-l、 FAK、 Fas (Fas配體CD95/fas
(受體))、FLICE/MACH、 FLIP、胞襯蛋白、fos、 G-肌動蛋白、 Gas-2、凝溶月交蛋白、顆粒酶A/B、 ICAD、 ICE、 JNK、核纖層蛋白 A/B、 MAP、 MCL-1、 Mdm-2、 MEKK證1、 MORT畫l、 NEDD、 NF-B、 NuMa、 p53、 PAK-2、 PARP、穿孑L蛋白、PITSLRE、 PKC、 pRb、早老素、prICE、 RAIDD、 Ras、 RIP、鞘石粦脂酶、來自單純皰滲的胸香激酶、TRADD、 TRAF2、 TRAIL 、 TRAIL-R1 、 TRAIL-R2、 TRAIL-R3 、轉谷氨酰胺酶等。由根據本發明分離的RNA編碼的蛋白質還可以選自抗原，例如選自腫瘤特異性表面抗原(TSSA),例如5T4ot5(Bl整聯蛋白、707-AP、 AFP、 ART-4、 B7H4、 BAGE、 Bcr-abl、麗/CIX-抗原、CA125、 CAMEL、 CAP誦1、 CASP-8、 (3-聯環蛋白/m、 CD4、 CD19、 CD20、 CD22、 CD25 、 CDC27/m、 CD30、 CD33、 CD52、 CD56、 CD80、 CDK4/m、 CEA、 CT、 Cyp國B、 DAM、 EGFR、 ErbB3、 ELF2M、 EMMPRIN、 EpCam、 ETV6畫AML1、 G250、 GAGE、 GnT-V、 Gp100、 HAGE、 HER-2/new、 HLA-A*0201-R170I、 HPV-E7、 HSP70-2M、 HAST誦2、 hTERT (或hTRT )、 iCE、 IGF畫1R、 IL-2R、 IL-5、 KIAA0205、 LAGE、 LDLR/FUT、 MAGE、 MART-1/黑色素 -A(melan-A)、 MART國2/Ski、 MC1R、月幾J求蛋白/m、 MUC1、 MUM-1、 MUM-2、 MUM-3、 NA88陽A、 PAP、蛋白酶畫3、 p190 ;欠要bcr-abl、 Pml/RAR、 PRAME、 PSA、 PSM、 PSMA、 RAGE、 RU1或RU2、 SAGE、 SART-1或SART-3、存活素、TEL/AML1、 TGF、 TPI/m、 TRP畫1、 TRP畫2、 TRP畫2/INT2、 VEGF以及WT1，或選自序列，如 NY-Eso-l或NY-Eso-B。可以由才艮據本發明分離的RNA編碼的蛋白另外還包括與上述蛋白中的一種具有至少80%或85%,優選至少 90%,更優選至少95%以及最優選至少99%的序列同一性的蛋白或蛋白序列。
要分離的mRNA可以相對于相應的野生型mRNA具有以下^f多飾，相應的野生型mRNA可以作為替換或以合并方式而存在。一方面，編碼肽或多肽的修飾mRNA區的G/C含量可以大于編碼肽或多肽的野生型mRNA的編碼區的G/C含量，編碼的氨基酸序列相對于野生型沒有改變。這種#~飾基于以下事實要翻譯的mRNA 域的序列順序對于有效的mRNA翻譯是重要的。在這方面，各種核苷酸的組成和順序具有重要作用。尤其是，具有高G (鳥苷)/C (胞嘧啶)含量的序列比具有高A (腺苷)/U (尿嘧啶)含量的序列更加穩定。因此，才艮據本發明，雖然維持翻譯的氨基酸序列不變，但
密碼子相對于野生型mRNA以^使它們具有更高G/C核苷酸含量的方式變化。因為若干種密碼子編碼一種和相同的氨基酸(遺傳密碼的簡并)，所以可以確定最有利于穩定性的密碼子(可選的密碼子應用)。另一方面，借助于根據本發明的方法，還可以提供翻譯優化的腦A。
在根據本發明的方法中，反相用作HPLC純化的固定相。對于反相色譜法，非極性化合物用作固定相而極性溶劑，如水(其通常以緩沖液的形式使用)與例如乙腈和/或曱醇的混合物，用作洗脫的流動相。
可以以珠粒(bead)形式或作為聚合的"塊體"(即填充大部分色語柱的塊體)來提供填裝在柱上的材料，其用作固定相。不論其確切的特性如何，聚合固定相的特性是多孔的，其意味著^N立或塊體的特征是具有孔。
在根據本發明的方法的一種優選實施方式中，所提供的多孔反相材料的顆粒大小為8.0 pm至50 ^m，特另'J地8.0至30，更優選 8.0至25 ]Lim。該反相材料可以以小球的形式存在。借助于具有這種顆粒大小的多孔反相(可選地為珠粒形式)，可以特別有利地實施根據本發明的方法，其中可以獲得特別好的分離結果。
在根據本發明的方法中使用的反相是多孔的并且具有特定的顆粒大小。另一方面，在4吏用例如由A. Azarani和K.H. Hecker所描述的固定反相(其不是多孔的，因而就顆粒大小而言完全不同于本發明的主題)的情況下會產生過高壓力，以使得就算可以進行 RNA的制備型純化，也存在著很大困難。
15在才艮據本發明的方法的一種優選實施方式中，反相的孔徑為
