新型漆酶、組合物及使用方法

專利名稱：：新型漆酶、組合物及使用方法新型漆酶、組合物及〗吏用方法相關申請的交叉引用漆酶可在許多工業中被廣泛應用，包括洗滌劑工業、造紙工業、紡織品工業和食品工業。一個應用中，將酚氧化酶用作在洗滌劑清洗時從衣服上去污(如食物污漬)的助劑。已知由多種真菌產生漆酶，該真菌包括下述屬(genii)的種，曲霉屬()、脈孢菌屬(yVeMms/wm)、柄抱殼屬(iWos/wm)、葡萄孢屬(5Wo^/s)、側耳屬()、Fo/7i&s、射脈菌屬(」P似e&Vi)、栓菌屬()、多孔菌屬(尸《，(^7WMS)、葡萄穗霉屬(^"c/^6^ow)、3絲核菌屬(及/i&octow/")、雙極霉屬(5&o/fl/^)、彎孢屬(C"rv"/flnVi)、殼單孢屬(J附ems/7w/w附)、和香蒜屬。然而,仍舊需要在多種應用中具有不同性能鐠的漆酶。對于許多應用，可以通過使用介體(也被稱作增強劑)來提高漆酶的氧化效力。本領域已知包括漆酶和介體的體系是漆酶-介體體系(LMS)。相同的化合物也可以用于活化或起始漆酶的作用。本文所述為新型漆酶、編碼該漆酶的核酸序列以及表達該漆酶的載體和宿主細胞。附圖簡要說明圖1是實施例7中使用的木霉屬(7>/c^fe"/Mfl)表達質粒pTrex3g-漆酶A的示意圖。可用本文描述的其他漆酶基因代替漆酶A基因。13圖2是實施例8a中使用的曲霉屬表達質粒pKB401的示意圖。可用本文描述的其他漆酶基因代替漆酶B基因。圖8是柱狀圖，示出使用梭孢殼屬(T7^tov/")、毀絲霉屬()和下皮黑孔屬(OfTe")的物種的漆酶和多種介體在pH5漂白可溶性龍藍的結果。圖10是在60°C和pH6時，作為介體濃度和酶濃度的函數的重組漆酶D和丁香酰胺介體的總色差圖。22圖11是在60°C和pH6時，作為介體濃度和酶濃度的函數的重組漆酶D和丁香腈(syringonitrile)介體的總色差圖。發明具體說明出于描述和公開可與本發明聯合使用的組合物和方法學的目的，本文引用的所有出版物通過明確地引用作為參考。I.漆酶和漆酶相關的酶por/o;ps/ss^6ver附/5/wm)、粗皮靈芝(GWif^fef附fl^S"鼎fiffle)和木霉屬。6[27此外，可通過這才羊的方法產生漆酶或漆酶相關的酶，該方法包括在允許漆酶表達的條件下，于培養基中培養宿主細胞，并且從培養物中回收漆酶，所述宿主細胞轉化有攜帶編碼所述漆酶的DNA序列以及允許編碼該漆酶的DNA序列表達的DNA序列的重組DNA栽體。用于培養轉化后的宿主細胞的培養基可為任何適于生長所討論的宿主細胞的常規培養基。可方便地將表達了的酶分泌到培養基中并且可通過>^知的方法從其中回收該酶，該方法包括通過離心或過濾從培養基中分離細胞，利用諸如硫酸銨的鹽沉淀培養基中的蛋白質性質的組分，隨后通過層析方法如離子交換層析、親和層析等進行回收。本文的術語"同一性百分比"指使用序列比對程序比對時，編碼同一性水平。可以用于確定兩序列間同一性的示例性計算機程序包括但不限于BLAST禾呈序##，例如BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，7>眾可從互聯網網址www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST獲得。也參見Altschul等人，19卯以及Altschul等人，1997。優選地，介體是4-氰基-2，6-二甲氧基苯酚、4-甲酰胺基-2，6-二曱氧基苯酚或其N-取代的衍生物，例如4-(N-曱基曱酰胺基)-2，6-二甲氧基苯酚、4-[N-(2-羥乙基)甲酰胺基1-2，6-二曱氧基苯酚或4-(N，N-二曱基曱酰胺基)-2，6-二曱氧基苯酴。上述式中A可放置在羥基的間位而非放置在如示出的對位上。[44I具體實施方式中，介體可為乙酰丁香酮、丁香酸甲酯、丁香酸乙酯、丁香酸丙酯、丁香酸丁酯、丁香酸己酯或丁香酸辛酯。優選地，介體為4-氰基-2，6-二甲氧基苯酚、4-甲酰胺基-2，6-二甲氧基苯酚或其N-取代的衍生物，例如4-(N-曱基甲酰胺基)-2，6-二曱氧基苯酚、4-[N-(2-羥乙基)甲酰胺基]-2，6-二甲氧基苯酚、或4-(N，N-二甲基甲酰胺基)-2，6-二甲氧基苯酚。本發明的介體可以0.005-1000nmole/g粗斜棉布的濃度存在，優選0.05-500fimole/g粗斜棉布，更優選0.5-100jimole/g粗斜棉布。可通過熟練技術人員已知的方法如WO97/11217、WO96/12845和US5752980所/〉開的那些來制備介體。III.實用性漆酶的工業應用包括紙漿和紙的漂白以及諸如龍藍染色的粗斜棉布織物的紡織品漂白。也發現了漆酶在染發中是有用的(參見例如WO95/33836和WO95/33837)。歐洲專利No.0504005公開了漆酶可以用于染色羊毛。本文描述的漆酶可以用于飼料領域。