含凝血酶的溶液中的α-凝血酶的穩(wěn)定化方法

專利名稱：：含凝血酶的溶液中的α-凝血酶的穩(wěn)定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含凝血酶溶液中的不穩(wěn)定的a-凝血酶的穩(wěn)定化方法、含有穩(wěn)定化oc-凝血酶的含凝血酶溶液、以及含有該溶液的液狀纖維蛋白原測定用試劑。
背景技術(shù)：
：纖維蛋白原是作為血凝塊的主要蛋白質(zhì)的纖維蛋白的前體物質(zhì)，由肝實質(zhì)細胞產(chǎn)生。生物體中的纖維蛋白原的約80%分布于血漿中(正常成年人中約為200~400mg/dL),其余分布于組織中。纖維蛋白原是含有經(jīng)二硫鍵結(jié)合的3對多肽(Aa,BP和Y)鏈的糖蛋白質(zhì)，Aa，鏈通過凝血酶被分解而形成纖維蛋白，從而起到血栓生成、止血血栓的主要作用。在臨床上，在炎癥中增加，在高度的肝功能障礙、DIC等中減少。作為纖維蛋白原的測定法，有Clauss法(凝血酶添加法)、PT演算法(凝固時間法)、TIA(免疫比濁法)、乳膠法等，一般采用凝血酶添加法，即在加入檸檬酸鈉的血漿試樣中添加凝血酶和氯化鉤，測定凝固的時間，根據(jù)用已知濃度的纖維蛋白原制成的校正曲線，通過計算求出試樣的纖維蛋白原濃度(mg/dL)的方法?？梢栽诶w維蛋白原測定時使用的凝血酶，從作為其前體的凝血酶原中切下肽而形成具有凝固活性的a-凝血酶。已知這種a-凝血酶會自分解成低分子量的不具有凝固活性的P-凝血酶，進而分解成Y-凝血酶，長期保存時，通常進行冷凍干燥。因此，進行了在溶液中進行穩(wěn)定化的一些嘗試，例如，已知有在凝血酶中(l)添加高濃度甘油、多元醇(蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇等)的方法(專利文獻l);(2)添加糖、氨基酸等的方法(專利文獻2)等。但是，這些方法作為液狀纖維蛋白原測定用試劑中的凝血酶的穩(wěn)定化方法，效果并不充分。3作為纖維蛋白原測定用試劑中的凝血酶的穩(wěn)定化方法，已知有在含凝血酶溶液中添加凝血酶拮抗抑制劑的方法(專利文獻3)。但是，該方法的機理在于抑制凝血酶的活性。因此，^吏用該方法時，對于纖維蛋白原測定檢查中具有重要測定意義的纖維蛋白原低濃度試樣，凝固時間極度延遲，因此有時無法進行測定。這一情況不僅會造成單位時間的試樣處理數(shù)降低，而且還會導(dǎo)致因無法測定纖維蛋白原低濃度試樣所致的再檢測的增加，因此該方法不適于緊急檢查。因此，希望開發(fā)出含ot-凝血酶溶液中的a-凝血酶的穩(wěn)定化方法，該方法能夠適用于即使在低濃度的纖維蛋白原試樣中也不會無法進行測定、測定時間的極度延遲少、而且對低濃度試樣的測定值的影響少的液狀纖維蛋白原測定用試劑。專利文獻l:特開昭62-106028專利文獻2:特開昭64-040433專利文獻3:特開2004-19136
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種含凝血酶溶液中不穩(wěn)定的oc-凝血酶的穩(wěn)定化方法、含有穩(wěn)定化oc-凝血酶的含凝血酶溶液以及含有這種溶液的液狀纖維蛋白原測定用試劑。本發(fā)明人等反復(fù)進行了積極的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管以往只認為P-凝血酶、Y-凝血酶僅僅是a-凝血酶的自分解產(chǎn)物，但P-和Y-凝血酶作用于oc-凝血酶的分解活性卻比oc-凝血酶作用于oc-凝血酶的自分解的活性要強。