生物素化合物與支持物可逆結合的方法

專利名稱：：生物素化合物與支持物可逆結合的方法
技術領域：
：本發明提供生物素化合物和生物素結合化合物之間的結合的反轉的溫和方法。特別地，本發明涉及從硝基-鏈霉抗生物素(或相關領域描述在醫療實踐、研究和診斷過程中，對于從各種生物學液體快速、準確地分離或定量測定不同類型的細胞存在持續的需要。實現這類分離或測定所一般使用的方法是通過在兩個實體一一分離或檢測實體和靶一一之間形成連接。這類連接通常使用親和結合，即依靠一對結合配偶體(partner)來完成。該對的一個成員連接至檢測或分離實體，或者是檢測或分離實體的一部分，第二個成員連接至靶或是靶的一部分。當該兩部分接觸時，發生連接。很多結合配偶體系統是已知的，例如抗原-抗體、酶-底物、細胞上的配體-受體相互作用和生物素-鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白結合。雖然在實體之間這類連接的形成允許用于這類分離、純化或固定，但是如果希望通過打斷或反轉該連接進一步操作分離的或純化的細胞群，那么經常出現問題。抗生物素蛋白-生物素系統——特別是鏈霉抗生物素-生物素系統一一是分子、免疫學和細胞分析中最廣泛使用的親和結合之一(Wilchek，M.andBayer，E.A.，MethodsEnzymol.184:5-13and14-45，1990)。一般而言，待純化或檢測的耙分子被直接結合于生物素，或者結合于生物素化中間物。這樣的中間物幾乎可以是與靶分子復合或綴合的任何分子或大分子。例如，如果特定抗原或表位是靶，那么其結合劑(binder)將是抗體或其含互補位的片段。生物素化乾與鏈霉抗生物素結合；為了易于檢測，所述鏈霉抗生物素可以與固相結合。鏈霉抗生物素還可以容易地固定在表面上，以從原始的復雜混合物中俘獲、分離或檢測生物素化部分，例如生物素化分子或生物素標記的細胞。該基礎性鏈霉抗生物素-生物素相互作用技術可用于親和層析、細胞化學、組織化學、病理探測(pathologicalprobing)、免疫測定、原位雜交、生物親和傳感器和交聯劑中，以及用于更具體的技術例如尋靶、藥物遞送、流式細胞術和細胞學探測中。生物素對于鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白的高親和性，為檢測和分離生物素相關的靶的許多已經建立的方法提供基礎。抗生物素蛋白和生物素之間的結合(親和常數，k大約10—15M)被認為是已知的最強的非共價的生物學相互作用之一。(N.M.Green，MethodsEnzymol.184:51-67,1990)。甚至當結合配偶體的一個或兩個與其他物質共價結合時，這種強結合作用被保持。結合形成非常迅速，并且被認為在寬范圍的pH、溫度及其他變性條件下是穩定的。(Savageetal.，Avidin-BiotinChemistry:AHandbook,1992:1—23,Rockford，PierceChemicalCompany)。該特另'J出眾的親和力，以及生物素和它的衍生物易于摻入各種生物物質的能力，賦予鏈霉抗生物素-生物素系統極大的通用性。生物素與鏈霉抗生物素的解離據報道比生物素與抗生物素蛋白的解離快大約30倍。(Piran&Riordan.J.Immunol.Methods133，141-143，1990)。在非特異性結合方面，這兩個分子也不同。抗生物素蛋白是糖基化的，并且糖部分的存在使其與生物物質非特異性結合。對于許多應用，這些非特異性的相互作用使抗生物素蛋白不如鏈霉抗生物素適合。去糖基化的抗生物素蛋白是從SouthernBiotechnologyAssoc.Inc.，Birmingham,AL，USA和從AccurateChemical&ScientificCo.,Westbury，NY，USA商業可獲得的，其商標名為NEUTRALITEAVIDIN。使用生物素-鏈霉抗生物素(或抗生物素蛋白)連接的大多數應用依靠兩個結合配偶體的基本上不可逆的結合。然而，有許多這樣的情況，其中釋放結合的生物素是希望的，例如在使用生物素化抗體回收細胞期間。破壞或反轉生物素-鏈霉抗生物素連接的許多策略已被報道。(Lee&Vacquier，AnalBiochem.206:206-207,1992，Elgar&Schofield，腿Sequence2:219-226，1992，和Conrad&Krupp，NucleicAcidsRes.20:6423-6424,1992)。高親和力迫使使用苛刻的(harsh)化學試劑和復雜的程序，例如在高鹽條件下煮或者使用加熱到94。C的甲酰胺和EDTA數分鐘(Tong&Smith,Anal.Chem.64:2672-2677，1992),或者使用6MpH1.5的鹽酸胍，以達到部分的或完全的結合破壞。美國專利號5，387，505描述分開包含生物素化靶核酸和抗生物素蛋白-包被的聚合顆粒的復合物的方法。該方法包括在包含氯化鈉、SDS和EDTA的鹽洗滌溶液存在下，加熱復合物至至少65。C的溫度。在WO02/061428中，發明人描述破壞生物素-鏈霉抗生物素或生物素-抗生物素蛋白連接的方法，其通過在大約80°C的溫度下，在不存在額外加工步驟的情況下，將綴合物與有效量的純化或蒸餾水溫育。這類條件通常對任何結合部分是有損害性的，但是它們對核酸起作用，因為核酸受到損害的上限溫度在大約300°C。因此，使用這類條件反轉生物素-鏈霉抗生物素連接通常是不希望的，特別是在純化蛋白質或分離細胞、細菌和病毒等時，此時保持細胞完整性和保持存活力或感染性是重要的。在產生可釋放的鏈霉抗生物素-生物素或抗生物素蛋白-生物素綴合物的嘗試中，已經開發了大量方法。—些科學家已經引入化學可切割的連接體來將生物素連接到一個結合配偶體。Shimkus等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，pp.2593-2597，1985)描述使用連接體中的二硫鍵——其將生物素連接到嘧啶環的C-5—一作為將核苷酸可逆結合到抗生物素蛋白-瓊脂糖柱的手段。該原理也在美國專利號4，772，691中描述。美國專利號5,215,927建議在生物素分子和特異性結合試劑之間插入鍵，該鍵可被酶試劑或化學試劑特異性切割，例如各種肽酶可切割的肽鍵、二糖酶可切割的二糖鍵、或在溫和還原、氧化、酸性或堿性條件下可以選擇性斷裂的化學鍵。—個這類的連接體，硫代-NHS-SS-生物素，是商業可獲得的(PierceBiotechnologyInc,Rockford，IL.USA)。它是胺反應性生物素化試劑，其包含延伸的間隔臂，以減少與抗生物素蛋白結合相關的位阻。使用該基團，將硫代-NHS-SS-生物素與靶分子連接，并且生物素部分使用50mMDTT通過疏醇切割被除去。該復雜的方法是緩慢的并且使用受限，這是因為硫醇通常破壞天然蛋白質的二硫鍵。用來解離鏈霉抗生物素-生物素結合的一種方法包括蛋白酶K消化鏈霉抗生物素(Wilchek&Bayer，Anal.Biochem.171:1-32，1988)。僅僅當生物素化產物不包括蛋白質時，蛋白酶K是可用的。商業可獲得的CELLectionTM生物素結合劑(DynalBiotechAS，Prod.No.115.33)包含經由DNA連接體用鏈霉抗生物素包被的磁珠，以提供靶釋放的可切割位點。通過在室溫下與DNAse溫育15分鐘發生釋放，然后進行強力吹吸(pipeUing)以最大化細胞釋放。使用酶或化學可切割的連接體，對于從生物環境分離真正地天然細胞，是次-最佳的(sub-optimal)。其他方法包括使用單體抗生物素蛋白(PierceBiotechnologyInc，Rockford，IL.USA.)，切割生物素或鏈霉抗生物素，和使用生物素類似物如N-羥基琥珀酰亞胺-亞氨基生物素(ifflinobiotin)和酰胺生物素(amidobiotin)。N-羥基琥珀酰亞胺-亞氨基生物素(NHS-亞氨基生物素)是NHS-生物素的胍基類似物，其對于鏈霉抗生物素具有pH敏感的結合親和力。該系統的缺點是結合要求pH為9.5或以上，而NHS-亞氨基生物素與鏈霉抗生物素的完全解離需要4以下的pH。因此，使用NHS-亞氨基生物素不適于分離天然細胞。