通過細胞同步化的雜交瘤融合效率的增強的制作方法

專利名稱：通過細胞同步化的雜交瘤融合效率的增強的制作方法
M細胞同步化的雜交瘤融合效率的增強
背景技術：
1發明領域
2本發明涉及通過融合配偶體的細胞同步化來增強雜交瘤融合效率的方 法，其目的在于輔助抗體的生產。3相關技術
4單克隆抗體(mAbs)作為治療試劑在多種疾病的治療中已經成為了一 種有效的方法。此外，單克隆抗體也是更好地了解多種疾病的免疫病理的有力 工具。
5單克隆抗體的產生過程首先由Kohler和Milstein報道(Kohler和 謹stein， Nature256: 495497 (1975))，他們ilil雜魏技術產生單克隆抗體，
yyoJts種方法成為實驗室的標7傻呈序。雜交瘤產生的一般方案包括(i)用純
化的蛋白抗原免疫動物(例如小鼠、大鼠或兔子)；(ii)收集生產抗體的B細 胞， 一般^)W中；(ii0將B細胞同次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷的 非分泌的骨髓瘤細胞系(例如，x63-Ag8.653，來源于BALB/c小鼠株)融合； (iv)在含有次黃嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶脫^^苷(HAT)的選擇培養基中培 養雜交瘤細胞；并且(v)篩選肖嫩生產期望的抗體的細胞；并且(vi)極限稀釋克 隆以獲得分泌該抗體的均一細胞系。
6在這4^時的多步過程中，最重要的步驟之一為細胞融合，即分泌抗 體的B細胞和骨髓瘤細胞融合。鼠科的HGPRT陰性B細胞骨髓瘤細胞系，FO， 倍增時間8-12小時，在雜交瘤方法中已經成為一種標準的融合配偶體。當與來 自正產生強烈體液免疫反應的小鼠的脾細胞融合時，分泌目的mAb的源自FO 的雜交瘤會,快慰也生成。
7但是，這種細胞融合方法的效率非常低。即使在已知最好的條件下， 例如試劑純度，溫度，和細胞存活率，僅有大約0.08%的脾抗體分泌細胞能夠 融合。這種效率低下歸結于許多因素。例如，兩個脾細胞融合產生的雜交瘤不 是永生的，不會生長；兩^t髓瘤細胞融合產生的雜交瘤不分泌抗體，并且將在選擇培養基中死亡。此外，多于兩個細胞的融合產生不穩定的合胞體并且多 核懶每無法生存。
8由于所有這些變數的存在，最初的雜交瘤往往都不穩定，而且皿擇
過程中無法存活，而存活的那些通常分泌低水平的抗體。因此，需要產生雜交 瘤及生產單克隆抗體的改進的方法。
9發明推誠
10本發明提供了一種提高雜交瘤g蟲合效率的方法，包括同步化融合配偶 體細胞。 一方面，本發明提供了生產抗體的B細胞的同步化。另一方面，本發 明提供了小鼠骨髓瘤細胞的同步化。
11在一個實 案中，同步化^ilML清饑餓實現的。本發明提供了一 種產生抗體的更有效的方法。相應地，另一方面，本發明提供了利用本發明改 進的方法生產的抗體。禾傭本發明生產的抗體可用于治療、診斷、和/或研究目 的。
12發明詳述
13引證本文弓l證的所有的出版物或專利當顯示本發明時的技術狀態和 域提供了本發明的描述和實現時，全文M:援弓I并A^文。出版物是指任何科 學或專利的出版物，或以任何媒體形式，包括所有的記錄，電子或印刷形式， 可獲得的任何其他信息。以下參考文獻全文fflil援引并A^文Ausubel,等,ed, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2006); SambrooK等,Molecular Cloning: ALaboratoiy Manual, 2nd Editioi^ Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan,等，eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2006); Colligan等，Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997- 2006)。
14術語"免,"在本文中是措潛在地可誘發受試者中的免疫反應的分 子。由于一些免疫原在不含佐劑盼瞎況下給予時，不引起免疫反應，術語"免疫 原"包括當與佐齊哄施用才能弓胞免疫反應的肝。