而且還發(fā)現(xiàn)，通過將P-和/或Y-凝血酶相對于總凝血酶的含量抑制到較低的一定范圍內(nèi)，出乎意料的是，能夠?qū)崿F(xiàn)以往認為由于發(fā)生自分解而不穩(wěn)定的oc-凝血酶溶液中的穩(wěn)定化，從而完成了本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明提供一種含凝血酶溶液中的oc-凝血酶的穩(wěn)定化方法，其特征在于，cx-凝血酶含量相對于含凝血酶溶液中的總凝血酶至少為70%以上。根據(jù)本發(fā)明，可以抑制含凝血酶溶液中oc-凝血酶殘留率的降低、活性的降低，提高含凝血酶溶液的保存穩(wěn)定性、品質(zhì)。而且，還可以提高適于緊急檢查的液狀纖維蛋白原測定用試劑的保存穩(wěn)定性、品質(zhì)。圖1:純化凝血酶的10-20%SDS-PAGE圖像。圖的左側(cè)為純化ot-凝血酶的圖像，圖的右側(cè)為純化P-和y-凝血酶的混合物的圖像。而且，A相當于oc-凝血酶，B相當于P-和y-凝血酶。圖2:37x:加速試驗后的oc-凝血酶含量殘留率。以第0周的凝固時間作為100%。圖3:37x:加速試驗后的凝血酶活性。以第0周的凝固時間作為100%。圖4:37"c加速試驗后的試樣1的凝固時間延遲。以第0周的凝固時間作為100%。圖5:37x:加速試驗后的試樣2的凝固時間延遲。以第0周的凝固時間作為100%。具體實施例方式本發(fā)明中，oc-凝血酶含量相對于含凝血酶溶液中的總凝血酶為70%,優(yōu)選80%以上，更優(yōu)選卯％以上。此外，更優(yōu)選相對于含凝血酶溶液中的總凝血酶，oc-凝血酶含量在70%以上且0-和/或y-凝血酶含量小于30%,進一步優(yōu)選oc-凝血酶含量在80%以上且P-和/或y-凝血酶含量小于20%，特別優(yōu)選oc-凝血酶含量在90%以上且0-和/或y-凝血酶含量小于10%。如后述實施例所示，由于隨著P-和y-凝血酶相對于總凝血酶的含量提高，p-和y-凝血酵使溶液中的a-凝血酶的殘留率降低、活性降低，因此本發(fā)明通過提高oc-凝血酶相對于總凝血酶的含量、另一方面抑制P國和y-凝血酶相對于總凝血酶的含量，從而可以提高溶液中的oc-凝血5酶保存穩(wěn)定性、品質(zhì)。本發(fā)明中的所謂凝血酶，是指含有OC-凝血酶的凝血酶，所謂總凝血酶，是指所有oc-凝血酶、p-凝血酶和Y-凝血酶。本發(fā)明中oc-凝血酶相對于總凝血酶的含量，可以采用能夠定量測定凝血酶的公知方法求出oc-凝血酶，P-凝血酶和y-凝血酶的各測定值，用下式(l)求出。oc-凝血酶相對于總凝血酶的含量(％)=(oc-凝血酶測定值/總凝血酶測定值的總和)x100…式(l)而且，同樣地，可以用下式(2)求出P-和/或y-凝血酶相對于總凝血酶的含量。P_和/或y-凝血酶相對于總凝血酶的含量(％)=(P和/或y-凝血酶測定值/總凝血酶測定值的總和)x100…式(2)作為定量測定凝血酶的方法，可以例舉例如通過活性測定法、光密度分析法進行的蛋白定量等，可以是任意的測定方法。而且，還可以適當?shù)卦跍y定前用公知的方法分離并純化a-凝血酶及其分解物。更具體來說，在通過使用合成底物S-2238(第一化學(xué)藥品制)的活性測定法(合成底物法)求出a-凝血酶含量時，可以用公知的離子交換樹脂分離a-，P-和Y-凝血酶后，分別測定各成分對S-2238的分解活性，求出a-凝血酶活性相對于總凝血酶活性的活性比率(％)。此外，使用光密度分析法時，可以通過公知的蛋白質(zhì)分析用電泳分離成a-，p-和Y-凝血酶這三種成分，通過光密度分析法求出各蛋白質(zhì)含量后，求出a-凝血酶的蛋白質(zhì)含量相對于總凝血酶的蛋白質(zhì)含量的比率(％)。