改變水稻的脂肪酸組成的制作方法

專利名稱：：改變水稻的脂肪酸組成的制作方法
技術領域：
：本發明涉及具有改變的油酸、棕櫚酸和/或亞油酸水平的米糠油(riceoil)、米糠(ricebran)和水稻種子。本發明還提供了遺傳修飾水稻植物的方法，由此從中產生的米糠油、米糠和水稻種子具有改變水平的油酸、棕櫚酸和/或亞油酸。
背景技術：
：植物油是人體膳食脂肪的重要來源，在發達國家占大約25%的熱量攝入(Brounetal.,1999)。目前世界植物油的產量為大約1億1千萬噸/年，其中86%用于人類消耗。幾乎所有這些油均得自油料種子作物如大豆、油菜、向日葵、棉籽和落花生，或者得自種植園樹木(plantationtree)如棕櫚樹、橄欖樹和椰子樹(Gunstone，2001;OilWorldAnnual,2004)。關于食用油的各個脂肪酸成分對于人體健康各個方面的影響的日益增長的科學了解和社會共識推動了具有改良的營養價值而同時保留各種食物應用所需的功能性的修飾的植物油的開發。這些修飾需要關于植物脂肪酸合成的代謝途徑及編碼這些途徑的酶的基因的知識(Liuetal.,2002a;ThelenandOhlrogge，2002)。對于各種脂肪和油的營養作用、特別是脂肪和油的組成成分對于心血管疾病、癌癥和多種炎癥性疾病的影響給予了很大關注。飲食中高水平的膽固醇和飽和脂肪酸被認為增加心臟病的風險，這個結果已經導致減少攝取膽固醇豐富的飽和動物脂肪而贊成攝取無膽固醇的不飽和植物油的營養學建議(Liuetal.，2002a)。雖然經膳食攝取動物脂肪中存在的膽固醇可以明顯增加血液總膽固醇水平，但是也發現包含所述脂肪和油的脂肪酸自身對于血清膽固醇水平即可具有顯著作用。特別感興趣的是膳食脂肪酸對于血液中不希望的低密度脂蛋白(LDL)和希望的高密度脂蛋白(HDL)形式膽固醇的作用。通常，飽和脂肪酸、特別是在植物油中存在的主要飽和物豆蔻酸(14:0)和棕櫚酸(16:0)具有增加血清LDL-膽固醇水平及隨后增加心血管疾病風險的不希望的性li質(Zocketal.，1994;Huetal.,1997)。然而，已經充分確定在植物油中存在的另一種主要飽和物，硬脂酸(18:0)不增加LDL-膽固醇水平且也許實際上可降低總膽固醇水平(BonanomeandGrundy，1988;Doughertyetal.，1995)。因此，通常認為硬脂酸對于心血管疾病的風險至少是中性的(Tholstrup，etal.，1994)。另一方面，不飽和脂肪酸如單不飽和油酸(18:1)和多不飽和亞油酸(18:2)以及ot-亞麻酸(ALA，18:3)對于降低LDL-膽固醇有益處(MensinkandKatan，1989;RocheandGibney，2000)，因此降低了心血管疾病的風險。盡管在營養方面是需要的，但是高不飽和油在用于許多食品應用中太不穩定，特別是在暴露于長時間高溫和氧化條件下的商業性深度油炸應用方面太不穩定。在這種條件下，不飽和油中存在的許多碳雙鍵的氧化性斷裂導致短鏈醛、氫過氧化物和酮衍生物的產生，產生不合乎需要的味道且由于極性化合物水平增加而降低油炸性能(Changetal.，1978;Williamsetal.,1999)。油加工商和食品生產商傳統上依賴于氫化以降低油中不飽和脂肪酸的水平，從而增加其在油炸應用中的氧化穩定性且還提供了固體脂肪以用于人造黃油和起酥油中。氫化作用是一個化學過程，通過將碳雙鍵轉變為碳單鍵而降低了油的不飽和程度。完全氫化作用產生完全飽和脂肪。然而，部分氫化過程導致飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的水平均增加。在部分氫化過程中形成的一些單不飽和物是反式異構體形式(如反油酸，油酸的反式異構體)，而不是天然發生的順式異構體(Sebedioetal.,1994;FernandezSanJuan,1995)。與順式不飽和脂肪酸相反，現在己知反式脂肪酸與棕櫚酸在增加血清LDL膽固醇水平(MensinkandKatan,1990;NoakesandClifton,1998)和降低血清HDL膽固醇(ZockandKatan，1992)方面具有同樣效力，并因此導致心血管疾病風險增加(AscherioandWillett,1997)。由于對于反式脂肪酸的反營養作用的了解日益增多，現在越來越多地傾向于在食品業中不使用氫化油，而贊成使用既具有營養益處且無需氫化而可提供需要的功能性的脂肪和油，特別是富含油酸(在需要液態油的情況中)或者硬脂酸(在優選固體或半固體脂肪的情況中)的那些脂肪和油。植物油幾乎完全由三酰甘油(TAG)分子組成，所述分子由被酯化為甘油主鏈的三個脂肪酸(酰基)鏈組成且沉積于稱作油質體的特定油體結構中(StymneandStobart,1987)。這些貯存脂質作為幼苗發芽的能量來源，直至12其能進行光合作用。常用的可食用植物油通常由5種主要脂肪酸組成-飽和棕櫚酸和硬脂酸、單不飽和油酸和多不飽和亞油酸以及a-亞麻酸。除了脂肪酸之外，植物油也含有一些重要的微量成分如維生素E、植物固醇、萜類和混合的類異戊二烯。對這些微量成分越來越感興趣，因為一些這樣的成分已經示出對于皮膚健康、衰老、視力和血液膽固醇發揮有益作用或者防止乳腺癌或者心血管疾病(Theriaultetal.，1999;MoghadasianandFrohlich，1999)。狎柳微斷〃雨會成圖1示出了發育中的種子中脂肪酸合成的代謝途徑示意圖。脂肪酸合成的最初階段發生在細胞的質體區室中，其中脂肪酸碳鏈的合成用C2分子開始并且通過逐步縮合過程延伸，從而從丙二酰基-ACP貢獻額外的C2碳單位以延長酰基鏈。這個程序的第一步包括用丙二酰基-ACP縮合乙酰-CoA且通過P-酮酯酰合酶in(KASIII)催化。隨后的縮合循環由p-酮酯酰合酶I(KASI)催化，導致最終形成與酰基載體蛋白(ACP)連接的飽和C16酰基鏈，棕櫚酰-ACP。質體內的最終延長由(3-酮酯酰合酶II(KASn)催化，形成飽和C18酰基鏈，硬脂酰-ACP。當去飽和發生時，第一個雙鍵通過質體中的可溶酶即硬脂酰-ACPA9-去飽和酶被導入C18鏈的A9位置，產生單不飽和的C18:1油酰-ACP。因此合成的脂肪酸保留在質體中以進一步修飾并摻入質體脂質(plastidiclipid)中；或者通過酰基-硫酯酶(acyl-thioesterases)從其ACP中釋放，產生游離脂肪酸，游離脂肪酸被輸出到細胞溶膠中以進一步修飾并最終慘入TAG分子中。己經發現高等植物具有至少兩種類型的酰基硫酯酶其對于油酰-ACP(不飽和酰基-ACP)具有底物特異性；以及F"W，其對于飽和酰基-ACP具有偏愛性(Jonesetal..1995;Voelkeretal.，1996)。在離開質體時，游離脂肪酸被酯化為輔酶A(CoA)，然后可用于轉移至三磷酸甘油(G-3-P)主鏈，形成溶血磷脂酸(LPA)、磷脂酸(PA)和磷脂酰膽堿(PC)。此外，在一些植物中，特別是蕓苔屬(Sra^/M)物種中，被酯化為CoA的油酸能被延長以形成二十碳烯酸(C20:1)和芥子酸(C22:1)。被酯化為PC的油酸可用于進一步修飾，之后被摻入TAG中。在可食用油中，對PC的主要修飾是分別通過微粒體A12-去飽和酶(FaW)和A15-去飽和酶(Fad3)進行相繼的油酸去飽和形成亞油酸和Ot-亞麻酸。觀存^^"激全激^^^^錄欲基因失活方法如轉錄后基因沉默方法(PTGS)己經成功用于失活脂肪酸生物合成基因并且在油料種子作物中產生營養方面改良的植物油。例如，通過共抑制F^/2編碼的微粒體A12-去飽和酶產生了在其種子油中具有80n/。油酸的大豆品系(Kinney,1996)。這樣降低了A12-去飽和水平，導致大量油酸聚集。使用相似的方法，基于共抑制的FflW基因的沉默用于提高歐洲油菜(Smw/cawa;船)和芥菜(及中油酸水平(Stoutjesdijketal.,2000)。同樣，發現得自油菜籽的基因的突變體等位基因在棉籽中的轉基因表達能抑制內源棉花F^/2基因的表達并導致在大約一半的原始轉基因棉花品系中油酸含量增力口(Chapmanetal.，2001)。另外，通過自身切割核酶終止的尸fl^基因在大豆中的轉基因表達能失活內源基因，導致油酸水平增加(Buhretal.,2002)。RNAi-介導的基因沉默技術已經用于開發具有營養改良的脂肪酸組成的油料種子。在棉籽中，靶向ghFad2-l(棉花i^W基因家族的種子特異性成員)的發夾RNA(hpRNA)基因沉默構建體的轉基因表達導致油酸從占油中總脂肪酸的15%的正常水平增加至直至77%(Liuetal.，2002b)。這種增加的代價主要是亞油酸從60%的正常水平降低至低如4%。谷笏爐游霸嚴凝與在油料種子中進行的脂肪酸生物合成和修飾的大量工作形成對照，在谷物中相對未進行油修飾的研究。這可能是由于在谷粒中油的水平較低(大約1.5-6%重量)并且因此感覺到人類飲食中來自谷物的油的重要性較低的緣故。水稻(Oo;^M/z'vaL.)在發展中國家是最重要的谷物并且廣泛生長，特別是在亞洲占全世界產量的大約90%。世界上絕大多數水稻以"精白米"形式食用，其基本上是水稻谷粒的胚乳，通過對收獲的谷粒進行研磨以除去外層糠皮和胚芽(胚和盾片)而產生。這樣做主要是因為"糙米"不好貯存，特別是在熱帶條件下不好保存。谷粒如水稻的油含量相對于油料種子非常低(4%)，在油料種子中油可以組成谷粒重量的60%(OhlroggeandJaworski,1997)。然而，脂質可仍包含14直至37。/。干重的谷物胚(ChoudhuryandJuliano1980)。水稻谷粒中大多數脂質含量在外層糠皮中發現(Resurreccionetal.，1979)，但是一些脂質也存在于胚乳中，至少一些與淀粉相關(表1和2)。米糠油中的主要脂肪酸是棕櫚酸(16:0)(占TAG中總脂肪酸的大約20。/。)、油酸(18:1)(大約40。/。)和亞油酸(18:2)(大約34%)(Radcliffeetal,199"。在不同水稻栽培種中，例如天然的油酸水平范圍是37.9%-47.5%，亞油酸(18:2)是38.2%-30.4°/。(Tairaetal.，1988)。表1:各種植物油的選擇的脂肪酸的典型脂肪酸組成(總脂肪酸的wt%)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>雖然基因已經示出高親和性催化游離棕櫚酸產生，所述棕櫚酸隨后在油料種子植物和雙子葉植物中被轉變為棕櫚酰-CoA，但是沒有關于尸a^在水稻或其它谷物中作用的報道信息。表2:與淀粉相關植物脂質的選擇的脂肪酸的脂肪酸組成(總脂肪酸的wt%)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>數據根據Morrison(1988)改編,一些脂肪酸去飽和酶已經在水稻中鑒定，但不是F"W。Akagaietal.，(1995)公布了水稻染色體4上編碼發育中種子中硬脂酰-酰基載體蛋白去飽和酶的基因的核苷酸序列。該基因產物參與從硬脂酰ACP產生油酰ACP。Kodamaetal.(1997)報道了水稻中Fa必的結構、染色體位置和表達。通過使用大豆F"必表達技術，水稻種子油中亞麻酸(18:3)的比例增加了10倍(Anaieta1.，2003)。近年來，已經報道了通過導入來自細菌的亞油酸異構酶基因在水稻中產生綴合的亞油酸(Kohno-Muraseetal.，2006);據報道綴合的亞油酸具有抗癌活性。也已經報道了使用固定的微生物酶，以相似的機理(vein)在體外修飾米糠油以摻入癸酸，這樣在一些疾病中可以改良膳食脂質的利用(JenningsandAkoh，2000)。在玉米中，對和FA-6去飽和酶基因已經被測序和染色體作圖(MikkilinenandRocheford，2003)。對于玉米谷粒中油酸/亞油酸比率，Fad2和Fad6克隆不能作圖至任何QTL。沒有關于在水稻、玉米或小麥中鑒定的其它i^W或F"W基因的公開報道。水稻在高溫下長期貯存削弱了谷粒品質，這是由于米糠油的水解和氧化變質所致。在收獲期間脫去外殼以產生糙米破壞了外層糠皮，使得油擴散至外層。隨后內源的和微生物脂肪酶催化三酰甘油水解為游離脂肪酸(FFA)，其隨后被氧化產生脫風味(off-flavour)(Yasumatsuetal.,1966,Tsuzukietal,2004，Zhouetal，2002ChampagneandGrimm,1995)。己醛是在高溫下貯存的生的和煮熟的糙米的頂部空間中增加的主要成分(Boggsetal.，1964,Shibuyaetal.，1974,Tsugitaetal.，1983)。然而，己醛自身不是"脫"風味的主要原因，變質的稻米的討厭臭味和氣味可能是由于在貯存后增加的混合揮發物所致。這些揮發物包括烷醛、烯醛(alkenals)、芳族醛、酮、2-戊基呋喃、4-乙烯基苯酚等(Tsugitaetal.,1983)。然而，在貯存期間己醛水平示出與糙米中亞油酸(18:2)的氧化相關并因此是氧化變質的良好指征(Shinetal.，1986)。己醛從亞油酸產生可以通過脂加氧酶(LOX)催化(StAngeloetal.,1980)。Suzukietal.(1999)鑒別了沒有Lox3的水稻變種并發現該突變谷粒在35'C貯存8周，在生的和煮熟的糙米谷粒的頂部空間蒸汽中均形成較少的己醛。他們還發現突變水稻形成較少的戊醛和戊醇。通過磨去水稻谷粒外層獲得的富有營養的外層米糠皮是極佳的食物源料，含有抗氧化化合物如生育三烯酚類和也是植物雌激素的Y-谷維素(RukminiandRaghuram,1991)。己經發現米糠油中存在的生物活性化合物降16低人體膽固醇水平(Mostetal.，2005)。這些生物活性成分也已經示出改善喂食高膽固醇飲食的大鼠的脂質譜(Haeta1.，2005)。主要在米糠中發現的另一種重要成分是維生素A前體。然而，由于對稻米進行研磨和食用精白米而喪失了這些營養和健康益處。仍需要這樣的谷物如水稻的產生具有對于健康有益的改良的油組成的谷粒的變種，同時在貯存時更加穩定，使得在人膳食中可以更多地使用例如糙米。發明概述一方面，本發明提供了米糠油，其脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸、小于大約17%的棕櫚酸、小于大約30%的亞油酸和/或其任何組合。在一個實施方案中，油酸與亞油酸的比率大于1.5:1，優選大于2:1，更優選大于3:1，還更優選大于4:1。在另一個實施方案中，所述米糠油的脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸、小于大約17%的棕櫚酸和小于大約30%的亞油酸。在再一個實施方案中，所述米糠油的脂肪酸組成包含大于大約40%的油酸，優選大于大約50%的油酸，還更優選大于大約60%的油酸。在一個實施方案中，所述米糠油的脂肪酸組成的范圍是48-80%的油酸、6-16%的棕櫚酸和10-25%的亞油酸。在又一個實施方案中，所述米糠油的脂肪酸組成包含小于大約16%的棕櫚酸，優選小于大約15%的棕櫚酸，更優選小于大約14%的棕櫚酸，更優選小于大約13%的棕櫚酸，還更優選小于大約12%的棕櫚酸。在另一個實施方案中，所述米糠油的脂肪酸組成包含小于大約25%的亞油酸，優選小于大約20%的亞油酸，還更優選小于大約15%的亞油酸。另一方面，本發明提供了米糠，其脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸、小于大約17%的棕櫚酸、小于大約30%的亞油酸和/或其任何組合。在一個實施方案中，油酸與亞油酸的比率大于1.5:1，優選大于2:1，更優選大于3:1，還更優選大于4:1。在另一個實施方案中，所述米糠的脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸、小于大約17%的棕櫚酸和小于大約30%的亞油酸。在再一個實施方案中，所述米糠的脂肪酸組成包含大于大約40%的油酸，優選大于大約50%的油酸，還更優選大于大約60%的油酸。在一個實施方案中，所述米糠的脂肪酸組成處于48-80%的油酸、6-16%的棕櫚酸和10-25%的亞油酸的范圍。在又一個實施方案中，所述米糠的脂肪酸組成包含小于大約16%的棕櫚酸，優選小于大約15%的棕櫚酸，更優選小于大約14%的棕櫚酸，更優選小于大約13%的棕櫚酸，還更優選小于大約12%的棕櫚酸。在另一個實施方案中，所述米糠的脂肪酸組成包含小于大約25%的亞油酸，優選小于大約20%的亞油酸，還更優選小于大約15%的亞油酸。另一方面，本發明提供了水稻種子，其脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸、小于大約17%的棕櫚酸、小于大約30%的亞油酸和/或其任何組合。在一個實施方案中，油酸與亞油酸的比率大于1.5:1，優選大于2:1，更優選大于3:1，還更優選大于4:1。在另一個實施方案中，所述水稻種子的脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸、小于大約17%的棕櫚酸和小于大約30%的亞油酸。在再一個實施方案中，所述水稻種子的脂肪酸組成(即種子內的油)包含大于大約40°/。的油酸，優選大于大約50%的油酸，還更優選大于大約60%的油酸。在一個實施方案中，所述水稻種子的脂肪酸組成處于48-80%的油酸、6-16%的棕櫚酸和10-25%的亞油酸的范圍。