舌癌的判定方法

專利名稱：：舌癌的判定方法
技術領域：
：本發明涉及判定舌癌的惡性度的舌癌的判定方法。
背景技術：
：舌癌在口腔癌中發病率最高，出現淋巴結轉移的頻率也高，還有報道稱，舌癌的5年生存率在轉移陰性病例中為50%左右，在包括遲發轉移的陽性病例中為11%左右(非專利文獻1)。此外，在臨床病程中存在比以其它部位為原發部位的口腔鱗狀上皮癌更早地發生轉移的傾向。因此，不論腫瘤的大小，正確地判定舌癌的惡性度，決定基于該判定的治療方針不僅從癌的控制的角度，從受到治療后的攝食吞咽和發音障礙的影響的QOL的角度來看也是重要的。目前，作為舌癌的預后的推定因子，采用病理組織學上的分化度(非專利文獻2)、浸潤性(非專利文獻2)、淋巴結轉移(非專利文獻2和3)、原發性病灶的大小(非專利文獻2)、血清中的腫瘤標記(非專利文獻4)等。非專利文獻l:JanNyman等舌癌的局部控制和生存的預后因子(Prognoticfactorsforlocalcontrolandsurvivalofcanceroftheora1tongue).ActOncologia;1993:677-73非專利文獻2:KurokawaH等舌鱗狀細胞癌的深度浸潤前沿的組織學分級的高予頁后值(Thehighprognosticvalueofthehistologicgradeatthedeepinvasivefrontoftonguesquamouscellcarcinoma).JOralPatholMed2005:34:329-33非專利文獻3:0kamotoM等1/1I期舌鱗狀細胞癌患者的遲發性頸部轉移的予頁測(PredictionofdelayedneckmetastasisinpatientswithstageI/IIsquamouscellcarcinomaofthetongue).JOralPatholMed2002:15:227-2335非專利文獻4:XinHuang等舌癌中的舌鱗狀細胞癌抗原1的血清蛋白質組學石開究(Serumproteoraicsstudyofthesquamouscellcarcinomaantigenlintonguecancer).J.oraloncology.2006Jan;42(1):25-30發明的揭示然而，病理組織學的檢査方法雖然可以通過癌組織的形態分析來了解口腔癌的存在，但缺乏關于其生物學性質的客觀信息和可靠性，在實際的治療法的決定上，并不是足以作為生物學性質(惡性度)涉及許多方面的口腔癌的獨立信息源的檢查方法。另外，采用腫瘤標記的檢查方法雖然是客觀的定量數據，但停留于檢查時掌握病理狀態，假陽性或假陰性的頻率高，作為用于決定治療法的信息的可靠性不足。于是，近年來期待可在分子水平上對腫瘤的特性進行特征化的生物標記的實用化，但具體的判定系統的構建尚未完成。目前，作為候選的口腔癌的分子生物學的生物標記，可以例舉基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase)家族、鈣粘著蛋白(cadherin)家族、整聯蛋白(integrin)家族等。如上所述，舌癌的預后和轉歸在流行病學上與淋巴結轉移的數量有密切關系，在預測腫瘤的惡性度方面是單純且現實的指標。因此，通過使用前述的參與組織改造、細胞粘著、細胞運動或血管新生等的適當的分子作為生物標記，可以實現未發生轉移的更早期的階段的舌癌惡性度的精確判定。而且，若在早期精確掌握癌的生物學性質，則可以實現與之相應的最適的治療，帶來非常大的好處。但是，目前還沒有采用基因表達水平的舌癌的惡性度判定的實用例。于是，本發明的目的在于提供通過使用整聯蛋白家族基因作為生物標記，測定整聯蛋白家族基因的mRNA量，從而可以更客觀且正確地判定舌癌的惡性度的舌癌的判定方法。本發明人事先進行的口腔鱗狀上皮癌的微陣列基因表達分析的結果中，整聯蛋白a3和整聯蛋白04顯示出在轉移陽性腫瘤中表達顯著較高的傾向。整聯蛋白(ITG)具有由a鏈和0鏈構成的跨膜型的異源二聚體的結構，是連結細胞質和細胞外基質的受體。細胞膜表面的ITG作為纖連蛋白、膠原或層粘連蛋白等細胞外基質蛋白的受體或者參與血小板或白細胞的連接的受體而形成超家族。目前，ITG在人類中克隆了18種a鏈、8種0鏈，作為a鏈和P鏈組合而成的受體確認了24種。各種受體的細胞外結構域(domain:與特定的細胞外基質形成特異性的結合。a鏈、3鏈都有90%為細胞外結構域，在剩下的較短的細胞內結構域上介以踝蛋白、樁蛋白、a-輔肌動蛋白等細胞內錨定蛋白結合有細胞骨架的肌動蛋白纖維。己知ITG在起到連結細胞外配體和細胞骨架的連接分子的作用的同時，對于來自細胞外基質的信號傳遞，通過引發酪氨酸磷酸化、細胞內鈣濃度的變化、肌醇磷脂的合成、細胞周期蛋白的合成、早期基因的表達來參與細胞運動和細胞的增殖、分化、凋亡。除此之外，還報道了通過阻斷ITG和配體間的反應而實現的細胞分化和凋亡的抑制。腫瘤組織中，已知ITG分子的分布為適應高浸潤，轉移能力而失去規律性。如果綜合考慮這些方面，可以預想ITG介導的連接和信號傳遞的無序化以各種各樣的形式參與到腫瘤細胞的產生、增殖、凋亡、運動性、浸潤性等病理狀態中。于是，本發明人基于事先的微陣列基因表達分析的結果，作為舌鱗狀上皮癌的轉移性和生存預后的生物標記候選分子，著眼于整聯蛋白家族基因。