用于免疫治療的活化淋巴細胞的制備方法

專利名稱：：用于免疫治療的活化淋巴細胞的制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種制備活化淋巴細胞的方法，更具體地涉及制備用作細胞免疫治療劑的活化淋巴細胞的方法，當人體患有必需施予免疫細胞的疾病時，通過從人體外周血液中分離淋巴細胞，在體外大量增殖和活化分離出的淋巴細胞，并將該活化淋巴細胞施予淋巴細胞來源的人體；或通過凍存該活化淋巴細胞，并將凍存的該活化淋巴細胞施予淋巴細胞來源的人體。
背景技術：
：人體免疫細胞包括自然殺傷(NK)細胞和T細胞，它們能識別和消除轉化的某些細胞，如癌細胞或感染病毒的細胞。因此，利用那些細胞的功能可以預防和治療這些疾病。然而，對于癌癥患者來說，免疫細胞難以表現足夠的抗癌作用，因為各種抗癌療法包括外科手術，抗癌藥物治療和放射治療導致免疫系統減弱，從而削弱免疫細胞的功能或顯著減少免疫細胞的數量。為此，如果將患者免疫細胞在體外大量增殖和激活，然后再施予該自體患者，有可能獲得期望較高的抗癌效果。活化淋巴細胞是一種細胞免疫治療產品，通過在體外大量增殖和激活人體血液免疫細胞，并將該活化免疫細胞施予該自體患者，用于治療癌癥。它是一種具有個體針對性的抗癌免疫治療劑，通過激活自體患者的免疫細胞誘導體內免疫，如包括樹突狀細胞的抗癌免疫治療劑。由于腫瘤抗原暴已知的，所以用細胞毒性T淋巴細胞(CTL)特定地消除腫瘤細胞是可能的[Rosenbergetal.，1999]。但人們知道，各種癌中MHCI族的表達降低，并且由于這一機制，癌細胞可以避開CTL的免疫監視[Amiotetal.，1998]。另一方面，MHCI族-缺陷癌細胞對自然殺傷(NK)細胞高度敏感[Pawelecetal.，2004]。NK細胞不需要識別抗原就能消除癌細胞和感染病毒的細胞[Albertssonetal.，2003;Coluccietal.，2003;Smythetal.，2002]。NK細胞的活性通過激活信號和抑制信號之間的信號平衡來調節[Faragetal.，2003]。最為完好的激活配體是NKG2D配體。其中，MHCI族-相關A鏈和B鏈(MICA/B)受應激，如熱休克，氧化應激和病毒性感染誘導，UL-16結合蛋白(ULBPs)的表達受病毒感染誘導[Vivieretal.，2002]。NKG2D配體的表達受應激誘導，這些配體在不同癌細胞系中表現出不同的表達形式[Watzletal.，2003]。NKG2D配體具有標記應激的細胞或轉化的細胞的能力，意味著癌細胞對NK細胞的敏感性可通過調節激活配體的表達來控制。因為NKG2D配體能增強對NK細胞的敏感性，所以可以消除NKG2D配體高度表達的癌細胞，即使其MHCI族的表達是正常的[Rauletetal.,2003]。由此，如果NKG2D配體的表達增強，則NKG2D受體-表達細胞如NK、NKT、CD8+T和^T細胞的抗癌療效可以進一步增強。在20世紀80年代初期，羅森伯格(Rosenberg)小組完成了黑色素瘤、腎細胞癌、淋巴瘤、肺癌和結腸癌方面的LAK細胞(淋巴因子-激活的殺傷細胞，用IL-2激活NK細胞)臨床試驗[Rosenbergetal.，1985]，但LAK細胞的臨床應用受到限制，因為LAK細胞的抗癌細胞毒性相對較弱，并且難以大量獲得這種細胞。為了克服這一限制，沃夫斯密特(Schmidt-Wolf)等開發了一項通過在抗CD-3抗體、IFN-y、IL-1和IL-2的存在下培養外周血單核細胞，制備大量高效毒性細胞的技術[Schmidt-Wolfetal.