在本發(fā)明中使用的凝血酶可以是人等動物來源的凝血酶、通過基因工程法制備的凝血酶、或市售的藥品。作為本發(fā)明中使用的凝血酶的制備方法，可以例舉公知的蛋白質(zhì)的分離和純化法，例如過濾、清洗、干燥、重結(jié)晶、各種柱色譜、hplc、6液液分配等。更具體來說，可以例舉陽離子交換樹脂等離子交換樹脂、芐脒樹脂等親合樹脂、超濾膜、凝膠過濾等。此外，通過將這些方法適當組合以調(diào)整提高OC-凝血酶相對于總凝血酶的含量。本發(fā)明的含凝血酶溶液是使凝血酶懸浮或溶解于水和/或有機溶劑中而成的水溶液、有機溶劑溶液或者水和有機溶劑的混合溶液，優(yōu)選為水溶液或者水和有機溶劑混合溶液。作為該有機溶劑，只要不會造成oc-凝血酶的分解和活性抑制等、且對纖維蛋白原測定沒有影響，就沒有特別限定，例如，可以例舉例如二甲基亞砜、甘油、聚乙二醇、聚丙二醇等。還可以將這些物質(zhì)中的一種或兩種以上組合使用。本發(fā)明的含凝血酶溶液的pH可以不做特別調(diào)整，但為了抑制a-凝血酶的分解和活性抑制，優(yōu)選在4~9，更優(yōu)選5.5~7,進一步優(yōu)選6~6.5。為了將該pH調(diào)整到4~9，可以適當選擇在pH49的范圍具有緩沖能力的緩沖劑進行使用。例如可以將選自于檸檬酸、磷酸、乙酸、咪唑、HEPES、MOPS、BIS-TRIS、TRIS、MOPSO、ADA、MES等中的一種或兩種以上適當組合。而且，在將該pH調(diào)整到5.5~7時、調(diào)整到66.5時，例如可以將選自于檸檬酸、磷酸、咪唑、BIS-TRIS、MOPSO、ADA、MES等中的一種或兩種以上適當組合。這些緩沖劑的添加量只要是具有緩沖能力的量就沒有特別限定，但優(yōu)選例如含凝血酶溶液中的緩沖劑的濃度在5~1000mM，特別是20~300mM。而且，本發(fā)明的含凝血酶溶液中的oc-凝血酶活性量可以根據(jù)a-凝血酶相對于上述總凝血酶的含量，調(diào)整到目標活性值，并沒有特別限制。例如，在纖維蛋白原測定用試劑中^f吏用時，a-凝血酶活性以公知的合成底物法計為20~1000單位/mL，更優(yōu)選為50~500單位/mL，特別優(yōu)選為100300單位/mL。本發(fā)明的含凝血酶溶液可以在對纖維蛋白原測定沒有影響的范圍內(nèi)適當配合如下的公知化合物，用公知的制備方法制造。在該含凝血酶溶液中，可以在對纖維蛋白原測定沒有影響的范圍內(nèi)適當配合用于穩(wěn)定a-凝血酶、提高保存穩(wěn)定性等的公知化合物，例如，可以例舉鈣離子、有機酸、表面活性劑、蛋白質(zhì)等。作為前述釣離子的具體例子，優(yōu)選水溶性的鈣化合物，可以例舉例如氯化釣、乳酸釣、葡糖酸鈣、葡糖醛酸鉤、酒石酸釣等。這些鉤化合物還可以使用一種或組合使用2種以上。該釣化合物對于cx-凝血酶的穩(wěn)定化有效量只要是使穩(wěn)定性提高的量即可，沒有特別限定，例如含凝血酶溶液中的釣濃度優(yōu)選在5mM~100mM，更優(yōu)選在lOmM~50mM。作為前述有機酸的具體例子，可以例舉甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、葡糖酸、乳酸、葡糖醛酸、乙醇酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、戊二酸、氨基乙酸、氨基己酸等，可以使用游離酸或其鹽中的任一者。而且，這些有機酸可以使用一種或組合使用兩種以上。該有機酸的添加量只要是使含oc-凝血酶溶液的穩(wěn)定性提高的量即可，沒有特別限定，例如含凝血酶溶液中的該有機酸的濃度優(yōu)選在10mM~500mM,更優(yōu)選在50mM~200mM。