在又一個實施方案中，所述水稻種子的脂肪酸組成包含小于大約16%的棕櫚酸，優選小于大約15%的棕櫚酸，更優選小于大約14%的棕櫚酸，更優選小于大約13%的棕櫚酸，還更優選小于大約12%的棕櫚酸。在另一個實施方案中，所述水稻種子的脂肪酸組成包含小于大約25%的亞油酸，優選小于大約20%的亞油酸，還更優選小于大約15%的亞油酸。在關于米糠或水稻種子的上述任何實施方案中，脂肪酸組成典型通過提取油并通過FAME/GC分析加以確定，如實施例1所述。各個脂肪酸的組成以占油中總脂肪酸的百分比(w/w)表示。另一方面，本發明提供了產生本發明的米糠油、米糠和/或水稻種子的水稻植物。另一方面，本發明提供了分離的多核苷酸，當其存在于水稻植物的細胞中時，與沒有所述多核苷酸的細胞相比下調和/或多肽在所述細胞中的活性水平。18優選地，所述多核苷酸與能指導所述多核苷酸在水稻植物細胞中表達的啟動子可操縱地連接。在一個實施方案中，所述多核苷酸下調從至少一個和/或基因表達的mRNA水平。合適的多核苷酸的例子包括但不限于選自如下的多核苷酸反義多核苷酸，有義多核苷酸，催化性多核苷酸，微小RNA(microRNA),編碼結合FaW或多肽的多肽的多核苷酸和雙鏈RNA。在一個實施方案中，所述多核苷酸是反義多核苷酸，其在生理條件下與包含SEQIDNO:5-8、11-14或者19-25所示任一或多個核苷酸序列的多核苷酸雜交。在再一個實施方案中，所述多核苷酸是催化性多核苷酸，其能切割包含SEQIDNO:5-8、11-14或者19-25所示任一或多個核苷酸序列的多核苷酸。在另一個實施方案中，所述多核苷酸是包含寡核苷酸的雙鏈RNA(dsRNA)分子，所述寡核苷酸包含SEQIDNO:5-8、11-14或者19-25所示任一或多個核苷酸序列的至少19個連續核苷酸，其中所述分子的雙鏈部分長度為至少19堿基對且包含所述寡核苷酸。優選地，所述dsRNA從單啟動子表達，其中雙鏈部分的鏈通過單鏈部分連接。構建載體以產生這種dsRNA分子的例子在實施例5中提供。在優選的實施方案中，所述多核苷酸或其鏈在嚴格條件下能與包含SEQIDNO:5-8、11-14或者19-25所示任一或多個核苷酸序列的多核苷酸雜交。另一方面，本發明提供了一種鑒別多核苷酸的方法，所述多核苷酸存在于水稻植物細胞中時，與沒有所述多核苷酸的細胞相比下調所述細胞中i^d2和/或多肽的活性水平，所述方法包括i)確定候選多核苷酸下調細胞中和/或i^W多肽活性水平的能力，及ii)選擇下調細胞中和/或多肽活性水平的多核苷酸。步驟i)可依賴于例如分析細胞中和/或多肽的量或酶活性或者編碼F^^和/或i^W多肽的mRNA量。或者，步驟i)可包括分析細胞或者包含所述細胞的種子或植物的脂肪酸含量。優選地，步驟i)包括在植物細19胞、更優選在水稻細胞中導入候選多核苷酸或者包含與候選多核苷酸可操縱地連接的啟動子的嵌合DNA，還更優選包括從所述植物細胞再生轉基因植物以及從轉基因植物產生種子的步驟。候選基因可以是一組候選基因之一，至少為2或3個。本發明因此提供了本發明的多核苷酸在篩選方法中的應用。多核苷酸可以是但不限于是反義多核苷酸，有義多核苷酸，催化性多核苷酸，微小RNA，編碼結合F^O或7^W多肽的多肽的多核苷酸和雙鏈RNA。在一個實施方案中，所述反義多核苷酸在生理條件下與包含SEQIDNO:5-8、11-14或者19-25所示任一或多個核苷酸序列的多核苷酸雜交。在另一個實施方案中，所述催化性多核苷酸能切割包含SEQIDNO:5-8、11-14或者19-25所示任一或多個核苷酸序列的多核苷酸。在再一個實施方案中，所述雙鏈RNA(dsRNA)分子包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQIDNO:5-8、11-14或者19-25所示任一或多個核苷酸序列的至少19個連續核苷酸，其中所述分子的雙鏈部分長度為至少19堿基對且包含所述寡核苷酸。本發明還提供了使用本發明的方法鑒別的分離的多核苷酸。另一方面，本發明提供包含或者編碼本發明多核苷酸的載體。優選地，所述多核苷酸或者編碼所述多核苷酸的序列與啟動子可操縱地連接。優選地，所述啟動子賦予所述多核苷酸相對于水稻植物的至少一種其它組織或器官而優先在所述植物的胚、胚乳、糠皮和/或種子中表達。本發明還提供了包含本發明的載體和/或本發明的多核苷酸的細胞。在一個實施方案中，所述多核苷酸或載體被導入所述細胞或者所述細胞的袓細胞中。在再一個實施方案中，所述細胞是水稻細胞或者農桿菌(^4gro6acte"',)細胞。優選地，所述多核苷酸被整合進所述細胞的基因組中。另一方面，本發明提供了包含本發明細胞的水稻植物。再一方面，本發明提供了產生本發明細胞的方法，所述方法包括將本發明的多核苷酸或者載體導入細胞中的步驟。優選地，所述方法進一步包括從所述細胞再生轉基因植物的步驟。本發明還提供了本發明的多核苷酸或載體在生產重組細胞中的應用。再一方面，本發明提供了遺傳修飾的水稻植物，其中與相應未修飾的植物相比，所述植物相中具有FaW和/或活性的多肽表達降低。優選地，所述植物已經被轉化為包含本發明的多核苷酸或者其包含所述多核苷酸的后代植物。再一方面，本發明提供了一種產生本發明米糠油、米糠和/或水稻種子的方法，所述方法包括將水稻植物暴露于F^/2或多肽的拮抗劑。另一方面，本發明提供了一種獲得遺傳修飾的水稻植物的方法，所述水稻植物可用于產生與未修飾的糙米種子相比貯存期延長的糙米種子，所述方法包括對所述植物進行遺傳操作，由此與產生未修飾的糙米種子的相應植物相比，F^^禾B/或FWS多肽的活性和/或產生水平在所述水稻種子中降低。優選地，i^/2和/或多肽的活性和/或產生水平僅在所述植物種子中降低。在一個實施方案中，i^W2多肽的活性和/或產生水平降低。在再一個實施方案中，所述轉基因植物包含本發明的多核苷酸或載體。另一方面，本發明提供了使用本發明的方法產生的遺傳修飾的水稻植物或其后代。另一方面，本發明提供了一種選擇水稻植物的方法，該植物可用于產生本發明的米糠油、米糠和/或水稻種子，所述方法包括i)篩選誘變的水稻種子或者水稻植物群，及ii)選擇能產生本發明的米糠油、米糠和/或水稻種子的種子或植物。在一個實施方案中，步驟i)包括分析誘變的種子和/或植物的具有F""2或i^W活性的多肽。在另一個實施方案中，步驟i)包括分析誘變的種子和/或植物的Fad2或基因的序列和/或表達水平。在再一個實施方案中，步驟i)包括分析誘變的種子和/或植物的油、糠和/或種子的脂肪酸組成。另一方面，本發明提供了一種選擇水稻植物的方法，該植物可用于產生本發明的米糠油、米糠和/或水稻種子，所述方法包括i)分析得自候選水稻植物的米糠油、米糠和/或種子的脂肪酸含量，及21ii)選擇可用于產生本發明的米糠油、米糠和/或水稻種子的水稻植物。再一方面，本發明提供了一種選擇水稻植物的方法，該植物可用于產生本發明的米糠油、米糠和/或水稻種子，所述方法包括-i)分析候選植物樣品的具有或活性的多^:，及ii)基于所述多肽的序列、產生水平和/或活性選擇可用于產生本發明的米糠油、米糠和/或水稻種子的水稻植物。另一方面，本發明提供了一種選擇水稻植物的方法，該植物可用于產生本發明的米糠油、米糠和/或水稻種子，所述方法包括i)分析候選植物的或FW5基因的序列和/或表達水平，及ii)基于所述基因的序列和/或表達水平選擇可用于產生本發明的米糠油、米糠和/或水稻種子的水稻植物。再一方面，本發明提供了一種鑒別可用于產生本發明的米糠油、米糠和/或水稻種子的水稻植物的方法，所述方法包括檢測所述植物的核酸分子，其中所述核酸分子與植物中F"^2基因和/或F"W基因的至少一部分連接和/或包含所述部分。另一方面，本發明提供了一種鑒別可用于產生貯存期延長的糙米種子的水稻植物的方法，所述方法包括檢測植物的核酸分子，其中所述核酸分子與植物中Fad2基因和/或FatB基因的至少一部分連接和/或包含所述部分。在一個實施方案中，上述兩種方法包括i)使第二種核酸分子與得自所述植物的所述核酸分子雜交，ii)任選地使至少一種其它核酸分子與得自所述植物的所述核酸分子雜交，及iii)檢測所述雜交步驟的產物或者所述雜交步驟產物的不存在。在一個實施方案中，所述第二種核酸分子用作引物以逆轉錄或者復制所述核酸分子的至少一部分。可以使用任何技術檢測核酸，所述技術例如但不限于限制片段長度多態性分析、擴增片段長度多態性分析、微衛星擴增和/或核酸測序。在一個實施方案中，所述方法包括核酸擴增。在另一個實施方案中，所述方法分析基因的表達水平。本發明還提供了一種獲得水稻植物或種子的方法，所述方法包括22i)使第一種親代水稻植物與第二種親代水稻植物雜交，所述第一種親代水稻植物包含賦予植物谷粒油中油酸比例增加的F""2等位基因，所述第二種親代水稻植物包含賦予植物谷粒油中棕櫚酸比例降低的等位基因，ii)從雜交后代中篩選存在這兩個等位基因的后代植物或谷粒，及iv)選擇包含這兩個等位基因且植物谷粒油中油酸比例增加以及棕櫚酸比例降低的后代植物或谷粒。另一方面，本發明提供了一種將F"d2等位基因導入水稻植物中的方法，所述方法包括i)使第一種親代水稻植物與第二種親代水稻植物雜交，其中第二種植物包含所述等位基因，及ii)使步驟i)的雜交后代與和第一種親代植物相同基因型的植物回交足夠次數以產生具有第一種親代植物大部分基因型但是包含所述等位基因的植物，iii)選擇具有第一種植物的大部分基因型且包含所述等位基因的植物，其中所述等位基因賦予植物的油、糠和/或種子中油酸的比例增加。再一方面，本發明提供了一種將F"^等位基因導入水稻植物中的方法，所述方法包括i)使第一種親代水稻植物與第二種親代水稻植物雜交，其中第二種植物包含所述等位基因，及ii)使步驟i)的雜交后代與和第一種親代植物相同基因型的植物回交足夠次數以產生具有第一種親代植物大部分基因型但是包含所述等位基因的植物，iii)選擇具有第一種植物的大部分基因型且包含所述等位基因的植物，其中所述等位基因賦予植物的油、糠和/或種子中棕櫚酸的比例降低。再者，本發明提供了一種增加水稻植物的油、糠和域種子中油酸比例的方法，所述方法包括對所述植物進行遺傳操作，由此當與野生型植物相比時Fad2多肽的產生減少，其中所述多肽具有A12去飽和酶活性。再一方面，本發明提供了一種降低水稻植物的油、糠和/或種子中棕櫚酸比例的方法，所述方法包括對所述植物進行遺傳操作，由此當與野生型植物相比時F^B多肽的產生減少，其中所述多肽具有(i^W)活性。本發明還提供了使用本發明的方法獲得的水稻植物或者其后代植物。另一方面，本發明提供了得自本發明植物的米糠油。另一方面，本發明提供了得自本發明植物的米糠。另一方面，本發明提供了得自本發明植物的水稻種子。再者，本發明提供了一種產生種子的方法，所述方法包括a)生長本發明的植物，及b)收獲種子。再一方面，本發明提供了包含本發明的米糠油、米糠和/或水稻種子的食品°另一方面，本發明提供了制備食品的方法，所述方法包括在本發明的米糠油中烹調可食用物質。顯然，本發明一方面的優選特征和特性可適用于本發明的許多其它方面。在本說明書中，單詞"包含"應理解為意味著包含指定要素、整數或步驟、或一組要素、整數或步驟，但是不排除任何其它要素、整數或步驟、或一組要素、整數或步驟。本發明在后文通過非限制性實施例以及附圖加以描述。附圖簡述圖1:高等植物的質體和細胞溶膠中主要的脂肪酸生物合成途徑。圖2:水稻蛋白的序列對比。ProteinFATB2=SEQIDNO:l，proteinFATB3=SEQIDNO:2，proteinFATBl=SEQIDNO:3，proteinFATB4=SEQIDN0:4。圖3:水稻F加5基因結構。L0C—Os02g4=SEQIDN0:5，LOC-Osllg4=SEQIDNO:6，LOC-Os06gO=SEQIDN0:7，LOC-Os06g3=SEQIDN0:8。圖4:通過ClustalW對比F"f5基因序列。使用默認參數，注意"基因"是不同長度的。圖5:相應于LOC-Os6g05130的基因外顯子-內含子結構。上面一行相應于mRNA編碼序列(SEQIDNO:9)的起始處，成對的第二行相應于基因(SEQIDNO:10)。圖6:四個F"W同工型的編碼序列對比示出分別以小寫字母和大些字母交替表示的連續外顯子以及用于通過RT-PCR區分同工型的引物的位置(下劃線處)。起始密碼子(起始位置l)以粗體表示。AC108870=SEQIDNO:11，AP005291=SEQIDNO:12，AP000399=SEQIDNO:13，AP004236=SEQIDNO:14。圖7:通過ClustalW對比Fad2同工型的推導的多肽序列。注意F—1品系相應于Os02g48560，F—2相應于Os07g23410，F—3相應于Os07g23430，O—4相應于Os07g23390。使用ClustalW(Fast)程序默認參數。ProteinF—1=SEQIDNO:15，ProteinF—3=SEQIDNO:16，ProteinF—2=SEQIDNO:17，ProteinF—4=SEQIDNO:18。圖8:i^W序列的對比示出同工型AP004047中5'UTR位置(小寫字母)和用于通過RT-PCR進行擴增的引物的位置(下劃線處)。終止密碼子的位置在方框中示出，終止密碼子下游的非翻譯區以小寫字母表示。AP005168=SEQIDNO:19，AP004047=SEQIDNO:20，Contig2654=SEQIDNO:21。圖9:水稻FaW基因結構。圖10:水稻尺W2基因的蛋白質編碼區的核苷酸序列對比。品系0一2相應于Os07g23410，0—4相應于Os07g233卯，0—1相應于Os02g48560，0—3相應于Os07g23410。使用ClustalW程序默認參數。CdsFAD20—2=SEQIDNO:22，CdsFAD20—4=SEQIDNO:23，CdsFAD20—1=SEQIDNO:24，CdsFAD20一3=SEQIDNO:25。圖11:通過GC分析指定基因型谷粒的總油級分確定的棕櫚酸、油酸和亞油酸的相對百分比示意圖。圖12:在對指定基因型谷粒進行的GC總脂質分析中棕櫚酸與油酸的相對百分比示意圖。圖13:在對指定基因型谷粒進行的GC總脂質分析中亞油酸與油酸的相對百分比示意圖。圖14:散點圖示出指定基因型的水稻植物谷粒中亞油酸對油酸的百分比。注意這兩種脂肪酸量之間的關系(反應在直線的斜率中)在分析的所有品系中基本相同，但是庫大小容量(poolsizecapacity)看起來不同(以不同品系沿著分析的空間位移表示)。圖15:不同基因型的亞油酸對棕櫚酸的百分比散點圖。注意FW5中受影響的品系與在i^W中受影響的品系的不同斜率。這提示這些成分之間的關系在不同基因型中是不同的，很可能反映了影響步驟中的不同。25圖16:不同基因型的油酸對棕櫚酸百分比散點圖。注意斜率的不同。圖17:對Fa6/2RNAi植物和FaWRNAi植物的油組成變異的主成分分析示意圖。結果示出主成分2是亞油酸對油酸，主成分2是棕櫚酸對亞油酸和油酸。圖18:Western印跡示出抗肽抗血清反應。通過SDS-PAGE分析FflW-99抗總葉蛋白提取物。在Tos-17品系中缺少大約20kDa的肽。圖中示出用免疫前血清的反應。R是指FaWRNAi品系，T是指Tos-17品系，Wl和W2是野生型。序列表索引SEQIDNO:l-水稻FatB2蛋白SEQIDNO:2-水稻FatB3蛋白SEQIDNO:3-水稻FatBl蛋白SEQIDNO:4-水稻FatB4蛋白SEQIDNO:5-水稻FatB3基因SEQIDNO:6-水稻FatB2基因SEQIDNO:7-水稻FatBl基因SEQIDNO:8-水稻FatB4基因SEQIDNO:9-編碼水稻FatBl蛋白的cDNA.SEQIDNO:10-編碼水稻FatBl蛋白的基因(僅部分序列，見圖5-包括所有外顯子序列和一些側翼序列和內含子序列)SEQIDNO:ll-編碼水稻FatB2蛋白的開放讀框SEQIDNO:12-編碼水稻FatB3蛋白的開放讀框SEQIDNO:13-編碼水稻FatBl蛋白的開放讀框SEQIDNO:14-編碼水稻FatB4蛋白的開放讀框SEQIDNO:15-水稻Fad2同工型1SEQIDNO:16-水稻Fad2同工型3SEQIDNO:17-水稻Fad2同工型2SEQIDNO:18-水稻Fad2同工型4SEQIDNO:19-水稻Fad2-3cDNASEQIDNO:20畫水稻Fad2-1cDNA.26SEQIDNO:21-水稻Fad2畫2cDNASEQIDNO:22-編碼水稻Fad2-2的開放讀框SEQIDNO:23-編碼水稻Fad2-4的開放讀框SEQIDNO:24-編碼水稻Fad2-1的開放讀框SEQIDNO:25-編碼水稻Fad2-3的開放讀框SEQIDNO:26-FatB共有序列SEQIDNO:27-33-Fad2共有序列SEQIDNO:34-55和60-63-寡核苷酸引物SEQIDNO:56-59-抗原性水稻FatB肽SEQIDNO:64-83-可用于RNAi的單鏈分子序列發明詳述一般技術除非特別指出，本文所用所有技術和科學術語均具有本領域技術人員通常了解的相同含義(例如在細胞培養、植物分子生物學、分子遺傳學、免疫學、免疫組織化學、蛋白質化學和生物化學領域)。除非特別指出，本發明利用的重組蛋白、細胞培養和免疫學技術均是為本領域技術人員熟知的標準程序。這些技術在例如如下文獻中描述和解禾畢J.Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning,JohnWileyandSons(1984)，J.Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratoryPress(1989)，T.A.Brown(editor),EssentialMolecularBiology:APracticalApproach,Volumes1and2，IRLPress(1991)，D.M.GloverandB.D.Hames(editors),DNACloning:APracticalApproach,Volumes1-4，IRLPress(1995and1996)和F.M.Ausubeletal.(editors),CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePub.AssociatesandWiley-Interscience(1988,包括迄今為止的所有更新)，EdHarlowandDavidLane(editors)Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratory,(1988)，以及J.E.Coliganetal.(editors)CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons(包括迄今為止的所有更新)。選擇的定義如本文所用，術語"Fa^多肽"是指進行將油酸轉變為亞油酸的去飽和酶反應的蛋白質。因此，術語"F"&活性"是指將油酸轉變為亞油酸。這些脂肪酸可以是酯化形式，例如是磷脂的一部分。水稻F^/2多肽的例子包括包含圖7和SEQIDNO:15-18所示的一種氨基酸序列的蛋白質以及其變體和/或突變體。這種變體和/或突變體與圖7和SEQIDNO:15-18所示任一多肽可是至少80%、更優選至少90%、更優選至少95%、還更優選至少99%相同的。多核苷酸"或"&&基因"編碼F"W多肽。多核苷酸的例子包括包含圖8或圖10以及SEQIDNO:19-25所示的一種核苷酸序列的核酸以及其等位基因變體和/或突變體。尸"d2基因的例子包括包含圖8和SEQIDNO:19-21所示的一種核苷酸序列的核酸以及其等位基因變體和/或突變體。這種等位基因變體和/或突變體與圖8和/或圖10和/或SEQIDNO:19-25所示任一多核苷酸可是至少80%、優選至少90%、更優選至少95%、還更優選至少99%相同的。如本文所用，術語"FaW多肽"是指水解棕櫚酰-ACP產生游離棕櫚酸的蛋白質。因此，術語"F"W活性"是指水解棕櫚酰-ACP產生游離棕櫚酸。水稻多肽的例子包括包含圖2和SEQIDNO:l-4所示的一種氨基酸序列的蛋白質以及其變體和/或突變體。這種變體和/或突變體與圖2和SEQIDNO:l-4所示任一多肽可是至少80。/。、優選至少90%、更優選至少95%、還更優選至少99%相同的。"FW5多核苷酸"或"7^5基因"編碼多肽。多核苷酸的例子包括包含圖4和圖6以及SEQIDNO:5-8和11-14所示的一種核苷酸序列的核酸以及其等位基因變體和/或突變體。F"W基因的例子包括包含圖4和SEQIDNO:5-8所示的一種核苷酸序列的核酸以及其等位基因變體和/或突變體。這種等位基因變體和/或突變體與圖4和/或圖6和/或SEQIDNO:5-8及11-14所示任一多核苷酸可是至少80%、優選至少90%、更優選至少95%、還更優選至少99%相同的。如本文所用，術語"水稻"是指稻屬的任何物種，包括其祖先，以及通過與其它物種雜交產生的后代。優選所述植物是商業培育的稻屬物種例如稻(Oryzasativa)的株系或栽培種或者變種或者適于商業產生谷粒的品系。如本文所用，術語"米糠油"是指得自水稻植物的種子/谷粒或者其一部分如糠皮的組合物，其包含至少60Q/。(w/w)脂質。米糠油在室溫典型是液態。優選地，所述脂質包含長度為至少6個碳原子的脂肪酸。所述脂肪酸典型是酯化形式，例如三酰甘油、磷脂。本發明的米糠油包含油酸。本發明的米糠油也可以包含至少一些其它脂肪酸，例如棕櫚酸、亞油酸、豆蔻酸、硬脂酸和/或亞麻酸。所述脂肪酸可以是游離脂肪酸和/或三酰甘油(TAG)。在一個實施方案中，本發明的米糠油中至少50%、更優選至少70%、更優選至少80M的脂肪酸是TAG。本發明的米糠油可以形成水稻谷粒/種子或其部分如糊粉層或胚/盾片，其統稱作"米糠"。或者，本發明的米糠油已經從水稻谷粒/種子或者米糠中提取。這種提取方法的例子在實施例1中提供。因此，在一個實施方案中，本發明的"米糠油"是"基本純化的"或者"純化的"米糠油，其已經與一或多種其它脂質、核酸、多肽或者與其天然狀態相關的其它污染分子分開。優選所述基本純化的米糠油至少60%、更優選至少75%、更優選至少90%沒有預期天然相關的其它成分。在優選的實施方案中，當與完整種子/谷粒或者糠中比率相比時，提取時油酸與亞油酸、棕櫚酸與油酸和/或棕櫚酸與亞油酸的比率無明顯改變(例如不超過5%的變化)。在再一個實施方案中，米糠油未暴露于如氫化等方法，與完整種子/谷粒或者糠中比率相比時，所述方法可以改變油酸與亞油酸的比率、棕櫚酸與油酸的比率和/或棕櫚酸與亞油酸的比率。本發明的米糠油可進一步包含非脂肪酸分子，例如但不限于，谷維素和固醇。米糠油可以通過本領域已知的任何方法從水稻種子或者糠中提取。這典型包括用非極性溶劑提取，所述溶劑例如是乙醚、石油醚、氯仿/甲醇或者丁醇混合物。谷粒中與淀粉相關的脂質可以用水-飽和丁醇提取。米糠油可以通過本領域已知方法"脫膠"以除去多糖或者以其它方式處理以除去污染物或者改良純度、穩定性或者色澤。油中的三酰甘油及其它酯可以被水解釋放游離脂肪酸或者如本領域所已知對油進行氫化或者經化學或酶處理。從水稻種子或者糠中提取后的米糠油典型包含稱作Y-谷維素的脂質基團。如本文所用，"包含Y-谷維素"是指所述油中存在至少0.in/。(w/w)Y-谷維素化合物。在提取后和從TAG取出之前的米糠油中Y-谷維素的水平典型為1.5-3.5。/。(w/w)。所述化合物典型是阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基桂皮酸)的固醇酯及其它三萜酯的混合物。阿魏酸環阿屯酯(Cycloartenylferulate)、24-亞甲基環阿屯醇阿魏酸酯(24-methylenecycloartanylferulate)和菜油甾醇阿魏酸酯(campesterylferulate)是谷維素中的主要阿魏酸酉旨，阿魏酸(3-谷甾醇酯和阿魏酸豆甾醇酯水平較低。據認為Y-谷維素的存在幫助米糠油的食用者對抗慢性疾病如心臟病和癌癥，因此Y-谷維素的存在是有益的。如本文所用，術語"米糠"是指內部精白米谷粒與水稻種子/谷粒的外殼之間的層(糊粉層)以及谷粒的胚/盾片。米糠通過對糙米拋光產生精白米的主要副產物。如本文所用，術語"貯存期延長"是指通過本發明的方法產生的種子/谷粒在收獲時可以作為糙米貯存，與例如自野生型(未遺傳修飾的)水稻植物中收獲的糙米相比可貯存更長時間。如本文所述，一種測量糙米的"貯存期延長"的方法是在4(TC貯存至少8周后測量己醛產生情況(見實施例8)。術語"植物"包括完整植物、植物結構(例如葉、莖)、根、花器官/結構、種子(包括胚、胚乳和種皮)、植物組織(例如維管結構、基本組織等)、細胞及其后代等。"轉基因植物"、"遺傳修飾的植物"或者其變化用語是指含有在相同物種、變種或栽培種的野生型植物中未發現的基因構建體(轉基因)的植物。"轉基因"在本文具有生物
技術領域：
的正常含義，包括通過重組DNA或RNA技術產生或改變的并已經導入植物細胞中的遺傳序列。轉基因可包括衍生自植物細胞的遺傳序列。典型地，轉基因通過人工操作例如通過轉化方法導入植物中，但是可以使用本領域技術人員公認的任何方法。術語"種子"和"谷粒"在本文可互換應用。"谷粒"通常是指成熟的、收獲的谷粒，但是根據情況也可以是指吸漲或發芽后的谷粒。成熟谷粒的含水量通常小于大約18-20%。如本文所用，術語"相應未修飾的植物"是指野生型植物。如本文所用"野生型"是指未根據本發明進行修飾的細胞、組織或植物。野生型細胞、組織或植物可以用作對照物以與如本文所述修飾的細胞、組織或植物對比外源核酸的表達水平或者性狀修飾的程度和性質。適于作為參考標準的野生型水稻變種包括Nipponbare。"核酸分子"是指寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段。其可以是源于基因組或合成的DNA或RNA，雙鏈或單鏈DNA或RNA，以及如本文限30定與碳水化合物、脂質、蛋白質或者其它物質組合以進行特定活性的DNA或RNA。術語"核酸分子"和"多核苷酸"可互換應用。多核苷酸的％相同性通過GAP(NeedlemanandWunsch，1970)分析(GCG程序)確定，gapcreationpenalty=5，gapextensionpenalty=0.3。除非特別指出，査詢序列的長度為至少45個核苷酸，所述GAP分析排列對比兩個序列的至少45個核苷酸的區域。優選地，查詢序列的長度為至少150個核苷酸，GAP分析排列對比兩個序列至少150個核苷酸的區域。更優選地，查詢序列的長度為至少300個核苷酸，GAP分析排列對比兩個序列至少300個核苷酸的區域。還更優選地，GAP分析排列對比兩個序列的全長。"寡核苷酸"可以是RNA、DNA或者其衍生物。盡管術語多核苷酸與寡核苷酸具有重疊的含義，但是寡核苷酸典型是相對短的單鏈分子。這種寡核苷酸的最小大小是為在寡核苷酸與靶核酸分子上互補序列之間形成穩定雜種所需的大小。優選地，所述寡核苷酸的長度為至少15個核苷酸，更優選至少18個核苷酸，更優選至少19個核苷酸，更優選至少20個核苷酸，還更優選至少25個核苷酸。如本文所用，術語"核酸擴增"是指使用DNA聚合酶增加核酸分子拷貝數的任何體外方法。核酸擴增導致核苷酸摻入DNA分子或者引物中，從而形成與DNA模板互補的新DNA分子。新形成的DNA分子可以用作模板以合成另外的DNA分子。如本文所用，"可操縱地連接"是指兩或多個核酸(例如DNA)節段之間的功能關系。典型地，其是指轉錄調節元件(啟動子)與轉錄序列的功能關系。例如，如果啟動子刺激或調節合適細胞中的編碼序列如本文所述多核苷酸的轉錄，則該啟動子與該編碼序列是可操縱地連接的。通常，與轉錄序列可操縱地連接的啟動子轉錄調節元件與轉錄序列是物理連續的，即它們是順式作用的。然而，一些轉錄調節元件如增強子不需要與轉錄由所述增強子增強的編碼序列物理連續或者位置緊密相鄰。如本文所用，采用術語"基因"的最廣泛的含義，包括脫氧核糖核苷酸序列，包含結構基因的蛋白質編碼區并且包括位于5，和3'末端距任一末端至少大約2kb且參與基因表達的編碼區鄰近的序列。位于編碼區5'且存在于mRNA上的序列稱作5'非翻譯序列。位于編碼區3'或下游且存在于mRNA上的序列稱作3'非翻譯序列。術語"基因"涵蓋了cDNA和基因的31基因組形式。基因的基因組形式或克隆含有由稱作"內含子"或者"間插區"或者"間插序列"的非編碼序列中斷的編碼區。內含子是被轉錄為核RNA(hnRNA)的基因節段；內含子可含有調節元件如增強子。內含子從核或初級轉錄物中被除去或"剪接除去"，因此在信使RNA(mRNA)轉錄物中沒有內含子。mRNA在翻譯期間起作用以指定初生多肽中氨基酸的序列或順序。術語"基因"包括編碼本發明所述全部或部分蛋白質的合成的或者融合分子以及上述任一序列的互補核苷酸序列。如本文所用，術語"遺傳連鎖的"或者相似用語是指染色體上標記基因座與第二個基因座足夠接近，其在50%以上的減數分裂中例如非隨機地一起遺傳。這個定義包括其中標記基因座和第二個基因座形成相同基因的一部分的情況。另外，這個定義包括其中標記基因座包含負責感興趣性狀的多態性的實施方案(換句話說，所述標記基因座與表型直接"連鎖"或者"完全連鎖")。在另一個實施方案中，所述標記基因座與第二個基因座是不同的，但在染色體上足夠接近，其在50%以上的減數分裂中一起遺傳。在每個世代遺傳連鎖基因座之間觀測到的重組百分比(厘摩(cM))小于50。在本發明的特殊實施方案中，遺傳連鎖基因座在染色體上可以相距45、35、25、15、10、5、4、3、2或lcM或更低。優選地，所述標記相距小于5cM，且最優選大約0cM。"等位基因"是指細胞、個體植物或者群體內的遺傳序列(如基因)的一種特殊形式，該特殊形式在序列上與相同基因的其它形式不同，在基因的序列中具有至少一個、通常具有一個以上的變異位點。在不同的等位基因之間不詞的這些變異位點的序列稱作"變異"、"多態性"或者"突變"。如本文所用，"多態性"是指不同物種、栽培種、株系或者植物個體的本發明基因座的等位基因之間核苷酸序列中的變化。"多態性位置"是基因序列中預先選擇的核苷酸位置。在一些情況中，遺傳多態性通過氨基酸序列變化而反映，因此多態性位置可以在多肽序列預定位置處氨基酸序列的多態性的位置。在其它情況中，多態性區域可以位于基因的非多肽編碼區中，例如在啟動子區域中，由此可以影響基因的表達水平。典型的多態性是缺失、插入或者取代。這些可以涉及單一核苷酸(單核苷酸多態性或SNP)或者兩或多個核苷酸。術語"多肽"和"蛋白質"可互換應用，是指可以或者不可以通過添加非氨基酸基團修飾的單多肽鏈。應理解這種多肽連可以與其它多肽或蛋白質或者其它分子如輔因子結合。如本文所用，術語"蛋白質"和"多肽"也可包括如本文所述本發明多肽的變體、突變體、修飾物、類似物和/或衍生物。多肽的。/。相同性通過GAP(NeedlemanandWunsch，1970)分析(GCG程序)確定，gapcreationpenalty=5，gapextensionpenalty=0.3。査i旬序歹U的長度為至少25個氨基酸，GAP分析排列對比兩個序列至少25個氨基酸的區域。更優選地，查詢序列的長度為至少50個氨基酸，GAP分析排列對比兩個序列至少50個氨基酸的區域。更優選地，查詢序列的長度為至少IOO個氨基酸，GAP分析排列對比兩個序列至少IOO個氨基酸的區域。還更優選地，査詢序列的長度為至少250個氨基酸，GAP分析排列對比兩個序列至少250個氨基酸的區域。甚至優選地，GAP分析排列對比兩個序列的全長。反義多核苷酸術語"反義多核苷酸"意味著DNA或RNA或者其組合，與編碼7^W或尸"d2多肽的特異mRNA分子的至少一部分互補且能干擾轉錄后事件如mRNA翻譯的分子。反義方法的應用為本領域所熟知(見例如G.HartmannandS.Endres,ManualofAntisenseMethodology,Kluwer(1999))。反義技術在植物中的應用參見Bourque，1995和Senior,1998所回顧。Bourque(1995)列出了作為一種基因失活方法反義序列怎樣用于植物系統中的大量實例。她還指出達到任何酶活性的100%抑制不是必需的，因為部分抑制更可能在該系統中產生可測量的改變。Senior(1998)指出反義方法目前是充分認定的操縱基因表達的技術。本發明的反義多核苷酸在生理條件下與靶多核苷酸雜交。如本文所用，術語"在生理條件下雜交的反義多核苷酸"是指所述多核苷酸(全部或部分單鏈)至少能與編碼如圖2或7或者SEQIDNO:l-4或者15-18所示蛋白質的mRNA在正常條件下在細胞、優選水稻細胞中形成雙鏈多核苷酸。反義分子可包括相應于結構基因的序列或者實現控制基因表達或剪接事件的序列。例如，反義序列可相應于本發明基因的靶向編碼區，或者5'-非翻譯區(UTR)或者3'-UTR或者這些區域組合。其可以與內含子序列部分互補，內含子序列可以在轉錄期間或之后被剪接除去，優選僅互補于靶基33因的外顯子序列。就通常高多樣化的UTR而言，靶向這些區域提供了基因抑制的更高特異性。反義序列的長度應為至少19個連續核苷酸，優選至少50個核苷酸，更優選至少100、200、500或1000個核苷酸。可以使用與完整基因轉錄物互補的全長序列。所述長度最優選為100-2000個核苷酸。反義序列與靶向轉錄物的相同性程度應為至少90%，更優選95-100%。反義RNA分子當然可以包含不相關的序列，其可發揮穩定所述分子的功能。催化性多核苷酸術語催化性多核苷酸/核酸是指DNA分子或者含有DNA的分子(在本領域也稱作"脫氧核酶")或者特異性識別獨特底物并催化該底物的化學修飾的RNA或含有RNA的分子(在本領域也稱作"核酶")。催化性核酸中的核酸堿基可以是堿基A、C、G、T(以及對于RNA的U)。典型地，催化性核酸含有特異性識別靶核酸以及核酸裂解酶活性的反義序列(在本文也稱作"催化結構域")。特別適于本發明的核酶的類型是錘頭核酶(HaseloffandGerlach,1988;Perrimanetal，1992)和發夾核酶(Shippyetal,1999)。本發明的核酶及編碼所述核酶的DNA可以通過使用本領域熟知的方法化學合成。所述核酶也可以從與RNA聚合酶啟動子可操縱地連接的DNA分子制備(在轉錄時產生RNA分子)，所述啟動子例如是T7RNA聚合酶或者SP6RNA聚合酶的啟動子。因此，本發明還提供了編碼本發明的催化性多核苷酸的核酸分子，即DNA或cDNA。當載體也含有與所述DNA分子可操縱地連接的RNA聚合酶啟動子時，所述核酶可以在體外與RNA聚合酶和核苷酸一起保溫而產生。在一個單獨的實施方案中，所述DNA可以插入表達盒或者轉錄盒中。在合成之后，RNA分子可以通過與具有穩定核酶的能力并使其對于RNase具有抗性的DNA分子連接而修飾。如同本文所述反義多核苷酸一樣，本發明的催化性多核苷酸應也能在"生理條件"下雜交靶核酸分子(例如編碼圖2或7或者SEQIDNO:l-4或15-18所示任何多肽的mRNA)，所述生理條件即在細胞內的那些條件(尤其是在植物細胞如水稻細胞中的條件)。