1000 A至5000 A，特別地孔徑為1000 A至4000 A,更優選1500 A 至4000 A, 2000 A至4000人或2500 A至4000 A。反牙目的凈爭另'M尤選的孔徑是1000 A至2000 A，更優選1000 A至1500 A以及最優選1000 A至1200 A或3500-4500 A。借助于具有這些孔徑的反相，利用根據本發明的方法可以獲得特別好的RNA純化的結果，尤其是因而可以避免在按照A. Azarani和K.H. Hecker的方法中所產生的升高的壓力，從而可以以特別有利的方式進行制備型分離。在孔徑小于1000A時，RNA分子的分離會變得較差。
1000 A至5000 A的孑L徑，特別是1000 A至4000 A的孔徑，更優選1500 A至4000 A ， 2000 A至4000 A或2500 A至4000 A的孔徑可以適合于從混合物的其他組分中分離出RNA,其中RNA的大小如上所述具有多達約15000個核苦酸(作為單鏈RNA分子) 或堿基對(作為雙鏈RNA分子)，特別地100至10000，更優選500 至10000個核芬酸或石咸基對，甚至更優選800至5000個核苷酸或石咸基對以及甚至更優選800至2000個核苷酸或石威基對。然而，也可以根據要分離的RNA的大小來選擇反相的孔徑，即，如果要分離專交大的RNA分子則可以選擇專交大的孔徑，而如果選擇豸交小的 RNA分子則可以選擇較小的孔徑。這是由于這樣的效應，即，RNA 分子的保留和分離不僅取決于(反)相的相互作用而且還取決于分子進入基質的孔中并因此提供進一步保留效應的可能性。不限于此，例如，反相的孔徑為約2000 A至約5000 A，更優選為約2500至約 4000,最優選為約3500至約4500 A ，因此可以用來分離較大的RNA 分子，例如，100至10000個，更優選500至10000個核苷酸或石威基對，甚至更優選800至5000個核苷酸或石咸基只于以及甚至更優選 800至2000個核苷酸或石咸基對的RNA分子。可替換地，不限于此，反相的孔徑為約1000 A至約2500 A,更優選為約1000 A至約2000 A，以及最優選為約IOOOA至1200 A可以用來分離較小的RNA分子，例如，還可以以這種方式來分離約30-1000、 50-1000或100-1000 或20-200、 20-100、 20-50或20-30個4亥苷酸的RNA分子。
通常，已知用作反相固定相的任何材料，尤其是任何高分子材泮牛，如果可以以多孔形式^是供，則該材沖牛可以用于本發明的方法。固定相可以由有機和/或無機材料構成。用于本發明的聚合物的實例是(非烷基化)聚苯乙烯、(非烷基化)聚苯乙烯二乙烯基苯、硅
更優選用含丁基、辛基和/或十八烷基的殘基改性的硅膠、用苯基殘基改性的硅膠)、聚曱基丙烯酸酯等，或其他適用于例如凝膠色譜法或如上所述的其他色語法的材料，如葡聚糖，包括例如Sephadex 和Sephacry^材料、瓊脂糖、葡聚糖/瓊脂糖混合物、聚丙烯酰胺等。
在一種特別優選的實施方式中，用于反相的材料是多孔聚苯乙烯聚合物、(非烷基化)(多孔)聚苯乙烯二乙烯基苯聚合物、多孔硅膠、用非極性殘基改性的多孔硅膠(特別是用含烷基的殘基改性的多孔硅膠、更優選用含丁基、辛基和/或十八烷基的殘基改性的多孔硅膠、用苯基殘基改性的多孔硅膠)、多孔聚甲基丙烯酸酯，其中尤其可以使用多孔聚苯乙烯聚合物或非烷基化的(多孔)聚苯乙烯二乙烯基苯。使用聚苯乙烯二乙烯基苯的固定相本身是已知的。本身已知的已用于HPLC法的聚苯乙烯二乙烯基苯是可商購的，其可以用于才艮據本發明的方法。
特別優選用于才艮據本發明方法的非烷基化多孔聚苯乙烯二乙烯基苯，尤其可以具有8.0±1.5 )im、特別是8.0±0.5 jam的顆粒大小， 1000-1500 A、特別是1000-1200 A或3500-4500 A的孔徑，^旦不限于此。將這種材料用于反相，可以以特別有利的方式來實現根據本發明的方法的上述優點。以上詳細描述的固定相通常位于柱中。V2A鋼通常用作柱的材料，但其他材料也可以用于柱，條件是它們適合于HPLC過程中主要的條件。通常，柱是直的。有利的是，HPLC柱的長度為5cm至 100 cm且直徑為4 mm至25 mm。用于才艮據本發明方法的柱可以特別具有以下尺寸長度為50mm以及直徑為7.5 mm或長度為50 mm 以及直4圣為4.6 mm，或長度為50 mm以及直^圣為10 mm或長度和直徑適合于RNA的制備型回收的任何其他尺寸，在擴大規才莫(或升級，upscaling)的情況下，甚至數米的長度以及更大的直徑也是可行的。這里，尺寸應適合于液相色譜的技術上的可能性。
在一種優選實施方式中，以離子對方法來實施才艮據本發明的方法，其中將帶有親脂殘基和正電荷的離子加入到流動相中作為帶負電荷的RNA的反荷離子(或抗4軒離子，counterion)。這樣，就獲得了具有親脂特性的離子對，其通過反相體系的非極性固定相而減速。在實踐中，離子對方法的具體條件必須針對每個具體的分離問題根據經驗而確定。反荷離子的大小、其濃度以及溶液的pH值在很大程度上影響分離結果。這意味著，憑經驗確定的離子對方法的條件不能直4妾應用于不同的分離問題。例如，如果現有4支術已知一種離子對方法，這并不意。木著相同的條件可以必然地也適用于本發明的分離問題，即使最終事實上證明相同或類似的條件是有利的。在才艮據本發明的方法中，有利地加入烷基銨鹽，如乙酸三乙銨，和 /或四烷基銨化合物，如四丁基銨。優選地，加入0.1M乙酸三乙銨并將pH值調節至約7。用于離子對方法的這種緩沖液以特別有利的方式解決了本發明的分離問題，即，制備級上RNA的純化。可以考慮以下的其他緩沖溶液三氟乙酸、乙酸、曱酸、乙酸鹽纟爰沖液、石粦酸鹽纟爰沖液、石克酸氫四丁銨、溴化四丁銨以及氯化四丁銨。