15術語"單克隆抗體"在本文中是指單一肝鄉賊的抗體好制劑。單克 隆抗體表現出對特定表位的單一結僧寺異性和親和性。單克隆抗體包括鼠、人、 人化和嵌合單克隆抗體。16一般來說，抗體是對特定免疫原表現出結合特異性的蛋白質或者多肽。 完整的抗體是異源四聚糖蛋白，由兩條相同的，和兩條相同的重鏈組成。通
常針輕^M;—個共價二硫li3i接到重鏈，而不同免疫球蛋白頓中型重粒 間的二硫鍵的數目是不同的。旨重鏈和輕鏈中也存在規則間隔的鏈內二硫鍵。
*重鏈的一端有一個可變區(VH)，緊接著多個恒定區。針g^E其一端 有一個可變區(VL)而在另一端有一個恒定區。，盼恒定區同重鏈的第一個 恒定區是對準的(aligned),而輅連的可變區同重鏈的可變區就準的。任何脊 椎動物種抗體的,都可以根據他們恒定區氨基,列分成命名為k和X的明 顯不同的兩種類型之一。根據重鏈恒定區的氨基,列，免疫球蛋白可分為五 種主要類，艮PlgA 、 IgD 、 IgE、 IgG及IgM。 IgA和IgG進一步可亞分類為同 種型IgAl,IgA2,IgGl,IgG2,IgG3和IgG4。
17
一般地，制備和表征抗體的方法是本領域所公知的(例如，Ausubel, Harlow和Lane,以及Colligan，上文)。可根據免疫原的免疫方案施用免疫原。 例如，可利用以足以誘發有效免疫反應的量的單次施用免疫原。或者，也可釆 用初次施用免疫原后一次或更多次強化的其他方案。施用可M51任何適合的途 徑，例如鵬內、靜脈內、皮下、肌肉內、皮內鵬過爪墊、鄉。 一般4頓嚙 齒類動物，如小鼠和大鼠。
18免疫接種之后，具有生產抗鵬能的體細胞，特別是B淋巴細胞(B 細胞)，將被篩選出用于mAb的產生方案。這些細胞可，、扁杉淋或淋巴結、 ^^卜周血樣品獲得。從免疫動物中得到的生產抗體的B細胞隨后同永生的骨髓 瘤細胞系的細胞融合。適合用于生產雜交瘤的融合方法的骨髓瘤細胞系，是 不生產抗體的，具有高融合效率，并且具有酶缺陷，該缺陷然后使得在僅僅支 持期望的融合細胞(雜交瘤)生長的某些選擇培養基中不能生長。例如，如果 免疫動物是小鼠，那么可利用P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653， NSl/l,Ag41, Sp210畫Ag14， FO,NSO/U, MPC國ll,MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0 BuL
19本領域中，產生生產抗體的脾細胞或淋巴結細胞以及骨髓瘤細胞的雜
種的方法是眾所周知的。 一般地，體細胞與骨髓瘤細胞以2: l的比例混合，然
而當一種或復數種可促進細胞膜融合的試劑(化學的或電的)存在時，該比例
分別可在約20: l到約l: l之間變化。用仙臺病毒進行融合的方法己被Kohler &謹8&111描述(1975;1976)，并且4頓聚乙二酉I(PEG),如37X(v/v)的PEG的方法己被Gefter等描述(1977年)。使用電誘導融合方法也是可行的(Goding pp. 71-74,1986)。
20盡管所有，的細胞都會,融合，但是并非所有細胞都相同地融合， 或都具有生存能力。例如，分裂活躍的母細胞樣B細胞是最適用于與骨髓瘤細 胞融合的細胞。如果B細胞沒有SA母細胞樣階段，其細胞核與骨M細胞的 細胞核沒有同時進入有絲分裂，細胞融合將不會發生。并且，在內質網中過多 的抗體翻譯誘導非折疊蛋白質反應(UPR)，其可抑制翻譯和誘導細胞調亡。換 句話說，僅有為蛋白分泌而優化的細胞才能夠分泌大量的抗體。因此，對于B 淋巴母細胞同分裂活躍的骨髓瘤細胞并且每種僅僅一個之間的正確融合，細胞 周期同步^^t于雜交瘤融合效率是主要的貢獻因素。
21本發明提供了一種改駐的生產抗體的方法，其中可以操縱標準方法來 提高抗體生產B細胞和骨髓瘤細胞之間的融合效率。在一個實施方式中，骨髓 瘤細胞在與抗體生產B細胞融合之辦皮同步化。在另一個實 式中，抗體生 產B細胞在與骨髓瘤細胞S蟲合之前被同步化。