其它人已經報道了在更溫和條件下破壞生物素-鏈霉抗生物素復合物的多種方法，例如引入可光切割的生物素亞磷酰胺(Olejniketal，NucleicAcidsRes.24:361-366，1996),或者使用聚合物綴合物連同鏈霉抗生物素突變體，這產生溫度或pH依賴性的釋放。例如，Ding等(BioconjugateChem.10:395-400，1999)已經將溫度敏感性聚合物——聚(N-異丙基丙烯酰胺)(NIPAAm)綴合到遺傳工程改造的鏈霉抗生物素(SAv)，以產生能在室溫或更低溫度下結合生物素并且在37。C下釋放所結合的生物素的綴合物。更近來，同一基團將pH敏感性聚合物(NIPAAm和丙烯酸的共聚物)綴合到遺傳工程改造的SAv分子上同一特異性位置(BioconjugateChem.11:78-83，2000)。發現降低pH引起聚合物折攏(collapse)，這導致生物素結合阻斷，反之，升高pH引起聚合物完全水合，從而使生物素結合。美國專利號5,332，679描述免疫測定或DM探針測定，其利用基于生物素和鏈霉抗生物素的可逆的結合置換系統(bindingdisplacementsystem)。在i亥觀寸定中，可釋》文的酉己體、可釋力文的酉己體的結合配偶體、目的分析物、分析上可檢測的(報道分子)基團和分析物的至少一個結合配偶體被首先連接至不溶相，以便形成與不溶相結合的報道分子-標記的復合物，然后，加入置換劑配體，其置換可釋放的配體連同一部分的報道分子-標記的復合物，以便釋放的報道分子在游離液體介質中是分析上可檢測的，并且可與樣品中分析物的濃度相關。例如，當可釋放的配體是脫硫生物素并且結合配偶體是鏈霉抗生物素時，對鏈霉抗生物素具有比脫硫生物素更高的親和常數的生物素，可被用作置換劑配體。適當的置換劑配體的實例包括生物素、脫硫生物素、鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白。生物素是優選的置換劑配體。適當的可釋放的配體的實例包括脫疏生物素、亞氨基生物素、和功能化的偶氮染料、鏈霉抗生物素、琥珀酰化的抗生物素蛋白、和抗生物素蛋白。脫硫生物素是優選的。專利族，美國專利號4,656,252;4,478,914;和4，282，287，描述制備多層系統的方法，包括連續地、重復地連接蛋白質物質和配體物質的特定分子或顆粒層，以形成多層系統。該蛋白質物質包括蛋白質例如抗生物素蛋白，配體物質包括蛋白質例如生物素和這些的衍生物、類似物或取代物。典型的生物素類似物是脫硫生物素和生物素砜，典型的生物素衍生物包括己酰胺生物素和生物胞素。在其形成期間，將多層系統連接(共價或非共價地)到固體表面。該系統和方法可用來改變或修飾固體表面的性質——包括分子連接到表面的程度一一用于增加免疫測定和親和層析。所述的酰胺生物素化合物包括生物素、生物素衍生物、生物素類似物、和生物素取代物，其具有通過酰胺基共價結合到氨基羧酸的反應性羧基，并且氨基酸的羧基與環狀化合物例如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的羥基共價反應，或者與大分子例如酶的反應性氨基發生共價反應。本發明的酰胺生物素化合物的通式包括生物素-C(=0)NHRC(=0)(0)mN(H)nY，其中R是將生物素與大分子和潛在位阻分開的間隔基團。典型地，R可以是芳基例如亞苯基或烷基取代的亞苯基、脂環基例如C5或C6基團、或優選地烷基例如C卜C12或更大例如C3-C10聚亞甲基。Y是反應性氨基或羥氨基化合物，例如包含反應性氨基的蛋白質物質，例如酶。整數n或m可以是0或1，這取決于氨基反應物Y是否是伯胺或仲胺或羥基胺。典型的新的化合物包括苯曱酰基酰胺生物素-N-羥基琥珀酰亞胺；C1-C12烷酰基酰胺生物素-N-羥基琥珀酰亞胺；例如，己酰胺生物素-NHS;和其酶綴合物。美國專利號4，656，252描述三種不同的酰胺生物素。這種修飾的生物素衍生物是商業可獲得的，其名稱為DSB-XT"生物素(MolecularProbes,Eugene,0R，USA)。DSB-X，生物素是脫硫生物素的衍生物，一種穩定的生物素前體。DSB-Xtm生物素使用7原子間隔子，以增加DSB-XT"生物素綴合物在鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白的深藏生物素-結合袋中結合的能力。該衍生物對抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素具有中等親和力。通過低濃度的游離生物素或脫硫生物素在中性pH和室溫下，它們的相互作用被快速反轉。與DSB-X生物素-標記的分子復合的靶可用抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素綴合物選擇性的檢測，或者在親和基質上分離，然后在溫和條件下釋放DSB-X生物素-標記的生物分子(Hirschetal.Anal.Biochem.308，343-357，2002)。在他們的出版物中，Hirsch等描述數種可逆系統。在多孔板測定中，使用5mM游離生物素并且在室溫下溫育2小時或在4。C下溫育過夜，進行置換。對于柱，他們推薦以10個到20個柱體積用>25mM的置換配體洗脫，并且對于點漬法，他們談到與置換配體溫育2-16小時。DES-XTM生物素可以與多種分子綴合，并且使用鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白包被的固相固定靶，或者可以使用DES-X-包#皮的固相和鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白標記的分子。MolecularProbes提供DSB-X生物素的多種抗體綴合物，以及DSB-X生物素瓊脂糖。降低生物素與鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白的親和力的另一種方法是使用重組或化學修飾的鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白。Kulomaa等的WO01/05977包括抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素的突變，該突變通過用賴氨酸置換特定的色氨酸殘基進行。這兩種突變體蛋白都產生穩定的二聚體。當用緩沖液(PBS中0.5%BSA;0.5V土溫20和1MNaCl)中的O.5mM生物素在37。C下檢測1小時時，這些穩定的二聚體表現出可逆的生物素-結合特性。美國專利號6，022，951也描述對生物素具有減少的親和力的突變重組鏈霉抗生物素。發明人建議以一種或多種缺失、插入、點突變或這些遺傳改變的組合的形式修飾鏈霉抗生物素，這些修飾改變但保持生物素結合位點。為了破壞他們突變的鏈霉抗生物素的鏈霉抗生物素-生物素結合，他們可以使用在0.1raM到10niM之間的生物素。另外，可以在高或低的pH下、在高鹽中或在存在離子洗滌劑、解離劑、離液劑、有機溶劑、蛋白酶(蛋白酶K)或水的情況下，進行洗脫。在他們的實施例11中，他們使用他們的減少親和力的鏈霉抗生物素包^皮在玻璃珠上，用于分離和分開B細胞和T細胞。他們使用包含包被有抗人IgG的2ml的玻璃珠的3ml柱。在500n1/分鐘的流速下，將lml的淋巴細胞加入到該柱，并且收集包含T細胞的流過組分。用另外l5ml的PBS在500jii1/分鐘下洗滌該柱，以回收另外的T細胞。使用15ml的PBS中的2mM生物素從該柱洗脫結合的B細胞。該過程的總時間為至少1小時。美國專利號6，391，571;6,312,916;和6，417，331描述使用多種氨基酸取代和缺失制造的抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素的突變蛋白，其對生物素具有減少的結合親和力。發明人表明他們可以使用50mM、pH3.0的乙酸銨或/和9到10mM亞氨基生物素或生物素的梯度，從他們的Spherosi卜冊2鏈霉抗生物素突變蛋白吸附柱洗脫他們的生物素化牛血清白蛋白。使用pH7.2的PBS緩沖液和0到10mM生物素的梯度，洗脫他們的生物素化Fab抗體片段。