RNA干擾RNA干擾(RNAi)特別適用于特異性抑制特定蛋白質的產生。盡管不希望受理論的限制，Waterhouseetal.(1998)已經提供了dsRNA(雙鏈RNA)可用于降低蛋白質產生的機制模型。這種技術依賴于dsRNA分子的存在，其含有與感興趣基因的mRNA、在本發明中編碼本發明多肽的mRNA或其一部分基本相同的序列。所述dsRNA可以方便地在重組載體或宿主細胞中從單啟動子產生，其中有義和反義序列的側翼是不相關的序列，這樣使得所述有義和反義序列能與形成環結構的不相關序列雜交形成dsRNA分子。適用于本發明的dsRNA分子的設計和產生為本領域技術人員所熟知，特別參見Waterhouseetal.(1998)，Smithetal.(2000)、WO99/32619、WO99/53050、WO99/49029和WO01/34815所述。在一個實例中，導入DNA，其指導與被失活的靶基因同源的至少部分雙鏈的RNA產物合成。因此所述DNA既包含有義序列也包含反義序列，但轉錄成RNA時可以雜交形成雙鏈RNA區。在優選的實施方案中，所述有義和反義序列由間隔區分隔，所述間隔區包含當轉錄成RNA時被剪接除去的內含子。這種方式已經示出獲得更高效率的基因沉默。雙鏈區可包含自任一或者兩個DNA區轉錄的一或兩個RNA分子。據認為雙鏈分子的存在引發內源植物系統的應答，破壞雙鏈RNA以及來自靶植物基因的同源RNA轉錄物，有效地降低或者消除靶基因的活性。雜交的有義和反義序列的長度均應為至少19個連續核苷酸，優選至少30或50個核苷酸，更優選至少100、200、500或者1000個核苷酸。可以使用相應于完整基因轉錄物的全長序列。所述長度最優選為100-2000個核苷酸。所述有義和反義序列與靶向轉錄物的相同性程度應至少為85%，優選至少90%，更優選為95-100%。RNA分子當然可以包含不相關的序列，該序列可發揮穩定該分子的功能。RNA分子可以在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III啟動子控制下表達。后者的例子包括tRNA或snRNA啟動子。優選的小干擾RNA(siRNA)分子包含與靶mRNA的大約19-21個連續核苷酸相同的核苷酸序列。優選地，靶mRNA序列從二核苷酸AA開始，包含大約30-70%的GC-含量(優選30-60%，更優選40-60°/。，更優選大約45%-55%)，且例如通過標準BLAST檢索確定，與除了其被導入的植物(優選水稻)基因組中的靶序列之外的任何核苷酸序列均不具有高百分比相同本發明dsRNA分子的例子在實施例5中提供。進一步的例子包括包含SEQIDNO:64-73(對于尸"W而言)和SEQIDNO:74-83(對于而言)所示序列的那些分子。微小RNA微小RNA調節是RNA沉默途徑的一個清楚限定的分支，使基因調控得以進展，與常規RNAi/PTGS不同。微小RNA是小RNA的一個特殊類別，其在組構為特征性反向重復中的基因樣元件中被編碼。當轉錄時，微小RNA基因產生莖:環前體RNA，從中微小RNA隨后被加工。微小RNA的長度典型為大約21個核苷酸。釋放的miRNA被摻入含有發揮序列特異性基因阻抑作用的Argonaute蛋白的特定亞類的RISC-樣復合物中(見例如MillarandWaterhouse，2005;Pasquinellietal,2005;AlmeidaandAllshire,2005)。共抑制可以使用的另一種分子生物學方法是共抑制。共抑制的機制還未完全了解，但是認為涉及轉錄后基因沉默(PTGS)，且與反義抑制的許多實例非常相似。所述方法包括將基因或其片段的額外拷貝以相對于啟動子有義方向導入植物中表達。所述有義片段、其與靶基因區域的對應以及其與靶基因的序列相同性程度如上文關于反義序列所述一樣。在一些情況中，基因序列的額外拷貝干擾靶植物基因的表達。參見WO97/20936和EP0465572中關于實施共抑制方法的內容。核酸雜交在一個實施方案中，本發明的多核苷酸或其鏈在生理條件下與包含SEQIDNO:5-8、11-14或者19-25所示任一或多個核苷酸序列的多核苷酸雜交。在再一個實施方案中，本發明的多核苷酸或其鏈在嚴格條件下還與包含SEQIDNO:5-8、11-14或19-25所示任一或多個核苷酸序列的多核苷酸雜交。如本文所用，短語"嚴格條件"是指在此條件下多核苷酸、探針、引物和/或寡核苷酸與其靶序列雜交，但是與其它序列不雜交。嚴格條件是序36列依賴性的，且在不同情況中有所不同。較長的序列與較短的序列相比在較高溫度下特異性雜交。通常，針對特定序列在指定離子強度和pH條件下，選擇低于熱解鏈點(Tm)大約5t:的嚴格條件。所述Tm是這樣的溫度(在指定離子強度、pH和核酸濃度下)，即在此溫度下50%的與靶序列互補的探針與靶序列雜交達到平衡。由于靶序列通常是過量存在的，因此在Tm，50%的探針處于平衡狀態。典型地，嚴格條件是其中鹽濃度低于大約l.OM鈉離子，典型為大約0.01至l.OM鈉離子(或者其它鹽)，pH7.0-8.3,對于短探針、引物或者寡核苷酸(例如10nt-50nt)而言，溫度為至少大約3(TC，對于較長的探針、引物和寡核苷酸而言，溫度為至少大約6(TC。嚴格條件也可以通過加入去穩定劑如甲酰胺而實現。嚴格條件為本領域技術人員所已知，可見于Ausubeletal.(如前),CurrentProtocolsInMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6以及本發明的實施例所述。優選地，所述條件是這樣的條件，即彼此至少大約65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%或99%同源的序列典型地保持彼此雜交。嚴格雜交條件的一個非限制性例子是在高鹽緩沖液中在65°C雜交，隨后在50'C在0.2XSSC、0.0P/。BSA中洗滌一或多次，所述高鹽緩沖液包含6XSSC、50mMTris畫HCl(pH7.5)、lmMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02。/。BSA以及500mg/ml變性鮭精DNA。在另一個實施方案中，提供了可以與包含SEQIDNO:5-8、11-14或19-25所示核苷酸序列的核酸分子在中等嚴格條件下雜交的核酸序列。中等嚴格雜交條件的一個非限制性例子是在6XSSC、5XDenhardt's溶液、0.5%SDS和100mg/ml變性鮭精DNA中在55。C雜交，隨后在1XSSC、0.1%SDS中在37'C洗滌一或多次。可以使用的其它中等嚴格條件為本領域所熟知，見例如Ausubdetal.(如前)禾口Kriegler，1990;GeneTransferAndExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY所述。在又一個實施方案中，本發明提供了可以與包含SEQIDNO:5-8、11-14或19-25所示核苷酸序列的核酸分子在低嚴格條件下雜交的核酸。低嚴格雜交條件的一個非限制性例子是在35%甲酰胺、5XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.2%BSA、100mg/ml變性鮭精DNA、10%(wt/vol)硫酸葡聚糖中在4(TC雜交，隨后在2XSSC、25rnMTris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA和0.1%SDS中在50"C洗滌一或多次。可以使用的其它低嚴格條件為本領域所熟知，見例如Ausubeletal.(如前)禾口Kriegler,1990，GeneTransferAndExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY以及本發明提供的實施例所。核酸構建體，載體和宿主細胞本發明包括遺傳修飾的水稻植物的產生，其中與相應的未修飾的植物相比，所述植物中具有和/或活性的多肽的表達降低。用于產生上述轉基因植物的核酸構建體可以易于使用標準技術產生。當插入編碼mRNA的區域時，所述構建體可包含內含子序列。這些內含子序列可有助于所述轉基因在植物中表達。術語"內含子"以其通常的含義使用，是指被轉錄的但是不編碼蛋白質且在翻譯之前從RNA中被剪接除去的遺傳節段。如果所述轉基因編碼翻譯產物,則內含子可以摻入5'-UTR或者編碼區中，或者如果其不編碼翻譯產物則可以摻入轉錄區的任何地方。然而，在優選的實施方案中，任何多肽編碼區均以單一開放讀框提供。本領域技術人員將意識到這種開放讀框可以通過逆轉錄編碼所述多肽的mRNA獲得。為了保證編碼感興趣mRNA的基因合適表達，所述核酸構建體典型包含一或多個調節元件如啟動子、增強子以及轉錄終止序列或者聚腺苷酸化序列。這種元件為本領域所熟知。可以提供包含調節元件的轉錄起始區，以在植物中調節表達或者組成型表達。優選地，表達至少在胚、胚乳、糠皮、發育中的種子和/或成熟種子(谷粒)的細胞中發生。在另一個實施方案中，調節元件可以是非特異于種子細胞的啟動子(如遍在蛋白啟動子或者CaMV35S或者增強的35S啟動子)。可用于本發明中的種子特異性啟動子的例子包括但不限于小麥低分子量麥谷蛋白啟動子(Colotetal，1987)、在小麥種子中表達ot-淀粉酶的啟動子(Stefanovetal.，1991)以及大麥醇溶蛋白啟動子(Brandtetal.,1985)。己經描述了在植物細胞中具有活性的許多組成型啟動子。對于在植物中組成型表達合適的啟動子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、Figwort花葉病毒(FMV)35S啟動子、甘蔗桿狀病毒啟動子、鴨跖草黃斑駁病毒啟動子、來自核酮糖-l，5-二-磷酸羧化酶的小亞基的光誘導啟動子、水稻胞液磷酸丙糖異構酶啟動子、擬南芥"ra6/A/w》)腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶啟動子、水稻肌動蛋白1基因啟動子、甘露堿合酶和章魚堿合酶啟動子、Adh啟動子、蔗糖合酶啟動子、R基因復合物啟動子以及葉綠素OC/卩結合蛋白基因啟動子。這些啟動子已經用于產生在植物中表達的DNA構建體；見例如PCT出版物WO8402913所述。所有這些啟動子均已經用于產生各種類型的植物可表達的重組DNA載體。啟動子可以通過如溫度、光或者應激等因素調節。通常，調節元件提供在表達的遺傳序列的5'。所述構建體也可以含有增強轉錄的其它元件，如nos3'或者ocs3'聚腺苷酸化區域或者轉錄終止子。5'非翻譯前導序列可以衍生自選擇的啟動子，所述啟動子表達本發明多核苷酸的異源基因序列，且如果需要則可以特異性修飾以增加mRNA的翻譯。見Kozieletal.(1996)關于轉基因的優化表達的回顧。5'非翻譯區也可以得自植物病毒RNA(煙草花葉病毒、煙草蝕刻病毒、玉米矮花葉病毒、苜蓿花葉病毒等)，得自合適的真核基因、植物基因(小麥和玉米葉綠素a/b結合蛋白基因前導序列)，或者得自合成的基因序列。本發明不限于其中非翻譯區衍生自伴隨啟動子序列的5'非翻譯序列的構建體。前導序列也可以衍生自不相關的啟動子或者編碼序列。可用于本發明的前導序列包含玉米Hsp70前導序列(U.S.5,362,865和U.S.5,859,347)以及TMVomega元件。轉錄的終止通過在嵌合載體中3'非翻譯序列與感興趣的多核苷酸可操縱地連接而完成。重組DNA分子的3'非翻譯區含有聚腺苷酸化信號，其在植物中起作用，導致在RNA的3'末端添加腺苷酸核苷酸。3'非翻譯區可以得自在植物細胞中表達的各種基因。通常使用的是胭脂堿合酶3'非翻譯區，來自豌豆小亞基Rubisco基因的3，非翻譯區，來自大豆7S種子貯存蛋白基因的3'非翻譯區。含有農桿菌腫瘤誘導(Ti)質粒基因的聚腺苷酸信號的3'轉錄的非翻譯區也是合適的。典型地，所述核酸構建體包含可選擇的標記。可選擇的標記有助于已經用外源核酸分子轉化的植物或細胞的鑒別與篩選。可選擇的標記基因可為水稻細胞提供抗生素或者除草劑抗性，或者使得可以利用底物如甘露糖。所述可選擇的標記優選賦予水稻細胞潮霉素抗性。優選地，所述核酸構建體被穩定摻入植物基因組中。因此，所述核酸包含允許所述分子摻入基因組中的合適元件，或者所述構建體置于可摻入植物細胞染色體中的合適載體中。本發明的一個實施方案包括重組載體，其包括至少一個本發明的多核苷酸分子，其插入能輸送該核酸分子至宿主細胞的任何載體中。這種載體含有異源核酸序列，即所述核酸序列非天然發現其與本發明的核酸分子相鄰、且優選衍生自除了所述核酸分子衍生自其中的物種之外的物種。所述載體可以是原核或真核RNA或者DNA，典型是病毒或者質粒。適于穩定轉染植物細胞或者適于建立轉基因植物的眾多載體已經在例如Po匿elsetal.CloningVectors:ALaboratoryManual,1985,supp.1987;WeissbachandWeissbach,MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,1989禾口Gelvinetal，PlantMolecularBiologyManual,KluwerAcademicPublishers,1990中描述。典型地，植物表達載體包括例如在5，和3'調節序列轉錄控制下的一或多個克隆的植物基因以及顯性可選擇標記。這種植物表達載體也可以含有啟動子調節區(例如控制可誘導或組成型表達、環境或發育調控的或者組織特異性表達的調節區域)、轉錄起始位點、核糖體結合位點、RNA加工信號、轉錄終止位點和/或聚腺苷酸化信號。本發明的另一個實施方案包括重組細胞，其包含用本發明的一或多種重組分子轉化的宿主細胞。核酸分子轉化進細胞中可以通過可以將核酸分子插入細胞中的任何方法實現。轉化技術包括但不限于轉染、電穿孔、顯微注射、脂染、吸附和原生質體融合。重組細胞可以保持單細胞，或者可以生長為組織、器官或者多細胞生物體。本發明的轉化的核酸分子可以保持在染色體外，或者可以整合進轉化的(即重組的)細胞的染色體內的一或多個位點，由此保留其被表達的能力。優選的宿主細胞是植物細胞，更優選是谷物細胞，更優選是水稻細胞。轉基因植物轉基因水稻(在本文也稱作遺傳修飾的水稻)可以使用本領域已知的技術產生，如A.Slateretal.，PlantBiotechnology-TheGeneticManipulationofPlants,OxfordUniversityPress(2003)以及P.ChristouandH.Klee,HandbookofPlantBiotechnology,JohnWileyandSons(2004)所述。在優選的實施方案中，轉基因植物對于已經導入的每個多核苷酸(轉基因)均是純合的，由此其后代對于希望的表型不分離。轉基因植物對于導入的轉基因也可以是雜合的，例如在已經從雜種種子生長的F1后代中。這種40勢這樣的優勢。已經描述了直接將基因輸送至細胞中的四種普通方法(l)化學方法(Grahametal.,1973);(2)物理方法，如顯微注射(Capecchi,1980)、電穿孔法(見例如WO87/06614、US5,472,869、5,384,253、WO92/09696和WO93/21335)和基因槍(見例如US4，945，050和US5,141,131);(3)病毒載體(Clapp,1993;Luetal，1993;Eglitisetal.，1988);(4)受體介導機制(Curieletal.，1992;Wagneretal，1992)。可以使用的加速方法包括例如微粒轟擊等。將轉化核酸分子輸送至植物細胞的方法的一個例子是微粒轟擊法。這種方法已經由Yangetal.，ParticleBombardmentTechnologyforGeneTransfer,OxfordPress,Oxford,England(1994)綜述。非生物學顆粒(微粒)可以用核酸包被，并且通過推力輸送至細胞中。所述顆粒的例子包括包含鎢、金、鉑等的那些顆粒。除了是可再生地轉化單子葉植物的有效方式之外，微粒轟擊的一個特別優勢之處是既不需要分離原生質體，也不需要對于農桿菌感染的易感性。通過加速方法將DNA輸送至玉米(Zeamqys)細胞中的方法的一個舉例性實施方案是生物彈(biolistics)a-顆粒輸送系統，其可用于推動用DNA包被的顆粒透過屏如不銹鋼或者Nytex屏到達懸浮培養的玉米細胞覆蓋的濾膜表面上。適用于本發明中的顆粒輸送系統是可得自Bio-RadLaboratories的氦加速PDS-1000/He槍。對于轟擊而言，可以將懸浮液中的細胞集中于濾膜上。將含有被轟擊的細胞的濾膜置于微粒檔板(stoppingplate)下方合適距離。如果需要，也可以將一或多個屏置于槍與被轟擊的細胞之間。或者，可以將不成熟的胚或者其它靶細胞排列在固體培養基上。被轟擊的細胞以合適距離位于微粒檔板之下。如果需要，在加速裝置和被轟擊的細胞之間也可以放置一或多個屏。通過使用本文所述的技術，可以獲得直至1000或更多個瞬時表達標記基因的細胞轉化灶(foci)。在轟擊后48小時表達外源基因產物的轉化灶中細胞的數目通常是1-10個，平均為1-3個。在轟擊轉化中，可以優化轟擊前培養條件和轟擊參數以產生最大數目的穩定轉化體。在這種技術中，轟擊的物理和生物學參數均是重要的。物理因素是參與操縱DNA/微粒沉淀的那些因素或者影響巨粒(macroprojectile)或微粒的飛行和速度的那些因素。