對于至此為止被報道參與腫瘤細胞的連接、運動、分化的控制機制的ITGa-1、-2、-3、-5、-6、-v和ITGP-1、-3、-4、-5、-6，進行了采用實時PCR法的基因表達定量分析。另外，腫瘤組織具有包括腫瘤細胞和位于周圍的癌間質(cancerstroma)中的成纖維細胞、炎癥類細胞等多種細胞的細胞構成。所以，預想癌組織的細胞構成對所定量的基因的mRNA量的影響較大。因此，在生物標記的分析中重要的是利用適當的基因的m脂A量將ITG基因表達水平的標準化。作為候選的用于標準化的分子，不僅可以是所謂的持家基因，也同樣可以對如下的基因進行定量編碼上皮細胞骨架的KRT5，編碼錨定蛋白的JUP、PLEC1、PXN，編碼針對ITG的配體(Ligand)分子的LAMA3、LAMA4、LAMA5、Col1A1、VTN。另外，嘗試了通過以功能性的或組織內局部存在的間接相關的基因的mRNA量將ITG基因的mRNA量標準化，從而避免因上述的臨床樣本的偏差而導致的問題。如上所述，鑒于上述課題而認真研究后發現，測定整聯蛋白家族基因和對照基因的mRNA量，通過兩者的比值將整聯蛋白家族基因的mRNA量標準化，根據所得的數值可以客觀且正確地判定舌癌的惡性度，從而想到了本發明。本發明提供舌癌的判定方法，其特征在于，測定舌癌組織標本中的整聯蛋白家族基因和對照基因的mRNA量，根據整聯蛋白家族基因的mRNA量/對照基因的m脂A量的比值來判定舌癌的惡性度。本發明的舌癌的判定方法中的所述整聯蛋白家族基因可以是整聯蛋白a3、整聯蛋白P4、整聯蛋白P5中的至少一種。本發明的舌癌的判定方法中的所述整聯蛋白家族基因和對照基因的mRNA量的測定可以通過實時PCR法進行。本發明的舌癌的判定方法中的所述整聯蛋白家族基因和對照基因的mRNA量的測定可以通過脂A印跡法或固相雜交法進行。本發明的舌癌的判定方法中的所述對照基因可以是持家基因、細胞骨架分子基因、錨定蛋白基因、細胞外基質基因中的至少一種。本發明的舌癌的判定方法中的所述對照基因可以是ACTB。本發明的舌癌的判定方法中的所述對照基因可以是KRT5。本發明的舌癌的判定方法中的所述對照基因可以是JUP和/或PXN。本發明的判定方法可以是舌鱗狀上皮癌的判定方法。本發明提供舌癌組織標本的分析方法，其特征在于，包括測定舌癌組織標本中的整聯蛋白家族基因和對照基因的mRNA量的步驟，以及將整聯蛋白家族基因的m脂A量/對照基因的mRNA量的比值與臨床數據進行關聯的步驟。本發明的舌癌組織標本的分析方法中的所述臨床數據可以是選自T匪分期、Y-K分類、對化學療法的反應、對放射線療法的反應、預后的1種或2種以上的數據。本發明的舌癌組織標本的分析方法中的所述整聯蛋白家族基因和對照基因的mRNA量的測定可以通過實時PCR法進行。本發明的舌癌組織標本的分析方法中的所述整聯蛋白家族基因和對照基因的mRNA量的測定可以通過RNA印跡法或固相雜交法進行。本發明的舌癌組織標本的分析方法中的所述整聯蛋白家族基因可以是整聯蛋白a3、整聯蛋白P4、整聯蛋白P5中的至少一種。本發明的舌癌組織標本的分析方法中的所述對照基因可以是持家基因、細胞骨架分子基因、錨定蛋白基因、細胞外基質基因中的至少一種。本發明的舌癌組織標本的分析方法中的所述對照基因可以是ACTB。本發明的舌癌組織標本的分析方法中的所述對照基因可以是KRT5。本發明的舌癌組織標本的分析方法中的所述對照基因可以是JUP和/或PXN。本發明的舌癌組織標本的分析方法中的所述舌癌可以是舌鱗狀上皮癌。本發明提供舌癌組織標本的分析用試劑盒，其特征在于，包括用于進行選自整聯蛋白a3、整聯蛋白04和整聯蛋白35的1個或2個以上的整聯蛋白家族基因在舌癌組織標本中的mRNA量的測定的引物對，用于進行選自ACTB、KRT5、JUP和PXN的l個或2個以上的對照基因在舌癌組織標本中的mRNA量的測定的引物對，以及說明本發明的舌癌組織標本的分析方法的使用說明書。本發明提供舌癌組織標本的分析用試劑盒，其特征在于，包括用于進行選自整聯蛋白a3及KRT5、整聯蛋白a3及JUP、整聯蛋白34及JUP、整聯蛋白P4及KRT、整聯蛋白P5及ACTB、整聯蛋白05及PXN的l組或2組以上的整聯蛋白家族基因及對照基因的組合在舌癌組織標本中的mRNA量的測定的引物對的組合，以及說明本發明的舌癌組織標本的分析方法的使用說明書。本發明提供舌癌組織標本的分析用試劑盒，其特征在于，包括用于進行選自整聯蛋白a3、整聯蛋白P4和整聯蛋白35的1個或2個以上的整聯蛋白家族基因在舌癌組織標本中的mRNA量的測定的探針，用于進行選自ACTB、KRT5、JUP和PXN的l個或2個以上的對照基因在舌癌組織標本中的mRNA量的測定的探針，以及說明本發明的舌癌組織標本的分析方法的使用說明書。本發明提供舌癌組織標本的分析用試劑盒，其特征在于，包括用于進行選自整聯蛋白a3及KRT5、整聯蛋白a3及JUP、整聯蛋白04及JUP、整聯蛋白P4及KRT、整聯蛋白P5及ACTB、整聯蛋白05及PXN的1組或2組以上的整聯蛋白家族基因及對照基因的組合在舌癌組織標本中的mRNA量的測定的引物對，以及說明本發明的舌癌組織標本的分析方法的使用說明書。如果采用本發明的舌癌的判定方法，則測定舌癌組織標本中的整聯蛋白家族基因和對照基因的表達量、即mRNA量，根據兩者的比值，可以客觀且正確地判定舌癌、特別是舌鱗狀上皮癌的惡性度。如果釆用舌癌組織標本的分析方法，則通過將舌癌組織標本中的整聯蛋白家族基因的mRNA量/對照基因的mRNA量的比值與臨床數據進行關聯，可以進行在客觀且正確地判定舌癌、特別是舌鱗狀上皮癌的惡性度方面有用的分析。