美國專利號6,165,750和6,156,493描述嵌合的鏈霉抗生物素四聚體，其具有至少一個包含氨基酸修飾的單體，該修飾產生對生物素減少的結合親和力、改變的解離率、改變的結合率(on-rate)或改變的結合焓。他們使用生物素柱，并且通過將2raM生物素加入到流動緩沖液來洗脫他們的突變鏈霉抗生物素。美國專利號5,168,049描述了在免疫學上基本與天然鏈霉抗生物素等同并且能與生物素或生物素衍生物或類似物結合的多肽。其他的專利報告了對鏈霉抗生物素具有結合活性的肽的產生。美國專利號5，506，121描述產生這類肽(Strep-標簽)，其可以使用1niM亞氨基生物素或5mM硫辛酸的溶液從鏈霉抗生物素瓊脂糖柱洗脫。與生物素相比，這類肽配體的優點本質上是它們的編碼序列在DNA水平與期望蛋白質的基因連接，并且隨后可與該蛋白質的基因一起共表達，通過該方法，形成標記有肽配體的重組蛋白質。美國專利號6，103，493提供鏈霉抗生物素突變蛋白，其對于肽配體的結合親和力是這樣的，以致可以通過其他的鏈霉抗生物素配體例如生物素、亞氨基生物素、硫辛酸、脫硫生物素、二氨基生物素、固A(hydroxyazobenzene-be腦icacid，羥基偶氮苯-苯甲酸)或/和二甲基-HABA竟爭性洗脫它們。可以通過運用10ml、2.5mM的濃度的二氨基生物素、脫硫生物素和生物素的每一個，逐步洗脫結合的蛋白質。美國專利號5，973，124描述修飾抗生物素蛋白-型分子的方法。生物素結合位點中的必需酪氨酸殘基以如此方式修飾與相應的未修飾的抗生物素蛋白-型分子中的未修飾的酪氨酸殘基相比，它的pKa減少。通過用基團例如硝基、囟素、偶氮和氨基，在酪氨酸殘基的羥基的一個或兩個鄰位取代，完成該修飾。他們表明這類修飾可在不同的抗生物素蛋白-型分子上進行，所述分子包括(i)天然卵清抗生物素蛋白；(ii)重組抗生物素蛋白；(iii)去糖基化形式的抗生物素蛋白；(iv)細菌鏈霉抗生物素；(v)重組鏈霉抗生物素；(vi)截短的鏈霉抗生物素；和它們的衍生物。發明人示出他們能通過加入堿性溶液(例如pHIO)或加入過量的生物素(例如在任何pH下，0.6mM)，從含有修飾的抗生物素蛋白-型分子的柱釋放生物素化的化合物。根據他們的圖，他們需要大約5個柱體積的含生物素緩沖液，以實現釋放(Moragetal.Anal.Biochem.243，257-263，1996)。這些硝化的抗生物素蛋白衍生物是從MolecularProbes,Eugene,0R，USA商業可獲得的，其名稱為CaptAvidin。盡管迄今為止做出了進步，但是對于選擇性分離和釋放細胞及其它生物分子仍需要新的和提高的方法；對于在生物素和鏈霉抗生物素之間的可逆結合，先前報道的方法對于構象敏感的靶或天然細胞的分離均不是最適宜的。因此，在本領域對于可逆和可靠破壞生物素和鏈霉抗生物素(或抗生物素蛋白)之間的結合的可選方法，存在持續的需要。發明概述本發明的方面提供在生物素化部分和生物素結合化合物如鏈霉抗生物素(或抗生物素蛋白)之間的結合的反轉的簡單方法，該方法沒有破壞靶的天然構象或分離的細胞的天然狀態。可以通過使用硝基-鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白和修飾的生物素如脫疏生物素或其衍生物如DSB-X生物素的組合，使鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白-生物素之間的強相互作用變弱很多。蛋白質，例如針對細胞表面抗原的抗體，可以用修飾的生物素進行生物素化。該抗體被俘獲或結合至硝基-鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白(其又被固定在固體表面上)。該固相/抗體復合物用于從復雜混合物中俘獲特定的細胞。然后，通過將復合物與有效量的游離生物素接觸，在非常溫和和快速的條件下，釋放具有結合抗體的細胞。釋放出的具有生物素化抗體的細胞可以因此-波分離和純化。本方法優于現有技術的一個新的方面是，生物素-鏈霉抗結果釋放速度變得比在現有技術中報道的快很多。該方法避免先前使用的苛刻的化學變性條件。它也避免與置換配體的任何冗長的溫育，或避免從親和柱洗脫分離的靶時發生的稀釋效應。分離的細胞比使用以前可用的方法分離的細胞更接近它們的天然狀態。本方法已經表明非常適用于細胞分離和分開過程。本方法可用于多種其他的過程，例如檢測、識別、測定、純化、分開和/或分離靶蛋白或核酸分子。也提供進行本發明方法的試劑盒。附圖描述下列附圖形成本說明書的一部分，并且被包括以進一步說明本發明的某些方面。通過參考這些附圖中的一個或多個，連同本文提供的具體實施方案的詳細說明，可更好地理解本發明。圖l是標記和分離特定細胞的五種不同原理的示意圖。兩種原理——其中一抗用于標記和細胞分離，顯示在圖A和B中；而二重標記原理在圖C、D和E中示出，其中使用一抗和二抗。圖1A顯示直接單層標記技術，其中特定抗體用修飾的生物素進行標記，并且在與靶細胞溫育以前，與修飾的鏈霉抗生物素包被的固體支持物結合。圖1B顯示間接單層標記技術，其中特定抗體標記有修飾的生物素，并且在與修飾的鏈霉抗生物素包被的固體支持物溫育以前，與耙細胞溫育。圖1C顯示直接雙層標記技術，其中針對抗-耙抗體的抗體標記有修飾的生物素，并且在與抗-靶抗體溫育之前，與修飾的鏈霉抗生物素包被的固體支持物結合。然后，這些復合物與靶細胞溫育。圖1D顯示間接雙層標記技術，其中在與修飾的鏈霉抗生物素包被的固體支持物溫育之前，生物素-標記的抗-抗體和抗-靶抗體的復合物與靶細胞溫育。圖1E顯示組合型雙層標記技術，其中在和已經與靶細胞結合的抗-耙抗體溫育之前，修飾的生物素-標記的抗-抗體與修飾的鏈霉抗生物素結合。圖2是本發明應用方法的示意圖，其示出修飾的生物素化細胞結合抗體如何可用于與熒光染料標記的鏈霉抗生物素結合，以在熒光顯微術或流式細胞術中進行檢測。圖3是用于經過抗原呈遞細胞(APC)特異性刺激T細胞的本發明的應用方法的示意圖。顯示的是在結構中具有遺傳學或化學插入的抗原肽(顯示為正方形)的DSB-標記的修飾的抗體。在APC分離之后，保留下來的修飾的抗體被內化并且加工(負載/加工)。APC的抗原肽的隨后呈遞可被用于刺激特定的T細胞。該T細胞通過它們的T細胞受體(TcR)，在主要組織相容性復合物II類((MajorHisto-國patibilityComplex)細C)classII)的背景中，識別肽。圖4是本發明的應用方法的示意圖，其示出分離的細胞如何可以由用于細胞分離的抗體進行刺激。分離的細胞在細胞表面上保留用于分離的DSB-連接的-抗體。引入另外的生物素化共刺激分子和鏈霉抗生物素包被的Dynabeads將產生細胞-珠復合物，從而推動細胞活化、增殖和/或分化。圖5是示出在用DynabeadsM-280鏈霉抗生物素、生物素-抗-CD28和DSB-連接的-抗-CD3刺激后CD3+T細胞的增殖的圖。使用DSB-連接的-抗-CD3和硝基-鏈霉抗生物素-珠分離CD3+T細胞。在釋放后，細胞在細胞表面上保留DSB-連接的-抗-CD3，并且引入生物素-抗-CD28和DynabeadsM-280鏈霉抗生物素以產生細胞進入細胞周期所需要的刺激信號(通過TCR/CD3復合物和共刺激分子)。48小時的刺激后，用3H-胸苷(thyraidin)脈沖細胞，并在72小時后收獲細胞，如在實施例4中所描述的。發明詳述盡管用"包括"多種成分或步驟(解釋為指"包括但不限于")的方式描述組合物和方法，但是組合物和方法也可"基本上由多種成分或步驟構成"或者"由多種成分或步驟構成"，此類術語應解釋為定義基本上封閉的成員組。方法本發明的一個實施方案提供在使用抗生物素蛋白-生物素技術的方法中，回收生物素化配體的方法(如在圖1A中所示)，其包括下列步驟(a)將修飾的生物素化配體固定化到連接至固體支持物的修飾的鏈霉抗生物素-型分子上；(b)在如此固定化的修飾的生物素化配體和它的靶之間進行期望的反應或分離過程；(c)通過加入低濃度的游離生物素，從固定化的修飾的鏈霉抗生物素移出修飾的生物素化配體/靶復合物；和(d)回收修飾的生物素化配體/靶復合物。