，1991]。培養的細胞稱作"CIK(細胞因子誘導殺傷)細胞"，相比現有的LAK細胞，CIK細胞具有高細胞毒性和高增殖率。眾所周知，該細胞組中表現毒性效應的細胞對CD56表面抗原呈陽性，其中CD3+CD56十細胞約為2030%，CD3-CD56+細胞(NK細胞表面抗原)所占比率很低(<10%)。然而，研究包括CIK細胞在內的細胞對腫瘤細胞的毒性顯示CD3-CD56+細胞的殺傷能力高于CD3+CD56+細胞[Schmidt-Wolfetal.，1993;Luetal.，1994;Scheffoldetal.，1995]。因此，認為LAK細胞和CIK細胞中具有最高抗癌作用的細胞是NK細胞(CD3-CD56+)。同時，MSDilber等開發了通過在抗CD-3抗體和IL-2中培養外周血單核細胞，大量培養CD3-CD56+的技術[Carlensetal.，2001]。培養的細胞稱作"CINK(細胞因子誘導自然殺傷)細胞"，比起現有的LAK細胞，該細胞具有高增殖率。然而，根據該方法，CD3-CD56+細胞僅可在補充了抗-CD3抗體和IL-2的CellGroSCGM培養基中大量培養。4另外，人們知道CD4+CD25+調節性T細胞在正常人體的外周血單核細胞(PBMCs)中以小于5%的比率存在，且在體外抑制T細胞的增殖[K.E.Earleetal.,2005]。此外，體外用IL-2培養的CIK細胞能誘導CD4+CD25+調節性T細胞的增殖，分泌大量IL-IO，由此抑制CTL的增殖，降低CTL的細胞毒性[JanSchmidtetal.，2004]。特別地，人們知道CD4+CD25+調節性T細胞減少CIK或NK細胞中表達的NKG2D受體的數量，并且由活化的CD4+CD25+調節性T細胞產生的TGF-P抑制NK細胞的細胞毒性[FrancoisGetal.，2005]。因此，在本發明中，從PBMC分化和增殖的自體活化淋巴細胞中，CD4+CD25+調節性丁細胞的比率顯著降低至5%，因此改善了自體活化淋巴細胞在體內的功能。
發明內容因此，本發明為解決現有技術中存在的問題作了很多努力，結果發現在白細胞介素-2(IL-2)、y干擾素(IFN-y)和抗CD-3抗體的存在下，通過從人體外周血中分離培養淋巴細胞，可大量制備對腫瘤細胞和感染病毒的細胞具有很強殺傷力的€056+和NKG2D+細胞，從而完成本發明。因此，本發明的一個主要目的在于提供制備活化淋巴細胞的方法，其中在抗CD-3抗體、IL-2和IFN-y存在下，通過從人體外周血中分離培養淋巴細胞，可大量制備對腫瘤細胞和感染病毒的細胞具有很強殺傷力的CD56+和NKG2D+細胞。本發明的另一個目的在于提供一種細胞免疫治療組合物，該組合物包含根據所述方法增殖的活化淋巴細胞作為活性成分。圖1顯示活化淋巴細胞在培養6天，10天，15天和21天的數量測量結果。圖2顯示用流式細胞儀對每一測試組中活化淋巴細胞的表面抗原CD3和CD56進行分析所獲得的圖表。圖3顯示用流式細胞儀對每一測試組中活化淋巴細胞的表面抗原NKG2D和CD56進行分析所獲得的圖表。圖4顯示用流式細胞儀對每一測試組中活化淋巴細胞的表面抗原CD16和CD56進行分析所獲得的圖表。圖5顯示冷凍活化淋巴細胞前后，分別用流式細胞儀對活化淋巴細胞的表面抗原CD3和CD56,表面抗原NKG2D和CD56以及表面抗原CD16和CD56進行分析所獲得的圖表。