22哺乳動物細胞細胞分裂周期有4個主要階段。G0/G1期指的是分g 期結束到DNA合鵬始這段時間；S期對應于細胞倍增其DNA含量的這段時 期；G2期指DNA合成結束到分裂前期開始的這段時期；并且M期指有絲分裂 期。為了將一群細胞同步化，有一些方法能夠將細胞可逆地阻^^在細胞周期的 特定階段。例如，諾考達唑(nocodazole)是抗有絲分裂試劑，它育,ffl31同卩
微管蛋白結合和防止兩^i間二硫mt—的形成而破壞微管，從而抑制微管動
力學，破壞有絲分裂紡錘體功能，斷裂高爾基復合體。諾考達唑(nocodazole) 使細胞周期停滯在G2/M期。其他例雅括含羞草素(mimosine)， 一種植物氨 基酸和鐵螯合劑，其抑制DNA復制，并且^m胞周期停滯在Gl/S期；以及頓 腸霉素(叩hidocolin)，其i!31干擾DNA聚合酶的活性防止有絲細胞分裂，也 使細胞周期停滯在G1/S期。財卜，對于大多數類型的細胞來說，在缺乏血清的 培養基中細胞的生長誘導細胞周期停滯在G1期。
23培養中，大部分對數生長的細胞都處于細胞周期的G1期。但是，這 一時期可能不是細胞融合的最佳時期。已經發現以秋水仙堿， 一種能夠將細 胞停 有絲分裂中期的有絲分裂紡錘體抑制劑，處理骨髓瘤細胞之后，雜交 瘤細胞融合的集落 :提高26%"570%。根據本發明，^ffl—種或更多種細胞周常培養基，能讓細胞以同步化模式生長。此外，
M改變恢復時間，育^夠在融合之前選擇B細胞或者#|§瘤細胞處于的細胞周
期的階段。
24融合之后，雜^tlffi^擇培養基中培養，特定的雜交瘤被篩選出來。
一般地，雜交瘤的篩選題過下歹陟驟進行通過在M滴定板中單個克隆稀
釋培養細胞，隨后(大約2周到3周之后)，測試M克隆上清液的期望的反應 性。該測定可以是放射性免疫測定、酶免疫測定、細胞毒性測定、空斑測定、 免^t點測定等。
25抗體生產細胞也可以從免疫了感興趣的抗原的人或其他^I的動物的 少r周皿現1AJS胖現百W個C:培M^守到。tTFJ甘迫的伯土細肥t!i目^及用于表達編石馬 本發明的抗體、其特異性片段或變體的異源或內源核酸。融合細胞(雜交瘤) 或重組細胞可以使用選擇性培養條件或其他適合的已知方法分離，并用極限稀 釋或細胞分選或其他已知的方法進行克隆。生產具有期望的特異性的抗體的細 胞肯,通艦合的方法篩選(例如ELISA)。
26在本領域中，其他合適的生產或分離具有所需特異性的抗體的方法是 ;0^f周知的，例如，參見Colligan,Harlow和Lane,Ausubel，上文，其每篇均全 文M51援弓l并入本文。工程化或者人化非A^人抗體的方法也是可利用的并且 是本領域所熟知的。 一般地，人化或工程化的抗體具有一個或更多個非人源， 例如，但不限于小鼠，大鼠，兔，非人類靈長類動物或其他哺乳動物，的氨 基酸殘基。這些人氮基酸殘基常常被稱為"輸入"殘基，其通常是取自已知的人 辦列的"輸入"的可變，恒定或其他區。已知的人類Ig序列是本領域公知的， 且可{頓^{可已知的序歹"參見，例如，但不限于，Kabat等，Sequences of Proteins oflmmunological Interest U.S. Dept. Health (1983)和PCT公開WO 05/33029和 US 10/872,932,其提交于2004年6月21日，全^CM:援引并A^文。
27如本領域公知的，這種輸入序列可以用來斷氐免疫原性，或斷氐，提 高或修飾結合性、親和性、結^I率(on-rate)、解離速率(off-rate)、抗體親抗 原性、特異性、半衰期或任何其他合適的特征。 一般地，部分或全部非人類或 人類CDR序列被保留，同時在可變區和恒定區的非碧列被人或其他氨基1^萬 取代。抗體還可以任選:ttt行人化，同時保留對于抗原的高親和性和其他有利 的生物學特性。為了實現這一目標，人化抗體任選可通過利用親本序列和人化序列的三維模型對親本序列和各種m^上的人化產品進行分析的方法而制備。