本發明的可選的實施方案涉及包括下列步驟的方法(如在圖1B中圖解的)(a)溫育修飾的生物素化配體和它的乾；(b)將修飾的生物素化配體/靶復合物固定化到連接至固體支持物的修飾的鏈霉抗生物素-型分子上；(c)通過加入低濃度的游離生物素，從固定化的修飾的鏈霉抗生物素移出修飾的生物素化配體/靶復合物；和(d)回收修飾的生物素化配體/靶復合物。本發明的第三個實施方案涉及包括下列步驟的方法(如在圖1C中圖解的)(a)將修飾的生物素化抗-配體固定到連接至固體支持物的修飾的鏈霉抗生物素-型分子上；(b)將步驟a的復合物與配體一起溫育；(c)在如此固定的步驟b的復合物與它的靼之間進行期望的反應或分離過程；(d)通過加入低濃度的游離生物素，從固定的修飾的鏈霉抗生物素移出修飾的生物素化抗-配體/配體/靶復合物；和(e)回收修飾的生物素化抗-配體/配體/乾復合物。本發明的第四個實施方案涉及包括下列步驟的方法(如在圖ID中圖解的)(a)溫育修飾的生物素化抗-配體和配體；(b)將步驟a的復合物與靶一起溫育；(c)將步驟b的復合物固定到連接至固體支持物的修飾的鏈霉抗生物素-型分子上；(d)通過加入低濃度的游離生物素，從固定的修飾的鏈霉抗生物素移出修飾的生物素化抗-配體/配體/靶復合物；和(e)回收修飾的生物素化抗-配體/配體/靶復合物。本發明的第五個實施方案涉及包括下列步驟的方法(如在圖IE中圖解的)(a)將修飾的生物素化抗-配體固定到連接至固體支持物的修飾的鏈霉抗生物素-型分子上；(b)將步驟a的復合物與配體一起溫育；(c)在如此固定的步驟b的復合物與它的靶之間進行期望的反應或分離過程；(d)通過加入低濃度的游離生物素，從固定的修飾的鏈霉抗生物素移出修飾的生物素化抗-配體/配體/靶復合物；和(e)回收<奮飾的生物素化抗-配體/配體/乾復合物。所描述的方法優于現有技術的優點是釋放結合的細胞更快得多，并且在非常溫和的條件下進行，所述條件例如在生理pH下的PBS緩沖液或細胞培養基中的大約50laM到大約500liM生物素。如本文使用的，術語"生物素"意圖指生物素(順式-六氫-2-氧代-lH-p塞吩并[3,4]咪唑-4-戊酸)和任何生物素衍生物以及類似物。此類衍生物和類似物是與天然或修飾的鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白的生物素結合袋形成復合物的物質。這樣的化合物包括，例如，亞氨基生物素、脫硫生物素和鏈霉抗生物素親和肽，并且也包括生物素-s-N-賴氨酸、生物胞素酰肼、2-亞氨基生物素和生物素基-s-氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯的氨基或巰基衍生物、硫代-琥珀酰亞胺-亞氨基生物素、生物素溴代乙酰基肼(biotinbromoacetylhydrazide)、對-重氮苯甲酰基生物胞素、3-(N-馬來酰亞胺丙酰)生物胞素。用于本發明的優選的生物素衍生物是脫硫生物素或它的衍生物湖-X生物素，其從MolecularProbes,Eugene,0R，USA商業可獲得；產品號D20658)。術語"生物素化物質"或"部分"應被理解為修飾的生物素或生物素類似物與其他部分的綴合物，所述其他部分例如生物分子，如核酸分子(包括單鏈或雙鏈DNA、RNA、DNA/RM嵌合分子、核酸類似物和包含或并入核香酸序列的任何分子例如肽核酸(PNA)或其任何修飾物)、蛋白質(包括糖蛋白、酶、肽文庫或展示產品和抗體或其衍生物)、肽、碳水化合物或多糖、脂質等等，其中所述其他部分被共價連接到修飾的生物素或生物素類似物。許多生物素化配體是商業可獲得的，或可以通過標準方法制備。將生物分子例如核酸分子或蛋白質分子偶聯到生物素的方法是本領域熟知的(BayerandWilchek，MethodsinMolec.Biology10，143.1992)。術語"結合配偶體"被定義為能夠與另一個生物分子特異性或非特異性結合或相互作用的任何生物或其他的有機分子，該結合或相互作用可被稱為"配體，，結合或相互作用，并且由下列物質所例證，但不限于這些物質抗體/抗原、抗體/半抗原、酶/底物、酶/抑制劑、酶/輔因子、結合蛋白/底物、載體蛋白/底物、凝集素/碳水化合物、受體/激素、受體/效應物或阻抑物/誘導物結合或相互作用。適當的配體依賴本發明的方法的期望應用而選擇。其他的特異性親和吸附部分，例如小麥胚粘合劑(wheatgermagglutinant)、抗-獨特型抗體和染料配體，也可與修飾的生物素偶聯，以便分離糖基化的蛋白質例如SP1轉錄因子、染料結合蛋白質例如丙酮酸激酶和肝臟乙醇脫氬酶及其他抗體。在一些情況下，配體是針對藥物、激素、抗生素或具有抗原性質的其他化合物的抗體。抗體也可以針對另一個抗體(也就是說抗-抗體)。單克隆和多克隆抗體都可被使用，并且他們可以是完整的分子或其各個片段。對特定配體特異性的抗體可通過本領域公知的和記錄在文件中的方法來生產。用于本發明的方法中的抗體可以是任何種、類別或亞類，只要這樣的抗體能夠與特定的靶配體形成連接，并且可以用修飾的生物素進行生物素化。如此，用于本發明的抗體包括任何種類或亞類的免疫球蛋白，例如源于任何動物的IgG、IgA、IgM、IgD或者IgE，所述動物例如通常使用的任何動物，例如綿羊、兔、山羊或小鼠。單克隆抗體完整的抗體或抗體的"片段"，單克隆或多克隆的，包含抗體的結合區域的那些片段，例如缺少Fc部分的片段(例如Fab、FaV、F(ab')2、Fv)，通過還原切割完整抗體中連接重鏈部分的二硫鍵而獲得的所謂的"半分子"片段。通過重組DM或其他合成技術生產或修飾的抗體，包括單克隆抗體、抗體的片段、"人源化抗體"、嵌合的抗體或合成制造的或改變的抗體樣結構。也包括的是抗體的功能衍生物或"等同物"，例如單鏈抗體。可選地，配體可以是抗原性物質(包括一價的或多價的或多決定蔟(multidetermi謹t)抗原)。如本文使用的，術語"綴合物"和"復合物"指包含生物素化合物和生物素結合化合物的任何綴合物或復合物，其中生物素化合物和生物素結合化合物通過非共價結合連接。典型地，生物素與一種或多種——優選一種——生物或化學實體例如生物分子結合或連接。如上面解釋的，這類包含與其他實體連接的生物素的生物素化合物，在本文也稱為"生物素化部分"。如本文使用的，術語"生物素結合"化合物意圖包括能優選的生物素結合化合物包括修飾的鏈霉抗生物素和抗生物素蛋白，以及其衍生物和類似物，例如硝基-鏈霉抗生物素。如本文使用的，術語"抗生物素蛋白"指天然的卵清糖蛋白抗生物素蛋白，以及其衍生物或等同物，例如去糖基化或重組形式的抗生物素蛋白，例如，N-酰基抗生物素蛋白如N-乙酰基、N-鄰苯二曱酰和N-琥珀酰抗生物素蛋白；和商品ExtrAvidin、Neutralite如本文使用的術語"鏈霉抗生物素"指通過鏈霉菌屬選擇的菌林產生的細菌鏈霉抗生物素，例如，阿維丁鏈霉菌(Streptomycesavidinii)，以及其衍生物或等同物，例如重組和截短的鏈霉抗生物素，例如"核心"鏈霉抗生物素。某些抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素物質是商業可獲得的，例如天然的抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素、非糖基化的抗生物素蛋白、N-酰基抗生物素蛋白和截短的鏈霉抗生物素；或者可以通過公知的方法制備(參見Avidin-biotintechnology,MethodsofEnzymology，Vol.184:1-671，1990。在該參考文獻中，Green描述抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素的制備；Hiller等，制備非糖基化抗生物素蛋白；Bayer等，制備鏈霉抗生物素和截短的鏈霉抗生物素；Chandra&Gray描述重組抗生物素蛋白)。天然和重組形式的鏈霉抗生物素和抗生物素蛋白都可用于本文描述的方法，只要他們可以被修飾，如US-A-5，973，124中描述的。用于本發明的優選的鏈霉抗生物素的衍生物是硝基-鏈霉抗生物素，其如在實施例2中描述的那樣進行制備。用作起始材料的優選的衍生物是重組核心-鏈霉抗生物素。在本發明的優選實施方案中，生物素類似物或者修飾的生物素結合化合物，被固定化在固定化部分，例如固體支持物上。