例如，本文展示的漆酶可以單獨用作飼料添加劑或用作飼料添加劑的一部分而旨在增加用于任何種類的動物(例如雞、牛、豬、魚和寵物)的營養價值；和/或用作加工植物材料和食品工業副產品的加工助劑而旨在產生適合作為飼料原材料的材料/產品o本文描述的漆酶可以用于隱形眼鏡清潔領域。例如，該漆酶可以用于隱形眼鏡的清洗、存放、消毒和/或保存。本文描述的漆酶可以用于個人護理領域。例如，該漆酶可以用于制備用于人的個人產品如香氛，和用于人的皮膚護理、毛發護理、口腔衛生、個人清潔和除臭劑和/或止汗劑的產品。本文展示的酶可以用于例如，染發和/或漂白，指曱染色和/或漂白；皮膚染色和/或漂白；表面修飾(例如作為偶聯劑)；作為抗微生物劑；用于除味；牙齒美白等。本文描述的漆酶可以用于清潔領域。例如，該漆酶可以用于洗衣房項目如衣服或織物的清潔、處理或護理；用于家用硬表面的清潔；用于盤亞護理，包括洗碗機應用；和用于皂條和液體和/或合成表面活性劑棒和液體。本i^艮示的酶可以用于例如去污/脫色，和/或用于除味，和/或用于衛生處理等。本文描述的漆酶可以用于廢水處理領域。例如，該漆酶可以用于著色化合物的脫色；用于酚性成分的解毒；用于抗微生物活性(例如用于水循環中)；用于生物修復等。漆酶介體可以用做衛生處理劑和抗微生物劑(如木材保護、洗滌劑)。該介體可獨立于酶使用或與酶結合使用。如本文所使用，"清潔組合物，，和"清潔制劑"指可用于從待清潔的項目(如織物等)除去不想要的化合物的組合物。該術語包含任何被選捧用于所想要的特定類型清潔組合物和該產品形式(如液體、凝膠、顆粒或噴霧組合物)的材料/化合物，只要該組合物與漆酶和該組合物中使用的其他酶兼容。考慮待清潔的表面、項目或織物，以及在使用時針對清潔條件所期望的組合物形式，可容易地進行清潔組合物材料的特定選擇。該術語還指任何適于清潔和/或漂白任何物體和/或表面的組合物。該術語旨在包括但不限于洗滌劑組合物(例如液體和/或固體衣物洗滌劑和細織物洗滌劑；硬表面清潔制劑，例如用于玻璃、木材、陶瓷和金屬拒臺面和窗戶；地毯清潔劑；烤箱清潔劑；和紡織品及衣物預去污劑(pre-spotter)，以及盤皿洗滌劑)。如本文使用，術語"洗滌劑組合物"和"洗滌劑制劑"用于指旨在用于清潔污染的物體的清洗介質中所使用的混合物。一些實施方式中，該術語用于指洗滌織物和/或衣服的洗滌劑(例如"衣物洗滌劑，，)。替代的實施方式中，該術語指其他洗滌劑，如用于清潔盤皿、刃具等的那些(如"洗碗洗滌劑")。當前考慮的組合物并不旨在局限于任何特定的洗滌劑制劑或組合物。事實上，除了漆酶，該術語旨在包括含有表面活性劑、轉25移酶、水解酶、助洗劑(builder)、漂白劑、漂白活化劑、漂白粉和熒光染料、結塊抑制劑、掩蔽劑、酶活性劑、抗氧化劑和增溶劑的洗滌劑。使用市售可得的漆酶獲得四條肽序列AIGPVADLHI(SEQIDNO.19)、MLTPTSI(SEQIDNo.20)、TVGGPA(SEQIDNo.21)和YSFVLNANQP(SEQIDNO.22)。純化該市售可得的漆酶。N-末端測序得到SEQIDNo.19。用胰蛋白酶對純化后的樣品進行蛋白水解消化。通過凝膠電泳分離片段，選擇3條條帶并手工收集。對于每一條帶進行肽測序并得到SEQIDNo.20、21和22。實施例2a.來自ATCC20013菌林的單色下皮黑孔菌漆酶A基因的克隆[70為了從ATCC20013菌林克隆漆酶A基因，兩條引物分別根據獲自ATCC20013菌林的漆酶B基因的DNA序列(參見實施例3a)設計并自Invitrogen獲得TTCGCAGGTCAACGATATTC(SEQIDNo.35)以及根據獲自CBS115.075菌林的漆酶A基因(參見實施例2c)設計并自Invitrogen獲得GTTAGGTGGTTGAAGGATTG(SEQIDNO.36)。在含有獲自ATCC20013菌林的基因組DNA作為模板的highTPCR反應中使用該引物(參見實施例3)。使用來自Qiagen的QIAquick離心柱純化PCR片段并使用TOPO克隆試劑盒(Invitrogen)將其克隆到pTOPO質粒。使用Ready-To-GoPCR珠(GEHealthcare)擴增22個克隆并且對3條PCR片段(2-1、2-3和2-6)測序。SEQIDNo.37列出了來自ATCC20013的漆酶A基因的1316bpDNA序列。b.來自CBS154.29菌抹的單色下皮黑孔菌漆酶A基因的克隆[71為了從CBS154.29菌林克隆漆酶A基因，兩條引物分別根據獲自CBS115.075菌林的漆酶A基因(參見實施例2c)設計并自Invitrogen獲得CACCAGCATGAGCTCAAAGCTAC(SEQIDNo.45)和獲得引物SEQIDNo.36。在含有獲自CBS154.29菌林的基因組DNA模板、dNTP、引物和lx緩沖液中4%DMSO的HerculasePCR反應中使用該引物。將該PCR混合物加熱至98。C持續4分鐘使該DNA模板變性。將HerculaseII酶(Stratagene)加入該試管中并在下述程序循環30次進行PCR反應98。C持續30秒，50。C持續30秒和72。C持續2分鐘。在72。C完成最后的延伸5分鐘并且將反應冷卻至4°C。