三維免疫球蛋白的模型對本領域技術人員來說通常是可獲得的并且是熟悉的。 用來說明和顯示選擇的候選免疫球蛋白序列可能的三維構象結構的計算mi呈序 是可獲得的。檢查這些顯示允許分析殘^Ef,免疫球蛋白序列功能中的可能 的作用，即，分析影響候選免疫球蛋白結合它的抗原的能力的歹 。通^種 方法，FR的殘基能夠從一致和輸入的序列選擇出來并組合，以獲得期望的抗 慚寺性，如提高的對耙抗原的親和性。 一般的，CDR殘基超接的和駐要參 與影響抗原結合的。本發明的抗體的人化或工程化可以用任何己知的方法實施， 例如，但不限于描述于下文的那些，Winter (Jones等Wature 321 :522 (1986); Riechmann等，Nature 332:323 (1988); Verhoeyen等，Science 239:1534 (1988)), Sims等，丄Immunol. 151 : 2296 (1993); Chothia and Lesl^ J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter等，Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta等，J. Immunol. 151 :2623 (1993),美國專利號5723323, 5976862, 5824514， 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101,5585089,5225539; 4816567, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, Collig叫Ausubel, Harlow and Lane,上文，
每一篇全:M51援引并A^文，包括其引用的參考文獻。
28如本文所述和/或本領域公知的，抗體還可以任Mil免疫能夠生產
人抗體的所有組成成分的轉基因動物(例如，小鼠，大鼠，倉鼠，非人類靈長 類動物等)而產生。生產期望的抗體的細胞可以由這些動物分離并利用適當的
方法7JC生化，如本文所述的方法。
29可以生產結合人抗原的人抗體的所有組成成分的轉基因小鼠可以用已 知的方法產生(例如，但不限于，授予Lonberg等的美國專利號5，770,428, 5,569,825, 5,545,806, 5,625,126, 5,625,825, 5,633,425, 5,661，016和5,789,650; Jakobovits等WO 98/50433, Jakobovits等WO 98/24893, Lonberg等WO 98/24884, Lonberg等WO 97/13852, Lonberg等WO 94/25585, Kucherl^ate等 WO 96/34096， Kucherlapate等EP 0463 151 Bl, Kucherlapate等EP 0710 719 Al, Surani等美國專利號5，545,807， Bruggemann等WO 90/04036, Bruggemann等 EP 0438 474 Bl, Lonberg等EP 0814 259 A2， Lonberg等GB 2 272 440入Lonberg等Nature 368:856-859 (1994), Taylor等，Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994)， Green 等，Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez等,Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor等,Nucleic Acids Research 20(23):6287~6295 (1992), Tuaillon等，Proc Nad Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993),Lonberg等，Int Rev Immunol 13(l):65-93 (1995)以及Fishwald等,Nat Biotechnol 14(7):845畫851 (1996)，每一篇全^CM3！ 援引并入本文)。 一般地，這些小鼠包括至少一種轉基因，所述轉基因包含來自 功能性重組的或可進行功能性重組的至少一種人免疫球蛋白基因座的DNA。在 這種小鼠中內源性免疫球蛋白基因座可被破壞或缺失，以消除動物生產內源性 基因編碼的抗體的能力。