圖6顯示在輔以抗-CD3抗體和IL-2的介質中培養的，正常人體CIK(細胞因子誘導殺傷)細胞中的CD4-和CD25-陽性細胞。圖7顯示在培養的0天、14天和21天，用流式細胞儀對活化淋巴細胞的表面抗原CD4和CD25進行分析所獲得的結果。最佳實施方式為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供制備活化淋巴細胞的方法，包括以下步驟(1)從外周血中采集和分離淋巴細胞；(2)在白細胞介素-2(IL-2)、7干擾素(IFN-力和抗-CD3抗體的存在下，在體外培養淋巴細胞，以制備活化淋巴細胞；(3)將該活化淋巴細胞凍存給定的一段時間；和(4)解凍和復蘇凍存步驟的淋巴細胞。當需要長期儲存步驟(1)和(2)制備的活化淋巴細胞時，使用步驟(3)和(4)。本發明方法中的步驟(1)是從外周血中采集和分離淋巴細胞的步驟，其中該淋巴細胞采集自患病或健康人體的外周血液。因為方便易行，優選從臂靜脈采集血液，但只要其含有淋巴細胞任何位置都可能用到。步驟(1)采集的外周血中可加入肝素鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)或檸檬酸，這樣就不會發生凝血。本發明的活化淋巴細胞可通過從采集的外周血中分離淋巴細胞，經體外培養增殖和激活該分離淋巴細胞而得到。本發明方法的步驟(2)是激活和增殖步驟(1)中分離的淋巴細胞的培養步驟。培養步驟(1)采集的淋巴細胞的方法優選但不限于在IL-2，IFN-y或抗-CD3抗體單獨或組合存在下完成。在這種情況下，最優選在IL-2，IFN-y和抗-CD3抗體組合存在下培養該淋巴細胞，因為比起IL-2，IFN-y或抗-CD3抗體單獨存在，這樣能顯示很強的抗癌作用。而且，通過使用合適的抗原誘導抗原特異性T淋巴細胞，然后在其中加入一種CD3抗體或各種促分裂素，也可獲得抗原特異性活化淋巴細胞。至于抗原，有可能使用純化抗原，來自癌細胞或病毒的提取物，癌細胞或病毒本身，或具有交叉反應的偽抗原。在這種情況下，任何材料都可使用，只要它具有增殖和激活淋巴細胞的功能。同6時，培養過程中也可使用IL-15代替所述IL-2。本發明步驟(2)中使用的IL-2和IFN-Y可在商業上獲得，優選在培養基中以1-2000U/ml的濃度使用。IL-2禾卩IFN^還可以在普遍廣泛使用的細胞培養基中溶解后使用，例如生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液、RPMI-1640、DMEM、IMDM、AIM-V(GIBGO，USA)、X-Vivo(Cambrex)、LGM、KBM-306(KohjinBio)、CellGro(CellGenix)等。IL-2和IFN-y—旦溶解，就需要在冷凍狀態下儲存，以防止其活性降低。同時，作為培養基，只要它適合培養淋巴細胞，可以沒有特定限制地使用任何培養基，優選的例子包括RPMI-1640、DMEM、IMDM、AIM-V、X-Vivo、LGM、KBM和CellGro，尤優選無血清培養基，如AIM-V、CellGro、KGM和X-Vivo。步驟(2)中的培養基優選含有血清，因為含血清的培養基有很好的增殖作用。至于血清，不僅可用商業上獲得的胎牛血清或正常人的血清，還可使用自體血清。還可能使用無血清培養基。淋巴細胞的培養可在通常細胞培養系統中進行，例如C02培養箱。細胞培養中C02的濃度為110%，優選37%;培養溫度為3040°C，優選3538。C。