使用QIAquick離心柱純化PCR片段并將其克隆到pENTR/D-TOPO載體(Invitrogen)中。使用Ready-To-GoPCR珠擴增15個克隆并且從兩個克隆(pENTR15-24和pENTR15-30)分離質粒及對DNA模板測序。獲得來自CBS154.29的漆酶A基因的2374bpDNA序列。SEQIDNo.3列出了該DNA序列而SEQIDNo.4列出了翻譯后的蛋白質序列。c.來自CBS115.075菌林的單色下皮黑孔菌漆酶A基因的克隆[72]將根據來自ATCC20013菌林的漆酶B基因(參見實施例3a)的引物CAATCTATGACCGTAGATTC(SEQIDNo.39)和引物NNNNNNNNNNCGATCG(SEQIDNo.38)(其中N表示所有四種核苦酸(A、T、C和G)的混合物)用于lowTPCR反應(參見實施例3a)。自單色下皮黑孔菌菌林(CBS115.075)提取基因組DNA并在第一輪lowTPCR反應中用作模板。用QIAquick離心柱純化該PCR片段并將其在第二輪lowTPCR反應中用作模板，該第二輪lowTPCR反應使用根據來自ATCC20013菌林的漆酶B基因(參見實施例3a)的引物SEQIDNo.35和引物SEQIDNo.38。使用TOPO克隆試劑盒將該PCR片段克隆到pTOPO質粒。使用Ready-To-GoPCR珠擴增16個克隆并且對3個克隆的PCR片段(B2#l、B2#4和B2#ll)測序。為了克隆漆酶B基因的3，末端，設計并自Invitrogen獲得引物CCTCACCTGTATTGGCACAG(SEQIDNo.33),其和引物SEQIDNo.31用于第一輪的lowTPCR反應。用QIAquick離心柱純化該PCR片段并將其在第二輪lowTPCR反應中用作模板，該第二輪的lowTPCR反IDNo.31。使用TOPO克隆試劑盒將該PCR片段克隆到pTOPO質粒。使用Ready-To-GoPCR珠擴增16個克隆并且對4個克隆的PCR片段(C3、C4、C5和C7)觀'J序。設計并自Invitrogen獲得兩條引物CACCGCGATGTCTCTTCTTCGTAG(SEQIDNO.46)和TGRAGRTGGAASGGATGWGGTCC(SEQIDNO.47)其中R表示核苷酸A和G的混合物，S表示核苷酸C和G的混合物，而W表示核苷酸A和T的混合物。將該兩條引物用于highTPCR反應。使用QIAquick離心柱純化PCR片段(A3)。使用TOPO克隆試劑盒將該PCR片段克隆到pTOPO質粒。使用Ready-To-GoPCR珠擴增16個克隆并且對2個PCR片段(A3#l和A3#5)測序。設計并自Invitrogen獲得引物GTAATCATGTATCACCTGGGCTCAAGG(SEQIDNO.50)。將該引物與引物SEQIDNo.46用于HerculasePCR反應(參見實施例2b)。用QIAquick離心柱純化該PCR片段。使用TOPO克隆試劑盒將該PCR片段克隆到pTOPO質粒。使用Ready-To-GoPCR珠分析17個克隆并且對來自4個克隆的PCR片段Ul、#2、#4和#5)測序。從兩個克隆(pENTR-漆酶BCBS115075#1和pENTR-漆酶BCBS115075#3)制備質粒DNA并且對兩質粒測序。SEQIDNo.5列出了CBS115.075菌林的漆酶B的2173bpDNA序列而SEQIDNo.6列出了翻譯后的蛋白質序列。實施例4、來自CBS154.29菌林的單色下皮黑孔菌漆酶C基因的克隆[83根據翻譯后的肽序列GQRYSFV(SEQIDNo.52)設計引物ACGAACGAGTANCGTTGNCC(SEQIDNo.51)，其中N表示所有四種核苷酸(即A、T、C和G)的混合物。這一肽在漆酶A基因和漆酶B基因之間是保守的(參見實施例2和3)。該引物獲自Invitrogen并與引物SEQIDNo.24用于lowT反應。使用QIAquick離心柱純化該PCR片段。使用TOPO克隆試劑盒將該PCR片段克隆到pTOPO質粒。使用Ready-To-GoPCR珠分析33個克隆并且對來自4個克隆的PCR片段(#12、#5a、#19a和弁21a)測序。SEQIDNo.ll列出了1080bp的CBS154.29菌林的漆酶C基因序列而SEQIDNo.12列出了翻譯后的蛋白質序列。實施例5a.來自CBS115.075菌林的單色下皮黑孔菌漆酶D基因的克隆[84為了克隆來自CBS115.075菌抹的漆酶D基因的5，末端，根據來自CBS154.29菌林的漆酶D基因(參見實施例5b)設計引物(AACACGGAGACAGTCCAAAC，SEQIDNO.62)。將該引物與引物SEQIDNo.56用于highTPCR反應。使用QIAquick離心柱純化該PCR片段并測序。根據肽序歹'JLNANQP(SEQIDNo.54)設計引物CTGGTTGGTTNGCATTNAG(SEQIDNo.53)。該引物獲自Invitrogen并與引物SEQIDNo.26用于lowTPCR反應。