本發明的舌癌組織標本的分析用試劑盒可以實現在客觀且正確地判定舌癌、特別是舌鱗狀上皮癌的惡性度方面有用的分析。藉此，對于根據數據被判定為預后不佳的病例，即使對于過去在臨床上被判定為預后良好的病例，也可以通過采用縝密地實施更有力的術前術后的化學療法和放射線療法、手術中的切除范圍的擴大、術前術后的病程觀察中的各種檢查的判定的集中治療方針，從而改善癌控制率。此外，對于被判定為預后良好的病例，通過避免過多的治療和檢查，可以給各種患者提供最好的醫療服務。另外，通過附加基因水平上的研究來進行判定，可以進行高精度的判定，因此能夠減輕醫療費和背離治療原則的不安等患者的負擔。因而，對于社會也可以帶來通過進行適當的醫療而實現的醫療費的削減。附圖的簡單說明圖1是本發明的實施例1中主成分分析的采用第1主成分和第2主成分的各變量的因子載荷散布圖。10圖2是表示本發明的實施例l中考克斯(Cox)比例風險模型的基于舌鱗狀上皮癌組織內的ITGB4/JUP的高低的2組間的卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)生存曲線的圖。實施發明的最佳方式以下，對本發明進行詳細說明。本發明的舌癌的判定方法的特征在于，測定舌癌組織標本中的整聯蛋白家族基因的表達量、即mRNA量，通過整聯蛋白家族基因的mRNA量/對照基因的mRNA量的比值將整聯蛋白家族基因的m脂A量標準化，根據所得的數值判定舌癌的惡性度。另外，所述整聯蛋白家族基因可以是ITGA3、ITGB4、ITGB5中的至少一種。另外，所述整聯蛋白家族基因的m脂A量的測定不限定特定的方法，更優選使用實時PCR法。本發明的mRNA量的測定也可以使用RNA印跡法或固相雜交法。固相雜交法包括使raRNA或來源于mRNA的標記核酸與二維地排列有針對不同基因的探針的陣列雜交的多陣列雜交法和使mRNA或來源于mRNA的標記核酸與固定化有針對不同基因的探針的微球(beads)雜交的微球雜交法，但不局限于這些方法。實施本發明的舌癌的判定方法時，從舌癌組織的一部分中提取RNA，合成cDNA。以該cDNA為模板通過采用TaqMan(注冊商標)探針的定量實時PCR進行整聯蛋白家族基因群的表達定量。接著，同時進行用作對照的各種基因的表達定量。接著，取各種對照基因的mRNA量為分母，將ITGA3、ITGB4、ITGB5基因的m西A量標準化，制成數值數據。接著，使用該經標準化的數值數據來判定舌癌的惡性度。如上所述，根據整聯蛋白基因的mRNA量/對照基因的mRNA量的比值，可以正確地掌握、預測癌的生物學和臨床的性質，能夠用于舌癌的臨床判定。另外，所述對照基因是持家基因、細胞骨架分子基因、錨定蛋白基因、細胞外基質基因中的至少一種。另外，所述對照基因可優選使用其中的ACTB。11另外，所述對照基因可優選使用其中的KRT5。另外，所述對照基因可優選使用其中的JUP和/或PXN。本發明中使用的用于通過實時PCR法進行整聯蛋白家族基因和/或對照基因的mRNA量的測定的引物對可以基于從日本國立遺傳學研究所的日本麗A數據庫(DDBJ)及其它機構的主頁得到的各種基因的cDNA的核苷酸序列通過本發明的
技術領域：
的普通技術人員所周知的方法進行設計。本發明中使用的用于通過RNA印跡法或固相雜交法進行整聯蛋白家族基因和/或對照基因的mRNA量的測定的探針可以基于從日本國立遺傳學研究所的日本DNA數據庫(DDBJ)及其它機構的主頁得到的各種基因的cDNA的核苷酸序列通過本發明的
技術領域：
的普通技術人員所周知的方法進行設計。如上所述，通過本發明的舌癌的判定方法，可以更客觀且正確地判定舌癌、特別是舌鱗狀上皮癌的惡性度。以下，通過本發明的實施例對本發明進行詳細說明，但本發明并不受到這些實施例的任何限制。還有，以下的實施例l中的實驗方法等如下。(作為對象的病例)用于基因表達分析的腫瘤標本是1999年2005年在新瀉大學醫學及牙科綜合醫院牙科口腔外科、長岡紅十字醫院牙科口腔外科、信州大學醫學院牙科口腔外科實施治療的66例舌癌病例的活組織檢查或手術切除時釆集的標本。這些病例在組織學上被診斷為鱗狀上皮癌，T醒分期、浸潤方式(Y-K分類)及其它詳細的數據示于表l。本發明中的研究的實施計劃不僅得到新瀉大學牙醫學系倫理委員會的同意，而且在進行研究時遵守日本文部科學省公布的關于臨床研究的倫理規定的內容。取得患者的研究協助時說明了研究的主旨，并在獲得知情同意的基礎上簽訂了同意書。66名舌鱗狀上皮癌患者的特性特性患者數(％)年齡平均62.38(范圍21-91)性別男性41(62%)女性25(38%)觀察天數115-1821天(平均795)尺寸(mm)<2020(30%)204032(48%)》4014(21%)頸部淋巴結轉移陰性31(47%)陽性35(53%)遠端臟器轉移陰性60(91%)陽性6(9%)局部復發陰性64(97%)陽性2(3%)化學療法—43(65%)+23(35%)放射線療法—39(59%)+27(39%)結果生存54(82%)死亡12(18%)(RNA的提取)腫瘤組織被浸漬保存于RNALater(安比雍公司(Arabion)，得克薩斯州，美國)。這些腫瘤組織未進行特別的解剖，由腫瘤實質細胞和成纖維細胞、血管內皮細胞、炎癥細胞等多種間質構成細胞構成。