優選地，修飾的生物素結合化合物例如硝基-鏈霉抗生物素(或抗生物素蛋白)，將被固定化。連接作用的任何一種成分連接到固相，使該連接的成分容易操作。因此，連接到某種固相可以使得能夠從混合物中的剩余成分中分離出連接的成分。例如，這可通過進行洗滌步驟實現，或者如果該成分連接到磁珠，那么使用磁場實現從混合物中的剩余成分中物理分離出連接的成分。固體支持物可能是任何公知的支持物或基體，其當前被廣泛用于化學或生物化學過程中的固定、分離等，或者被提議用于化學或生物化學過程中的固定、分離等。這些支持物可以采取顆粒、片、試條(dip-sticks)、凝膠、過濾器、膜、微纖維條、管、孔或板、纖維或毛細管、梳、移液管尖、微陣列或芯片或它們的組合的形式，并且方便地可以由聚合材料例如瓊脂糖、瓊脂糖凝膠(Sepharose)、纖維素、硝化纖維、藻酸鹽、特氟綸(Teflon)、膠乳、丙烯酰胺、尼龍膜、塑料、聚苯乙烯、玻璃或二氧化硅或金屬制成。生物芯片可被用作固體支持物，以提供微型實驗系統——如在Nilsson等中描述的(Anal.Biochem.224:400-408，1995);或者作為診斷工具。許多適當的固體支持物是商業可獲得的。優選的固體支持物是為結合修飾的生物素或修飾的生物素結合化合物提供大的表面面積的物質。此類支持物通常具有不規則表面，并且例如可以是多孔的或微粒狀的，例如顆粒、纖維、織物、熔渣或篩。微粒物質例如珠通常是優選的，這是由于它們更大的結合能力，特別是聚合珠/顆粒。方便地，根據本發明使用的微粒固體支持物包括球形珠。珠的大小不是關鍵的，但是它們可以為，例如至少0.01"m直徑的量級，并且具有優選地不超過10和更優選地不超過6|im的最大直徑。例如，直徑1.0nm、2.8jnm和4.5um的珠已經示出工作良好。單分散顆粒，即基本上大小一致的那些顆粒(例如大小具有小于5%的直徑標準差)，具有下列優點它們提供非常均一的反應重復性。通過在美國專利號4,336,173中描述的技術生產的單分散聚合物顆粒是特別適當的。顆粒可以完全由相同的聚合物組成，或者它們可以是核-殼(core-shell)聚合物，如在美國專利號4，703，018和EP-A-0280556中描述的，其中殼聚合物具有必需的反應基團。在本發明方法中適用的非磁性聚合物珠可從DynalBiotechAS(Oslo,Norway)獲得，其商標DYNOSPHERES，以及可從Qiagen、GEHealthcareLifeSciences、Serotec、Seradyne、Merck、NipponPaint、Chemagen、Promega、Prolabo、Polysciences、Agowa和BangsLaboratories獲得。然而，為了幫助操作和分離固定的物質，并且如果需要的話也為了促進自動化，可磁化的("磁性的")珠是優選的。如本文使用的，術語"磁性的"指當支持物被放入磁場中時，支持物能夠具有給予其的磁矩，因此支持物在該場的作用下可被移置。換言之，在結合任何修飾的生物素或修飾的生物素化部分后，包括磁性顆粒的支持物通過磁性聚集(magneticaggregation),可容易地從樣品的其他成分中移出，這提供快捷、簡單的和有效的分離顆粒的方法。另外，這樣的磁性聚集是遠不及傳統的技術例如離心作用一一其產生可以破裂細胞或降解連接至修飾的生物素分子的任何其他部分，例如蛋白質或核酸的剪切力一一嚴酷的分離方法。因此，通過應用磁場，例如使用永久磁體，具有修飾的生物素或修飾的生物素化部分的磁性顆粒——所述修飾的生物素或修飾鏈霉抗生物i(抗生物素蛋白)上二一可以在適當的表面上移動。應工用磁體到包含樣品混合物的容器的側面，以聚集顆粒到容器壁并移出其余的樣品以便剩余樣品和/或顆粒可用于任何期望的進一步的步驟，這通常是足夠的。可選地，本方法可使用處理這類磁性顆粒的自動化系統進行。可將包含靶細胞的樣品轉移到這樣的儀器，并且可以加入攜帶針對乾的抗體的磁性顆粒一一所述抗體通過修飾的生物素/硝基鏈霉抗生物素復合物連接。如果希望，可以洗滌分離的支持物結合的細胞，并將其轉移到包含置換生物素的其他小瓶中，然后移出釋放的顆粒。在這點上，特別提到BeadRetriever,其可從DynalBiotechAS,Norway獲得。該儀器具有將支持物(攜帶細胞)從一個孔簡便、有效地轉移到另一個孔的系統。優選地，這樣的f茲性顆粒是超順磁的(superparamagnetic)以避免頑磁并因此聚集，并且有利地，這樣的磁性顆粒是單分散的(即在大小上基本一致，例如大小具有小于5%的直徑標準差)，以提供均一的動力學和分離。超順磁單分散顆粒的制備由Sintef在EP-A-106873中描述。由DynalBiotechAS(Oslo,Norway)以商標DYNABEADS出售的公知的單分散聚合超順磁珠，是示例性的商業可獲得的磁性顆粒，其可根據本發明的應用而進行使用或修飾。如果希望，修飾的生物素結合化合物(例如硝基-鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白)或修飾的生物素，可經由基底(substrate)表面上的反應基團、通過本領域公知的方法，共價連接到適當的支持物上。這些包括例如，通過鞋基、羧基、醛或氨基一一其可通過處理固定支持物以提供適當的表面涂層而被提供一一的連接。可選地，具有功能化表面的支持物是從許多制造商商業可獲得的，例如上面所述的那些顆粒制造商。具有下列功能化表面的磁性顆粒可從DynalBiotechAS,Oslo,Norway獲得疏水珠DynabeadsM-450Epoxy(具有環氧基團)DynabeadsM-450Tosylactivated(具有甲苯磺酰基)DynabeadsM-280Tosylactivated(具有甲苯磺酰基)DynabeadsMyOneTosylactivated(具有甲苯磺酰基)DynabeadsM-500Subcellular(具有甲苯磺酰基)DynabeadsM-270Amine(具有氨基)。在關心的具體方法中，表面的適當選擇可依賴于連接到修飾的生物素或修飾的生物素結合化合物的部分的類型。通過可直接與顆粒的外表面上的反應基團反應的生物素結合化合物的氨基或巰基可實現該連接。存在許多有用的反應基團，其與修飾的生物素結合分子的游離胺基反應。這樣的基團包括但不限于羧基、活性卣素、活化的2-取代的乙磺酰基、活化的2-取代的乙基羰基、活性酯、乙烯基磺酰基、乙烯基羰基、醛、環氧、氨基和巰基，所有這些在本領域是已知的。這些基團中的一些與修飾的生物素結合分子直接反應，而其他的，例如羧基，需要使用化合物來產生中間物，該中間物與修飾的生物素結合化合物分子反應。適于交聯固體表面和生物素結合化合物的試劑包括溴化氰、羰二咪唑、戊二醛、羥基琥珀酰亞胺和甲苯磺酰氯。已經發現曱苯磺酰基-和環氧表面都適用于本發明。制備本發明試劑的一般方法包括使用通常已知的反應，將修飾的鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白或它們的衍生物共價連接到顆粒。代表性的制備方法在下面實施例2中舉例說明。本文描述的本發明的修飾的生物素-結合分子可用于使用抗生物素蛋白-生物素技術的任何方法，特別是其中希望破壞結合或反轉結合復合物的那些方法。術語"反轉"、"切割"、"釋放"或"破壞"在本文可互相交換使用，并且意圖指物理分離或分開或解離結合復合物的配偶體。所需要的是破壞或打破在修刮物之間的連接以使各個實體分離通過加入例如用酶或熒光、化學發光或放射性試劑標記的鏈霉抗生物素，可以以高度靈敏性檢測和量化分離的靶。綴合的鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白產物(具有熒光素、若丹明、鐵蛋白或辣根過氧化物酶)是商業可獲得的。這樣的標記將幫助在流式細胞術中檢測分離的細胞。細胞必須在釋放溶液中洗滌一次，以除去游離生物素，然后可以加入熒光染料綴合的鏈霉抗生物素，從而所有分離的細胞被標記，并易于在熒光顯微術或流式細胞術中檢測(圖2)。連接到釋放出來的細胞的生物素化抗體也可用于將蛋白質遞送入細胞，以進行下列的體外研究A,吞噬作用；B,遞送毒性或代謝物質；或C，遞送通過抗原呈遞細胞(APC)上的MHCII/HLA復合物降解和呈遞的蛋白質/肽。