生物學因素包括在轟擊之前和之后立即41參與細胞操縱的所有步驟，幫助減輕與轟擊相關的損傷的對耙細胞的滲透調節，以及轉化DNA的性質，例如線性化DNA或者完整的超螺旋質粒。確信轟擊前操作對于成功轉化不成熟的胚是非常重要的。在另一個實施方案中，質體可以被穩定轉化。關于在高等植物中質體轉化的方法包括基因槍輸送含有可選擇標記的DNA并且通過同源重組使得該DNA耙向于質體基因組(U.S.5,451，513、U.S.5，545，818、U.S.5,877,402、U.S.5,932479和WO99/05265)。因此，預期希望可以在小規模研究中調整轟擊參數的各個方面以充分優化條件。特別希望可以調整物理參數如缺口距離、飛行距離、組織距離以及氦壓。也可以通過更改影響受體細胞生理狀態、且因此可影響轉化和整合效率的條件使得損傷降低因素最小化。例如，可以調整受體細胞的滲透狀態、組織水合作用和傳代培養階段或者細胞周期以優化轉化。本領域技術人員通過本發明的揭示將獲知其它常規調整方法。農桿菌介導的轉移是將基因導入植物細胞的廣泛應用的系統，因為可以將DNA導入完整的植物組織中，從而不需要從原生質體中再生完整植物。使用農桿菌介導的植物整合載體將DNA導入植物細胞中為本領域所熟知(見例如US5，177，010、US5,104,310、US5，004,863、US5，159，135)。另外，T-DNA的整合是相對精確的方法，產生很少的重排。被轉移的DNA區域由邊界序列限定，且在植物基因組中通常插入間插DNA。現代農桿菌轉化載體能在大腸桿菌(E.coli)以及農桿菌中復制，使得可以對其方便地進行操縱(Kleeetal,In:PlantDNAInfectiousAgents,HohnandSchell，eds.,Springer-Verlag，NewYork,pp.179-203(1985)。此外，農桿菌介導的基因轉移的載體中的技術優勢改善了載體中基因和限制位點的排列，促進了能表達多種多肽編碼基因的載體的構建。所述載體具有便利的多接頭區，兩側是啟動子和聚腺苷酸化位點以指導插入的多肽編碼基因的表達，所述載體適于本發明。另外，既含有armedTi基因也含有disarmedTi基因的農桿菌可用于轉化。在農桿菌介導的轉化是有效的那些植物變種中，由于基因轉移的易做到和限定性質，這是一種可選方法。使用農桿菌轉化方法形成的轉基因植物在一個染色體上典型含有一個遺傳基因座。這種轉基因植物可以被認為對于添加的基因是半合子的。更優選的是對于添加的結構基因是純合的轉基因植物，即轉基因植物含有兩個添加的基因，一個基因位于一對染色體的每個染色體上的相同位置。純合轉基因植物可以通過有性交配(自花授粉)含有一個添加的基因的獨立分離的轉基因植物、使產生的一些種子萌發以及針對感興趣的基因分析所得植物而獲得。也應理解兩個不同的轉基因植物也可以交配以產生含有兩個獨立分離外源基因的后代。合適后代的自花授粉可以產生對于這兩個外源基因均是純合的植物。也可以進行與親代植物的回交以及與非轉基因植物的異型雜交，這是植物繁殖的方式。對于通常用于不同性狀和作物的其它培育方法的描述可見于Fehr,In:BreedingMethodsforCultivarDevelopment,WilcoxJ.ed.，AmericanSocietyofAgronomy,MadisonWis.(1987)。植物原生質體的轉化可以使用基于磷酸鈣沉淀、聚乙二醇處理、電穿孔以及這些處理方法的組合而實現。這些系統應用于不同植物變種依賴于從原生質體再生特定的植物株的能力。從原生質體再生谷物的舉例方法在(Fujimuraetal"1985;Toriyamaetal"1986;Abdullahetal.，1986)中描述。也可以使用其它的細胞轉化方法，這些方法包括但不限于通過將DNA直接轉移進花粉中、通過將DNA直接注射進植物的生殖器官中、或者通過將DNA直接注射進不成熟胚的細胞中即隨后再水合粉狀胚而將DNA導入植物中。植物從單一植物原生質體轉化體或者從多個轉化的外植體的再生、發育和培育為本領域所熟知(Weissbachetal.，In:MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,SanDiego,Calif.,(1988)。這種再生和生長過程典型包括選擇轉化的細胞、培養那些個體化的細胞從胚發育的通常階段至生根的小植物階段等步驟。相似地再生轉基因胚和種子。隨后將所得轉基因的生根的苗種植于合適的植物生長基質如土壤中。含有外來的、外源基因的植物的發育或再生為本領域所熟知。優選地，使再生的植物自花授粉，提供純合的轉基因植物。此外，可以將得自所述再生植物的花粉與農業重要品系的種子生長植物雜交。相反地，將這些重要品系的植物花粉用于對再生植物授粉。使用本領域技術人員熟知的方法栽培本發明的含有希望的外源核酸的轉基因植物。通過導入外源核酸而將遺傳變異導入植物中以轉化谷類植物如水稻以及從原生質體或者不成熟的植物胚再生植物的方法為本領域所熟知，見例如加拿大專利申請No.2,092,588、澳大利亞專利申請No.61781/94、澳大利亞專利No.667939、美國專利No.6,100，447、國際專利申請PCT/US97/10621、美國專利No.5,589,617、美國專利No.6，541，257所述，以及在專利說明書W099/14314中闡述的其它方法。優選地，轉基因水稻植物通過根癌農桿菌G4graZ7acfen'Mm^we/ac/ms)介導的轉化方法產生。水稻的農桿菌介導的轉化的例子在本文實施例5中提供。攜帶希望的核酸構建體的載體可以被導入組織培養植物或外植體的可再生的水稻細胞或合適植物系統如原生質體。可再生的水稻細胞優選來自不成熟胚的盾片、成熟胚、衍生自其中的愈傷組織或者分生組織。為了證實轉基因細胞和植物中轉基因的存在，可以使用本領域技術人員已知的方法進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增或者Southern印跡分析。轉基因的表達產物可以根據產物的性質以各種方式檢測，包括Western印跡和酶測定法。一種特別有用的在不同植物組織中量化蛋白質表達和檢測復制的方法是使用報道基因如GUS。一旦獲得轉基因植物，則可以使其生長以產生具有希望表型的植物組織或者部分。可以收獲所述植物組織或者植物部分，和/或收集種子。所述種子可作為源頭，生長具有希望特性的組織或部分的另外的植物。標記輔助選擇當在傳統培育程序中與回歸親本回交時，標記輔助選擇方法是選擇雜合植物的一種公認方法。每個回交世代的植物群對于在回交群中以1:1比率正常存在的感興趣的基因而言是雜合的，所述分子標記可用于區分基因的兩個等位基因。通過從例如幼苗中提取DNA并用特異性標記檢測漸滲的希望性狀，初步選擇植物進行進一步回交，同時將精力和資源集中于少數植物上。為了進一步加速回交程序，可以從不成熟的種子(開花后25天)中切除胚，并使其在無菌條件下在營養培養基中生長，而不是使全部種子成熟。在三葉階段組合應用這種稱作"胚拯救"的方法與DNA提取方法，并且分析希望的基因型，可以快速選擇攜帶希望性狀的植物，該植物可以在溫室或田野中培育至成熟，隨后與回歸親本進一步回交。在本發明方法中可以使用能檢測或F"詔基因的任何本領域已知的分子生物學技術。這種方法包括但不限于使用核酸擴增、核酸測序、核44酸與合適標記的探針雜交、單鏈構象分析(SSCA)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、異源雙鏈體分析(HET)、化學切割分析(CCM)、催化性核酸切割或其組合(見例如Lemieux，2000;Langridgeetal.,2001)。本發明還包括使用分子標記技術以檢測與(例如)賦予希望表型的或基因的等位基因連鎖的多態性。這種方法包括檢測或分析限制片段長度多態性(RFLP)、RAPD、擴增片段長度多態性(AFLP)和微衛星(簡單序列重復，SSR)多態性。緊密連鎖的標記可以易于通過本領域熟知的方法獲得，如Langridgeetal.(2001)回顧的分離群體分組分析法。"聚合酶鏈反應(PCR)"是這樣的反應，其中復制拷貝由靶多核苷酸組成，使用由"上游"和"下游"引物組成的"一對引物"或者"一組引物"以及聚合催化劑如DNA聚合酶，典型為熱穩定的聚合酶。PCR方法為本領域所己知，見例如"PCR"(Ed.MJ.McPhersonandS.GMoller(2000)BIOSScientificPublishersLtd,Oxford)所教導。可以對逆轉錄分離自植物細胞的mRNA獲得的cDNA進行PCR。然而，如果PCR是針對分離自植物的基因組DNA進行，則其通常較簡單。引物是寡核苷酸序列，其能以序列特異性方式與靶序列雜交并且在PCR期間被延伸。擴增子或者PCR產物或者PCR片段或者擴增產物是延伸產物，其包含所述引物以及新合成的靶序列的拷貝。多重PCR系統含有多組引物，導致同時產生一個以上的擴增子。引物可以與靶序列完全匹配，或者其可以含有內部錯配堿基，可以導致在特定靶序列中導入限制酶或者催化性核酸識別/切割位點。引物也可以含有另外的序列和/或含有修飾或標記的核苷酸以便于捕獲或者檢測擴增子。DNA熱變性、引物與其互補序列退火以及用聚合酶延伸退火的引物的重復循環導致靶序列指數式擴增。術語耙或耙序列或者模板是指被擴增的核酸序列。直接測序核苷酸序列的方法為本領域技術人員所熟知，可見于例如Ausubeletal.(如前)禾卩Sambrooketal.(如前)所述。可以通過任何合適的方法進行測序，例如雙脫氧測序法、化學測序法或其變化方法。直接測序具有確定特定序列的任何堿基對中的變化的優勢。基于雜交的檢測系統包括但不限于TaqMan測定和分子信標。TaqMan測定(US5,962,233)使用等位基因特異性(ASO)探針，在其一端具有供體染料以及在另一端具有受體染料，由此所述染料對通過熒光共振能量轉移(FRET)而相互作用。靶序列通過被修飾為包括加入標記的ASO探針的PCR擴增。對PCR條件進行調整，由此一個核苷酸的差異即影響探針的結合。由于Taq聚合酶的5，核酸酶活性，因此在PCR期間完全互補的探針被切割，而具有一個錯配堿基的探針不被切割。探針的切割使得供體染料與猝滅受體染料解離，明顯增加供體熒光。TaqMan測定的另一種選擇是分子信標測定(US5,925,517)。在分子信標測定中，ASO探針含有位于靶特異性物質(species)側翼的互補序列，由此形成發夾結構。發夾的環與靶序列互補，而發夾的每個臂均含有供體或者受體染料。當未與供體序列雜交時，所述發夾結構使得供體和受體染料靠近在一起，從而熄滅供體熒光。然而當與特定靶序列雜交時，所述供體和受體染料被分開，隨之熒光增加直至900倍。分子信標可以與通過PCR擴增靶序列聯合應用，提供了實時檢測靶序列的存在的方法或者可以在擴增后使用。TILLING本發明的植物可以使用稱作TILLING(靶向誘導基因組局部損傷(TargetingInducedLocalLesionsINGenomes))的方法產生。第一步，通過用化學誘變劑處理種子(或者花粉)而在植物群體中誘導導入的突變如新的單堿基對改變，然后使植物產生下一代，其中所述突變被穩定遺傳。提取DNA，貯存該群體所有成員的種子以產生可以隨時重復存取的資源。對于TILLING測定，設計PCR引物以特異性擴增感興趣的單一基因靶。如果靶是基因家族的成員或者多倍體基因組的一部分，則特異性尤為重要。其次，可以使用染料標記的引物從多個個體的混合DNA中擴增PCR產物。這些PCR產物被變性和再退火，使得錯配的堿基對形成。錯配或者異源雙鏈體是指天然發生的單核苷酸多態性(SNP)(即所述群體中的一些植物很可能具有相同多態性)以及誘導的SNP(即很少的個體植物可能展示突變)。在異源雙鏈體形成之后，使用內切核酸酶如識別并切割錯配DNA的Ce/I是在TILLING群體中發現新SNP的關鍵。使用這種方法，可以篩選數千種植物以鑒別在基因組的任何基因或特定區域中具有單堿基改變以及小插入或缺失(1-30bp)的任何個體。被測定的基因組片段的大小可以是0.3-1.6kb。在8-倍混合中，每個測定具有1.4kb片段(扣除片段的末端，其中由于噪聲而使得難以進行SNP檢測)和96個泳道，這種組合允許每一次測定可篩選直至百萬個基因組DNA的堿基對，由此TILLING是一種高通量技術。TILLING在SladeandKnauf(2005)和Henikoffetal.(2004)中進一步描述。除了可以有效檢測突變之外，高通量TILLING技術對于天然多態性的檢測也是理想的。因此，通過與已知序列形成異源雙鏈體而查詢未知同源DNA示出多態性位點的數目和位置。核苷酸改變以及小插入和缺失均得以鑒別，包括至少一些重復數目多態性。這被稱作Ecotilling(Comaietal.2004)。每個SNP均由其在幾個核苷酸內的大約位置記錄。因此，每個單元型可以基于其遷移率而存檔。使用用于錯配-切割測定的相同擴增的DNA等份可以相對較小增加付出而獲得序列數據。通過其與所述多態性的接近性選擇用于單一反應的左側或者右側測序引物。序列分析儀軟件進行多重對比，揭示堿基改變，在每種情況中均證實了凝膠條帶。Ecotilling與目前用于大多數SNP揭示的完全測序方法相比可以更簡便地進行。可以篩選含有陣列的生態型DNA的平板，而不用篩選來自誘變的植物的DNA庫。因為檢測是在接近堿基對分辨率的凝膠上并且背景模式在泳道間是一致的，因此可以匹配相同大小的條帶，由此在一個步驟中揭示SNP并確定其基因型。在這種方式中，最后的SNP測序簡便且有效，可以對用于篩選的相同PCR產物的等份進行DNA測序。誘變程序本領域已知產生突變水稻植物品系的技術。可用于產生突變體水稻植物的誘變劑的例子包括放射誘變和化學誘變。突變體也可以通過如T-DNA插入和轉座子誘導的誘變產生。所述誘變程序可以對于水稻植物的任何親代細胞進行，例如種子或者組織培養中的親代細胞。化學誘變劑可通過化學性質分類，例如垸化劑、交聯劑等。可用的化學誘變劑包括但不限于N-乙基-N-亞硝基脲(ENU)、N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)、鹽酸甲基芐肼、苯丁酸氮芥、環磷酰胺、甲磺酸甲酯(MMS)、甲磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯、丙烯酰胺單體、三亞乙基三聚氰胺(TEM)、47苯丙氨酸氮芥、氮芥、長春花新堿、二甲基亞硝胺、N-甲基-N'-硝基-亞硝基胍(MNNG)、7,12-二甲基苯并蒽(DMBA)、環氧乙垸、六甲基磷酰胺，以及bisulfan。誘導突變的合適輻射的例子是通過Y射線輻射，如由銫137放射源提供。所述y射線輻射優選以大約60-200Krad的劑量提供給植物細胞，最優選大約60-90Krad的劑量。典型地，將植物暴露于誘變劑持續足夠時間以達到希望的遺傳修飾，而不足以完全破壞細胞的生存力及其再生為植物的能力。抗體特異性結合或F"d2多肽的單克隆或多克隆抗體可用于本發明的一些方法中。術語"特異性結合"是指抗體結合或多肽而不結合水稻的其它蛋白質、尤其是水稻種子蛋白的能力。如本文所用，術語"表位"是指抗體結合的FaW或F^/2多肽的區域。可以將表位給予動物以產生抗該表位的抗體，然而，在完整多肽的情況中，用于本文所述方法的抗體優選特異性結合表位區。如果希望是多克隆抗體，則用如圖2或7或者SEQIDNO:l-4或者15-18所示那些免疫原性多肽免疫接種選擇的哺乳動物(例如小鼠、兔、山羊、馬等)。收集經免疫動物的血清并根據已知程序處理。如果含有多克隆抗體的血清含有其它抗原的抗體，則該多克隆抗體可以通過免疫親和性層析純化。產生和處理多克隆抗血清的技術為本領域所已知。為了可以產生這種抗體，本發明還提供了使本發明的肽或其片段，其半抗原化至另一種在動物中用作免疫原的肽。抗本發明多肽的單克隆抗體也可以由本領域技術人員容易地產生。通過雜交瘤產生單克隆抗體的一般方法為本領域所熟知。無限增殖的抗體產生細胞系可以通過細胞融合產生，也可以通過其它技術如用致癌DNA直接轉化B淋巴細胞或者用Epstein-Barr病毒轉染而獲得。產生的單克隆抗體群可以針對各種性質篩選，即針對同種型和表位親和性進行篩選。另一種技術包括篩選噬菌體展示文庫，其中例如噬菌體在其用大量不同的互補決定區(CDR)包被的表面上表達scFv片段。這種技術為本領域所熟知。對于本發明而言，除非特別指定相反含義，術語"抗體"包括完整抗體的保留其靶抗原結合活性的片段。這種片段包括Fv、F(ab')和F(ab')2片段，以及單鏈抗體(scFv)。此外，所述抗體及其片段可以是人源化抗體，例如EP-A-239400所述。抗體可以結合固體支持物和/或在合適的容器中包裝于試劑盒中，試劑盒中還包括合適的試劑、對照物、說明書等。優選地，所述抗體被可檢測地標記。允許直接測量抗體結合的可檢測的標記的例子包括放射性標記、熒光團、染料、磁珠、化學發光劑、膠體顆粒等。允許間接測量結合的標記的例子包括酶，其中底物可提供給有色或熒光產物。可檢測的標記的其它例子包括共價結合酶，其在加入合適底物之后能提供可檢測的產物信號。用于綴合物的合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、蘋果酸脫氫酶等。在不可商購的情況中，這種抗體-酶綴合物易于通過本領域技術人員已知的技術產生。可檢測的標記的另一例子包括生物素，其高親和性結合抗生物素蛋白或者鏈霉抗生物素蛋白；熒光染料(例如藻膽蛋白、藻紅蛋白和別藻藍蛋白；熒光素和Texas紅)，其可與熒光激活細胞分選儀一起應用；半抗原等。