總腦A提取如下進行在TRIzol試劑(英杰公司(一>tf卜口^工y株式會社)，卡爾斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亞州，美國)中勻漿后(Ultra-TurraxT8，IKA實驗室技術公司(IKALabortechinik)，斯道芬(Staufen)，德國)，按照該試劑的流程附加2次苯酚沉淀處理(PCI西格瑪奧德里奇公司(、乂夕"^7WKy:y千株式會社)，圣路易斯，美國)。以2wg總RNA為模板，通過反轉錄反應(S叩erScr叩tII，英杰公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國按照標準流程)合成單鏈cDNA。(采用實時PCR的相對的基因表達定量)以由舌鱗狀上皮癌組織合成的cDNA為模板，進行采用定量實時PCR(Smart循環儀(SmartCycler)，賽菲德公司(C印heid)，桑尼威爾(Sunnyvale)，加利福尼亞州，美國)的基因表達定量。實時監控使用TaqMan(注冊商標)探針(TaqMan(注冊商標)基因表達分析(GeneExpressionAssays),應用生物系統公司(AppliedBiosystems)，加利福尼亞州，美國)以TaqMan(注冊商標)通用PCR主混合物(UniversalPCRMasterMix)(應用生物系統公司)按照應用生物系統公司(ABI社)標準流程(95"C/600秒，95"C/15秒+6(TC/60秒X溫度循環)進行。以作為標準的舌癌組織的cDNA為模板制成數級的稀釋系列(1:10:100:1000:10000:100000)，對于各濃度的樣品進行采用同樣的流程的實時PCR，繪制各基因的標準曲線。基因的mRNA量根據循環閾值(thresholdcycle)(Ct值)基于各自的標準曲線定量。作為分析對象的基因選定如下的基因ll種ITG家族基因、3種所謂的持家基因(HKG)、7種包括ITG的配體的細胞外基質基因(ECM)、4種在ITG受體的細胞質側發揮作用的包括所謂的錨定蛋白(ANK)和細胞骨架分子(CSK)的基因(表2)。[表2]所分析的基因功能上的類別基因編號探針*HsO1673837—mlHs00985382_glHs00233722—mlHs01547684_mlHs01041013—ml整聯蛋白家族Hs00233790一mlHs00559595一mlHs00173978一mlHs01103172_glHs00174435一ml/r咖Hs00982346—mlHs99999903—ml持家基因04Hs99999905—mlHs99999901—si細胞骨架分子Hs00361185一mlHs00158408—ml錨定蛋白Hs0095420_glPA7VHs00236046一mlHs01125432_ml"崩4Hs00935293—mlHs00966637_ml細胞外基質7M7Hs00233648—ml/W/Hs015499-0_glHs01076775_gl1/77VHs00169863_ml*應用生物系統公司的TaqMan⑤基因表達分析中的分析ID(統計學分析)對于由臨床數據和基因表達數據得到各變量算出作為基本統計量的平均值、標準差、偏斜度、峰度而評價分布型后，算出各變量間的相關系數矩陣。對于將所述的11種ITG家族(ITG)基因的表達水平以其它的14種HKG、ECM、ANK和CSK基因的表達水平標準化而得的數值數據，以曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢驗對其與作為臨床惡性度的指標的頸部淋巴結轉移的有無和死亡的轉歸的相關性進行單變量分析。介于該檢驗的結果，通過分步法進行多變量回歸分析中的變量選擇，將對于頸部淋巴結轉移和轉歸顯示高相關性(P《0.01)的ITG基因表達比用于后續的多變量分析。作為臨床的參數，采用作為對象的病例的年齡、性別、與腫瘤的進展范圍有關的腫瘤的大小、作為與轉移有關的項目的頸部淋巴結轉移的有無和數量及遠端臟器轉移、作為與治療有關的信息的化學療法的有無和放射線治療的有無、作為臨床病程的死亡的轉歸的信息。作為多變量分析，進行采用所有變量的主成分分析，研究變量間的相關性。接著，進行基于以頸部淋巴結轉移為目標變量的多元邏輯回歸分析的相關因子檢測以及關于頸部轉移的預測模型的評價。然后，進行基于將是否死亡的轉歸作為終點的考克斯(COX)比例風險模型的分析。(組織學觀察)對于與基因表達分析中使用的標本相同的腫瘤標本，觀察石蠟切片所得的HE組織染色的結果。標本用10%福爾馬林固定后，用常規方法制成。對于統計學上與臨床惡性度顯示出顯著的相關性的多個標記，結合臨床的病程，研究基于其高低的形態學觀察結果。實施例l(統計學分析)1.單變量分析各變量間的相關系數矩陣的觀察結果中，在背景因素間，頸部淋巴結轉移與放射線照射(r=0.54)、遠端臟器轉移與死亡的轉歸之間(r=0.67)發現較高的相關性。在ITG基因比之間，ITGA3/JUP與ITGA3/KRT5(1^0.75)、ITGB5/LAMA3與ITGB5/TNC(f0.52)、ITGB4/JUP與ITGA3/GAPD(r二0.57)、ITGB4/JUP與ITGB4/KRT5(r二0.91)、ITGB5/ACTB與ITGB5/TNC(r=0.64)、ITGB5/ACTB與ITGB5/LAMA3(r=0.69)、ITGB5/ACTB與ITGB5/LAMA5(r=0.59)、ITGB5/L認A4與ITGB5/FNl(r-0.60)之間分別顯示出高相關性。