(a)綠色焚光蛋白-標記的抗體可以在胞吞區室中示蹤，或可以使用FITC綴合的鏈霉抗生物素，其與DSB-X-標記的抗體結合。(b)DSB-X-標記的抗體可以與毒素綴合，以研究藥物遞送入細胞中。(c)DSB-X-標記的抗體/DSB-X-蛋白可涉及細胞內化和降解/加工，以及隨后呈遞用于特異性T細胞刺激的抗原肽。對于體內治療應用，通過遞送T細胞表位的抗體靶向APC的概念已在Bogen等的美國專利號6,294,654和Brekke0.H.&SandlieI.EuropeanBioPharmaceuticalReview,Spring2002中描述。典型的APC是B細胞、單核細胞、巨噬細胞或樹突細胞。用于這樣的APC的任何細胞表面標i己可用于耙向抗體。在本發明的多個方面中所描述的概念的新穎性在于將體外細胞分離和體外特定的T細胞刺激組合。當與用于T細胞擴增(expansion)的DynabeadsCD3/CD28產品(DynalBiotechASOsloNorway)結合使用時，特定的T細胞可以甚至進一步擴增。可以運用本觀念篩選和發現新的T細胞表位，以用于疫苗開發。可以想象將抗原蛋白直接綴合到抗體，而不是如在上述兩個參考文獻中描述的將它們遺傳并入抗體。如果抗原蛋白本身是細胞受體的配體，那么它可以在DSB-X-綴合之后，直接用于細胞分離(參見圖3)。本發明的方面也可與細胞刺激和擴增一起應用(參見圖4)。細胞結合的抗體展示DSB-部分，即在選擇和釋放后，它們可以在溶液中或固體表面(例如磁珠)上結合鏈霉抗生物素。這可用于幫助將兩個或多個信號遞送到細胞。例如應用抗-CD3分離，隨后與共刺激抗體/配體例如抗-CD28、抗-CD137或抗-NKG2D交聯。這將使能夠控制和改變所涉及的分子的比率(例如抗-CD3-抗-CD28比率)的非常具有靈活性的系統成為可能。如果希望使分離的細胞不含任何抗體，則本發明的方法可以與其他的釋放原理——如在美國專利號5，429,927中描述的——相結合。在那個文件中，發明人描述了通過使連接與二抗反應、從而切割抗原/抗體連接的方法，其中所述二抗結合并破壞抗原和抗體之間的結合，因此釋放抗原(參見實施例5)。在釋放結合對之后，即在釋放修飾的生物素化抗體之后，可以重復使用硝基-鏈霉抗生物素支持物。在本發明優選的實施方案中，固相包括磁性顆粒，并且通過磁性聚集從混合的細胞群中分離磁性顆粒和附著的細胞。在使用磁性顆粒進行正分離細胞的許多現有技術方法中，為了從顆粒釋放細胞，將細胞/顆粒"蓮座(rosettes)"在37。C下溫育過夜，以實現從顆粒分離細胞。在一些情況下，細胞與顆粒分開；但是在很多情況下，它們沒有分開，此類差的回收使分離低表現細胞亞群變得困難。本發明的方面涉及分離惡性細胞或對不同疾病特異的細胞群的方法，并在不受其他污染細胞的干擾的情況下，進一步表征這些細胞。同時，本方法可用于從一個個體或從一群個體分離防衛細胞群；然后，在被返回給處于治療中的患者之前，分離的群可進行擴增和/或加強。這樣的防衛細胞群可以是，例如單核細胞/巨噬細胞、淋巴細胞或骨髓干細胞。方法也可用于從患者分離和培養傳染物例如細菌或病毒，以便量化它們或表征它們的傳染性、毒性或對藥物治療的敏感性。體液，例如患者的血，可以與具有對病毒表面抗原特異的抗體的支持物接觸。如果通過修飾的鏈霉抗生物素將抗體與固體支持物交聯，那么使用溫和的洗脫技術可釋放結合的傳染物，而對其沒有損害。分離的傳染物最后通過活培養而鑒定。可以通過該技術分離的傳染物包括慢病毒、癡疾和傳染性酵母。在噬菌體文庫技術中，結合配體(例如抗體、受體)被連接到固體支持物例如微量滴定板。這通常通過生物素化配體和隨后通過鏈霉抗生物素橋固定到板來完成。因此，通過使用本發明的修飾的鏈霉抗生物素，可以通過溫和的加入生物素從微量滴定板釋放高親和力噬菌體，連同修飾的生物素化配體。然后，回收的與噬菌體結合的高親和力的肽，可通過隨后感染細菌和通過建立的噬菌體文庫方法來富集。本方法可用于其中的純化方法包括傳統用于分離細胞、核酸、蛋白質及其他生物物質、有機化合物等等的那些方法。本發明的方法也可用于除去固定化酶，因此產生可逆的酶反應劑；和用于將細胞固定到柱材料，因此產生基于細胞的反應系統。本方法也可用于分離，然后洗脫抗原/抗體-復合物，以用于進一步的下游分析，如質鐠法。在高通量篩選中的應用也是適當的。本發明的另一個實施方案關注于涉及核酸的方法。這樣的方法包括純化、基于DNA的分析、測序、體外擴增等。通過應用修飾的生物素/修飾的鏈霉抗生物素復合物，核酸可以可逆地固定到固相。這與涉及生物素/鏈霉抗生物素結合的傳統方法一一其中生物素化鏈保持固定在固相上——相反。本方法一個優選的應用是在再生用于DNA分析的探針的方法中。固定的核酸可以是單鏈的或雙鏈的，并且其可包括克隆序列或隨機序列。使用本領域已知的方法，容易地制備生物素化核酸。本文描述的連接和釋放系統中涉及的所有參數可根據待被分離的靶/細胞類型、使用的配體系統或抗原/抗體、使用的修飾的生物素和鏈霉抗生物素以及使用的固相的類型如磁珠的大小而改變。對于任何給定的靶和使用的結合對，本領域技術人員可容易地確定所有使用條件。用于置換的條件可適當改變。使連接與置換配體例如游離生物素(或其片段)"反應"的步驟，可以以任何方便的或期望的方式進行。包含連接的"反應混合物"或樣品一一方便地在水性介質中一—可以簡單地接觸置換配體，例如可簡單地將置換配體加入到樣品中，并在適當條件下，使反應混合物停留一段時間間隔，以使置換配體結合，然后可以分離連接的一種或兩種組分。當然，最佳切割所需要的置換配體的數量^4居結合的實體、它們的比率和實體例如需要分離的細胞的數或量而變化，并且可以根據需要容易地確定。例如，在上述的正細胞分離的情況中，磁性顆粒與耙細胞的比率在不同的系統中和根據不同的應用而改變，因此，需要不同的數量的置換配體以從顆粒分開細胞。實例濃度可以是lmM、5mM或10mM。在大約0.1到10mM、優選2到5raM范圍內的游離生物素的濃度已被發現是有效的。用于分開的條件也可適當改變。典型地，對于非吞噬細胞，與游離生物素的溫育在大約0°C(冰上)到37。C的范圍內、優選室溫下的溫度下是有效的。吞噬細胞必須在0°C(水上)到2-8。C(冷室)溫育。溫育時間根據使用的溫度、材料和濃度而改變，并且對于任何給定組的條件，其可由本領域技術人員容易地確定。對于用戶而言，短的溫育時間是吸引人的。典型地，溫育時間的范圍為大約2到大約30分鐘，優選地大約5到10分鐘。因此，對于具有仍舊附著的生物素化配體的細胞，可將懸浮在適當的培養基中的蓮座細胞簡單地與2到5mM的游離生物素在周圍溫度下溫育5到10分鐘，以從生物素結合固體支持物釋放。在一些情況中，可能希望例如通過溫和的攪拌或混合例如吹吸，以幫助破壞通過置換配體結合而變得不穩定的連接，從而幫助反轉連接。通過在提供溫和傾斜和旋轉的儀器上溫育，獲得最好的結果。該反轉抗體-耙配體連接的更廣泛方法的優點是明顯的，并且包括更方便、耗費較少時間和努力來開發并因此更具有成本效益的益處。同樣，本發明的方法在既不導致連接中涉及的抗體或靶配體組分的活性的破壞或損失、又不影響涉及的任何細胞的生命或天然狀態的非常溫和的/柔和的條件下進行。本發明方法的另一個優點是留在細胞表面上的生物素化配體可以立即用于下游的應用。試劑盒本發明可選的實施方案涉及試劑盒。試劑盒可以包含固體支持物、配體和置換試劑。固體支持物通常可以是任何固體支持物。例如，固體支持物可以是微粒或磁性顆粒。固體支持物可以進一步包括至少一種修飾的鏈霉抗生物素例如硝基鏈霉抗生物素。配體可以針對攜帶修飾的生物素優選脫硫生物素或甚至更優選DSB-X-生物素的特定靶。配體可以與固體支持物上的修飾的鏈霉抗生物素結合。置換試劑通常可以是足以從固體支持物置換配體的任何材料。例如，置換試劑可以是生物素。試劑盒可選地包括用于用修飾的生物素標記配體的試劑。包括下列實施例來說明本發明的優選的實施方案。本領域技術人員應理解，在隨后的實施例中公開的技術代表本發明人(一個或多個)發現的、在本發明實踐中良好發揮功能的技術，因此其可以^皮認為構成其實踐的優選的模式。然而，根據本公開內容，本領域技術人員理解，在公開的具體實施方案中可以進行許多變化，并仍然獲得類似或相似的結果，而沒有背離本發明的范圍。