優選地，所述可檢測的標記允許在平板發光計中直接測量，例如生物素。這種標記的抗體可用于本領域已知技術中以檢測本發明多肽。實施例實施例l:材料與方法^伊,欽連攻勸對于脂肪酸及其它分析，除非特別指出，則如下所述從水稻谷粒中提取總脂質。在一些情況中，由一半谷粒組成的樣品用于提取，含有胚的另一半谷粒用于胚拯救。該技術也可以用于其他谷物。將一粒發育中的種子或者半粒種子在濾紙之間擠壓并置于試管中。加入2ml0.5M甲醇鈉，緊密密封該試管，然后在8(TC保溫10分鐘。在試管冷卻后，加入O.lml冰乙酸，隨后加入2ml蒸餾水和2ml石油精。將該混合物渦旋10秒鐘，在各相分離后，將上層石油層移至小試管中。向該試管中加入大約lg的碳酸氫鉀/硫酸鈉混合物并渦旋所得混合物。將樣品溶液移至自動取樣器小瓶中，在-2CTC于冷凍裝置中貯存直至進行如Soutjesdicetal.(2002)所述GC分析。A就才量鄉W微顏(S/妙母r膽)這個方法是對BlighandDyer(1959)所述方法加以調整而得。將1.5ml的CHCyMeOH(l:2)加入于0.4ml緩沖液中的組織樣品中，劇烈渦旋樣品。再加入0.5ml的CHC13，再次渦旋該樣品。加入0.5ml的H20，再次渦旋該樣品。將該試管在3000rpm短暫離心以分離各相，白色沉淀物出現在分界處。將有機相(下層)移至新的試管中并在真空下濃縮。如果提取酸性脂質，則加入0.5ml的1%HC104代替0.5ml的H20。上述程序的體積可以更改，只要保持CHCl3/MeOH/H20比率即可。劍吝微麼伊斷扁)以定量線定微齢量為了直接從谷粒制備FAME,精確稱重10-15粒種子并將其移至玻璃管中。向每個種子樣品中加入內部標準10pl的lmg/ml17:0-甲酯。向每個試管中加入0.75ml的IN鹽酸甲醇(methanolic-HCl，Supelco)，蓋緊蓋子并在80°C回流至少2-3小時或者過夜。冷卻樣品，加入0.5mlNaCl(0.9%w/v)，隨后加入300nl己烷。再次蓋上試管蓋子并劇烈渦旋。將上層己烷相(200-250^U)小心移至Eppendorf管中。在氮氣下使樣品完全干燥。將干燥的FAME樣品溶解于20|il己烷中并移至小瓶中的圓錐形玻璃襯管中以進行GC分析。縱氣鰣叛遂飾分橋如下所述通過堿性轉甲基作用制備脂肪酸甲酯。將一個種子樣品在濾紙盤之間擠壓。然后將移至濾紙盤中的脂質中的脂肪酸在2mL的0.02M甲醇鈉中于80°C甲基化10分鐘，隨后冷卻30分鐘。然后加入O.lmL冰乙酸，隨后依次加入2mL蒸餾水和2mL己烷。在渦旋及相分離之后，將含有脂肪酸甲酯的上層己烷層移至微量小瓶中。通過如先前所述(Stoutjesdijketal.,2002)的氣液層析法分析脂肪酸甲酯。50如下所述對水稻(cv.Nipponbare)進行轉化。i)愈傷組織誘導與培養去除成熟谷粒的外殼，然后將其浸泡在70%EtOH中30秒以除去外層蠟狀物。將清潔的谷粒用無菌H20洗滌3次并浸泡在25%漂白液(加入2滴Tween-20去污劑)中振蕩20分鐘以使其表面無菌。在無菌條件下，將該谷粒用70%EtOH短暫漂洗，用無菌H20徹底洗滌8-10次并鋪板于N6D培養基上。將平板用Micropore帶密封，在28。C全日照保溫。6-8周后產生愈傷組織，然后將其移至NB培養基中。將其用石蠟紙密封，置于28°C，每4周在新鮮NB平板上傳代培養。在5次以上傳代培養之后，愈傷組織不再用于轉化。ii)轉化從傳代培養平板中挑取看起來健壯的愈傷組織，將其移至新鮮NB平板上，密度為25-30個愈傷組織/平板。兩天后，建立含有使用的構建體的農桿菌菌株的新鮮培養物，在28。C保溫。培養基是補加了lOOpM乙酰丁香酮的NB培養基。將愈傷組織在細胞懸浮液中浸泡IO分鐘。在排出過量的懸浮液之后，將愈傷組織置于補加了100pM乙酰丁香酮的NB培養基上，在25'C在黑暗中保溫3天(共培養)。在共培養步驟之后，將愈傷組織在試管中用含有150mg/mlTimetin的無菌水輕輕洗滌3次。將愈傷組織在濾紙上吸干水分，并且以合適間隔鋪板于NBCT平板上(如果使用卡那霉素可選擇的標記基因或者合適的其它選擇劑，則該平板中含有100|iig/ml卡那霉素，150嗎/mlTimentin和200|ug/mlClaroforan)。該平板在黑暗中在26-28。C保溫3-4周。大約10天后觀測到抗性愈傷組織，將其移至NBCT+選擇平板中，于黑暗中進一步保溫14-21天。將健壯的愈傷組織移至PRCT+選擇平板上，于黑暗中保溫8-12天，然后移至RCT+選擇平板上，并且在28'C全日照保溫30天。之后，將已經發育的小植物移至組織培養罐中1/2MS培養基中，在日照下保溫10-14天以進一步生長直至移至土壤中。iii)用于水稻組織培養的培養基組成和成分N6大量元素(20X)(g/l):(NH4)2S04，9.3;KN03，56.6;KH2P04，8;MgS04.7H20，3.7;CaCl2.2H20，3.3。N6微量元素(1000X)(mg/100ml):MnS04.4H20，440;ZnS04.7H20，150;H3B03，160;KI，80。N6維生素(100X)(mg/100ml):甘氨酸，20,鹽酸硫胺素，10;維生素B6，5;煙酸，5。B5微量元素(100X)(mg/1000ml):MnSO4.4H20，1000;Na2Mo04.2H20，25;H3B03，300;ZnS04.7H20，200;CuS04.5H20，3.87;CoCl2.6H20，2.5;KI，75。來自Sigma細胞培養的B5維生素(IOOX)和Gamborg's維生素溶液(畫Ox)。FeEDTA(200X)(g/200ml):鐵-鈉鹽，1.47。2，4-D(lmg/ml):將lOOmg的2,4-二氯-苯氧乙酸溶解于lml無水乙醇中，加入3ml的lNKOH，用INHC1調節為pH6。BAP(lmg/ml):來自Sigma細胞培養的6-芐氨基嘌呤。NAA(lmg/ml):來自Sigma細胞培養的萘乙酸。ABA(2.5mg/ml):將250mg的脫落酸溶解于2ml的1MNaOH中，用無菌蒸餾水制成lOOml。終背景濃度為20mMNaOH。潮霉素(50mg/ml):潮霉素溶液來自Roche。Timetin(150mg/ml):將3100mg的Timetin溶解于20.66ml無菌水中。終濃度為150mg/ml。Claforan(200mg/ml)。將4gm的Claforan溶解于20ml無菌水中。MS鹽Murashige-Skoog最小有機培養基。N6D培養基(每升的量)N6大量元素(10X)100mlN6微量元素(1000X)lmlN6維生素(1000X)lmlMS鐵/EDTA5ml肌醇lOOmg酪蛋白氨基酸300mg脯氨酸2.9g2,4-D(lmg/ml)2ml蔗糖30g用lMKOH將pH調節為5.8，加入3gphytogel/升，高壓滅菌NB培養基(每升的量)52N6大量元素(20X)50mlB5微量元素(100X)10mlB5維生素(100X)10mlFeEDTA(200X)5ml2,4-D(lmg/ml)2ml蔗糖30g脯氨酸500mg谷氨酰胺500mg酪蛋白酶水解產物(CEH)300mgNBO:NB培養基，加上30g/l甘露醇和30g/l山梨醇，之后調節pH值。NBCT+選擇培養基(潮霉素-H30):NB培養基加上30mgA潮霉素、Timentin150mg/ml、Claforan200mg/l。NBCT+選擇培養基(潮霉素-H50):NB培養基加上選擇50mg/l潮霉素，200mg/lClaforan和Timentin150mg/ml。PRCT+選擇培養基:NB培養基，無2,4-D，在高壓滅菌后加入BAP，2mg/l;NAA，lmg/l;ABA，5mg/l;Claforan，勵g/l;Timetin;150mg/ml+選擇培養基。RCT+選擇培養基NB培養基，無2,4-D，在高壓滅菌后加入BAP，3mg/l;NAA，0.5mg/l;Timetin，150mg/ml;Claforan,lOOmg/1+選擇培養基。'/2MS培養基MS鹽于維生素混合物，2.21g;蔗糖，10g每升，加入2.5gphytogel/1，高壓滅菌后加入0.05mg/lNAA和Timentin150mg/ml。實施例2:從水稻中鑒別和分離FaW基因FatB基因編碼棕櫚酰-ACP硫酯酶，該酶具有從酰基載體蛋白中優先轉移長度為16個或更少個碳原子的脂肪酸至酰基-CoA的活性，并因此防止脂肪酸碳鏈進一步延長。使用Genbank登錄擬南芥基因座AtACPTE32和Iris基因座AF213480的序列，使用基于同源性的檢索方法鑒別了推定的水稻序列。使用的檢索程序為在NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/、可獲得的Megablast。使用NCBI默認參數，使用的數據庫對于水稻(Oo^^WzVa)而言是非冗余(nr)且高通量的基因序列(htgs)。然后翻譯通過Megablast程序從水稻中選擇的最相似的序列并檢查在所有F"^序列中發現的保守序列NQHVNN(SEQIDNO:26)的存在。確信在擬南芥中是必需的其他氨基酸殘基是半胱氨酸264，天冬酰胺227和組氨酸229(其均存在于保守序列NQHVNN中)包含提議的催化三聯體。中國水稻數據庫(網站地址http:〃rise.genomics.org.cn/rice/index2.isp)也有限程度地應用，使用BLAST檢索的默認參數及擬南芥序列和Iris序列。翻譯的序列在圖2中對比。關于所有F"W基因結構的總述在圖3中示出。如下述，所述基因相應于所討論的蛋白質序列AC108870相應于Osllg43820，AP005291相應于Os02g43090，AP000399相應于Os06g5130，AP004236相應于Os06g39520。注意來自一個基因的多個轉錄物的可能性在圖中示出。圖4示出使用默認參數的"基因"序列的CLUSTALW(fast)對比-注意所述"基因"的長度不同。所述基因包含6個外顯子。Os06g5130描述的基因的結構詳細示于圖5。圖6示出cDNA的編碼序列的對比，標示了用于選擇性PCR擴增的不同引物。Os06g5130與Os06g39520(相應于圖2中序列ap000399和ap004236)的翻譯的肽序列之間的序列相同性整體是74%，完整編碼序列在核苷酸水平的相同性是69%。在這兩種情況中，使用默認參數的BESTFIT程序。從Os02g43090(—個轉錄物)、Os06g05130、Os06g39520和Os011g43820推導的多肽分別相應于298、427、423和425個氨基酸。編碼的蛋白質的活性通過與已知示出具有這種活性的多肽的高度序列相同性推測。另外，觀測到的基于這些序列的基因失活構建體對于棕櫚酸水平的作用也與這種推測一致(見下文所述)。基因家族的表達是復雜的，從這四個基因中推測具有至少7個轉錄物。基于進行的RT-PCR實驗以及從EST文庫中回收的克隆的相關數目，看起來來自Os06g5130的RNA在谷粒中相對豐富，而Osllg43820在該組織中中等水平表達，其它基因僅低水平表達。實施例3:從水稻中鑒別和分離/^/2基因由基因編碼的蛋白質(脂肪酸去飽和酶2)在18:1脂肪酸中導入雙鍵-它們是A12去飽和酶。擬南芥基因座athdl2aaa的Genbank序列用于針對54水稻(Oo^as"riw)檢索nr和htgs數據庫，使用默認設置Megablast。翻譯從水稻中檢索到的最相似的序列，并檢測如下序列的存在保守疏水性基序FSYVVHDLVIVAALLFALVMI(SEQIDNO:27)、AWPLYIAQGCVLTGVWVIA(SEQIDNO:28)、ISDVGVSAGLALFKLSSAFGF(SEQIDNO:29)、VVRVYGVPLLIVNAWLVLITYLQ(SEQIDNO:30)以及組氨酸水稻序列HECGHH(SEQIDNO:31)、HRRHHA(SEQIDNO:32)和HVAHH(SEQIDNO:33)。獲得的同工型的翻譯的氨基酸序列示于圖7。圖8提供了序列對比，示出在同工型AP004047中5'UTR的位置(小寫字母)以及用于RT-PCR擴增的引物的位置(下劃線)。終止密碼子的位置以方框標示，終止密碼子下游非翻譯區以小寫字母表示。當編碼具有AP004047氨基酸序列的蛋白質的核苷酸序列用于檢索水稻基因組時(使用默認參數BLAST程序)，從水稻基因組中獲得高度相似的四個基因序列。這些基因的整體結構示于圖9。如下述，所述基因相應于蛋白質序列。蛋白質序列AP004047(在本文也稱作FAD2-1)相應于基因Os02g48560，序列AP005168(在本文也稱作FAD2-2)相應于Os07g23410，序列contig2654相應于Os07g23430。另外，存在與這些序列具有感興趣程度的序列相同性但是又與這些序列明顯不同的一個序列，其也許是假基因。這個序列是Os07g233卯。與i^W基因不同，F^/2基因不含有任何內含子。所有蛋白質編碼序列的對比示于圖10。Os02g48560與Os07g23410的完整編碼區的序列相同性為79%。由Os02g48560編碼的多肽(即AP004047)的分子量在加工之前為44.35kDa，含有388個氨基酸。Os07g23410編碼的多肽的分子量為44.9kDa，含有390個氨基酸。利用默認參數的BESTFIT程序確定這些推導的多肽具有77%的序列相同性。從Os07g23430中推導的多肽的分子量為41kDa(363個氨基酸)，從Os07g23390中推導的多肽的分子量為24kDa(223個氨基酸)。所有推導的多肽序列的對比示于圖7。相應于Os02g48560的序列在谷粒中表達，這個觀測結果與這個基因在EST文庫中的克隆的相關頻率數據一致，其中同族序列從谷粒cDNA文庫中回收。相應于在染色體7上編碼的兩個同工型(Os07g23430、23410)的序列從葉EST文庫中回收，但是至今沒有關于相應于其它基因(Os07g23390)的序列的報道；我們推斷其也許根本就是低水平表達。總之，水稻Rk/2基因家族也是復雜的基因家族。從Os02g48560中推導的兩個轉錄物通過序列不可區分。從Os02g48560中推導的序列在谷粒中顯著表達。實施例4:FflW和/^/2基因在水稻中的表達為了確定如實施例2和3所述在水稻中鑒別的4個推定的基因和3個Fa^基因可以在發育中的水稻谷粒中表達，進行逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。由于所述基因在序列上密切相關，因此需要設計特異于每個基因的引物，以特異性測定每個基因的轉錄物。從序列對比(圖6和8)中鑒別序列趨異的區域并且設計和檢測一些引物對。檢測推定的F"W基因表達的引物序列在表3和表4中示出。作為內部標準以對比表達水平，對于編碼a-微管蛋白的水稻基因OsTubAl的表達，對RNA也進行RT-PCR。已知這個基因在所有活躍分裂組織中表達且不受激素ABA的影響，因此適合用作葉和谷粒分析的組成型表達對照。使用QiagenRNeasy試劑盒根據廠商指導從開花后大約15天的水稻谷粒中制備RNA。然后使用DNAse處理(DNA-free試劑盒，Ambion)以從RNA制備物中除去污染的DNA。RT-PCR混合物含有5^1的5XQiagenOneStepRT-PCR緩沖液、的dNTP混合物(含有10mM每種dNTP)、15pmol每種引物和大約20pg的RNA，終體積為25^1。使用如下RT-PCR循環程序進行RT-PCR擴增30分鐘50。C(逆轉錄)，15分鐘95。C(初始PCR活化)，30次循環(l分鐘94°C，1分鐘57°C，1分鐘72°C)(PCR擴增)，然后在72"C最后延伸10分鐘。表3:設計用于使用一步RT-PCR擴增和區分推定的轉錄物的相對表達的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>表4:設計用于使用一步RT-PCR擴增和區分推定的轉錄物的相對表達的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>RT-PCR實驗結果表明FW2-1基因序列(TIGR水稻數據庫標識符LOC—Os02g48560)相對于編碼其它同工型的基因在谷粒和葉中均高水平表達。其它兩個基因(LOC—Os07g23410和LOC—Os07g23430)看起來在葉中低水平表達且主要在葉中表達。對編碼i^W同工型的基因進行分析示出FaW-l(Genbank標識符AP000399,TigrLOC—Os06g05130)和F^5-2(Genbank標識符AC108870，TIGR標識符Osllg43820)與其它兩個基因相比在谷粒中更高水平表達。Tos-17轉座插入突變體在編碼AP000399的基因中具有插入序列。參考基因mRNA轉錄物的相對豐度，Fa^-1(Genbank標識符AP000399，TIGRLOC—Os06g05130)和FatB-4(AP004236，TIGRLOC—Os06g39520)在葉組織中更高水平表達。當與作為標準的微管蛋白基因轉錄物的豐度相對比時(其在小麥谷粒中具有中等豐度的mRNA且因此期望在水稻谷粒中是相似地豐度)，通過RT-PCR確定所有和F^/2mRNA低水平聚集。然而，這個結論基于這樣的假定，即每種檢測基因的弓I物與靶轉錄物以與微管蛋白弓I物/轉錄物相似效率地雜交。這個結論通過EST數據庫檢索確認。