流動相的選擇取決于所期望的分離類型。這意味著為特定分離而確定的流動相(如可以例如從現有4支術已知的)直4妄應用于不同的分離問題不具有足夠的成功前景。對于每個分離問題，理想的洗脫條件，尤其是所4吏用的流動相，必須通過經-驗性試-驗來確定。
在才艮據本發明的HPLC法的一種優選實施方式中， -使用含水溶劑和有才幾溶劑的混合物作為洗脫RNA的流動相。有利的是，緩沖液作為含水溶劑而4吏用，特別具有6.0-8.0的pH,例如約7，例如 7.0;優選地該緩沖液是乙酸三乙銨，特別優選0.02 M至0.5 M，特另'J是0.08 M至0.12 M,特別是約0.1 M乙酸三乙銨緩沖液，如上所述，其在離子對方法中還作為RNA的反荷離子。
在一種優選的實施方式中，在流動相中使用的有機溶劑是乙腈、曱醇、乙醇、l-丙醇、2-丙醇以及丙酮或它們的'混合物，i陣別優選乙腈。借助于這些有4^溶劑，尤其是乙腈，應用#4居本發明的方法可以以特別有利的方式來進行RNA的純化。
在才艮據本發明的方法的一種特別優選的實施方式中，流動相是 O.IM乙酉史三乙銨(pH7)禾口乙腈的混合物。
已證明對于根據本發明的方法而言特別有利的是，流動相包含 5.0 vol.Q/o至25.0 vol.Q/o有才幾溶劑(才目只十于-危動才目)，并應用含7K〉容劑使其達到100vol.%。通常，在梯度分離的情況下，有機溶劑的比例增加，相對于在流動相中的最初體積百分比(vol.%),特別是增力口至少10%,更優選增加至少50%以及最優選增加至少100%，可選地增加至少200%。在一種優選實施方式中，在根據本發明的方法中，在流動相中有機溶劑的比例在HPLC分離過程中總計占3至9 vol.%,優選4至7.5 vol.%，特別是5.0 vol.% (在每種情況下均相對于流動相)。更優選地，流動相中有機溶劑的比例在HPLC分離過程中從3至9、特另'J是5.0 vol.o/o增力口至高達20.0 vol.% (在每種情況下均相對于流動相)。更優選地，以在流動相中有才幾溶劑的比例在HPLC分離過程中從6.5至8.5，特別是7.5 vol.。/。增加至高達 17.5vol.% (在每種情況下均相對于流動相)的方式實施該方法。
已i正明，-危動才目包* 7.5 vol.Q/o至17.5 vol.o/o的有才幾溶劑(才目乂于于流動相)，以及應用水緩沖溶劑使其達到100 vol.%,對于才艮據本發明的方法是更加特別有利的。
在根據本發明的方法的情況下，可以等度地或借助于梯度分離來進4亍洗脫。在等度分離(isocratic separation)中，用單一;先脫液或多種洗脫液的恒定混合物(constant mixture )來進4亍RNA的洗脫，其中可以使用以上詳細描述的溶劑作為洗脫液。
在才艮據本發明的方法的一種優選實施方式中，進4亍梯度分離。在這方面，借助于梯度程序來改變洗脫液的組成。梯度分離所必要的設備是本領域技術人員已知的。這里，可以在混合室的低壓側或專交遠的泵(further pumps )的高壓側進4亍4弟度洗脫。
優選地，在根據本發明的方法中，如上所述，在梯度分離過程中有才幾溶劑的比例相對于含水溶劑而增加。上述試劑在這里可以用作含水溶劑，并且上述試劑同樣可以用作有才幾溶劑。
例如，在HPLC分離過程中流動相中有才幾溶劑的比例可以從5.0 vol.。/。增加至20.0 vol.% (在每種情況下均相對于流動相)。尤其是，在HPLC分離過程中流動相中有才幾溶劑的比例可以從7.5 vol.。/o增力口至17.5 vol.%,尤其是從9.5增加至14.5 vol.% (在每種情況下均相，十于《u動相)。
已證明以下梯度程序對于使用根據本發明的方法的RNA的純化特別有利
洗脫液A: 0.1M乙酸三乙銨，pH7
20洗脫液B: O.IM乙酸三乙銨，pH7，含25vol.o/o乙腈
洗脫液組成
開始62% A和38% B (第1至第3分鐘)
增加至58% B( B每分鐘增力口 1.67% ),(第3至第15分鐘)
100% B (第15至第20分鐘)
以下描述梯度程序的另一實例，其中使用相同的洗脫液A和B:
洗脫液組成
起始水平62% A和38% B (第1至第3分鐘)
分離范圍I:梯度38。/o-49.5。/。B ( B增加5.75%/分鐘)(第 3至第5分鐘)
分離范圍II:梯度49.5%-57% B ( B增加0.83%/分鐘)(第 5至第14分鐘)
沖洗范圍100%B (第15至第20分鐘)
為了使柱不被污損或堵塞并且檢測不被中斷，將純化的溶劑用于HPLC是有利的。這樣的純化的溶劑是可商購的。還可以另外用 1至5 jam的微過濾器對其進行過濾，該微過濾器通常安裝在泵上游的系統中。使用前對所有溶劑進行脫氣也是有利的，否則大多數泵中會存在氣泡。如果溶劑中存在氣泡，這不僅會干擾分離而且還會干擾對斥全測器中流出物的連續監測。可以通過加熱、用》茲力攪拌器進行強力攪拌、短時抽真空(或瞬時抽真空，brief evacuation )、超聲處理或通過使小股的氦穿過溶劑儲存容器來對溶劑進行脫氣。