實施例縮寫在實驗中使用下列縮寫BSA=血清白蛋白DSB=脫硫生物素DMSO-二甲基亞砜訓S=Dulbecco'sPBSDynabeads-NSA=硝基-鏈霉抗生物素包被的DynabeadsDynabeads-SA=鏈霉抗生物素包被的DynabeadsFCS-胎牛血清EDC/NHS-1-乙基_3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺氬氯化物/N-幾基琥珀酰亞胺PBS-磷酸鹽緩沖鹽溶液RT=室溫RU-相對單位(RU)實施例1:脫硫生物素-X/鏈霉抗生物素(DSB-X/SA)相互作用的BiaCore數據材料和方法1.固定化方法通過4吏用BiaCore的AmineCouplingKit,激活CM5芯片(BiaCore,BiaCoreAB，Uppsala,Sweden),以結合配體例力口鏈霉抗生物素或CaptAvidin。該方法遵循制造商所提供的方法。簡言之，將EDC/NHS暴露于CM5芯片，以5|i1/分鐘流動7分鐘。然后，將配體暴露于激活的CM5表面，以5u1/分鐘流動7分鐘。用乙醇胺滅活過量的反應基團，以5ju1/分鐘流動7分鐘。配體的RU的量級介于4000-19000RU之間。將具有共價結合的配體(重組核心鏈霉抗生物素或CaptAvidin(賄基抗生物素蛋白))的CM5芯片暴露于分析物(生物素化或DSB-Xtm生物素化的抗體)，所述分析物在50-400jug/ml的濃度下，以5n1/分鐘流動，直到達到分析物的飽和結合。分析物的RU的量級介于1000一6000RU之間。3.分析物的釋放將具有共價結合的配體(鏈霉抗生物素或CaptAvidin)和親和結合的分析物(生物素化或DSB-X生物素化抗體)的CM5芯片暴露于游離D-生物素，所述生物素在50juM-10niM的濃度下，以5ja1/分鐘流動。4.分析在生物評估(Bioevaluation)程序中處理所有監控的數據，以顯現游離D-生物素與不同復合物鏈霉抗生物素-DSB-Xtm生物素化抗體、CapUvidin-DSB-X'm生物素化抗體和CaptAvidin-生物素化抗體的相互作用。結果表l示出觀察的DSB-X生物素化抗體(DSB-XAb)和生物素化抗體對CaptAvidin⑧和鏈霉抗生物素的結合特性的比較。通過加入lOmM游離生物素當一半的結合分子釋放時，測量出解離時間。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>*才艮據文獻實施例2:硝化鏈霉抗生物素和偶聯到Dynabeads的方法。材料和方法1.制備硝基-鏈霉抗生物素25。C下，用60mM四硝基甲烷處理鏈霉抗生物素(50rag，在5ml的50mMTris緩沖液中，pH8.5)2小時。由MpTM-25柱(GEHealthcareLifeSciences)純化硝基-鏈霉抗生物素。2.制備硝基-鏈霉抗生物素珠用0.1M磷酸鹽緩沖液，pH7.4(3X3ml)洗滌100mgDynabeadsM-280Tosylactivated，并將其重懸于1.8ml0.1M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液中。加入200|il硝基-鏈霉抗生物素(PBS中，10mg/ml)，然后將0.1M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液中的1ml3M(NH4)2S04加入到珠中。37。C下，在滾筒上16小時后，用pH4.0的3ml50mM檸檬酸/磷酸鹽緩沖液洗涂珠，并將其重懸于3ml中。加入100iul生物素(DMSO中10mg/ml)以封閉未修飾的生物素結合位點。30分鐘后，用pH10的3ml50mM碳酸鹽緩沖液洗滌珠以釋放與修飾的結合位點結合的任何生物素。將珠儲存在PBS、0.1%BSA緩沖液中。13.混合至均勻(例如旋轉-混合/渦旋)14.在具有傾斜和旋轉運動的儀器上在室溫下，溫育1015.混合至均勻(例如旋轉-混合/渦旋)17.收集上清液(將來自每一釋放周期的組合)18.從磁體移出管19.加入0.5ml釋放緩沖液，并混合至均勻(例如吹吸)實施例3:用于不同細胞分離過程中的方法，如在圖1中所示。材料和方法使用的抗體是小鼠抗-CD45抗體——克隆EOl、DSB-標記或沒有標記，和人抗-小鼠IgG抗體——克隆HAM6、DSB-標記的。I)培養和洗滌細胞1.在含10%FCS和1%丙酮酸鈉的RPMI1640中以0.3-0.5xl()6細胞/ml培養Daudi細胞。使用前24小時分開。2.在洗滌緩沖液(DPBS，0.1%BSA和2mMEDTA)中洗滌細胞。在2-8。C、300xg下離心8分鐘。以10'-108細胞/瓜1重懸于洗滌緩沖液中。II)用抗體敏化細胞1.將每106個細胞0.5(ag抗體(抗-CD45抗體，DSB-標記或沒有標記)加入到107-108細胞/1111的洗滌細胞中2.在2-8。C下溫育10-15分鐘(或在水上溫育30-45分鐘)通過加入10x過量體積的洗滌緩沖液洗滌細胞1次，在2-8匸、300xg下離心8分鐘。在洗滌緩沖液中以107-108細胞/0]1重懸細胞。3.可選的通過以2:1的比率同時加入DSB-標記的人抗小鼠IgG和抗-CD45，用"雙層抗體復合物"敏化細胞。III)洗滌Dynabeads:根據一般程序進行該洗滌。IV)偶聯Dynabeads和抗體1.將每毫克偶聯有硝基-鏈霉抗生物素的Dynabeads3MgDSB-標記的抗體(人抗-小鼠IgG抗體或抗-CD45抗體)加入到lOmg珠/ml的經洗滌的珠中。2.室溫下溫育10-20分鐘。3.用洗滌緩沖液填充3/4管，混合至均勻(例如旋轉-混合/渦旋)4.將管置入磁體5.除去上清液6.重復步驟3-5兩次7.在洗涂-緩沖液中重懸至初始體積可選的通過以1:2的比率同時加入DSB-標記的人抗小鼠IgG抗體和抗-CD45抗體，將珠與"雙層抗體復合物"偶聯。V)細胞牽引和釋放根據一般程序進行該步驟。全部的方案方法A:組合洗滌的細胞(I)和與DSB-抗-CD45抗體偶聯的Dynabeads-NSA(IV)。方法B:組合用DSB-抗-CD45抗體敏化的細胞(II)和洗滌的Dynabeads-NSA(III)。方法C:組合洗滌的細胞(I)和與"雙層抗體復合物"偶聯的Dynabeads-NSA(IV)(DSB-標記的人抗-小鼠IgG抗體和抗-CD45抗體)。方法D:組合用"雙層抗體復合物"敏化的細胞(II)(DSB-標記的人抗-小鼠IgG和抗CD45)和洗滌的Dynabeads-NSA(III)。方法E:組合用抗-CD45-抗體敏化的細胞和偶聯有DSB-人抗-小鼠IgG抗體的Dynabeads通過下列方程計算分離的細胞的百分比100%*(加入用于牽引的細胞數量-在組合洗滌溶液中的細胞數量)/加入用于牽引的細胞數量通過下列方程計算釋放的細胞的百分比100%*在組合釋放溶液中的細胞數量/(加入用于牽引的細胞數量-在組合洗滌溶液中的細胞數量)通過下列方程計算細胞得率百分比100%*在組合釋放溶液中的細胞數量/加入用于牽引的細胞數量其中加入用于牽引的細胞數量來自一般程序第2部分細胞牽引和釋放的步驟1在組合洗滌溶液中的細胞數量來自一般程序第2部分細胞牽引和釋放的步驟7在組合釋放溶液中的細胞數量來自一般程序第2部分細胞牽引和釋放的步驟17。結果在表2中示出表2<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>材料和方法I)分離外周血單核細胞(PBMC):1.按照密度梯度培養基制造商的說明書。2.在洗滌緩沖液(DPBS0.1%BSA和2mMEDTA)中洗滌細胞。在2-8。C、300xg下離心8分鐘。在洗滌緩沖液中以107-108細月包/ml重懸細月包。II)用抗體敏化細胞1.將每106個靶細胞0.5MgDSB-標記的抗體(抗-CD3抗體，克隆SpvT3b)加入到107-1()8個細胞/ml的洗滌的PBMC中2.在2-8'C下溫育10-15分鐘(或在冰上溫育30-45分鐘)3.通過加入10x過量體積的洗滌緩沖液洗滌細胞一次，在2-8。C、300xg下離心8分鐘。在洗滌緩沖液中以107-108個細胞/ml重懸細胞。III)洗滌Dynabeads:根據一般程序進行該步驟。