當FflW-l(TIGROs02g48560)序列用于檢索水稻EST序列時，轉錄物序列存在于圓錐花序、根和整個植物cDNA文庫中。相反，Fac^-2(TIGROs07g23410)和Facf2-3(TIGROs07g23430)序列僅存在于葉、莖干或者整個植物文庫中。Os07g23390的序列被認為是假基因的i^W-樣基因，在任何EST文庫中均不存在。相似地，i^W-l(TIGROs06g05130)序列在葉和圓錐花序EST文庫中均存在，而F"tB-2序列(TIGROsllg43820)僅存在于圓錐花序或者整個植物EST文庫中，/^W-4(TIGROs06g39520)僅存在于葉文庫中。盡管通過RT-PCR判斷F加S-3(AP005291，Os02g430900)序列與其它序列相比在葉和谷粒中均相對低水平表達，但是其存在于圓錐花序和整個植物EST文庫中。這些檢索使用NCBI網站(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)上的BLAST程序，使用EST數據庫和限制從水稻中檢索序列。基于這些數據認為F6W2-1和F^5-2是應下調谷粒脂質改變的基因。關于這方面，認為FaW-3也是重要的。實施例5:基因沉默構建體的構建和水稻的轉化58微淑2教艦鏈細辦鄉產f設計在發育中的水稻谷粒中表達雙鏈RNA(發夾RNA)的構建體以降低F^/2-l的表達。通過耙向三個F"W基因序列的共有區域，設計所述構建體，由此其對于在水稻谷粒中鑒別的所有三個F^/2基因均有效，以潛在地使對于脂肪酸組成的作用最大化。為了改善沉默效率，所述構建體在如Smithetal.(2000)所述的反向重復序列的有義與反義部分之間含有內含子。使用如下寡核苷酸通過PCR從F"W-1基因的5'末端擴增一個505堿基對的片段pFad2-F5'-AAAGGATCCTCTAGAGGGAGGAGCAGCAGAAGC-3'(SEQIDNO:52)和pFad2隱R5'-AAAACTAGTGAATTCTACACGTACGGGGTGTACCA-3'(SEQIDNO:53)。將此PCR產物連接進pGEM-Teasy中，轉化進大腸桿菌和鑒別含有該插入體的菌落。然后將來自稱作pGEM-T-Fad2的質粒的含有505bpFa^片段的^oI/五coiI片段以有義方向連接進含有內含子Rint9的載體ZLRint9_BC3895(得自ZhongyiLi，CSIROPlantIndustry)中。然后將來自pGEM-T-Fad2的丑"mHIAS評I片段連接進(以反義方向)所得質粒中，由此形成含有發夾構建體的內含子。然后將含有具有發夾的1內含子的BamHl/i:/7"I片段插入pBxl7casNOT載體(ZhongyiLi,個人通訊)的相同限制位點中，所述載體含有具有Nos終止子/聚腺苷酸化序列的Bxl7種子特異性啟動子，由此所述沉默基因在發育中的種子中以(啟動子)有義-內含子-反義(終止子)順序表達。然后將含有Bxl7啟動子和FaW-l反向重復區的///"dllM^I片段插入二元載體pWBvec8(Wangetal，1998)的相同限制位點中，所述載體含有賦予潮霉素抗性的可選擇標記基因。然后將這個載體導入農桿菌中并用于水稻轉化，如實施例1所述。所述雙鏈RNA構建體稱作dsRNA-Fad2-l。湖劍陋表達艦鏈麗辦鄉產生使用具有如下序列的引物通過PCR擴增水稻棕櫚酰-ACP硫酯酶FW5-1基因(TigrLOC—Os06g05130)的665堿基對片段Rte-sl，5'-AGTCATGGCTGGTTCTCTTGCGGC-3'(SEQIDNO:54)和Rte-al，5'隱ACCATCACCTAAGAGACCAGCAGT-3'(SEQIDNO:55)。這個PCR片段用于產生反向重復構建體，其具有有義方向的所述片段的一個拷貝和反義方向的另一個拷貝，由來自棉花微粒體Q)6-去飽和酶GhFad2-l基因(Liuetal.，1999)的5'UTR的內含子序列分隔。隨后將反向重復構建體插入pUbilcasNOT(ZhongyiLi基于Lietal.,1997所述序列)的Ubil啟動子與Nos終止子之間的&cl位點。然后將具有pUbil啟動子的水稻的反向重復部分插入二元載體pWBVec8的iVort位點中并如上文針對構建體所述導入農桿菌中。所述雙鏈RNA構建體稱作dsRNA-FatB-1。在靴財柳分柝微麼資成使用相應于啟動子區域內位點的一種引物以及F^^序列末端的另一種引物通過PCR檢測獲得的具有dsRNA-Fad2-l的十個單獨的可繁殖的轉基因植物中dRNA基因的存在。發現這十個植物中的九個植物在PCR反應中是陽性的，因此含有F^/2RNAi構建體。相似地，對23個可繁殖的轉基因品系針對RNAi構建體進行檢測，發現其中20個品系是PCR陽性的。為了分析轉基因對于脂肪酸組成的作用，從轉化的水稻植物的谷粒和葉樣品中分離全部脂質。對于在FWA1基因中含有Tosl7插入序列的水稻突變品系(TIGR基因座Os06g5130相應于登錄號AP000399鑒別的蛋白質)也進行如此操作以對比特異性失活該基因的效果。如實施例1所述，通過GC-FAME確定每種脂質提取物的脂肪酸組成。數據示于表5-7，一些數據在圖11-13中示出。每種脂肪酸的比例以占谷粒的種子油中總脂肪酸的百分比表示，如實施例1所述通過HPLC確定。最驚人的結果是在i^d2dsRNA植物中谷粒的油酸和亞油酸組成中的改變程度。在一些品系中油酸的比例從36。/。增加至至少65。/。(w/w)，在最受影響的水稻品系(品系22A)中亞油酸的比例從37%降低至大約13%。令人驚奇地，F^^品系中棕櫚酸的比例也降低，例如品系22A中低于14%，相比之下對照組為18%。在F"WdsRNA品系中，谷粒中棕櫚酸的比例降低與亞油酸含量增加相關，而油酸與亞麻酸的比例基本不變。注意與這兩個轉基因品系中棕櫚酸比例的降低程度相似，但是FaW品系中亞油酸水平增加的程度遠低于在品系中觀測到的降低程度。即具有FaW構建體的亞油酸水平的變化程度較高。關于該途徑的催化步驟的感興趣的認識是通過分析FatB的一個同工型FatB-l的Tos-17插入敲除而提供的。在Tos-17突變體中，棕櫚酸和60油酸的比例的改變程度與dsRNA品系相比是降低的。這些結果表明編碼i^W同工型的基因在其功能方面有所不同。當將亞油酸與油酸的比例結果繪制成散點圖(圖14)時，顯然F^/2敲除品系中這兩種脂肪酸之間的關系與野生型水稻相同，但是亞油酸的比例顯著降低。相反，在^/5敲除品系中及在尸"WTos-17品系中程度較低，盡管亞油酸與油酸之間的關系相似，但是有一恒定變化。這意味著與野生型植物或者F"d2敲除植物相比，在F"必敲除植物中對于一定量的油酸而言存在更多的亞油酸。這個結果與這樣的想法一致，即F"W的敲除影響控制油酸和亞油酸的量的途徑而不影響由F"W控制的直接聯系油酸和亞油酸的步驟。將所有分析的水稻品系的亞油酸與棕櫚酸的比例的結果也繪制成圖。對于敲除品系觀測到正線性關系，而對于亞油酸與油酸觀測到相反的結果。然而對于FatB品系，觀測到不同的關系(圖15)。當將Fa&dsRNA植物和F"WdsRNA植物繪制成散點圖時(圖16)也觀測到油酸與棕櫚酸之間的關系差別。這些結果證實棕櫚酸與亞油酸(和油酸)之間的關系對于所述途徑的兩個干擾(perturbations)是不同的。在不同途徑干擾下對各個脂肪酸比例進行的主成分分析證實主成分1(表示導致最大變異的軸)由亞油酸對油酸的比例組成，而主成分2(其次重要的軸)由亞油酸和油酸對棕櫚酸的比例組成)。這個結果在圖17中例證。我們從這個實施例的結果中推斷使dsRNAi^W植物與dsRNAFa^植物或者Tos-17植物雜交以組合突變將進一步增加油酸的比率以及進一步降低棕櫚酸和亞油酸水平。表5:i^7W和突變體的水稻谷粒中脂肪酸組成的GC分析谷粒-突變體豆蔻酸(C14:0)棕櫚酸(C16:0)硬脂酸(C18:0)油酸(C18:1)亞油酸(C18:2)亞麻酸(C18:3)野生型(WH12)0.7018.831.6438.4136.421.29FatBTosl7插入突變體0.7215.132.3337.1538.611.87FatBds脂A轉化系0,5811.431.8134.9246.601.91Fad2dsRNA轉化系0.5814.262.1164.9412.621.23Tosl7對照0.8517.912.6033.2339.841.76FatBdsRNA對照1.0318.861.8434.0839.631.75Fad2dsRNA對照1.0217.472.3836.0337.421.5062表6:和突變體的水稻葉中脂肪酸組成的GC分析<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>實施例6抗體的產生和應用通過合成存在于F"W的推導的序列中的15或16聚體肽產生抗體。用于產生抗F^5的抗體的肽是FaW-UlAc-CGMNKNTRRLSKMPDE(SEQIDNO:56)。該肽相應于從氨基酸位置259翻譯的FatB序列(登錄號AP000399)并還在從AP005291,AC108870和AC004236翻譯的序列中發現。但是，這一序列在4個同工型中僅在序列TRRLSKMPDE(SEQIDNO:57)中相同。Ac-CGEKQWTLLDWKPKKPD(SEQIDNO:58)。這一序列在所有4個同工型的翻譯序列中發現。Ac-CGAQGEGNMGFFPAES(SEQIDNO:59)。這一序列僅在AP00399中發現并且在推導的多肽的最C端。在合成后，用標準技術使用交聯劑MBS(馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酸酰胺酯)將這些肽與卵清蛋白或匙孔血藍蛋白(KLH)偶聯。透析并凍干交聯的肽并以大約lmg/ml的濃度用弗氏不完全佐劑以2周間隔注射進兔中，共兩個月。抗F"W-99產生的抗血清檢測到i^W同工型之間的明顯差異，即在野生型水稻中存在的20kDa的多肽在相應于TIGR標識符Os06g5130的基因中有插入序列的Tos-17突變品系中不存在，該產物相應于i^W-l，序列由登錄號AP000399表示(圖18)。盡管這與大約40kDa的預期大小不同，但是這種差異先前已經在F"W同工型中注意到。不同大小的FW萬產物已經在發育的和成熟的Cwp/zea種子中觀察到，顯示有5種不同的FaW同工型，在成熟種子中大小較長，在成熟種子中產物較短(Leonardetal"1997)。可以使用所述抗血清檢測轉基因和突變植物樣品中的F"W蛋白并證實基因失活程度。實施例7.水稻中的突變體的鑒別從提取自大量不同水稻登錄的水稻DNA中產生跨越F"d2-1(編碼序列相應于NCBI數據庫中的APOO4047，TIGR基因座標識符LOC—Os02g48560)的活性位點(如果起始ATG被用作TIGRLoc_Os2g48560中編號的起點，則基本上是位置330至1020)的PCR產物。根據所用引物，這些產物的大小高至800bp。可能需要使用兩組重疊引物對。一組可能的引物是組AGTGCCGGCGGCAGGATGACGG(SEQIDNO:60)(在圖10的序列對比中的位置5-20)GCCGACGATGTCGTCGAGCAC(SEQIDNO:61)(在圖10的序列對比中的位置379-398的反向互補序列)組BTGCCTTCTCCGACTACTCGG(SEQIDNO:62)(圖10中的位置360-379)CCTCGCGCCATGTCGCCTTGG(SEQIDNO:63)(圖10中的位置1099-1118的反向互補序列)。退火的產物然后在Rotorgene6000儀器(CorbettLifeScience)或相當的儀器中解鏈，在所述儀器中異源雙鏈的解鏈中的差異可以通過染料LCGreen的熒光改變而靈敏地檢測。通過這一技術每天可以篩選幾百個、可能幾千個水稻品系。來自顯示改變的熱譜的樣品的PCR產物被測序并鑒別中的突變。然后失活F""2的選擇的突變體可以雜交進良種水稻品系以產生具有降低的活性并因此具有高油酸的水稻品系。如果需要消除兩個或全部同工型，則這可以通過鑒別在不同同工型中具有所需突變的品系并通過標記輔助育種將所述突變組合在良種水稻品系中而實現。至少F"W-7基因需要是無活性的以相當大地增加油酸含量或降低亞油酸含量。一或多個額外基因的失活會進一步增加油酸含量和降低亞油酸護理。在額外的尸"d2基因中具有突變的突變體可以使用用于額外Fad基因的特異引物如以相同方式鑒別。實施例8.穩定性分析-貯存中己醛產生的檢測正在用FSA,Werribee進行實驗以在野生型水稻中檢測貯存中的己醛產生。這涉及GC，使用取樣器檢測在高溫(40°C)貯存的谷粒的頂部空間中的揮發物。一旦優化系統后(并且我們有足夠量的谷粒)，我們將進行野生型和Fad2RNAi和RNAi水稻品系JT:存后揮發物特別是己醛的產生的比較和基因型的合適組合。這是水稻產業中谷粒貯存和糠貯存的重要質量問題。可能具有影響谷粒質量的作用的其它揮發物的產生和檢測也正在用FSA，Werribee和CSIRO昆蟲學進行研究。頂部空間分析需要大約10g的糙米。糙米在4°C(對照)和35C貯存8周。從糙米釋放的氣體樣品可以通過在8(TC加熱或通過自然擴散而在小瓶的頂部空間中獲得。頂部空間中的揮發成分然后可以通過直接注射進GC或GC-MS儀器并分析氣相層析譜而分析(Suzukietal.，1999)。分析頂部空間中的揮發物的另一種方法是通過如Nielsenetal.(2004)所述用氮氣作為吹掃氣將揮發物捕獲在合適的基質(例如250mgTenaxGR)上而進行。然后加力'曰'ru口17j口'j"兀hTj，mvjl刀wi]re^入口'j力jrri叉rni不f氏近1丁金力U。在具有低亞油酸的水稻品系中水稻貯存會改善的預期是基于一些觀察。Suzukietal.(1999)提供了數據表明在貯存過程中游離亞油酸的量增力口，并且在35'C揮發性醛如戊醛、己醛和戊醇的量增加3倍。己醛和有氣味揮發性醛的相關性也己被其它作者注意到。另一方面，Zhouetal.(2002)發現貯存時總亞油酸的降低并將這與亞油酸分解為其它產物包括導致產生臭氣的揮發物相關聯。結果中的差異可能是由于提取和分析方法的差異所致。體外亞油酸產生己醛由Nielsenetal.(2004)證實。本領域技術人員應理解可以對特異實施方案中所示的本發明進行各種改變和/或修改而不偏離廣泛描述的本發明的精神和范圍。本發明的實施方案因此被認為是示例性的，不是限制性的。所有本文討論和或弓I用的出版物以其全文并入本文。本申請要求AU2006903810的優先權，其全文并入本文。對本說明書中包括的文件、法令、材料、裝置等的任何討論僅為本發明提供上下文的目的。其不應被看作承認這些物質的任何或全部在本發明優先權日之前構成現有技術部分或是與本發明相關領域的普遍知識。參考文獻Abdullahetal.(1986)Biotechnology4:1087.Akagietal.(1995)PlantPhysiol.108,845-846AlmeidaandAllshire(2005)TRENDSCellBiol15:251-258,67Anaietal.(2003)PlantCellRep.21,988-992.AscherioandWillett(1997)Am.J.Clin.Nutr.66:1006S-1010S.BlighandDyerCanadianJ.Biochem.(1959)37:911-917.Boggsetal.(1964)J.FoodSci.29:487-489.BonanomeandGrundy(1988).N.Engl.Med.318:1244-1248.Brandtetal.(1985)CarlsbergRes.Commun.50:333-345.Brounetal.，(1999)Annu.Rev.Nutr.19:197-216.Buhretal.(2002).PlantJ.30:155-163.Champagneetal.(1995)CerealChem72:255-258.Changetal.,(1978).J.Am.OilChem.Soc.55:718-727.Chapmanetal.，(2001).J.Am.OilChem.Soc.78:941-947.Choudryetal.(1980)Phytochemistry19:1063-1069.Clapp(1993)Clin.Perinatol.20:155-168.Colotetal.(1987)E纖OJ6:3559-3564.Comaietal.(2004)PlantJ37:778-786.CurieletaL(1992)Hum.Gen,Ther.3:147-154.Doughertyetal.(1995).Am.J.Clin.Nutr.61:1120-1128.Eglitisetal.(1988)Biotechniques6:608-614.FenandezSanJuan(1995).Alimentaria33:93-98.Fujimuraetal.(1985)PlantTissueCultureLetters2:74.Grahametal.(1973)Virology54:536-539.Gunstone(2001)Inform11:1287-1289.Ha(2005)Nutritionresearch25，597-606.HaseloffandGerlach(1988)Nature334:585-591.Henikoffetal.