選擇洗脫液的流速4吏得能夠將RNA與包含在4寺研究才羊品中的其他成分良好地分離開來。選擇用于根據本發明方法的洗脫液的流速可以是1 ml/min至幾升/分鐘(在擴大規模的情況下)，尤其是約1至1000 ml/min,更優選5 ml至500 ml/min,甚至更優選大于100 ml/min,這取決于擴大規^莫的類型和范圍。可以通過泵來i殳置和調節這種流速。
有利地用UV檢測器在254 nm進行才企測，其中可以在600 nm 進4亍參考觀'J量(reference measurement )。》求而，可以可替才灸i也4吏用任何其他4企測方法，借此可以以令人滿意和可靠的方式檢測上文詳細描述的RNA。
為了用根據本發明的方法進行RNA的制備型純化，建議收集含RNA的經洗脫的溶劑量。在這方面，有利的是，以這樣一種方式進行這種收集使得洗脫的溶劑被收集在單獨分開的流分中。這可以例如用流分收集器進行。這樣，可將高純度的含RNA的流分與其他含RNA的流分(仍然含有不希望的雜質，盡管量非常少)分離開來。單獨流分可以例如經1分鐘而#1收集。
例如在，于4-12。C溫度下進行加樣的情況下進行，HPLC方法此外在更高的溫度下進4亍，優選在70。C或更高，特別優選在75。C或更高，尤其是高達82。C,以及特別優選在約78。C。為了使RNA變性，加熱通常是重要的，由此可最終實現更好的分離。在更低溫度下分離度會下降，即，RNA與雜質的分離減少。
可以用兩種方法來力。樣停流進樣或定量環進樣(loop injectoin)。對于停流進樣，使用能夠承受在HPLC中所施加的高壓的微量注射器。通過進口閥中的隔墊(septum )將樣品直接注射到柱填料上或注射到直接位于填料上的小滴惰性物質上。在這種情況下，該系統可以處于高壓下，或可以在注入前關閉泵，然后當壓力已經下降至接近正常值時進行注入。在定量環進樣的情況下，用定量環進樣器(lo叩injector)來注入樣品。其包括管狀環，樣品被引入其中。然后借助于適合的旋轉閥，通過該環將固定相輸送至泵外，環的出口直^妄通入柱中。才羊品以這種方式#皮固定相攜帶進入柱中，而沒有中斷溶劑流入泵中。
本發明進一步提供了多孔反相在上述根據本發明的HPLC法中的應用。
在才艮據本發明的方法的一種優選實施方式中，多孔反相的顆粒大小為8.0 pm至50 )Lim, 4爭別是8.0至30，更4尤選8.0至25 pm。 ,良相可以以珠_粒形式存在，用具有上述顆4立大d、和/或J朱并立形式的多孔反相可以特別有利地實施才艮據本發明的方法，其中可以獲得特別良好的分離結果。
用于根據本發明的應用的反相是多孔的，因為在使用例如由 A. Azarani和K.H. Hecker所描述的固定反相(其不是多孔的，因而就顆粒大小而言完全不同于本發明的主題)的情況下，會產生過高壓力，以使得就算可以利用HPLC進行RNA的制備型純化，也存在著4艮大困難。
在根據本發明的應用的一種優選實施方式中，反相的孔徑為 1000 A至5000 A,特別地孔徑為1000 A至4000 A,或上述優選值。反相的特別優選的孔徑是1000-1200 A以及3500-4500 A。借助于具有這些孔徑的反相，利用^4居本發明的方法可以獲得RNA純化特別良好的結果，尤其是由此避免了在按照A. Azarani和K.H. Hecker 的方法中所產生的升高的壓力，從而可以以特別有利的方式進行制備型分離。當孔徑小于1000 A時，RNA的分離會變得較差，因此這樣的顆粒大小是不太優選的。然而，如上所述，可以才艮據要分離的RNA大小來選擇孔徑。在根據本發明的應用的一種特別優選的實施方式中，用于反相的材料是聚苯乙烯二乙烯基苯，其中尤其可以使用非烷基化聚苯乙烯二乙烯基苯。使用聚苯乙烯二乙烯基苯的固定相本身是已知的。
已用于HPLC法的本身已知的聚苯乙烯二乙烯基苯是可商購的，其可以用于才艮據本發明的方法。
特別優選用于根據本發明的應用的非烷基化多孔聚苯乙烯二乙烯基苯尤其可具有8.0±1.5 |Lim、特別是8.0±0.5 pm的顆粒大小，以及1000-或4000 A的孔徑。將這種材料用于反相，可以以特別有利的方式來實現下述優點。
對于才艮4居本發明的應用，以上詳細描述的固定相位于柱中。 V2A鋼通常用作柱的材料，但其他材料也可以用于柱，條件是它們適合于HPLC回收過程中主要的條件。通常柱是直的。有利的是， HPLC柱的長度為5 cm至100 cm且直徑為4 mm至25 mm。用于才艮據本發明方法的柱可以尤其具有以下尺寸長度為50 mm以及直 4圣為7.5 mm或長度為50 mm以及JU圣為4,6 mm,或長度為50 mm 以及直徑為10 mm或長度和直徑適合于利用HPLC進行RNA的制備型回收的任何其他尺寸，在規才莫擴大(或升級，upscale)的情況下，甚至數米的長度以及更大的直徑也是可行的。這里，尺寸應適合于液相色語的技術上的可能性。
條件進行了描述，因此可參照上文以避免不必要的重復。
根據本發明的應用，尤其是下文中詳細描述的優選實施方式，具有一系列優點在根據本發明的應用的情況下，與現有技術的已