使用QIAquick離心柱純化該PCR片段并使用TOPO克隆試劑盒將該PCR片段克隆到pTOPO質粒。使用Ready-To-GoPCR珠分析18個克隆并且對來自克隆的PCR片段測序。為了克隆漆酶D基因更多的3，和5'末端，使用反向PCR。用EcoRV限制性酶在37。C消化0.4照來自下皮黑孔屬CBS154.29菌林的基因組DNA1.5小時。用乙醇沉淀經消化后的基因組DNA片段。在100jd體積中用T4DNA連接酶連接線性DNA片段5小時以上。將連接后的DNA片段加熱至100。C持續3分鐘并用作第一輪highTPCR反應中的DNA模板，該第一輪highTPCR反應使用兩條引物TGACCGGTGATCAACGTCCC，SEQIDNO.56和GGCGCAGACATCAATCACAG，SEQIDNo.57。使用QIAquick離心柱純化該PCR片段并將其用作第二輪highTPCR反應中的DNA模板，該第二輪highTPCR反應使用兩條引物TCTTCAGCATCAACAACGCC,SE()IDNO.58和TCCGGCAAGCACGGTTGG,SEQIDNo.59。使用QIAquick離心柱純化來自第二輪PCR反應的PCR片段并測序。33[89]為了克隆來自CBS154.29菌林的漆酶D基因更多的3'末端，使用反向PCR。用Smal限制性酶在37。C消化0.4照來自下皮黑孔屬CBS154.29菌林的基因組DNA1.5小時。用乙醇沉淀經消化后的基因組DNA片段。在100nl體積中用T4DNA連接酶連接線性DNA片段5小時以上。將連接后的DNA片^口熱至100。C持續3分鐘并用作第一輪highTPCR反應中的DNA模板，該第一輪highTPCR反應使用引物TCGTCTTCGCTGAGGGCATC，SEQIDNO.60和引物SEQIDNo.56。使用QIAquick離心柱純化該PCR片段并將其用作第二輪highTPCR反應中的DNA模板，該第二輪highTPCR反應使用引物CAGACCGCTGCAGCCAACCC，SEQIDNo.61和引物SEQIDNo.59。使用QIAquick離心柱純化來自第二輪PCR反應的PCR片段并使用TOPO克隆試劑盒將該其克隆到pTOPO質粒。使用Ready-To-GoPCR珠分析21個克隆并且對來自克隆弁Ce11和弁Cel4的PCR片段測序。SEQIDNo.13列出了2809bp的來自CBS154.29.49菌林的漆酶D基因序列而SEQIDNo.14列出了翻譯后的蛋白質序列。實施例6、來自CBS154.29菌林的單色下皮黑孔菌漆酶E基因的克隆[90將引物SEQIDNo.53和引物SEQIDNo.26(參見實施例5b)用于lowTPCR反應。使用QIAquick離心柱純化該PCR片段并使用TOPO克隆試劑盒將該PCR片段克隆到pTOPO質粒。使用Ready-To-GoPCR珠分析18個克隆并且對來自克隆弁Ael7的PCR片段測序。SEQIDNo.17列出了1163bp的來自CBS154.29.49菌林的漆酶E基因序列而SEQIDNo.18列出了翻譯后的蛋白質序列。實施例7、漆酶A基因在木霉屬中的表達為了構建用于CBS菌林115.075的漆酶A基因的表達質粒，在含有獲自115.075菌林的基因組DNA模板、dNTP和1x緩沖液中4%DMSO的HerculasePCR反應中使用兩條引物(SEQIDNo.45和SEQIDNo.36)。34將該PCR混合物加熱至98。C持續4分鐘使該DNA纟莫板變性。將HerculaseII酶(Stratagene)加入該試管并在98。C持續30秒，50。C持續30秒和72。C持續2分鐘循環30次進行PCR反應。在72。C完成最后的延伸5分鐘并且將反應冷卻至4°C。使用QIAquick離心柱純化PCR片段并克隆到pENTR/D-TOPO載體。使用Ready-To-GoPCR珠擴增15個克隆并且從pENTR-漆酶A-CBS115.075#11克隆分離質粒DNA。對漆酶A基因部分進行測序以確認漆酶A基因的PCR擴增的保真度。在10^1含有6.5^1TE、1^1pTrex3g栽體(0.1mg/ml)和2^1Clonasell的LBclonaseII反應(Invitrogen)中，將pENTR畫漆酶A-CBS115.075#11質粒(50ng)轉化為表達質粒pTrex3g-漆酶A(圖1)。通過DNA測序確i人該表ii^粒并用基因槍將其轉化至木霉菌菌林。使用來自Bio-Rad(Hercules,CA)的BiolisticPDS-1000/he顆粒遞送系統，按照制造商說明書(參見WO05/001036和US2006/0003408)通過基因槍轉化法完成木霉菌菌林的轉化。選擇66個轉化體并轉移至新平板上。在30。C，于30mlProflo培養基中總共15個穩定的轉化體生長持續2天。將5ml來自Proflo培養基2天齡培養物轉移至50ml含有lmM銅的限定培養基。在28。C使培養物生長5天。離心培養液并將上清用于ABTS檢測。實施例8a.