IV)細胞牽引和釋i文根據一般程序進行該步驟。V)細胞刺激1.將10x過量的X-Vivo15加入到釋放的細胞(在IV中步驟17)。在2-8。C、300xg下離心8分鐘。以1()6個細胞/ml在X-Vivo15中重懸細胞。2.將105個細胞(100ju1懸浮液)加入到96-孔U-底板中3.在X-Vivo15中稀釋生物素-抗-CD28抗體(克隆L2/93)至0.0013mg/ml4.將稀釋的抗體加入到96-孔板的細胞中0-0.026jag/孔(0-20ju1懸浮液)7.加入X-Vivo15至200|u1/孔的總體積8.37。C下，在C02-培養箱中溫育48小時9.用20jal的3H-胸苷(5jnCi/ml終濃度)脈沖24小時。10.收獲并計數。結果在圖5中示出。該圖示出在用DSB-連接的-抗-CD3和NSA-珠分離CD3+T細胞、用DynabeadsM-280SA和生物素-抗-CD28刺激后，CD3+T細胞的增殖。在刺激3天后脈沖，在4天后收獲，如在實施例4中所述。實施例5:雙分離的方法材料和方法使用Dynabeads-NSA牽引用抗-CD8-X-DSB(脫硫生物素-X偶聯的抗-CD8mAb,IgM)染色的細胞。在2-8。C下，牽引細胞20分鐘，5xl0'珠/ml和5xl06細胞/ml3x洗滌室溫下，用1單位DETACHaBEAD⑧或0.5raM生物素或兩者的組合釋放15分鐘。釋放后，洗滌細胞一次，以除去DETACHaBEAD⑧。然后，在分離之前、耗盡之后和釋放之后，用異硫氰酸熒光素標記的抗-CD3(抗-CD3-FITC)和藻紅蛋白標記的抗-CD8(抗-CD8-PE)對細胞染色。結果在圖6中示出。該圖示出分離之前(左上直方圖)和用Dynabeads-NSA+抗-CD8-X-DSB耗盡CD8+細胞之后(右上直方圖)人單核細胞的流動染色(抗-CD3-FITC對抗-CD8-PE)。使用DETACHaBEAD(左中直方圖)、d-生物素(右中直方圖)或DETACHaBEAD⑧+d-生物素的組合(下面的直方圖)從珠釋放分離的細胞。討論在DETACHaBEAD(最佳，室溫下45分鐘)和生物素(最佳1mM以上)的次最佳條件下，進行釋放，這給出次最佳的釋放結果。然而，兩個不同釋放機制間的協同作用(對同一結合實體)被觀察到。這表明"雙分離"方法可能是吸引人的。公開內容通過有限次試驗進行和實行。盡管本發明的組合物和方法已經根據優選實施方案進行了描述，但是對本領域普通技術人員顯而易見的是可以對組合物和/或方法，以及本文描述的方法的步驟和步驟順序進行變化，而沒有背離本發明的原理和范圍。更具體地說，顯然地，化學和生理學都相關的某些試劑可以替換本文描述的試劑，但是仍達到相同或相似的結果。對本領域普通技術人員顯而易見的所有這些相似的替代和修改被認為在本發明的范圍和原理內。權利要求1.將修飾的生物素化合物可逆地固定到支持物的方法，所述方法包括提供第一化合物，其包含修飾的生物素化合物；提供固體支持物，其包含修飾的生物素結合化合物；和將所述第一化合物和所述固體支持物接觸以形成固定的物質；其中所述修飾的生物素化合物對鏈霉抗生物素的親和力小于生物素對鏈霉抗生物素的親和力；且生物素對所述修飾的生物素結合化合物的親和力小于生物素對鏈霉抗生物素的親和力。2.權利要求1所述的方法，其進一步包括將所述固定的物質與置換分子接觸，以釋放所述第一化合物。3.權利要求1所述的方法，其進一步包括將所述固定的物質與游離生物素或其衍生物接觸，以釋放所述第一化合物。4.權利要求1所述的方法，其中所述修飾的生物素結合化合物包括硝基-鏈霉抗生物素或其衍生物。5.權利要求1所述的方法，其中所述修飾的生物素化合物包括脫硫生物素、DSB-X生物素或其衍生物。6.權利要求1所述的方法，其中所述固體支持物選自塑料、玻璃、陶瓷、硅氧烷、金屬、纖維素和凝膠的表面。7.權利要求1所述的方法，其中所述固體支持物是顆粒或磁性顆粒。8.權利要求1所述的方法，其中所述修飾的生物素化合物結合或連接到下列物質蛋白質、肽、核酸、寡糖、糖蛋白、脂質、碳水化合物、激素、毒素、其衍生物或其組合。9.將修飾的生物素結合化合物可逆地固定到支持物的方法，所述方法包括提供第一化合物，其包含修飾的生物素結合化合物；提供固體支持物，其包含修飾的生物素化合物；和將所述第一化合物和所述固體支持物接觸以形成固定的物質；其中所述修飾的生物素化合物對鏈霉抗生物素的親和力小于生物素對鏈霉抗生物素的親和力；且生物素對所述修飾的生物素結合化合物的親和力小于生物素對鏈霉抗生物素的親和力。10.權利要求9所述的方法，其進一步包括將所述固定的物質與置換分子接觸，以釋放所述第一化合物。11.權利要求9所述的方法，其進一步包括將所述固定的物質與游離生物素或其衍生物接觸，以釋放所述第一化合物。12.權利要求9所述的方法，其中所述修飾的生物素結合化合物包括硝基-鏈霉抗生物素或其衍生物。13.權利要求9所述的方法，其中所述修飾的生物素化合物包括脫硫生物素、DSB-X生物素或其衍生物。14.權利要求9所述的方法，其中所述固體支持物選自塑料、玻璃、陶瓷、硅氧烷、金屬、纖維素和凝膠的表面。15.權利要求9所述的方法，其中所述固體支持物是顆粒或磁性顆粒。16.權利要求9所述的方法，其中所述修飾的生物素化合物結合或連接到下列物質蛋白質、肽、核酸、寡糖、糖蛋白、脂質、碳水化合物、激素、毒素、其衍生物或其組合。17.試劑盒，其包括(1)連接到固體支持物的生物素結合化合物；(2)修飾的生物素化合物，其結合或連接到至少一種生物實體，或試劑，所述試劑用于用修飾的生物素生物素化生物實體；和(3)游離生物素或其衍生物，其中所述修飾的生物素化合物對鏈霉抗生物素的親和力小于生物素對鏈霉抗生物素的親和力；且生物素對所述修飾的生物素結合化合物的親和力小于生物素對鏈霉抗生物素的親和力。18.權利要求17所述的試劑盒，其中所述生物素結合化合物是硝基-鏈霉抗生物素。19.權利要求17所述的試劑盒，其中所述修飾的生物素包括脫硫生物素、DSB-X生物素或其衍生物。20.權利要求17所述的試劑盒，其中所述固體支持物包括磁性顆粒。21.試劑盒，其包括(1)連接到固體支持物的修飾的生物素化合物；(2)修飾的生物素結合化合物，其結合或連接到至少一種生物實體，或試劑，所述試劑用于用修飾的生物素生物素化生物實體；和(3)游離生物素或其衍生物，其中所述修飾的生物素化合物對鏈霉抗生物素的親和力小于生物素對鏈霉抗生物素的親和力；且生物素對所述修飾的生物素結合化合物的親和力小于生物素對鏈霉抗生物素的親和力。22.權利要求21所述的試劑盒，其中所述生物素結合化合物是硝基-鏈霉抗生物素。23.權利要求21所述的試劑盒，其中所述修飾的生物素包括脫硫生物素、DSB-X生物素或其^"生物。24.權利要求21所述的試劑盒，其中所述固體支持物包括磁性顆粒。全文摘要公開在生物素化合物和生物素結合化合物之間的結合的反轉的方法。從鏈霉抗生物素(或抗生物素蛋白)包被的支持物可逆釋放生物素化部分的方法作為實例示出。通過使用修飾的鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白和修飾的生物素如脫硫生物素或其衍生物如DSB-X生物素的組合，使鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白-生物素之間的強相互作用變弱很多。蛋白質，例如抗體，可以用修飾的生物素生物素化。當通過將修飾的生物素結合到修飾的鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白——其結合到固體表面——從而分離該蛋白時，可通過加入游離生物素，將其在非常溫和和快速的條件下釋放。與通過現有技術釋放方法獲得的蛋白質——使用以前可用的釋放方法獲得的蛋白質——相反，使用本文公開的方法獲得的蛋白質將保持它們的天然構象。也描述在多種過程中應用本方法，所述過程包括細胞分離方法和檢測、識別、測定、純化、分離和/或分開靶蛋白質或核酸分子的技術。文檔編號C12N5/10GK101622340SQ200780047089公開日2010年1月6日申請日期2007年11月15日優先權日2006年11月15日發明者A·紐勞特,L·諾德伯格,O·布雷克,P·索格申請人:茵維特羅根戴納股份公司