知方法的可能情況相比，可以分離明顯更大量的RNA。才艮據本發明的應用使得可以以高純度獲得這些更大量。可以分離降解片段或相對較長片段或由于提前終止轉錄所產生的片段。此外，可以較好地
24分離在RNA樣品中存在的其他雜質，如酶(例如核糖核酸酶或聚合酶)以及核普酸。可以在數分鐘內回收這些相對大量的RNA,甚至是從具有非常高度的雜質污染的樣品中進行回收。可以可靠地進行RNA回收，即，以較高的可靠性回收高純度RNA。根據本發明的應用使得可以實現高分離度。才艮據本發明的應用可以容易地自動操作。因此它最適合用于制備級的RNA的常規純化。在HPLC分離方法的條件下RNA是穩定的，即，可避免在HPLC純化過程中降解成RNA片段并由此產生新的雜質，或純RNA的產率降低。因此可以以簡單、快速、廉價的方式來精確地實施根據本發明的應用，并產生可靠的結果。在HPLC分離以后，可以簡單地用流分收集器來分離RNA,即，可以非常簡單;也實iE見RNA的回收，同才羊也可以直接對RNA進4于進一步處理。4僉測可以非常靈每文地進行。
以下參照附圖和示例性實施方式更加詳細地說明本發明，但不限于此。

圖l示出了分離lOjug焚光素酶-mRNA (分析型)的色譜圖2示出了分離1.5 |Lig熒光素酶-mRNA (制備型)的色譜圖3示出了圖2的色譜圖，其中以灰色突出顯示收集的流分；
圖4示出了在瓊脂糖凝膠上對收集的mRNA流分純度的驗證；
圖5示出了用孔徑為1000 A的固定相分離200 pg的2 kb和4 kbRNA片l史的色"i普圖6示出了用孔徑為4000 A的固定相分離100 jig的2kb和4 kbRNA片段的色譜圖；圖7示出了用孔徑為4000 A的固定基質分離250 pg的2 kb和 4 kb RNA片段的色語圖8是條形圖，其說明了經根據本發明的方法純化的RNA的熒光素酶表達得到改善；
圖9示出了用于示例性實施方式的野生型熒光素酶的序列，具體而言是mRNA序列；
圖10示出了用孔徑為4000 A的固定基質分離3 mg的Flic(GC) RNA制劑(FC-9050)的色i普圖11示出了用孑L徑為4000 A的固定基質分離1.5 mg的 FOLHl(GC)RNA制劑(FO-9334 )的色"i普圖12示出了用孑L徑為4000 A的固定基質分離1.5 mg的 KLK3(GC)RNA制劑(KL-8849 )的色i普圖13示出了用孑L徑為4000 A的固定基質分離1.5 mg的 PSCA(GC) RNA制劑(PS-8845 )的色i普圖14示出了用孑L徑為4000 A的固定基質分離1.5 mg的 STEAP(GC)RNA制劑(ST國8848 )的色i普圖15示出了用非多孔固定基質分離2 kb RNA ( 200|iig )和4kb RNA ( 200|ig )的'7昆合4勿的色i普圖16示出了對應于圖15的色譜圖的瓊脂糖凝膠分析，其示出了用非多孑L固定基質對2 kb RNA ( 200嗎)和4kb RNA ( 200pg )
的混合物的分離。
具體實施例方式
實施例1:利用4艮據>^發明的HPLC法來純化1.5 mg熒光素酶 mRNA
大小為1825個石威基對的熒光素酶mRNA用于分離。多孔的非烷基化聚苯乙烯/二乙烯基苯(聚苯乙烯二乙烯基苯)基質(來自 Polymer Laboratories的常^L商品)用作固定相。其顆并立大小為8 jam 且孔徑為4000 A。所使用的柱的長度為5.0 cm且直徑為7.5 mm。進樣器溫度為12。C, HPLC分離溫度、具體而言是分離柱的溫度為 78。C，即在完全變性條件下進4f操作。
通過以下梯度程序進行分離
洗脫液A: O.IM乙酸三乙銨，pH7
洗脫液B: O.IM乙酸三乙銨，pH7,含25vol.o/o乙腈
洗脫液組成
開始62% A和38% B (第1至第3分鐘)
增加至58% B ( B每分鐘分鐘增加1.67% )，(第3至第15
分鐘)
100% B (第15至第20分鐘)
用UV才全測器在254 nm進4亍才企測，在600 nm進4亍參考測量 (reference measurement )。流速為3 ml/min。
為了顯示在熒光素酶mRNA中的雜質，首先進4亍分析型分離，其中僅將10 熒光素酶mRNA施加于柱。這種分析型HPLC分離的結果示于圖1中(在色譜圖中用虛線示出梯度)。可以清楚地看到，除所期望的熒光素酶的mRNA(保留時間為12.760分鐘)之外，仍然存在雜質(保留時間為12.398分鐘和13.227分鐘)，其位于熒光素酶mRNA峰的兩側。
制備級純化熒光素酶mRNA的目的是除去這些不希望的雜質。
圖2和圖3示出了用于制備級(1.5mg)分離熒光素酶m函A 的相應的色i普圖，其中在圖2中以虛線示出梯度程序。在圖2和圖 3中以灰色突出顯示收集的流分1至10;這些流分經1分鐘而^皮收集。
在每種情況下，將來自收集流分2至10的1 jig熒光素酶mRNA 施加于瓊脂糖凝膠上并利用溴化乙錠加以顯色，以確定mRNA流分的純度。
瓊脂糖凝膠分離的結果示于圖4中(M表示大小標準)。流分 5至8包含所期望的熒光素酶mRNA而不含不希望的雜質。結果， RNA的分離是成功的，得到制備級的高純度的RNA流分。