作為前述表面活性劑，可以是陰離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑、兩性離子表面活性劑和非離子性表面活性劑中的任一種，作為其具體例子，可例舉如下的表面活性劑。作為陰離子表面活性劑，可以例舉例如十二烷基疏酸鈉、十二烷基磺酸鈉、十二烷基-N-肌氨酸鈉、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、?；敲撗跄懰徕c等。作為陽離子表面活性劑，可以例舉例如十六烷基三曱基溴化銨、四癸基溴化銨、十二烷基吡啶鏡氯化物等。作為兩性離子表面活性劑，可以例舉例如3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨]畫l畫丙磺酸鹽(CHAPS，3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)-l畫propanesulfonate)、3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CHAPSO)、棕櫚酰溶血卵磷脂、十二烷基-N-甜菜堿、十二烷基-P-丙氨酸等。作為非離子性表面活性劑，可以例舉例如辛基葡糖苷、庚基>5危代葡糖苷、癸酰基-N-甲基葡糖胺、聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯七曱基己基醚、聚氧乙烯異辛基苯基醚(Triton(注冊商標)X系列)、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇酯(Tween(注冊商標)系列)等。這些表面活性劑中，特別優(yōu)選使用的是非離子性表面活性劑。而且，這些表面活性劑可以使用l種或組合使用2種以上。該表面活性劑的添加量只要是使含oc-凝血酶溶液的穩(wěn)定性提高的量即可，沒有特別限定，例如含oc-凝血酶溶液中的該表面活性劑的濃度優(yōu)選在0.001~lw/v%，更優(yōu)選0.005~0.1w/v%。作為前述蛋白質(zhì)的具體例子，可以例舉白蛋白、明膠、球蛋白等，這些蛋白質(zhì)可以使用l種或組合使用2種以上。該蛋白質(zhì)的添加量只要是使含oc-凝血酶溶液的穩(wěn)定性提高的量即可，沒有特別限定，例如含oc-凝血酶溶液中的該蛋白質(zhì)的濃度優(yōu)選在0.05~10w/v%,更優(yōu)選0.1~5w/v%。而且，本發(fā)明的含oc-凝血酶溶液中，除上述之外，為了提高測定再現(xiàn)性，還可以在對纖維蛋白原測定沒有影響的范圍內(nèi)配合高分子多糖類和/或合成高分子類。作為該高分子多糖類的具體例子，可以例舉葡聚糖40、葡聚糖70、葡聚糖200,000、葡聚糖500,000、菲可(Ficoll)等。這些高分子多糖類可以使用l種或組合使用2種以上。該高分子多糖類的添加量只要是使再現(xiàn)性提高的量就沒有特別限定，例如含凝血酶溶液中的高分子多糖類的濃度優(yōu)選在0.1-10w/v%，更優(yōu)選0.3-3w/v%。作為所述合成高分子類的具體例子，可以例舉聚乙烯醇500、聚乙9烯醇1500、聚乙烯醇2000、聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000和聚乙烯吡咯烷酮等。這些合成高分子類可以使用l種或組合使用2種以上。該合成高分子類的添加量只要是使再現(xiàn)性提高的量就沒有特別限定，例如含凝血酶溶液中的合成高分子類的濃度優(yōu)選在0.1~10w/v%,更優(yōu)選0.3~3w/v%。