此外，在背景因素與基因之間，轉歸與ITGB4/JUP(r^.53)分別發現較高的相關性。對于通過以14種相關基因分別將11種ITG基因表達水平標準化而算出的151項基因表達比與頸部淋巴結轉移的有無及死亡的轉歸的關系進行的曼-惠特尼檢驗的結果示于表3和表4。顯示頸部淋巴結轉移的顯著性的基因表達比<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>ns:無顯著性，數值表示在曼-惠特尼U檢驗中顯示顯著性的P值*負相關|顯示p^0.001的基因表達比<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>對于頸部淋巴結轉移，ITGA3和ITGB5中確認有多個顯示顯著性的基因比。用于標準化的基因種類中，采用KRT5和JUP的情況下，有多個顯示顯著性的基因比項目。ITG家族基因與ECM基因群、錨定蛋白PXN的基因表達水平確認有大致上伴隨淋巴結轉移和轉歸變差而上升的傾向。僅ITGB5存在表達水平伴隨臨床病程的惡化而下降的傾向，因而推測ITGB5顯示在轉錄量隨觀察結果變差而上升的ECM分子和錨定蛋白基因中一致的顯著性。對于死亡的轉歸，顯示顯著性的基因比集中于ITGB4和ITGB5。該結果中，將對于頸部淋巴結轉移或死亡的轉歸顯示1X以下的顯著性水平的ITGA3/GAPD、ITGA3/KRT5、ITGA3/JUP、ITGB4/KRT5、ITGB4/JUP、ITGB5/ACTB、ITGB5/FN1、ITGB5/TNC、ITGB5/LAMA3、ITGB5/LAMA4、ITGB5/LAMA5、ITGB5/PXN用于多變量統計分析。2.多變量分析主成分分析在以臨床數據和基因表達數據為變量的主成分分析的結果中，特征值在1以上的主成分為第1主成分第7主成分，累計貢獻率為72.9%。包括2個以上各主成分和變量的因子載荷呈0.5以上的變量的主成分為第1主成分第3主成分，特征值都在2以上(表5)。[表5]主成分分析的臨床參數與12類基因表達比<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*下劃線表示主成分的各樞軸中最顯著的數值第1主成分(Z-l)中，與ITGB35相關的各種基因比以及死亡轉歸的因子載荷顯示了較高的絕對值。在ITGB4/JUP、ITGB4/KRT5、ITGA3/GAPD的基因表達信息中檢出較大的正值，在ITGB5/ACTB、ITGB5/L旭A5的基因表達信息中檢出負值。第2主成分(Z-2)中，ITGB的基因比以及與頸部淋巴結轉移的有無相關的因素的因子載荷顯示了較高的值。與反映死亡轉歸的第l主成分形成對照，在ITG基因表達比中，ITGA3/JUP和ITGA3/KRT5孤立地顯示了較高的正的因子載荷值，同時腫瘤長徑(尺寸)、化學療法顯示了較高的因子載荷值。第3主成分(Z-3)中，遠端臟器轉移和死亡轉歸顯示了大的因子載荷值，而在ITG基因表達比中沒有顯示高值的項目，這被理解為該成分表示臨床參數間的關聯。該第3主成分中，化學療法的因子顯示了較大的負的因子載荷值。在第1主成分和第2主成分的因子載荷散布圖中，如前所述，橫軸Z-1的第l主成分被解釋為與"死亡的轉歸"相關的基因的因素軸，縱軸Z-2的第2主成分被解釋為與"頸部淋巴結轉移"相關的基因的因素軸(圖l)。轉歸的因素軸(橫軸Z-1)中，在ITGB4和ITGA3的基因比群中確認表示相關的正的因子載荷，表示負相關的負的因子載荷由ITGB5的基因比構成，分別分布于圖的右半球和左半球。另一方面，頸部淋巴結轉移的因素軸(縱軸Z-2)中，ITG基因比大多分布于O的周圍，其中僅ITGA3/JUP和ITGA3/KRT5分布于與頸部淋巴結轉移同樣水平的因子載荷區域。另外，腫瘤的長徑(尺寸)雖然在第2主成分(縱軸)中與頸部淋巴結轉移的因素接近，但在第l主成分(橫軸)中位于絕對值較小的因子載荷區域。與頸部淋巴結轉移相關的多元邏輯回歸分析以單變量分析以及主成分分析的結果為基礎，進行了以頸部淋巴結轉移的有無為目標變量的多元邏輯回歸分析。其結果是，作為顯著影響頸部淋巴結轉移的因素，檢出了ITGA3/JUP和ITGB5/PXN(表6)。以頸部淋巴結轉移的有無為目標變量的多元邏輯回歸分析B標準差顯著水平比值比4,0131.7330.02155.287-2.0951.0230.0410.123常數0.2270.5820.6971,255其中，對于頸部淋巴結轉移，前一基因在正的方向上產生影響，后一基因在負的方向上產生影響。其中，ITGA3/JUP的偏回歸系數以及比值比顯示了最大的值。在與頸部淋巴結轉移的有無相關的預測精度的評價中，基于本模型的真陽性率為74.3%，真陰性率為71.0%，準確度為72.7%(表7)。[表7]頸部淋巴結轉移模型的預測精度預測值(頸部LN轉移"0神1***觀測值頸部LN轉移0221992671.074.372.7*頸部淋巴結轉移，**0無，氺**1肖關于生死的轉歸的考克斯(Cox)比例風險模型進行了基于以轉歸、即21生死作為終點的考克斯(COX)比例風險模型的回歸分析，結果作為顯著影響死亡轉歸的因素檢出ITGB4/JUP(表8)。