漆酶B基因在曲霉屬中的表達優化的合成漆酶B基因(SEQIDNO:67):ACTAGTGTCGCCGTTTACAAACGCGCAATCGGTCCCGTCACTGACCTGCA50TATTGTGAACCAGAATCTCGACCCCGATGGTTTCAACCGCCCCACTGTCC100TCGCAGGTGGTACTTTCCCCGGTCCTCTGATTCGTGGTAACAAGGGAGAT150AACTTTAAAATTAATGTGATTGACGACTTGACAGAGCACAGCATGCTCAA200GGCTACGTCCATCCACTGGCATGGCTTCTTCCAGAAGGGAACCAACTGGG250CCGATGGCCCCGCCTTTGTCACCCAATGTCCTATCACATCAGGAAACGCC300TTCCTGTACGATTTCAACGTTCCGGACCAAGCTGGTACTTTCTGGTACCA350CAGCCATCTCTCTACACAGTACTGTGACGGTCTTCGTGGTGCCTTTGTCG400TCTACGATCCTAATGATCCCAACAAGCAACTCTACGATGTTGATAACGGC450AACACCGTGATTACCTTGGCTGATTGGTACCATGCCCTTGCTCAGACTGT500CACTGGTGTCGCAGTCTCTGATGCAACGTTGATCAACGGATTGGGACGTT550CGGCCACCGGCCCCGCAAATGCCCCTCTGGCGGTCATCAGCGTCGAGCGC600AATAAGCGCTATCGTTTCCGATTGGTTTCTATTTCTTGCGACCCTAACTT650TATTTTCTCAATTGACCACCACCCCATGACCGTCATTGAGATGGACGGTG700TTAATACCCAATCTATGACCGTAGATTCGATCCAAATCTTCGCAGGTCAA750CGATACTCATTTGTCATGCAAGCCAACCAACCAGTTGGAAATTACTGGAT800CCGCGCTAAACCTAATGTTGGCAACACAACTTTCCTTGGAGGCCTGAACT850CCGCTATCTTGCGATACGTGGGAGCCCCTGACCAAGAACCGACCACTGAC900CAAACACCCAACTCTACACCGCTCGTTGAGGCGAACCTGCGACCCCTCGT950CTACACTCCTGTGCCGGGACAGCCATTCCCTGGCGGTGCTGATATCGTCA1000AGAACTTGGCTTTGGGTTTCAATGCCGGGCGTTTCACAATCAATGGAGCG1050TCCCTCACACCTCCTACAGTCCCTGTCCTGCTCCAGATCCTCAGCGGTAC1100TCACAATGCACAGGATCTTCTCCCGGCAGGAAGCGTGATCGAACTTGAAC1150AGAATAAAGTTGTCGAAATCGTTTTGCCCGCTGCGGGCGCCGTTGGCGGT1200CCTCATCCTTTTCACTTGCATGGTCACAATTTCTGGGTGGTTCGTAGCGC1250CGGTCAAACCACATACAATTTCAATGATGCTCCTATCCGTGATGTTGTCA1300GCATTGGCGGTGCAAACGATCAAGTCACGATCCGATTTGTGACCGATAAC1350CCTGGCCCATGGTTCCTTCACTGTCACATTGACTGGCATTTGGAGGCTGG1400ATTCGCTGTCGTCTTTGCGGAGGGAATCAATGGTACTGCAGCTGCTAATC1450CCGTCCCGGCGGCTTGGAATCAATTGTGCCCGTTGTACGATGCCTTGAGC1500CCGGGTGATACATGAGGCGCGCC1523其編石馬漆酶B基因，由McLabInc.(MolecularCloningLaboratories,384OysterPointBlvd，Suite15,SouthSanFrancisco,CA94080)合成。用限制性酶Spel和Ascl消化合成的質粒DNA并從凝膠中分離1.5kbDNA片段，將其克隆到也由Spel和Ascl消化的pTrex4載體產生表達質粒(pTrex4-漆酶Bopt)，該質粒與圖4示出的表達質粒類似，除了用密碼子優化的漆酶B基因代替(非優化的)漆酶B基因。將該質粒用基因槍轉化到木霉屬菌林。產生30個以上的轉化體并將其轉移至新板。選擇總計20個穩定的轉化體并將菌絲體轉移至30ml含有ImM銅的限定培養基。在28。C生長培養物4天。離心培養液并將上清用于ABTS檢測。40實施例11a.漆酶D基因在木霉屬中的表達為了構建用于CBS115.075菌林的漆酶D基因的表達質粒，在含有獲自CBS115.075菌林的基因組DNA模板的HerculasePCR反應(參見實施例2b)中4吏用兩條引物(SEQIDNo.63和SEQIDNo.64)。