雖然細胞培養的時間沒有具體限制，但細胞培養優選進行約228天，因為這確保抗-CD3抗體的刺激信息傳遞到細胞。培養時間尤其優選38天，因為這使抗-CD3抗體的刺激信息穩定地傳遞到細胞，并且顯示高的培養效率。更優選在培養過程中用顯微鏡觀察細胞的狀態，以便在添加適量培養基時測定細胞的數量。此外在細胞培養中，培養開始后的14天細胞不增殖，但之后可觀察到細胞增殖，培養基從橙色變為黃色。在培養基中添加的額外培養基的量優選為該培養基量的0.15倍。同時，額外培養基的添加以17天，優選24天的間隔進行，以便防止培養基變質和IL-2活性降低。本發明方法步驟(2)中的細胞培養可以通過將單核細胞懸浮在包含IL-2和IFN-Y的培養基中開始，并在培養容器中加入抗-CD3抗體用于固定化(immobilization)。此外，如有必要，培養基中還添加各種細胞因子和促分裂素，淋巴細胞增殖和活化的效率將進一步增加。還有，用于刺激淋巴細胞的抗-CD3抗體可以是動物或細胞產生和純化的抗體，或商業上獲得的OKT-3抗體。除了這些抗體，可不加任何特定限制地使用任何抗體，只要它能刺激7淋巴細胞的增殖和活化。例如，還可使用抗-CD28抗體。本發明方法的步驟(3)是將該活化淋巴細胞凍存一給定時間的步驟。在該步驟中，要保存的淋巴細胞可以以一定濃度懸浮在細胞防腐液的中，該濃度根據其大小適當選擇。在防腐液中懸浮和凍存該淋巴細胞所需要的密度為lxlOS細胞/毫升lxl(T細胞/毫升。在該步驟中細胞防腐液的用量并不重要，但鑒于方便，防腐液優選使用0.11000ml，更優選0.5100ml。本發明方法步驟(3)中使用的凍存液可以是商業上獲得的細胞防腐液，也可以自己配制用于步驟(3)。該細胞防腐液可以在合適的緩沖溶液或培養基中含有血清、高分子物質如蛋白質或多糖，和二甲亞砜(以下稱作"DMSO")，所有列出的物質都不是細胞保存所必需的。因此，用于保存細胞的防腐液不限于以上組分。淋巴細胞懸浮于合適的細胞防腐液并在低溫下凍存。制備好的凍存液在使用前可存放于冰箱(4'C)。在本發明制備活化淋巴細胞的方法中，該活化淋巴細胞優選為0056+和NKG2D+細胞。本發明中，CD56+為殺傷細胞標記，NKG2dD+為淋巴細胞活化受體標記。圖2的圖表顯示本發明實施例3的結果，其中x-軸是CD-3(T-淋巴細胞標記)標記的淋巴細胞，y-軸是CD56標記的淋巴細胞。每個圖表分為四部分進行分析，四部分中的左上部分(區域Ol)顯示CD-3陰性，CD-56陽性天然殺傷細胞(NK細胞)，右上部分(區域02)顯示CD-3陽性和CD-56陽性淋巴細胞。這兩部分中(01和02)的細胞為具有抗癌作用的淋巴細胞。在該分析結果中，根據本發明的實施方式，在IL-2，IFN-y和抗-CD3抗體組合存在下培養淋巴細胞時，殺傷細胞表面抗原CD56的表達率在所有試驗組均高于60。/c)(Gl至G4)，且T淋巴細胞標記CD3陰性細胞的比率在所有試驗組(Gl至G4)均高于50%。該結果表明本發明使用的AIM-V，CellGro，X-Vivo和KBM培養基都可用來大量培養具有很強抗癌作用的殺傷細胞。同時，圖3顯示NKG2D受體表達的分析結果。NKG2D受體是已知如NK，NKT，CD8T和YST細胞等參與激活淋巴細胞的激活受體之一。圖3表中x-軸是NKG2D標記的淋巴細胞，y-軸是CD56標記的淋巴細胞。每個圖表分為四部分進行分析，四部分中的左上部分(區域02)和右下部分(區域04)顯示NKG2D陽性淋巴細胞。