[表8]使用R0C曲線求出ITGB4/JUP的最適臨界值并二值化，通過卡普蘭邁耶法繪制出各組的生存曲線(圖2)。2組間的生存函數的對數秩檢驗和威爾科克森(Wilcoxon)檢驗中，ITGB4/JUP不足0.15的組顯示了比0.15以上的組高的生存率，顯著水平都不足O.1%，確認顯著差異。(基于基因表達分析結果的組織學觀察結果的研究)暨卜I翻班趙區墜qlss您根據基因表達分析的結果，基于ITGB4/JUP和ITGA3/JUP的值選擇病例。ITGB4/JUP顯示了高值的腫瘤大多經歷頸部淋巴結多發轉移后，發生遠端臟器轉移，結果死亡的病程。生存病例中，也觀察到原發腫瘤切除后發生頸部二次轉移等顯出臨床上的術后惡性的病程。組織觀察結果中并未都顯出一定的組織觀察結果，但單一細胞從小細胞瘤巢擴散性地浸潤的觀察結果是僅在ITGB4/JUP為高值的腫瘤中觀察到的組織學特征。細胞的分化水平整體被判斷為低分化的腫瘤實質形成的組織中，包括混雜有高分化區域和低分化區域的組織。在炎癥類細胞的浸潤強等情況下難以判別腫瘤浸潤影像，但全部在浸潤前端部得到了高浸潤觀察結果方面是一致的，在組織學上顯示了高惡性。ITGA3/JUP顯示高值的腫瘤主要觀察到小細胞瘤巢水平的浸潤觀察結果。除了同時具有ITGB4/JUP高值的情況以外，沒有發現遠端臟器轉移。細胞的分化度從低分化至高分化混雜，但可以說分化度總體上高于ITGB4/JUP為高值的腫瘤。如果與具有作為上皮細胞的未分化且較均質的腫瘤細胞的ITGB4/JUP為高值的腫瘤組織相比，雖然腫瘤細胞的異形性各種各樣，但觀察到小腫瘤細胞瘤巢單位的浸潤方式有基本上一定的組織學傾向。ITGB4/JUP、ITGA3/JUP都為低值的組織影像中未發現浸潤觀察結果，維持了基底膜結構和細胞間連接等上皮的基本觀察結果。(考察)以舌癌組織中的基因的表達水平為基礎，以惡性度精密判定系統的確立為目的，對編碼ITG受體的a和p亞單位的11種ITG基因進行了生物標記候選基因的研究。根據基因表達數據的統計學處理，ITGA3、ITGB4和ITGB5這3種基因的表達數據顯示出與舌癌的臨床病程良好地對應的可能性。統計學上，任一ITG基因的表達水平都確認與淋巴結轉移的形成相關，與組織學的惡性觀察結果也顯示出一定程度的相關性。本發明的研究結果中應當關注的方面在于，伴隨舌癌的病程所出現的淋巴結轉移中同時存在臨床上可控制在頸部淋巴結轉移的水平的淋巴結轉移和將來通過遠端臟器轉移而與死亡的轉歸密切相關的淋巴結轉移，前者顯示出通過ITGA3的基因表達水平所定義的可能性，后者顯示出通過ITGB4和ITGB5的基因表達水平所定義的可能性。本發明人進行的基因表達定量不進行細胞成分的分離，以活體檢査時或手術時所切除的所有腫瘤組織為對象。因此，難以在最初的階段將基因標本調整為一定的條件。以所采集的基因標本中包括各種各樣的濃度和分解水平、組織構成的不同、采集部位的偏差為前提。為了在這樣的條件下采集臨床上有效的基因表達信息而作的精心設計被認為是實際使用上無法避免的課題。作為高效地比較條件不同的基因表達定量結果的方法，一直以來采用相對于組織一般表達的所謂持家基因(HKG)表達水平的比值化、即標準化。但是，近年來，隨著定量實時PCR的普及，這些HKG的表達水平被指出在組織間或組織內采集部位上存在較大的偏差，并不適合作為用于標準化的基因。在這樣的背景下，為了選定可高效地抽提在構成鱗狀上皮癌(SCC)的上皮和腫瘤細胞、成纖維細胞、炎癥性浸潤細胞等中表現出特征性的局部存在的各種ITG家族基因群的表達水平變化的組合，嘗試了基于多種基因的表達的標準化。除了服G之外，以與ITG分子之間的共同局部存在性和功能上的關聯為基礎，研究了基于構成細胞間基質的各種間質(ECM)分子、細胞骨架分子(CSK)和錨定蛋白基因(ANK)的標準化。其結果是，在關于頸部淋巴結轉移和死亡轉歸的采用曼-惠特尼檢驗的單變量分析中，ITGA3、ITGB4和ITGB5在基于KRT5、JUP和PXN的標準化數據中檢出高顯著性。ITGA3和ITGB4是在口腔粘膜中主要局部存在于上皮內的分子，其標準化中，上皮類細胞的CSK、細胞膜上的ITG和鈣粘著蛋白等連接分子與作為連接細胞內纖維的ANK的KRT5和JUP顯示出作為比較病例間的基因表達數據時的標準化分子有用的可能性。今后依然需要通過詳細地研究這些分子間的局部存在性，總結所顯示的顯著性的功能上的證據。基于主成分分析的分析在從多種角度縱覽因子間的聯系方面是有用的。對應于死亡轉歸的第l主成分中，以ITGB4/JUP和ITGB5/ACTB為代表的ITG基因表達比與遠端臟器轉移和頸部淋巴結多發轉移一起顯示了較大的因子載荷絕對值。這意味著這些ITG基因表達水平與死亡的轉歸存在正相關或負相關。另一方面，對應于頸部淋巴結轉移的第2主成分中，ITGA3/KRT5和ITGA3/JUP孤立地顯示了較高的因子載荷，這暗示它們作為獨立的因子與頸部淋巴結轉移的形成相關。這些因子間的相互關系由第1主成分和第2主成分的因子載荷散布圖得到較好的表現。腫瘤的長徑(圖1中的尺寸D)在第2主成分軸(縱軸)附近位于較大的因子載荷區域，這表示雖然腫瘤的大小與死亡的轉歸沒有直接聯系，但在一定程度上影響頸部淋巴結轉移的形成。通過與之鄰近并同樣位于第2主成分軸的周圍的ITGA3/KRT5(K)和ITGA3/JUP(L)所表現的值與腫瘤的大小相關，與以第l主成分軸(橫軸)表示的死亡的轉歸無關。可以認為它們反映出在進行頸部肅清等適當的治療時可以控制的頸部淋巴結轉移能力。