30因此，本發明的方法提供了更有效的產生抗體的途徑。相應的，本發 明還掛共了f頓本發明改進后的方法生產的抗體。利用本發明生產的抗體可用 于治療、診斷、禾口/或研究目的。
31已經一般性地描述了本發明之后，參考下面的實施例將更容易地理解 其，所述實施例僅M例示的方式提供并且不意圖進行限制。
32鄉例1 FO髓瘤細胞血清饑餓提高雜交瘤細胞融合效率
33為了確定骨髓瘤細胞的細胞周期的階段是否對雜交瘤融合效率有影 響，在一段時間內fflil血清剝奪(1%FBS)使FO細胞同步化。隨后，同步化 的FO細胞直接同脾B細胞融合，鵬融合之前在完全培養基中恢復一段時間。 簡略的說，5只Balb/C小鼠用雞蛋溶菌酶在Titermax中免疫，2周時強化，4周 時收獲。取脾，集中單細胞懸液，MlympholyteM柱，并計數。另取首次用 于實驗的脾臟作為陰1W照。FO骨髓瘤細胞在DMEM+1%FBS中生長不同的 時間，洗滌，并且然后在融合之前于DMEM+10c/。FBS培養基中恢復特定時間。 ^t樣品以60xl(T6脾細胞同60xl(T6 FO細胞混合(對于首次用于實驗的對照 以15xl(T6脾與FO細胞混合)，用50e/oPEG融合，接種于96孔板于HAT培養 基培養，濃度為4xl(T6脾細膨板。融合后7-ll天ifj胸胞集落。結果表明， 沒有任何恢復期的血清錄U奪不會提高融合效率。另一方面，血清剝奪后進行恢 復會比與在完全培養基中孵育的FO細胞融合效率高。確定了對于FO骨髓瘤細 胞而言，最佳的饑餓時間是13小時而最佳的恢復時間也是13小時。在融合之 前進，諒種處理，育,使融合效率提高45%0
34處理之前獲得的骨髓瘤細胞，血清饑餓13小時后的骨M細胞，以丙啶(propidium iodide)染色，流式細 胞儀分析DNA含量。未經處理的細胞中，49-52X的細胞處于G0/Gl期，23-25 X的細胞處于S期，而22X的細胞處于G2/M期。處理之后血清饑餓沒有立即 顯著改變這一比例，但恢復之后，顯著將處于S期的細胞群增加到38X。這與 先前的報道相反，先前的報道暗示了當細胞同步處于M期時可提高雜交瘤融合 效率。總之，本發明成功地增加了雜交瘤融合效率，其是高效的，并誘發最小 副作用或沒有副作用。
35本發明可以以與前面的描述和實施例鵬寺別描述不同的方式實施。本 發明的許多修飾和變化根據上面的教導是可能的，并且因此落在本發明的范圍 之內。1. Koh〗er， G.， and C. Milstein. 1975. Contimious cultures of fused, cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256:495,
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權利要求
1.一種提高雜交瘤融合效率的方法，包括使融合配偶體骨髓瘤細胞同步化。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述骨髓瘤細胞選自P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NSl/l.Ag41, Sp210國Ag14, FO, NSO/U, MPC-ll, MPC11-X45畫GTG 1.7和S194/5XX0Bul。
3. 如權利要求l所述的方法，其中所述的同步4MffllL清饑懶得。
4. 一種提高雜交瘤融合效率的方法，包括使融合配偶皿體生產B細胞 同步化。
5. 如權利要求4所述的方法，其中抗體生產B細胞雄、扁杉&體或淋巴 結或外周血樣品獲得。
6. 如權利要求4所述的方法，其中所述的同步^131ifiL清饑臓得。
全文摘要
本發明提供了通過融合配偶體的細胞同步化來增強雜交瘤融合效率的方法，其目的在于輔助抗體的生產。
文檔編號C12N5/16GK101652472SQ200780038065
公開日2010年2月17日 申請日期2007年10月12日 優先權日2006年10月13日
發明者吉爾·蓋爾斯-科馬, 格雷戈里·班尼什, 邁克爾·里西琴 申請人:森托科爾奧索生物科技公司