而且，在本發(fā)明的含凝血酶溶液中，還可以在對纖維蛋白原測定沒有影響的范圍內(nèi)添加適當?shù)姆栏瘎?。作為該防腐劑，可以例舉例如疊氮化鈉、Proclin(注冊商標)300、環(huán)丙沙星、丙酸或苯甲酸鈉等，還可以從這些中使用l種或?qū)?種以上組合使用。而且，根據(jù)需要，也可含有氯化鈉等鹽、氨基酸、糖等一般的穩(wěn)定化劑等。所述防腐劑的添加量只要在規(guī)定范圍內(nèi)就沒有特別限定，例如，含血凝酶溶液中的Proclin(注冊商標)300的濃度在0.001~lw/v%,優(yōu)選為0.01~0.1w/v%。而且，上述記載的濃度記載了將市售的Proclin(注冊商標)300制成100w/v。/。時的濃度。本發(fā)明的液狀纖維蛋白原測定用試劑含有上述含a-凝血酶溶液，而且還可以在不影響纖維蛋白原測定的范圍內(nèi)適當配合用于測定纖維蛋白原而通常使用的化合物。所述液狀纖維蛋白原測定用試劑可以作為凝固能力檢查試劑、尤其是纖維蛋白原的定量用試劑使用。具體而言，用試樣稀釋用緩沖液將纖維蛋白原標準液稀釋到規(guī)定濃度后，添加稀釋纖維蛋白原標準液和液狀纖維蛋白原測定用試劑，于37匸測定凝固時間。基于該纖維蛋白原濃度和凝固時間的測定值制成校正曲線，根據(jù)該校正曲線換算被檢試樣的凝固時間的測定值，可以求出被檢試樣中的纖維蛋白原濃度。此外，本發(fā)明的含有含a-凝血酶溶液的液狀纖維蛋白原測定用試劑可以測定凝血酶活性抑制物質(zhì)的活性，例如，抗凝血酶活性、水蛭素活性、化學(xué)合成抑制劑的活性。而且，本發(fā)明的液狀纖維蛋白原測定用試劑可以制成測定用試劑盒，這種情況下還可以含有用于稀釋試樣和標準液的試樣稀釋用緩沖液。作為試樣稀釋用緩沖液，可以例舉MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPSO、CAPS等Good's緩沖液、巴比妥緩沖液。該試樣稀釋用緩沖液可以按在加入上述含凝血酶溶液中時達到上述含凝血酶溶液的pH、濃度范圍的方式來使用。實施例例舉以下實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。(制造例l)oc-凝血酶和pY-凝血酶的分離、純化使以50mM磷酸緩沖液pH7.0溶解的5萬單位的凝血酶溶液吸附于S-瓊脂糖凝膠(2.5xHem,Pharmacia),用同樣的緩沖液清洗后，通過采用含有0.4MNaCl的相同緩沖液的0~0.4MNaCl(各300mL)線性梯度進行洗脫。用合成底物法測定凝血酶活性，回收在低離子強度下洗脫的P-和Y-凝血酶混合物(以下稱為PY-凝血酶)部分和在高離子強度下洗脫的a-凝血酶部分。進而，使各部分的凝血酶溶液吸附于節(jié)脒-瓊脂糖凝膠(2.1x6cm，Pharmacia),用含有0.5MNaCl的相同緩沖液清洗后，通過采用含0.1M節(jié)脒、0.5MNaCl的相同緩沖液的0-0.1M千脒(各100mL)線性梯度進行洗脫，得到純化的a-凝血酶(約3萬單位)和純化的P.Y-凝血酶(約1萬單位)。而且，對于回收的各純化凝血酶溶液，用O.lMNaCl、20mMTris-HClpH7.4進行透析后，在后述的研究中使用。而且，通過合成底物法進行的凝血酶活性測定，加入用試劑1(100mMTris，50mM檸檬酸三鈉，0.05%BSA，pH7.4)稀釋500倍而成的的各含凝血酶溶液200jiL和試劑2(S-2283:lmg/mL)200jiL,于37C反應(yīng)10分鐘后，添加lmL的2%檸檬酸，在405nm的波長下進行測定。