與之相反，在第l主成分軸上，以ITGB4和ITGB5的表達比水平所定義的淋巴結轉移能力同樣與頸部淋巴結轉移、特別是頸部淋巴結多發轉移(F)相關，但同時與遠端臟器轉移和局部復發密切相關，因此最終被解釋為與死亡轉歸相關。第3主成分與第1主成分同樣表示轉歸和遠端臟器轉移的因素軸，但化學療法的實施顯示了較大的負的因子載荷，這意味著化學療法的實施與遠端臟器轉移和轉歸呈負相關，換言之，意味著化學療法的實施抑制遠端轉移和死亡轉歸的可能性。通過多元邏輯回歸分析，作為顯著影響頸部淋巴結轉移的因素，檢出有ITGA3/JUP和ITGB5/PXN。ITGA3/JUP是在前述的主成分分析的結果中與遠端轉移和死亡轉歸無關的表示淋巴結轉移的傾向的因子之一，而ITGB5/PXN是反映與遠端臟器轉移或死亡轉歸相關的因素軸的因子。其中，ITGA3/JUP的偏回歸系數和比值比顯示了最大的值，表示通常對淋巴結轉移具有較大的影響。該觀察結果被認為與淋巴結轉移大多在頸部淋巴結水平得到抑制、而不是幾乎都因遠端轉移和局部復發而陷入難以控制的局面的情況匹配。如上所述，淋巴結轉移是作為基于兩個獨立的轉移性的效果的總和所表現出的現象，這是也在多元邏輯回歸分析中顯示出的結果。采用基于這兩個因素所算出的頸部淋巴結轉移回歸模型的頸部淋巴結轉移的預測精度雖然顯示真陽性率74.3%、真陰性率71.0%、準確度72.7°%，但很難說達到臨床應用所需的水平。然而，對于由多種細胞成分構成的作為極復雜的生物學作用的結果的淋巴結轉移，作為僅基于與ITG分子相關的2個因素的判定，認為這是超乎預想的高準確度。今后的課題是通過在將來使其發展成加入了涉及其它生物學現象的多種分子群的預測模型，將準確性提升至實用的范圍。25作為針對與死亡轉歸相關的因素的分析而進行的考克斯(Cox)比例風險模型中，雖然是多變量分析，但僅檢出唯一的ITGB4/JUP。該結果與主成分分析的因子載荷散布圖中ITGB4和ITGB5的基因表達比的項目鄰近第1主成分(Z-1)、對應于死亡轉歸的因素軸分布的結果匹配，表示ITGB4和ITGB5的項目雖然負相關，但被判定為說明死亡轉歸或遠端臟器轉移的近似的因素。作為代表它們的主因子，ITGB4/JUP顯示風險比為1055671，顯著水平p<0.0001，同樣在基于卡普蘭邁耶法的累計生存率曲線和對數軸檢驗中也明確該因子具有較強的說明力。ITG家族分子一直以來在對腫瘤的性質產生影響的功能方面有較多的報道。ITGA3與ITGPl亞單位成對，在組織內起到針對間質分子纖連蛋白(FN)、以LAMA3為構成成分的層粘連蛋白-5(層粘連蛋白a1Y1)、以LAMA5為構成成分的層粘連蛋白-10(層粘連蛋白a501Yl)和層粘連蛋白-11(層粘連蛋白a502Y1)的受體的作用。ITGA3表達主要以上皮基底細胞為代表在肺、子宮、食道、腎小球等中發現廣泛的分布，其功能被認為在正常狀態下與細胞的連接、運動、凋亡有關。有報道稱，子宮癌和結腸癌中，具有ITGA3作為亞單位的整聯蛋白a30l的表達狀態影響癌細胞的轉移和病理組織學的分級。另一方面，ITGB4也被發現在上皮細胞和間質中的施旺細胞、血管內皮細胞等中有表達，整聯蛋白a6P4受體起到針對層粘連蛋白-5的受體的作用。除了細胞連接之外，在創傷治愈和神經伸長時、胎兒期也發現表達，所以被認為廣泛地與細胞的生成、分化、增殖相關。ITGB5也在上皮基底細胞中被發現，形成整聯蛋白avP5的亞單位，起到FN、玻連蛋白的受體的作用。被認為在正常細胞中與細胞的連接、增殖、運動、血管形成的功能相關，已知在浸潤性高的胃癌中有高表達。在腫瘤的增殖和轉移的形成中，向腫瘤組織內的血管新生被例舉為重要的現象。目前為止的研究中，ITGB4在血管內皮細胞中表達，被視作負責其細胞游動和浸潤的因子。敲除ITGB4的小鼠中顯示與腫瘤組織鄰接的血管新生顯著地得到抑制。相反地，對于ITGB5，敲除ITGB5的小鼠中向腫瘤細胞周圍的血管新生得到增強，所以對于腫瘤組織的血管新生顯示抑制作用。本發明的研究中顯示ITGB4表達比的上升和ITGB5表達比的下降與遠端臟器轉移和死亡轉歸相關，想到這些整聯蛋白表達信息可反映因血管新生的活化而產生的腫瘤向血管內的轉移和腫瘤增殖活化的現象。今后，對于它們的機制需要深入研究。以往，遠端轉移性的預想和生命預后的預測方面，僅通過組織學的判定，基準并不明確。雖然通過組織學的觀察結果也可以以一定程度的比例預想腫瘤具有的高惡性，但如本發明所示，在基于ITGB4/JUP和ITGA3/JUP的高低的分類中組織影像呈多樣的形態，即僅通過組織影像常常難以對于遠端轉移的可能性和轉歸進行具有再現性的預后判定。如本發明所示，暗示至少有與遠端轉移不太有關聯的和有密切關聯的這2種因子與頸部淋巴結轉移相關。基因表達數據譬如可以期待給口腔癌的治療時最傷腦筋的這些問題帶來至今為止沒有過的客觀的信息。舌癌占口腔癌的約一半，具有在較早期發生轉移的性質，因此認為即便是T1-T2病例，預測潛在的淋巴結轉移和遠端轉移的方法的實用化也可產生巨大的利益。以往的研究和本發明的研究中都顯示化學療法可以產生遠端轉移的抑制效果，在正確地把握了腫瘤的性質的基礎上制訂的治療計劃在控制率提高方面具有非常重要的意義。針對頸部淋巴結轉移、遠端臟器轉移的危險性和腫瘤的浸潤性的信息提供系統的構建所產生的總體上的利益以及生存率和QOL的改善、醫療費的合理化等所帶來的利益被認為非常巨大。權利要求1.