使用QIAquick離心柱純化PCR片段并將其克隆到pENTR/D-TOPO載體。使用Ready-To-GoPCR珠擴增16個克隆并且對4個質粒DNA測序。選擇pENTR-漆酶DCBS115.075弁2克隆。在lOfil含有6.5^ilTE、lplpTrex3g載體(0.1mg/ml)和2jilClonasell的LBclonaseII反應中，將pENTR誦漆酶DCBS115.075#2質粒(50ng)轉化為表達質粒pTrex3g-漆酶D，該表達質粒與圖l示出的表達載體類似，除了用密碼子優化的漆酶D基因代替漆酶A基因。通過DNA測序再次確認該表達質粒并用基因槍將其轉化至木霉屬菌林。選擇45個轉化體并轉移至新板。將來自28個穩定轉化體的菌絲體轉移至30ml含有0.5mM銅的限定培養基。在28。C使培養物生長4天。離心培養液并將上清用于ABTS檢測。b.漆酶D基因與CBH1融合在木霉屬中的表達DNA(SEQIDNO:70):ACTAGTGTCGCCGTTTACAAACGCGCTATTGGACCAGTTGCTGATCTGCA50CATCGTTAACAAGGATTTGGCCCCAGACGGCGTCCAGCGCCCAACTGTTC100TGGCCGGTGGAACTTTTCCGGGCACGCTGATTACCGGTCAAAAGGGCGAC150AACTTCCAGCTGAACGTGATTGATGACCTGACCGACGATCGCATGTTGAC200CCCTACTTCGATCCATTGGCATGGTTTCTTCCAGAAGGGAACCGCCTGGG250CCGACGGTCCGGCTTTCGTTACACAGTGCCCTATTATCGCAGACAACTCC300TTCCTCTACGATTTCGACGTTCCCGACCAGGCGGGCACCTTCTGGTACCA350CTCACACTTGTCTACACAGTACTGCGACGGTCTGCGCGGTGCCTTCGTTG400TTTACGACCCCAACGACCCTCACAAGGACCTTTATGATGTCGATGACGGT450GGCACAGTTATCACATTGGCTGACTGGTATCACGTCCTCGCTCAGACCGT500TGTCGGAGCTGCTACACCCGACTCTACGCTGATTAACGGCTTGGGACGCA550GCCAGACTGGCCCCGCCGACGCTGAGCTGGCCGTTATCTCTGTTGAACAC600AACAAGAGATACCGTTTCAGACTCGTCTCCATCTCGTGCGATCCCAACTT650CACTTTTAGCGTCGACGGTCACAACATGACGGTTATCGAGGTTGATGGCG700TGAATACCCGCCCTCTCACCGTCGATTCCATTCAAATTTTCGCCGGCCAG750CGATACTCCTTTGTGCTGAATGCCAATCAGCCCGAGGATAACTACTGGAT800CCGCGCTATGCCTAACATCGGACGAAACACCACTACCCTTGATGGCAAGA850ATGCCGCTATCCTGCGATACAAGAACGCCAGCGTTGAGGAGCCCAAAACC900GTCGGAGGACCCGCGCAGAGCCCATTGAACGAGGCCGACCTGCGACCTCT950GGTGCCCGCTCCTGTCCCTGGCAACGCAGTTCCTGGTGGTGCGGACATCA1000ACCACCGCCTGAACCTGACATTCAGCAACGGCCTCTTCTCTATCAATAAC1050GCATCATTTACAAACCCCAGCGTCCCTGCCTTGTTGCAGATTCTTTCCGG1100CGCACAAAACGCTCAGGATCTGCTTCCCACCGGTTCTTATATCGGCTTGG1150AGTTGGGCAAGGTCGTTGAACTCGTGATCCCTCCCTTGGCCGTTGGTGGC1200CCCCATCCATTCCACTTGCACGGCCACAACTTTTGGGTCGTCCGAAGCGC1250TGGTTCTGACGAGTATAATTTCGACGATGCAATTTTGCGCGACGTGGTCA1300GCATTGGCGCGGGAACTGACGAGGTTACTATCCGTTTTGTCACTGATAAC1350CCAGGCCCTTGGTTCCTCCATTGCCACATCGACTGGCACCTCGAAGCCGG1400CCTCGCCATTGTTTTCGCCGAAGGCATCAATCAAACCGCAGCCGCCAACC1450CGACTCCACAGGCCTGGGACGAACTCTGCCCCAAGTATAACGGACTCTCC1500GCTTCCCAGAAAGTGAAGCCCAAGAAGGGAACAGCCATCTAAGGCGCGCC1550其編碼漆酶D基因(才艮據來自CBS115.075的基因)，由DNA2.0Inc.