而且，根據(jù)合成底物法測定值向凝血酶活性的換算基于凝血酶標準品(日本藥典)進行，純化oc-凝血酶為1238單位/mL,純化PY-凝血酶為677單位/mL。(制造例2)各凝血酶的純度測定(光密度分析法)用Laemmli法通過非還原下的10-20。/。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將純化oc-凝血酶和純化pY-凝血酶分離。通過CBB進行蛋白染色后，充分脫色后，通過光密度分析法(柯達IS440CF)測定各條帶的染色度程度(強度，Intensity)。其結(jié)果是，如表l、圖1所示，純化oc-凝血酶的純度為約95%(約5%含3-和Y-凝血酶)，純化P.Y-凝血酶的純度為約80%(約20%含oc國凝血酶)。而且，A相當于a-凝血酶，B相當于P-和Y-凝血酶。表l強度含量比率(％)ABAB純化a-凝血酶74040■94,65.4純化|3.y-凝血酶150375卯4620.379.7(實施例l)條件1~5的含凝血酶溶液的制備條件1~5的含凝血酶溶液是由100單位/mLa-凝血酶、150mM氯化鈉、0.05"/。Proclin(注冊商標)300、以下述活性比率含有P.y-凝血酶的50mMMES緩沖液構(gòu)成的pH6.3的溶液，使用純化a-凝血酶和純化PY-凝血酶進行制備。條件l:PY-凝血酶相對于總凝血酶活性的活性比率5%條件2:PY-凝血酶相對于總凝血酶活性的活性比率10%條件3:P.Y-凝血酶相對于總凝血酶活性的活性比率15%條件4:PY-凝血酶相對于總凝血酶活性的活性比率20%條件5:PY-凝血酶相對于總凝血酶活性的活性比率50%(實施例2)a-凝血酶含量的穩(wěn)定性測定了條件1~5的含凝血酶溶液于37C保存0、1、2周時的a-凝血酶含量的殘留率。而且，a-凝血酶含量的測定用制造例2的純度12測定進行。其結(jié)果是，如表2和圖2所示，37X:加速試驗后的ot-凝血酶含量殘留率隨P.y-凝血酶活性比率增加而降低。對于py-凝血酵活性比率為50%(條件5)的含凝血酶溶液，于37lC保存2周時ot-凝血酶含量殘留率為50%，與之相對，條件4的PY-凝血酶活性比率為20%的含凝血酶溶液，于37C保存2周時獲得了oc-凝血酶含量殘留率為81%的良好結(jié)果，共存的PY-凝血酶少者(即oc-凝血酶的活性比率高者)，oc-凝血酶的殘留率高。[表2加速試驗后的ot-凝血酶含量殘留率條件l條件2條件3條件4條件5(p■y-凝血酶/總凝血酶含量)(％)510152050a-凝血酶含量殘留率)保存時間(37°C)37.C，0天100.0亂0100.0跳0跳037。C，l周96.797.196.694.278.937°C，2周106.289.796.78U50.4這里，根據(jù)圖2，由PY-凝血酶相對于總凝血酶的活性比率與ot-凝血酶的含量殘留率成反比可以預(yù)想，p.y-凝血酶的活性比率為30%(即，a-凝血酶相對于總凝血酶活性的活性比率為70%)時，371C保存2周后的ot-凝血酶含量的殘留率在70%以上。而且，根據(jù)該結(jié)果可知，相對于含凝血酶溶液中的總凝血酶，oc-凝血酶含量為70%以上，優(yōu)選在80%以上，更優(yōu)選在卯％以上。而且，還可知，更優(yōu)選相對于含凝血酶溶液中的總凝血酶，ot-凝血酶含量在70%以上且&-和/或Y-凝血酶含量小于30%，進一步優(yōu)選oc-凝血酶含量在80%以上且0-和/或Y-凝血酶含量小于20%,特別優(yōu)選a-凝血酶含量在90。/。以上且P-和/或Y-凝血酶含量小于10%。(實施例3)凝血酶活性的穩(wěn)定性與實施例1同樣地制備條件1~5的各含凝血酶溶液，根據(jù)在37*C13保存0、1、2周時通過合成底物法獲得的測定值求出凝血酶活性的殘留率。