該示例性實施方式表明，利用根據本發明的方法可以通過 HPLC在制備級純化mRNA。
實施眾，J2:用孑Uf圣為1000 A的固定沖目分離200 ng的2 kb和4 kb RNA片段
200 jug的2 kb和4 kb RNA片段用于分離。多孔的非烷基化聚苯乙烯/二乙晞基苯基質(來自Polymer Laboratories的常身見商品) 用作固定相。其顆粒大小為8 pm且孔徑為1000 A。所4吏用的柱長為2.5cm且直徑為4.6mm。進樣器溫度是12°C， HPLC分離溫度、具體而言是分離柱的溫度為78。C,即，在完全變性條件下進行纟喿作。
利用以下梯度程序進行分離
28;先脫、液A: 0.1 M乙酸三乙銨洗脫液B: 0.1 M乙酸三乙銨/25°/。乙腈洗脫液組成
起始水平62。/。A和38。/。B (第1至第3分鐘)
分離范圍I:梯度38%-49.5% B ( B增加5.75%/分鐘)(第 3至第5分鐘)
分離范圍II:梯度49.5%-57% B ( B增加0.83%/分鐘)(第 5至第14分鐘)
沖洗范圍100%B (第15至第20分鐘)
用UV檢測器在254 nm進行4企測，在600 nm進行參考測量。流速是3 ml/min。
圖5示出了在制備級(200 jug)進行這種分離的相應的色譜圖，其中在圖5中以虛線示出梯度程序。在圖5中以灰色突出顯示收集的流分；經l分鐘時間收集流分。結果，RNA的分離是成功的，得到制備級的高純度的RNA流分。
實施例3:用^L徑為4000 A的固定相分離100 pg的2 kb和4 kb RNA片段
100 |ng的2 kb和4 kb RNA片段用于分離。多孔的非烷基化聚苯乙烯/二乙烯基苯基質(來自Polymer Laboratories的常^見商口口口 ) 用作固定相。其顆粒大小為8 pm且孔徑為4000 A。所使用的柱長度為2.5 cm且直徑為4.6 mm。進樣器溫度是12°C， HPLC分離溫度、具體而言是分離柱的溫度為78。C,即，在完全變性條件下進行操作。利用以下梯度程序進行分離
S先脫液A: 0.1M乙酉臾三乙銨
洗脫液B: 0.1 M乙酸三乙銨/25%乙腈
洗脫液組成
起始水平62。/。A和38。/。B (第1至第3分鐘)
分離范圍I:梯度38%-49.5% B ( B增加5.75%/分鐘)(第 3至第5分鐘)
分離范圍II:梯度49.5%-57% B ( B增加0.83%/分鐘)(第 5至第14分鐘)
沖洗范圍100%B (第15至第20分鐘)
用UV才企測器在254 nm進行檢測，在600 nm進行參考測量。流速是3 ml/min。
圖6示出了在制備級(100 ng)進行這種分離的相應色語圖，其中在圖6中用虛線示出了梯度程序。在圖6中以灰色突出顯示收集的流分。結果，RNA的分離是成功的，得到制備級的高純度的 RNA流分。
實施例4:用孑L徑為4000 A的固定相分離250 jig的2 kb和4 kb RNA片段
250 |iig的2 kb和4 kb RNA片段用于分離。多孔的非烷基化聚苯乙烯/二乙烯基苯基質(來自Polymer Laboratories的常^L商品) 用作固定相。其顆粒大小為8 jiim且孔徑為4000 A。所^吏用的柱長度為2.5 cm且直徑為4.6 mm。進樣器溫度是12。C， HPLC分離溫度、具體而言是分離柱的溫度為78°C，即，在完全變性條件下進行操作。利用以下梯度程序進行分離
洗脫液A: O.IM乙酸三乙銨洗脫液B: 0.1 M乙酸三乙銨/25%乙腈洗脫液組成
起始7jc平62。/。A和38%B (第1至第3分4中)
分離范圍I:梯度38%-49.5% B ( B增加5.75%/分鐘)(第 3至第5分鐘)
分離范圍II:梯度49.5o/o-57。/oB(B增加0.83%/分鐘)(第 5至第14分鐘)
沖洗范圍100%B (第15至第20分鐘)
用UV才企測器在254 nm進4亍才企測，在600 nm進4亍參考測量。流速是3 ml/min。
圖7示出了在制備級(250 |Lig)進行這種分離的相應色鐠圖，其中在圖7中用虛線示出了梯度程序。在圖7中用灰色突出顯示收集的流分。結果，RNA的分離是成功的，得到制備級的高純度的 RNA流分。
達的改善。
實施例5:用孔徑為4000人的固定相分離3 mg的1.7 kb RNA(FliC(GC)畫制劑，FC9050)
3 mg的1.7 kb RNA(FliC(GC)-制劑，FC9050)用于分離。多孔的非*克基4匕聚苯乙烯/二乙烯基苯基質(來自Polymer Laboratories 的常規商品)用作固定相。其顆粒大小為8 jLim且孔徑為4000 A。所使用的柱長度為2.5 cm且直徑為4.6 mm。進樣器溫度為12°C, HPLC分離溫度、具體而言是分離柱的溫度為78。C,即，在完全變性條件下進行纟乘作。
通過以下梯度程序進行分離 S先脫液A: 0.1 M乙l史三乙銨洗脫液B: 0.1 M乙酸三乙銨/25%乙腈洗脫液組成
起始水平62。/。A和38。/c)B (第1至第3分鐘)
分離范圍I:梯度38%-49.5% B(B增加5.75%/分鐘)(第3 至第5分鐘)