(2004)PlantPhysiol135:630-636.Huetal.(1997).N.Engl.J.Med.337:1491-1499.JenningsandAkoh(2000)JournalofAgriculturalandFoodChemistry,48:4439-4443.Jonesetal.(1995)PlantCell7:359-371.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>'漁陽薛i外，hVIOV(8661)1它isSu喻'￡019-6609:68VSIl1。S，。V'麵，d(:661)VpJ9u3B叢.It^-6K:6Tiu可d.(9661)'I它pJ^isoa0817-W'6￡sp勿Ooo。IBpp[腿s工'6，S-￡l7S:厶t^ns!ui3iQibo!3oio舊pireimniinop3v(￡861)FpBi!Sns工卞￡:50乙'13U3D'iddv'Josq工(9861)PBureXpoi"￡-U￡:6S'耶N'u!IOT'呵0661).I它Pdanspq丄'6I-60S:H'ui3ipo〖a'unC)'(6661)'lBPiinB!j叫工I乙畫ZI:17Su!J33mSu3onoqepp^(乙00乙)3§SoqqoP朋usisqx'S1/S-乙t7S:t^.瓜sqOpo。d'。口3VT(8861)PPm!b丄卞HI-6IHpooj."j§v.i"(6661)'ppppizns卞IZ扁"I:6'P八'sP!dn闊。ispire9畫yCisI￡AI_￡ZAI:6ZIX§oio!sXqdiirew(乙00乙)？^f!ps3&ri(ns0t6-8￡6:8乙'sum工，os'ui3ipo!g['(000乙)^>[f!ps3&n(ns'0￡￡一￡乙￡:乙17BopB§unHB3聲op!8bpv(1661)'卩i3aoubj^s'6l7-S廿:Isp勿〖(0861)，Pop3uyis'0乙￡-61￡:A0l7"tnBN(OOO乙)'PP觀uisSU-60I:Wop3Ssum丄(SOO。jn^1^PUB叩可s'6乙I—ZJI:H'ipsio舊'jo何(6661)'Fl3XddwsT外-0917:IS1。SP。。d.f(9861)，Pmqspus90U9pspoojjoXp卩os3S9tredBf3tpimxmof(t7綴).I它P"nqiqs'6n—6A:n's八3M'm3u3'pu3D'ip9io舊(8661)Jo!uss6d￡Z:96.網"丄.ss!叢.卿0661)Po!p叫3S.I09-￡6S:01uo卩pitTNjos3qio;3Lreqj9urysq工joiBuano〖'(1661).IB^兩unpraS":-SZ￡Z:U'iih3'f'uiy(000Z)"uq^)piresipo^j:0￡雖t9/09惠法助改Waterhouseetal.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13959-13964.^Williamsetal.(1999)J.Am.Coll.Cardiol.33:1050-1055.Yasumatsuetal.(1966)Agric.Biol.Chem.30:483-486.Zhouetal.(2002)JournalofCerealScience35:65-78.Zocketal.(1994)ArteriosclerThromb.14:567-57權利要求1.米糠油，其脂肪酸組成包含大于大約48％的油酸，小于大約17％的棕櫚酸，小于大約30％的亞油酸和/或其任何組合。2.權利要求l的米糠油，其中油酸與亞油酸的比率大于1.5:1。3.權利要求1或2的米糠油，其脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸，小于大約17%的棕櫚酸及小于大約30%的亞油酸。4.權利要求1-3任一項的米糠油，其脂肪酸組成包含大于大約60%的油酸。5.權利要求l-4任一項的米糠油，其脂肪酸組成包含小于大約12%的棕櫚酸。16.權利要求1-5任一項的米糠油，其脂肪酸組成包含小于大約15%的亞油酸。7.米糠，其脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸，小于大約17%的棕櫚酸，小于大約30%的亞油酸和/或其任何組合。8.權利要求7的米糠，其中油酸與亞油酸的比率大于1.5:1。9.權利要求7或8的米糠，其脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸，小于大約17%的棕櫚酸和小于大約30%的亞油酸。10.權利要求7-9任一項的米糠，其脂肪酸組成包含大于大約60%的油酸。11.權利要求7-10任一項的米糠，其脂肪酸組成包含小于大約12%的棕櫚酸。12.權利要求7-11任一項的米糠，其脂肪酸組成包含小于大約15%的亞油酸。13.水稻種子，其脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸，小于大約17%的棕櫚酸，小于大約30%亞油酸和/或其任何組合。14.權利要求13的水稻種子，其中油酸與亞油酸的比率大于1.5:1。15.權利要求13或14的水稻種子，其脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸，小于大約17%的棕櫚酸和小于大約30%的亞油酸。16.權利要求13-15任一項的水稻種子，其脂肪酸組成包含大于大約60%的油酸。17.權利要求13-16任一項的水稻種子，其脂肪酸組成包含小于大約12%的棕櫚酸。18.權利要求13-17任一項的水稻種子，其脂肪酸組成包含小于大約15%的亞油酸。19.水稻植物，其產生權利要求1-16任一項的米糠油。20.水稻植物，其產生權利要求7-12任一項的米糠。21.水稻植物，其產生權利要求13-18任一項的水稻種子。22.分離的多核苷酸，當其存在于水稻植物的細胞中時，與不存在所述多核苷酸的細胞相比，其下調F"W和/或F"W多肽在所述細胞中的活性水平。23.權利要求22的多核苷酸，其與能指導所述多核苷酸在水稻植物細胞中表達的啟動子可操縱地連接。24.權利要求22或23的多核苷酸，其下調從至少一個和/或基因表達的mRNA水平。25.權利要求22-24任一項的多核苷酸，其中所述多核苷酸選自反義多核苷酸，有義多核苷酸，催化性多核苷酸，微小RNA，編碼結合Fad2或FaW多肽的多肽的多核苷酸和雙鏈RNA。26.權利要求25的多核苷酸，其是反義多核苷酸，在生理條件下與包含SEQIDNO:5-8、11-14或者19-25所示任一或多個核苷酸序列的多核苷酸雜交。27.權利要求25的多核苷酸，其是能切割包含SEQIDNO:5-8，11-14或者19-25所示任一或多個核苷酸序列的多核苷酸的催化性多核苷酸。28.權利要求27的多核苷酸，其是核酶。29.權利要求25的多核苷酸，其是雙鏈RNA(dsRNA)分子，包含含有SEQIDNO:5-8、11-14或者19-25所示任一或多個核苷酸序列的至少19個連續核苷酸的寡核苷酸，其中所述分子的雙鏈部分的長度為至少19個堿基對且包含所述寡核苷酸。30.權利要求29的dsRNA分子，其從單啟動子表達，其中所述雙鏈部分的鏈通過單鏈部分連接。31.—種鑒別多核苷酸的方法，所述多核苷酸當存在于水稻植物的細胞中時，與不存在所述多核苷酸的細胞相比下調和/或FaW多肽在所述細胞中的活性水平，所述方法包括i)確定候選多核苷酸下調F""2和/或多肽在細胞中的活性水平的能力，及ii)選擇下調和/或i^W多肽在細胞中的活性水平的多核苷酸。32.權利要求31的方法，其中所述多核苷酸選自反義多核苷酸，有義多核苷酸，催化性多核苷酸，微小RNA，編碼結合KW2或F"W多肽的多肽的多核苷酸和雙鏈RNA。33.權利要求32的方法，其中所述多核苷酸是反義多核苷酸，其在生理條件下與包含SEQIDNO:5-8、11-14或者19-25所示任一或多個核苷酸序列的多核苷酸雜交。34.權利要求32的方法，其中所述多核苷酸是催化性多核苷酸，其能切割包含SEQIDNO:5-8、11-14或者19-25所示任一或多個核苷酸序列的多核苷酸。35.權利要求32的方法，其中所述多核苷酸是雙鏈(dsRNA)分子，其包含含有SEQIDNO:5-8、11-14或者19-25所示任一或多個核苷酸序列的至少19個連續核苷酸的寡核苷酸，其中所述分子的雙鏈部分的長度為至少19個堿基對且包含所述寡核苷酸。36.使用權利要求31-35任一項的方法鑒別的分離的多核苷酸。37.包含或編碼權利要求22-30或者36任一項的多核苷酸的載體。38.權利要求37的載體，其中所述多核苷酸或者編碼所述多核苷酸的序列與啟動子可操縱地連接。39.權利要求37或38的載體，其中所述啟動子賦予所述多核苷酸相對于在水稻植物的至少一種其它組織或器官而優先在水稻植物的胚、胚乳、糠皮和/或種子中表達。40.包含權利要求37-39任一項的載體和/或權利要求22-30或36任一項的多核苷酸的細胞。41.權利要求40的細胞，其中所述多核苷酸或載體被導入所述細胞或所述細胞的祖細胞中。42.權利要求40或41的細胞，其是水稻細胞或者農桿菌細胞。43.權利要求40-42任一項的細胞，其中所述多核苷酸被整合進細胞的基因組中。44.包含權利要求40-43任一項的細胞的水稻植物。45.—種產生權利要求40-43任一項的細胞的方法，所述方法包括將權利要求22-30或36任一項的多核苷酸或者權利要求37-39任一項的載體導入細胞中的步驟。46.權利要求45的方法，其進一步包括從所述細胞再生轉基因植物的步驟。47.權利要求22-30或36任一項的多核苷酸或者權利要求37-39任一項的載體在產生重組細胞中的應用。48.—種經遺傳修飾的水稻植物，其中相對于未修飾的植物，所述植物中具有和/或活性的多肽的表達降低。49.權利要求48的植物，所述植物已經被轉化，由此包含權利要求22-30或36任一項的多核苷酸，或者包含所述多核苷酸的植物的后代。50.—種產生權利要求1-6任一項的米糠油、權利要求7-12任一項的米糠和/或權利要求13-18任一項的水稻種子的方法，所述方法包括將水稻植物暴露于或多肽的拮抗劑。51.—種獲得遺傳修飾的水稻植物的方法，所述植物可用于產生糙米種子，該種子當與未修飾的糙米種子相比時具有增加的貯存期，所述方法包括對所述植物進行遺傳操作，由此當與產生未修飾的糙米種子的植物相比時在所述水稻種子中F""2和/或FaW多肽的活性和/或產生水平降低。52.權利要求51的方法，其中禾n/或多肽的活性和/或產生水平僅在植物種子中降低。53.權利要求51或52的方法，其中多肽的活性和/或產生水平降低。54.權利要求51-53任一項的方法，其中所述轉基因植物包含權利要求22-30或36任一項的多核苷酸或者權利要求37-39任一項的載體。55.使用權利要求51-54任一項的方法產生的遺傳修飾的水稻植物或者其后代。56.—種選擇可用于產生權利要求1-6任一項的米糠油、權利要求7-12任一項的米糠和/或權利要求13-18任一項的水稻種子的水稻植物的方法，所述方法包括i)篩選誘變的水稻種子或水稻植物群體，及ii)選擇能產生權利要求1-6任一項的米糠油、權利要求7-12任一項的米糠和/或權利要求13-18任一項的水稻種子的種子或植物。57.權利要求56的方法，其中步驟i)包括分析誘變的種子和/或植物的具有或活性的多肽。58.權利要求56或57的方法，其中步驟i)包括分析誘變的種子和/或植物的或基因的序列和/或表達水平。59.權利要求56-58任一項的方法，其中步驟i)包括分析誘變的種子和/或植物的米糠油、米糠和/或種子的脂肪酸組成。60.—種選擇可用于產生權利要求l-6任一項的米糠油、權利要求7-12任一項的米糠和/或權利要求13-18任一項的水稻種子的水稻植物的方法，所述方法包括i)分析得自候選水稻植物的米糠油、米糠和/或種子的脂肪酸含量，及ii)選擇可用于產生權利要求1-6任一項的米糠油、權利要求7-12任一項的米糠和/或權利要求13-18任一項的水稻種子的水稻植物。61.—種選擇可用于產生權利要求l-6任一項的米糠油、權利要求7-12任一項的米糠和/或權利要求13-18任一項的水稻種子的水稻植物的方法，所述方法包括i)分析候選植物樣品的具有或活性的多肽，及ii)基于所述多肽的序列、產生水平和/或活性選擇可用于產生權利要求1-6任一項的米糠油、權利要求7-12任一項的米糠和/或權利要求13-18任一項的水稻種子的水稻植物。62.—種選擇可用于產生權利要求1-6任一項的米糠油、權利要求7-12任一項的米糠和/或權利要求13-18任一項的水稻種子的水稻植物的方法，所述方法包括i)分析候選植物的F^/2或FW萬基因的序列和/或表達水平，及ii)基于所述基因的序列和/或表達水平選擇可用于產生權利要求1-6任一項的米糠油、權利要求7-12任一項的米糠和/或權利要求13-18任一項的水稻種子的水稻植物。63.—種鑒別可用于產生權利要求l-6任一項的米糠油、權利要求7-12任一項的米糠和/或權利要求13-18任一項的水稻種子的水稻植物的方法，所述方法包括檢測所述植物的核酸分子，其中所述核酸分子與所述植物中基因和/或基因的至少一部分連接和/或包含所述植物中F^/2基因和/或FaW基因的至少一部分。64.—種鑒別可用于產生貯存期增加的糙米種子的水稻植物的方法，所述方法包括檢測所述植物的核酸分子，其中所述核酸分子與所述植物中基因和/或FW5基因的至少一部分連接和/或包含所述植物中FaW基因和/或基因的至少一部分。65.權利要求63或64的方法，其包括v)使第二種核酸分子與得自所述植物的所述核酸分子雜交，vi)任選使至少一種其它核酸分子與得自所述植物的所述核酸分子雜交，及vii)檢測所述雜交步驟的產物或者所述雜交步驟產物的不存在。66.權利要求65的方法，其中所述第二種核酸分子用作引物以逆轉錄或者復制所述核酸分子的至少一部分。67.權利要求63-67任一項的方法，其中使用選自如下的技術檢測核酸:限制片段長度多態性分析、擴增片段長度多態性分析、微衛星擴增和/或核酸測序。68.權利要求63-67任一項的方法，包括核酸擴增。69.權利要求63-68任一項的方法，其中所述方法分析基因的表達水平。70.—種獲得水稻植物或種子的方法，所述方法包括i)使第一種親代水稻植物與第二種親代水稻植物雜交，所述第一種親代水稻植物包含賦予植物谷粒的油中的油酸比例增加的F^/2等位基因，所述第二種親代水稻植物包含賦予植物谷粒油中的棕櫚酸比例降低的等位基因，ii)從雜交中篩選存在這兩個等位基因的后代植物或谷粒，及viii)選擇包含這兩個等位基因且具有植物谷粒的油中的油酸比例增加和棕櫚酸比例降低的后代植物或谷粒。71.—種將F"6/2等位基因導入水稻植物中的方法，所述方法包括i)使第一種親代水稻植物與第二種親代水稻植物雜交，其中所述第二種植物包含所述等位基因，及ii)使步驟i)雜交后代和與第一種親代植物相同基因型的植物回交足夠次數以產生具有第一種親代植物的大多數基因型但是也包含所述等位基因的植物，iii)選擇具有第一種植物的大多數基因型且包含所述等位基因的植物，其中所述等位基因賦予所述植物的油、糠和/或種子中油酸的比例增加。72.—種將i^W等位基因導入水稻植物中的方法，所述方法包括i)使第一種親代水稻植物與第二種親代水稻植物雜交，其中所述第二種植物包含所述等位基因，及ii)使步驟i)的雜交的后代和與第一種親代植物相同基因型的植物回交足夠次數以產生具有第一種親代的大多數基因型但是也包含所述等位基因的植物，iii)選擇具有第一種植物的大多數基因型且包含所述等位基因的植物，其中所述等位基因賦予所述植物的油、糠和/或種子中棕櫚酸的比例降低。73.—種增加水稻植物的油、糠和/或種子中油酸比例的方法，所述方法包括對所述植物進行遺傳操作，由此當與野生型植物相比時i^W多肽的產生減少，其中所述多肽具有A12去飽和酶活性。74.—種降低水稻植物的油、糠和/或種子中棕櫚酸比例的方法，所述方法包括對所述植物進行遺傳操作，由此當與野生型植物相比時F"W多肽的產生減少，其中所述多肽具有FatB活性。75.使用權利要求56-74任一項的方法獲得的水稻植物或者其后代植物。76.得自權利要求44、48、49、55或75任一項的植物的米糠油。77.得自權利要求44、48、49、55或75任一項的植物的米糠。78.得自權利要求44、48、49、55或75任一項的植物的水稻種子。79.—種產生種子的方法，所述方法包括a)生長權利要求19-21、44、48、49、55或76任一項的植物，及b)收獲所述種子。80.包含權利要求1-6或76任一項的米糠油、權利要求7-12或77任一項的米糠和/或權利要求13-18或78任一項的水稻種子的食品。81.—種制備食物的方法，所述方法包括在權利要求1-6或76任一項的米糠油中烹飪可食用物質。全文摘要本發明涉及油酸、棕櫚酸和/或亞油酸水平改變的米糠油、米糠和水稻種子。本發明還提供了遺傳修飾水稻植物的方法，由此該水稻植物產生的米糠油、米糠和水稻種子的油酸、棕櫚酸和/或亞油酸的水平改變。特別地，這個目的通過調節Fad2和/或FatB表達而實現。文檔編號C12N15/52GK101516181SQ200780033971公開日2009年8月26日申請日期2007年7月13日優先權日2006年7月14日發明者E·懷特洛,R·C·德費特,S·P·辛格,S·拉赫曼,李忠誼,青柳申請人:聯邦科學技術研究組織