具體地，右上部分顯示NKG2D和CD-56均為陽性的淋巴細胞。因此，根據本發明的實施方式，在IL-2，IFN-y和抗-CD3抗體組合存在下進行淋巴細胞的培養時，NKG2D陽性淋巴細胞的比率在所有試驗組均高于90%(G1至G4),NKG2D在幾乎所有的殺傷細胞中(CD-56陽性細胞)為陽性。從這些結果可以看出，根據本發明的制備方法培養的活化淋巴細胞顯示高的抗腫瘤細胞或抗感染病毒細胞活性。在本發明用于制備活化淋巴細胞的方法中，該活化淋巴細胞除CD56+和NKG2D+外，優選進一步包括CD16+。本發明中，所述CD16+為FcyRHI標記。圖4的圖表顯示本發明實施例3的結果，x-軸是CD16標記的淋巴細胞，y-軸是CD56標記的淋巴細胞。每個圖表分為四部分進行分析，四部分中的右上部分(區域P2)顯示對CD-16和CD-56均為陽性的淋巴細胞。己知CD-16表面抗原誘導抗體依賴細胞介導的細胞毒性(ADCC)。因此，認為由于根據本發明實施方式制備的細胞中，表面抗原-表達細胞的比率在所有試驗組均高于40%，則比起CD16表面抗原表達很少或不表達的CIK細胞，根據本發明制備的細胞將顯示出強大的抗癌作用。本發明用于制備活化淋巴細胞的方法中，活化淋巴細胞中004+和〔025+的比率優選為36%，更優選小于5%。人們知道，癌癥患者外周血中CD4-和CD25-陽性細胞比正常人高2.5倍[AnnaMariaWolfetal，2003]。也知道CD4-和CD25-陽性細胞可增加正常人外周血中培養的CIK(細胞因子誘導殺傷)細胞。即報道所說，即使是正常人的CIK細胞，在抗-CD3抗體(或OKT-3)和IL-2的存在下進行培養時，CD4-和CD25-陽性細胞的比率也會從培養前的0.5±0.07%增長到培養14天后的35.5±8.4%(見圖6)[JanSchmitetal.，2004]。在本發明中，從癌癥患者外周血中分離的淋巴細胞顯示CD4-和CD25-陽性細胞的比率顯示大于10y。，但當淋巴細胞在IFN-Y，抗-CD3抗體和IL-2存在下培養21天，該比率降低到小于5%的正常水平(見圖7)。本發明制備活化淋巴細胞的方法中，抗-CD3抗體優選在使用之前固定于培養容器中。為應用于本發明，抗-CD3抗體優選包含于培養基中，但是考慮到淋巴細胞增殖效率和操作簡便，更優選固定于培養容器中。用于固定抗體的培養容器包括玻璃、聚氨酯、聚烯烴或聚苯乙烯制成的容器。具體地，可以使用容易獲得的塑料制成的細胞培養瓶，其大小可適當選定。抗體的固定可通過向培養容器中添加抗-CD3抗體的稀釋液進行，以固定和穩定該抗體，比如在4-37t:下固定2-24小時。此外，為固定抗-CD3抗體，抗-CD3抗體在生理緩沖鹽水中稀釋，如濃度為0.1-3(Vg/ml的無菌磷酸鹽緩沖液。抗體在固定后儲存于冰箱(4°C)中備用。為用于本發明，將液體成分從儲存的抗體稀釋液中除去，殘留抗體如有必要可用生理緩沖液如磷酸鹽緩沖液于室溫下洗滌。圖1顯示在培養6天，IO天，15天，21天時活化淋巴細胞數量的測定結果。在圖1中，淋巴細胞于AIM-V培養基中培養G1和G5，CeIIGro培養基中培養G2和G6，X-Vivo培養基中培養G3和G7，KBM培養基中培養G4和G8。培養21天時，活化淋巴細胞數量的測定結果顯示，當淋巴細胞在含有抗-CD3抗體(Gl-G4)的培養基中培養時，與培養早期的淋巴細胞數量相比，活化淋巴細胞的數量平均增加168倍。當淋巴細胞在抗-CD3抗體固定化瓶(G5G8)中培養時，與培養早期的淋巴細胞數量相比，活化淋巴細胞的數量平均增加338倍。