分離范圍II:梯度49.5%-57% B ( B增加0.83%/分鐘)(第 5至第14分鐘)
沖洗范圍100%B (第15至第20分鐘)
用UV才企測器在254 nm進4亍才企測，在600 nm處進4亍參考測量。流速是3 ml/min。
圖IO示出了在制備級(3 mg)進行這種分離的相應色譜圖，其中在圖10中用虛線示出了梯度程序。在圖10中用灰色突出顯示收集的流分。可以看到，RNA的分離是成功的，得到制備級的高純度的RNA流分。
實施例6:用孑Uf圣為4000 A的固定才目分離1.5 mg的FOLHl(GC) RNA制劑(FO-9334)、 1.5 mg的KLK3(GC) RNA制劑(KL-8849)、 1.5 mg的PSCA(GC) RNA制劑(PS畫8845)或1.5 mg的STEAP(GC) RNA制劑(ST-8848)1.5 mg的FOLHl(GC) RNA制劑(FO-9334)、 1.5 mg的KLK3(GC) RNA制劑(KL-8849)、 1.5 mg的PSCA(GC) RNA制劑(PS-8845)或 1.5 mg的STEAP(GC) RNA制劑(ST-8848)用于分離。多孔的非烷基化聚苯乙烯/二乙歸基苯基質(來自Polymer Laboratories的常^L商品)用作固定相。其顆粒大小為8^m且孔徑為4 000A。所^吏用的柱長度為2.5 cm且直徑為4.6 mm。進才羊器溫度為12。C, HPLC分離溫度、具體而言是分離柱的溫度為78°C，即，在完全變性條件下進行操作。
利用以下梯度程序進行分離洗脫'液A: O.IM乙酸三乙銨洗脫液B: 0.1 M乙酸三乙銨/25°/。乙腈洗脫液組成
起始7jc平62。/。A和38。/。B (第1至第3分4中)
分離范圍I:梯度38%-49.5% B ( B增加5.75%/分鐘)(第 3至第5分鐘)
分離范圍II:梯度49.5%-57% B ( B增加0.83%/分鐘)(第 5至第14分鐘)
沖洗范圍100%B (第15至第20分鐘)
用UV沖企測器在254 nm進行4企測，在600 nm進行參考測量。流速是3 ml/min。
圖11、圖12、圖13和圖14分別示出了在制備級(1.5mg)上分離1.5 mg的FOLHl(GC) RNA制劑(FO-9334)、 1.5 mg的KLK3(GC) RNA制劑(KL-8849)、 1.5 mg的PSCA(GC) RNA制劑(PS國8845)或 1.5 mg的STEAP(GC) RNA制劑(ST-8848)的相應色譜圖，其中在這些圖中用虛線示出了梯度程序。在圖11、圖12、圖13以及圖14
33中用灰色突出顯示收集的流分。可以看到，在每種情況下RNA的分離都是可能的，使得在每種情況下得到制備級的高純度的RNA 流分。
實施例7:在非多孔固定^L乙烯二乙烯^g^^^t上分離200將的 2 kb RNA和200 pg的4kb RNA的混，合物(比較例)
200 jig的2 kb RNA和200 ng的4kb RNA的〉、昆合物用于分離。所使用的柱裝填有1000 A的非烷基化多孔聚苯乙烯二乙烯基苯或非多孔固定聚苯乙烯二乙烯基苯基質。用于1000 A的非烷基化多孔聚苯乙烯二乙烯基苯的4主長度為2.5 cm且直徑為4.6 mm。用于非烷基化非多孔聚苯乙烯二乙晞基苯的柱長度為2.5 cm且直徑為 4.0 mm。進樣器溫度為12°C, HPLC分離溫度、具體而言是分離柱的溫度為78。C,即，在完全變性條件下進行操作。
利用以下梯度程序進4亍分離 ;先脫液A: O.IM乙S臾三乙銨洗脫液B: 0.1 M乙酸三乙銨/25%乙腈洗脫液組成
起始tJc平62。/。A和38。/。B (第1至第3分鐘)
分離范圍I:梯度38%-49.5% B ( B增加5.75%/分鐘)(第 3至第5分鐘)
分離范圍II:梯度49.5%-57% B ( B增加0.83%/分鐘)(第 5至第14分鐘)
沖洗范圍100%B (第15至第20分4中)
用UV沖企測器在254 nm進行檢測，在600 nm進行參考測量。流速是3 ml/min。圖15示出了在制備級(分別為200 ^g)進行這種分離的相應色語圖，其中在圖15中用虛線示出了梯度程序。在圖15中用灰色突出顯示收集的流分。可以看到，利用常用的非烷基化多孔聚苯乙烯二乙烯基苯作為基質，兩種RNA均不能分離。圖16示出了對應于圖15的色"i普圖的瓊脂^唐凝月交。
權利要求
1.一種用于在制備級上純化RNA的方法，其特征在于，利用多孔反相作為固定相通過HPLC或低壓或常壓液相色譜法來純化所述RNA。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述RNA選自tRNA、 rRNA、 mRNA或全細月包RNA、特別地以及RNA變體，例如適體或核酶。
3. 根據前述權利要求之一所述的方法，其特征在于，所述RNA 的大小為多達約15000個核苦酸或石成基只于。
4. 才艮據前述片又利要求之一所述的方法，其特4正在于，所述RNA 的大小為多達100至10000個核香酸或石咸基對。
5. 根據前述權利要求之一所述的方法，其特征在于，所述多孔反才目的茅貞并立大小為8 pm至50 凈爭另'J是8 jum至30 pm并且更優選8 pm至25 jum。