通過合成底物法進行的活性測定采用記栽于前述制造例1中的方法。其結(jié)果是，如表3和圖3所示，對于條件5的P■Y-凝血酶活性比率為50。/。的含凝血酶溶液，于37X:保存2周后的凝血酶活性殘留率為20%以下，與之相對，對于條件4的PY-凝血酶活性比率為20%的含凝血酶溶液，于37"C保存2周后的凝血酶活性殘留率良好，為約60%，初期的PY-凝血酶活性比率越小(即oc-凝血酶的活性比率越高)，于371C保存2周后的凝血酶活性殘留率增大。[表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(實施例4)H^oc-凝血酶溶液的凝固活性的穩(wěn)定性對于實施例2中制備的條件1~5的含a-凝血酶溶液，使用于37X:保存了0、1、2周的含凝血酶溶液，對人血漿(試樣1和試樣2)進行凝固時間的測定。本實驗在用試樣稀釋液(TC緩沖液，Sysmex)稀釋為10倍的血漿lOOjuL中添加50jnL各含凝血酶溶液，用COAGREX800(Sysmex)測定凝固時間。與試樣1相關(guān)的結(jié)果示于表4和圖4中，與試樣2相關(guān)的結(jié)果示于表5和圖5中，在圖4和5中，按以第O周的凝固時間作為100%時的相對％來表示。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>根據(jù)圖4和圖5，對于P■Y-凝血酶活性比率為50%(條件5)的含凝血酶溶液，于37^C保存2周后的凝固時間相對于初期凝固時間的相對%超過120%，與之相對，對于PY-凝血酶活性比率在20%以下(條件l-4)的含凝血酶溶液，小于110%。根據(jù)上述內(nèi)容，確認了本發(fā)明的含凝血酶溶液在溶液中穩(wěn)定，作為液狀的纖維蛋白原測定用試劑有用。權(quán)利要求1、一種含凝血酶溶液中的α-凝血酶的穩(wěn)定化方法，其特征在于，α-凝血酶含量相對于含凝血酶溶液中的總凝血酶至少為70％以上。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的穩(wěn)定化方法，其中，p-和/或Y-凝血酶含量相對于含凝血酶溶液中的總凝血酶小于30%。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的穩(wěn)定化方法，其中，含凝血酶溶液的pH為4~9。4、一種含凝血酶溶液，其特征在于，相對于總凝血酶含有ot-凝血酶70%以上。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的溶液，其中，p-和/或y-凝血酶的含有比率相對于含凝血酶溶液中的總凝血酶小于30%。6、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的溶液，其中，pH為49。7、一種液狀纖維蛋白原測定用試劑，其中，含有權(quán)利要求4~6中任一項所述的含凝血酶溶液。全文摘要本發(fā)明提供一種凝血酶溶液中不穩(wěn)定的α-凝血酶的穩(wěn)定化方法、含有穩(wěn)定化α-凝血酶的溶液和含有這種溶液的液狀纖維蛋白原測定用試劑。含凝血酶溶液中的α-凝血酶的穩(wěn)定化方法，其特征在于，α-凝血酶含量相對于含凝血酶溶液中的總凝血酶至少為70％以上。文檔編號C12N9/96GK101558310SQ200780046549公開日2009年10月14日申請日期2007年12月6日優(yōu)先權(quán)日2006年12月21日發(fā)明者森川千鶴,池田來美,矢后弘和申請人:積水醫(yī)療株式會社