(1455AdamsDrive,MenloPark,CA94025)合成。用限制性酶Spd和Ascl消化合成的質粒DNA并從凝膠中分離1.5kb的DNA片段，將其克隆到也由Spel和Ascl消化的pTrex4載體產生表達質粒(pTrex4-漆酶Dopt)。將該質粒用基因槍轉化到木霉屬菌林。將40個轉化體轉移至新板。選擇總計24個穩定的轉化體并將菌絲體轉移至30ml含有0.5mM銅的限定培養基。在28。C,生長培養物4天。離心培養液并將上清用于ABTS檢測。實施例13、漆酶D基因使用密碼子優化的合成基因與BCE103融合在芽孢桿菌屬中的表達在兩種pH值，評估與低分子量介體組合的源自毀絲霉菌屬(Afyce/—Zrtom)(DeniliteII，Novozymes，Bagsvaerd，丹麥)、梭抱殼屬(EcostoneLCCIO，ABenzymes,Darmstadt,德國)和下皮黑孔屬物種的漆酶其漂白溶解的錠藍的能力。在pH值為5和7下，使用3種不同漆酶，在96孔微滴定板中，按實施例14所述進行溶解的靛藍的漂白。所用介體為芥子酸、4-甲酰胺基-2，6-二甲氧基苯酚(SA)、甲基4-乙酰丁香酸酯(AMS)、丁香酸甲酯(MS)和2，2，-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-64酸)(ABTS)。圖8和9示出了pH值為5和7時，分別使用源自毀絲霉菌屬、梭孢殼屬和下皮黑孔屬物種的三種漆酶對于可溶貧藍漂白的結果。這些數據列表于表2和3。表2、在pH5，介體濃度為250nM下，使用來自梭孢殼屬、毀絲霉菌屬和下皮黑孔屬物種的漆酶進行可溶欷藍漂白后，在600nm處相對于對照的吸光度變化介體漆酶梭孢殼屬毀絲霉菌屬下皮黑孔屬AA600標準差AA600標準差AA600標準差對照100.01600.01000.005芥子酸0.0680.0190.1570.0200.2400.007SA0.1700.0110.2540.0130,1420.005AMS0.1000.0120.1170.0070.0280.003MS(AB)0.0480.0110.0570.0070.0050.011MS(Denilite)0.0500.0130.0610.0070.0430.013ABTS0.2340.0120.2670.0080.3290.031對照2-0.0070.017-0.0110.007-0.0060.005表3、在pH7、介體濃度為250nM下，使用來自梭孢殼屬、毀絲霉菌屬和下皮黑孔屬物種的漆酶進行可溶錠藍漂白后，在600nm處相對于對照的吸光度變化介體漆酶梭孢殼屬毀絲霉菌屬下皮黑孔屬46<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>實施例16、純化和比活性的確定在14升發酵罐中，使用在名稱為"SignalS叫uencesandco-expressedchaperonesforimprovedheterologousproteinproductioninahostcell"的共同待決申請US60/984，430(代理W^J案巻號No.GC993P，2007年11月1日遞交)中所述的表達體系來表達漆酶D優化的基因(SEQIDNO:70)。在184小時收集發酵液并通過超濾法(UFC20070245)濃縮。將濃縮物滲濾(diafilter)到25mM醋酸鈉，pH4.0緩沖液中。然后將500ml滲濾后的UFC樣品上樣到含有PorosHS-20樹脂(AppliedBiosystems，20X275mmcolumn)的、以25mM醋酸鈉緩沖液，pH4.0平衡的離子交換柱中。用10倍柱體積的25mM醋酸鈉緩沖液,pH4.0沖洗柱。使用在25mM醋酸鈉緩沖液，pH4.0中從40mM至80mM氯化鈉的鹽梯度(12倍柱體積)從該柱洗脫漆酶D蛋白質。收集含有漆酶活性的級分并使用具有10K膜的Amicon400mL攪拌元件進一步濃縮。使用BSA作為標準，通過SDS蛋白質^測量總蛋白質為4mg/ml(>卯％純度)。用水將漆酶樣品稀釋10,000倍并在室溫下存放18小時和在4。C存放大于24小時。測量ABTS活性為8570單位/ml。然后通過用8570單位/ml除以4mg/ml計算重組漆酶D的比活性得到2140單位/ml蛋白質，這比葡萄穗霉屬漆酶(16U/mg)的活性高100倍，參見Mander等人，Appl.Environ.Microbiol.(2006)72:5020-5026)。因此，此酶由于高比活性而導致向環境中釋放的銅比其他漆酶(如葡萄穗霉屬漆酶)低。實施例17、用于粗斜棉布漂白的程序介體4-羥基-3，5-二甲氧基苯酚甲酰胺(丁香酰胺，SA)購自PunjabChemicals&CropProtectionLimited(Mumbai，印度)。4-羥基-3，5-二甲氧基節腈(丁香腈，SN)獲自Stereochemical,Inc"(Newark,DE)或PunjabChemicals&CropProtectionLimited(Mumbai，印度)。