6. 4艮據前述4又利要求之一所述的方法，其特;f正在于，所述反相的孑L徑為1000 A至5000 A。
7. 根據前述權利要求之一所述的方法，其特征在于，所述反相的孑U徑為1000 A至權0 A。
8. 根據前述權利要求之一所述的方法，其特征在于，所述多孔反相是多孔聚苯乙烯、多孔非烷基化聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯、多孔非烷基化聚苯乙烯二乙烯基苯、多孔石圭月交、用非相_性殘基改性的多孔硅膠、用含烷基的殘基改性的多孔硅膠、用苯基殘基改性的多孔硅膠、或多孔聚甲基丙烯酸酯，其中所述含烷基的殘基選自含丁基、辛基和/或十八烷基的殘基。
9. 根據前述權利要求之一所述的方法，特征在于，所述多孔反相由珠粒形成或作為聚合的塊體而存在。
10. 根據前述權利要求之一所述的方法，其特征在于，所述HPLC 柱的長度為大于5cm、特別是長達100cm,且直徑為大于4 mm、特別是達25 mm，優選長達1 m、更優選長達100 cm。
11. 根據前述權利要求之一所述的方法，其特征在于，HPLC純化以離子對方法進行，其中將帶有正電荷的離子加入流動相中作為帶負電荷的所述RNA的反荷離子，或通過尺寸排阻色語法、 ;疑月交過濾、親和色i普法、疏水作用色"i普法或離子對色i瞽法來進行HPLC純化。
12. 才艮據前述權利要求之一所述的方法，其特4正在于，針對洗脫目的，使用含水溶劑和有機溶劑的混合物來進行HPLC純化。
13. 根據權利要求12所述的方法，其特征在于，所述含水溶劑是緩沖劑。
14. 根據權利要求13所述的方法，其特征在于，所述緩沖劑是乙酸三乙銨、三氟乙酸、乙酸、甲酸、乙酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、辟L酸氳四丁銨、溴4^四丁銨以及IU匕四丁銨。
15. 根據權利要求14所述的方法，其特征在于，所述乙酸三乙銨緩沖液是0.1 M的乙酸三乙銨緩沖液。
16. 4艮據權利要求12至15之一所述的方法，其特征在于，所述有機溶劑是乙腈、甲醇、乙醇、l-丙醇、2-丙醇以及丙酮或它們的混合物。
17. 才艮據一又利要求16所述的方法，其特征在于，所述有才幾溶劑是乙腈。
18. 根據權利要求12至17之一所述的方法，其特征在于，所述流動相是O.l M乙酸三乙銨和乙腈的混合物。
19. 才艮據4又利要求12至18之一所述的方法，其特4i在于，所述流 ^/才目包^^目^j"于戶斤&;^^;沖目為5.0 vol.%i 25.0 vol.o/o的，才幾〉，劑，并與戶斤述含7jc溶劑構成100 vol.%。
20. 根據權利要求19所述的方法，其特征在于，所述流動相包含才目只寸于戶斤述-流動才目為7.5 vol.o/o至17.5 vol.%、凈爭另'J是9.5 vol.% 至14.4 vol.。/。的有4幾溶劑，并與所述含7jc溶劑構成100 vol.%。
21. 根據前述權利要求之一所述的方法，其特征在于，所述分離等度地進行。
22. 根據權利要求1至20之一所述的方法，其特征在于，進行梯度分離。
23. 根據權利要求22所述的方法，其中，在梯度分離的情況下，相對于在所述流動相中的最初vol. %，有機溶劑的比例增加，特別是增加至少10%、更優選增加至少50%并且最優選增加至少100%、可選;也增力a至少200%。
24. 根據權利要求23所述的方法，其特征在于，在HPLC分離過程中，所述流動相中的所述有^/U容劑的比例為3 vol.Q/。至9 vol.%、優選4 vol.o/o至7.5 vol.0/o、特另'J是5.0 vol.%。
25. 根據權利要求23或4又利要求24所述的方法，其特征在于，在 HPLC分離過程中，所述流動相中的所述有4幾溶劑的比例從3 vol.o/o至9vo1.0/0、特另'J是5.0 vol.%，增力口至高達20.0 vol.%，在每種情況下均相對于所述流動相。
26. 根據權利要求25所述的方法，其特征在于，在HPLC分離過程中，所述流動相中的所述有機溶劑的比例從6.5 vol.。/o至8.5 vol.%、特別是7.5 vol.%，增力口至高達17.5 vol.%，在每種情況下均相^十于所述流動相。
27. 多孔反相在4艮據4又利要求1至26之一所述的HPLC法中的應用。
28. 根據權利要求27所述的應用，其中，所述多孔反相如權利要求5至8之一所限定。
全文摘要
本申請描述了用于制備型純化RNA的方法，該方法的特征在于使用多孔反相作為固定相利用HPLC來純化RNA。本申請還描述了多孔反相在該HPLC法中的應用。
文檔編號C12N15/10GK101563457SQ200780047133
公開日2009年10月21日申請日期2007年12月20日優先權日2006年12月22日
發明者弗洛里安·馮德米爾貝, 托爾斯藤·穆茨克, 托馬斯·克特雷爾, 拉迪斯勞斯·賴德爾申請人:庫瑞瓦格有限責任公司

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