舌癌的判定方法，其特征在于，測定舌癌組織標本中的整聯蛋白家族基因和對照基因的mRNA量，根據整聯蛋白家族基因的mRNA量/對照基因的mRNA量的比值來判定舌癌的惡性度。2.如權利要求l所述的舌癌的判定方法，其特征在于，所述整聯蛋白家族基因是整聯蛋白a3、整聯蛋白P4、整聯蛋白P5中的至少一種。3.如權利要求1或2所述的舌癌的判定方法，其特征在于，通過實時PCR法進行所述整聯蛋白家族基因的mRNA量的測定。4.如權利要求1或2所述的舌癌的判定方法，其特征在于，通過RNA印跡法或固相雜交法進行所述整聯蛋白家族基因和對照基因的mRNA量的測定。5.如權利要求14中的任一項所述的舌癌的判定方法，其特征在于，所述對照基因是持家基因、細胞骨架分子基因、錨定蛋白基因、細胞外基質基因中的至少一種。6.如權利要求5所述的舌癌的判定方法，其特征在于，所述對照基因是ACTB。7.如權利要求5所述的舌癌的判定方法，其特征在于，所述對照基因是KRT5。8.如權利要求5所述的舌癌的判定方法，其特征在于，所述對照基因是JUP和/或PXN。9.如權利要求18的任一項所述的舌癌的判定方法，其特征在于，所述舌癌是舌鱗狀上皮癌。10.舌癌組織標本的分析方法，其特征在于，包括測定舌癌組織標本中的整聯蛋白家族基因和對照基因的mRNA量的步驟，以及將整聯蛋白家族基因的mRNA量/對照基因的m認A量的比值與臨床數據進行關聯的步驟。11.如權利要求10所述的舌癌組織標本的分析方法，其特征在于，所述臨床數據是選自TOM分期、Y-K分類、對化學療法的反應、對放射線療法的反應、預后的1種或2種以上的數據。12.如權利要求10或11所述的舌癌組織標本的分析方法，其特征在于，所述整聯蛋白家族基因和對照基因的mRNA量的測定通過實時PCR法進行。13.如權利要求10或11所述的舌癌組織標本的分析方法，其特征在于，所述整聯蛋白家族基因和對照基因的mRNA量的測定通過RNA印跡法或固相雜交法進行。14.如權利要求913中的任一項所述的舌癌組織標本的分析方法，其特征在于，所述整聯蛋白家族基因是整聯蛋白a3、整聯蛋白P4、整聯蛋白P5中的至少一種。15.如權利要求914中的任一項所述的舌癌組織標本的分析方法，其特征在于，所述對照基因是持家基因、細胞骨架分子基因、錨定蛋白基因、細胞外基質基因中的至少一種。16.如權利要求15所述的舌癌組織標本的分析方法，其特征在于，所述對照基因是ACTB。17.如權利要求15所述的舌癌組織標本的分析方法，其特征在于，所述對照基因是KRT5。18.如權利要求15所述的舌癌組織標本的分析方法，其特征在于，所述對照基因是JUP和/或PXN。19.如權利要求918中的任一項所述的舌癌組織標本的分析方法，其特征在于，所述舌癌是舌鱗狀上皮癌。20.舌癌組織標本的分析用試劑盒，其特征在于，包括用于進行選自整聯蛋白a3、整聯蛋白e4和整聯蛋白05的1個或2個以上的整聯蛋白家族基因在舌癌組織標本中的mRNA量的測定的引物對，用于進行選自ACTB、KRT5、JUP和PXN的l個或2個以上的對照基因在舌癌組織標本中的mRNA量的測定的引物對，以及說明權利要求1012中的任一項所述的舌癌組織標本的分析方法的使用說明書。21.舌癌組織標本的分析用試劑盒，其特征在于，包括用于進行選自整聯蛋白a3及KRT5、整聯蛋白a3及JUP、整聯蛋白P4及JUP、整聯蛋白04及KRT、整聯蛋白05及ACTB、整聯蛋白P5及PXN的l組或2組以上的整聯蛋白家族基因及對照基因的組合在舌癌組織標本中的raRNA量的測定的引物對的組合，以及說明權利要求1012中的任一項所述的舌癌組織標本的分析方法的使用說明書。22.舌癌組織標本的分析用試劑盒，其特征在于，包括用于進行選自整聯蛋白a3、整聯蛋白e4和整聯蛋白35的1個或2個以上的整聯蛋白家族基因在舌癌組織標本中的mRNA量的測定的探針，用于進行選自ACTB、KRT5、JUP和PXN的l個或2個以上的對照基因在舌癌組織標本中的mRNA量的測定的探針，以及說明權利要求IO、11或13所述的舌癌組織標本的分析方法的使用說明書。23.舌癌組織標本的分析用試劑盒，其特征在于，包括用于通過RNA印跡法或固相雜交法進行選自整聯蛋白a3及KRT5、整聯蛋白a3及JUP、整聯蛋白e4及JUP、整聯蛋白P4及KRT、整聯蛋白e5及ACTB、整聯蛋白P5及PXN的1組或2組以上的整聯蛋白家族基因及對照基因的組合在舌癌組織標本中的raRNA量的測定的探針的組合，以及說明權利要求IO、11或13所述的舌癌組織標本的分析方法的使用說明書。全文摘要本發明提供可以客觀且正確地判定舌癌的惡性度的舌癌的判定方法、舌癌組織標本的分析方法以及舌癌組織標本的分析用試劑盒。所提供的舌癌的判定方法的特征在于，測定舌癌組織標本中的整聯蛋白家族基因和對照基因的mRNA量，根據整聯蛋白家族基因的mRNA量/對照基因的mRNA量的比值來判定舌癌的惡性度；所提供的舌癌組織標本的分析方法的特征在于，包括測定舌癌組織標本中的整聯蛋白家族基因和對照基因的mRNA量的步驟，以及將整聯蛋白家族基因的mRNA量/對照基因的mRNA量的比值與臨床數據進行關聯的步驟；還提供舌癌組織標本的分析用試劑盒。文檔編號C12Q1/68GK101522912SQ20078003389公開日2009年9月2日申請日期2007年9月28日優先權日2006年10月12日發明者永田昌毅,黑川亮申請人:國立大學法人新瀉大學