酵在較低溫度下，重組漆酶D比目前市售可得的漆酶具有更好的性能。漆酶D(存在介體時)在溫度低于60°C，優選在40。C和60。C之間提供漂白作用。因此，該漆酶可對紡織品加工者提供能量益處。實施例19、重組漆酶和介體濃度對于漂白性能的影響(Launder-O-meter)[122在pH6和60'C進行下表的實驗來評估漆酶和介體濃度的影響(用氬氧化鈉4N溶液調整50mM磷酸二氬鈉緩沖液pH)。[123用丁香酰胺(SA)和丁香腈(SN)介體進行實驗。[124向具有5份樣品(7x7cm)的燒杯加入100ml緩沖液。總重為12g(粗斜棉布:液比=1:8)。按下表所示使用漆酶和介體濃度。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表7_<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>[125將作為98%甲醇中275mMSA或SN母液的稀釋液的丁香酰胺或丁香腈介體如下表所示加入每個燒杯。將作為400單位/ml漆酶母液的稀釋液的漆酶按下表所示加入每個燒杯。關閉燒杯并按實施例17所述在60。C加工。按實施例17所述評估該樣本。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>TCD=總色差[126上表和圖10及11示出了需要酶和介體兩者來進行漂白。其也表明在實現一定的漂白水平時酶/介體比例有一定靈活性。實施例20、重組漆酶D對于漂白性能的劑量反應效應(Unimac)[127經石洗的粗斜棉布的漆酶漂白-將重約3kg的12個粗斜棉布車腳按實施例17所述退漿并石洗。石洗后，按照下面工藝進行漆酶處理以10:1液比和pH6(21g磷酸二氫鈉和5g己二酸)和60'C用漆酶和介體處理30分鐘。漆酶處理后，以30:1液比對該粗斜棉布兩次冷水漂洗5分鐘。[128進行下述實驗。丁香酰胺0.33111]\1:<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>丁香腈0.39111]\1:<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>0.439.50.5338.8[129上表示出了結果。這顯示了利用重組漆酶D和酰胺介體，漂白水平非常迅速地變平。酶濃度為0.05和0.25時，獲得相同的漂白水平。對于重組漆酶D和腈介體，漂白水平增加至至多0.4g/l,而這似乎為最佳。[130]應理解，本文描述的實施例和實施方式只用于說明目的并且基于此的多種修改或改變對于本領域技術人員是可以預見的，且其包括在本申請的精神和范圍以及所附權利要求的范圍內。本文引用的所有出版物、專利以及專利申請在此通過整體引用作為參考。權利要求1、一種選自SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18的漆酶以及一種與任何SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16或18具有至少90％同一性的漆酶。2、一種編碼漆酶的核酸序列，其中所述漆酶選自SEQIDNOS.2、4、6、8、10、12、14、16、18以及是與任何SEQIDNOS.2、4、6、8、10、12、14、16或18具有至少卯％同一性的漆酶。3、一種編碼漆酶的核,歹ij，其中所述核^列選自SEQIDNOS.1、3、5、7、9、11、13、15和17。4、一種表達載體，包括權利要求2的核酸序列。5、一種表達栽體，包括權利要求3的核酸序列。6、一種宿主細胞，包括權利要求4的載體。7、一種宿主細胞，包括權利要求5的載體。8、一種漂白溶液中的染料的方法，該方法包括用權利要求l的漆酶以及有效的介體處理在溶液中的染料。9、根據權利要求8的方法，其中介體選自乙酰丁香酮、丁香醛、丁香酰胺、甲基丁香酰胺、2-羥乙基丁香酰胺、丁香酸甲酯、丁香腈、二甲基丁香酰胺和丁香酸。10、一種使用漆酶漂白織物的方法，其改進包括使用權利要求l的漆酵。11、權利要求10的方法，還包括選自乙酰丁香酮、丁香醛、丁香酰胺、甲基丁香酰胺、2-羥乙基丁香酰胺、丁香酸甲酯、丁香腈、二甲基丁香酰胺和丁香酸的介體。12、根據權利要求10的方法，其中用還原染料對織物染色。13、根據權利要求10的方法，其中該織物是纖維素織物、纖維素纖維的混合物或纖維素纖維和合成纖維的混合物。14、根據權利要求10的方法，其中該織物是粗斜棉布。全文摘要本文描述了新型漆酶、編碼該漆酶的核酸序列以及表達該漆酶的載體和宿主細胞。該新型漆酶可與介體結合使用以提供用于漂白粗斜棉布織物的改良方法。文檔編號C12N15/53GK101568640SQ200780047018公開日2009年10月28日申請日期2007年12月12日優先權日2006年12月18日發明者J·C·麥考利夫,王華明申請人:丹尼斯科美國公司