從上述結果可見，當淋巴細胞在抗-CD3抗體固定化瓶中培養時，細胞增殖率比在含抗-CD3抗體的基質AIM-V的培養情況高約兩倍，有可能在CellGro、X-Vivo和KBM培養基中大量培養活化淋巴細胞。此外，在用抗-CD3抗體固定化瓶培養和用含抗-CD3抗體的培養基培養之間，比較細胞的增殖和激活。結果是，當細胞在抗-CD3抗體固定化瓶進行培養時，細胞的增值率比其它情況高約兩倍。同樣，在培養21天時對表面抗原CD3、CD16、CD56和NKG2D分析顯示，根據培養條件來看，它們并無差升。在本發明制備活化淋巴細胞的方法中，細胞的凍存優選使用冷凍管或袋，細胞密度為0.510.0x107細胞/冷凍管或0.0510.0x101G細胞/冷凍袋。保存本發明的冷凍細胞的冷凍容器可以是商業獲得的冷凍細胞的冷凍管或袋，大小可根據需要適當選擇。冷凍細胞的數目優選0.510.0x107細胞/冷凍管或袋，冷凍管的數目為21000個，取決于血液采集量。在冷凍袋實例中，冷凍細胞的數目優選0.0510.0x101()細胞/冷凍袋，冷凍袋的數目為1IO個，取決于血液采集量。此外，為用于本發明，被凍存的細胞解凍，溶解10和復蘇，用于病人。在特殊情況下，細胞也可在解凍和溶解后立即給予。本發明用于制備活化淋巴細胞的方法中，細胞最多保存15年，可在適宜時間點解凍、溶解和復蘇，如有必要，還可以長時間凍存。凍存細胞可根據本領域技術人員熟知的任意細胞凍存方法進行儲存，但是當含有細胞的冷凍管或袋使用可控速率冷凍系統以-1匸/min的速率冷卻至-70-90°c，然后轉移儲存于氮氣罐中時，細胞可儲存15年或更久。本發明的凍存可以使用冷凍箱、超低溫冷凍箱或氮氣罐，但考慮到淋巴細胞的穩定性和增殖效率，優選使用可控速率冷凍系統。至于可控速率冷凍系統，可使用商業上可獲得的系統，也可使用由用戶改進的系統。此外，冷凍的細胞在可控速率冷凍系統中儲存030天，優選07天。這里所用的術語"0天"意指在可控速率冷凍系統中儲存期間為124小時。這里所用術語"期間"指恰好在活化淋巴細胞轉移至有儲存細胞能力的氮氣罐中進行長期保存之前的初始冷凍期。將細胞由可控速率冷卻系統轉移至氮氣罐中可用任何商業可得的物件進行，該物件可以進入氮氣罐，包括罐或冷凍管箱。根據本發明的另一方面，提供了一種用于培養活化淋巴細胞的培養基組合物。該組合物包含抗-CD3抗體，白細胞介素-2(IL-2)和y干擾素(IFN-y)。培養CD3-CD56+細胞的現有技術可以僅在添加抗-CD3抗體和IL-2的CellGroSCGM培養基中進行，但在本發明中，在IL-2，抗-CD3抗體禾MFN-y同時存在下，大量培養CD3-CD56+細胞不僅可在CellGroSCGM培養基中進行，而且可在AIM-V，CellGroDC，KBM-306和X-Vivo培養基中進行。根據本發明的另一方面，提供了一種細胞免疫治療組合物，該組合物包含根據本發明的制備方法增殖的活化淋巴細胞作為活性成分。這里，細胞免疫治療劑是一種通過體外大量增殖和激活人體血液免疫細胞，并將該活化細胞施予自體患者來治療癌癥的抗癌免疫治療劑。此外，該治療劑是一種具有個體針對性的抗癌治療劑，通過激活患者自體免疫細胞來誘導體內免疫，如含有樹突細胞的抗癌免疫治療劑。本發明中，當不僅來自正常人，也可以來自晚期癌癥患者的外周血淋巴細胞在抗-CD3抗體、IFN-y和IL-2存在下進行培養時，具有基本相同活性的活化淋巴細胞可以大量增殖。此外，當根據本發明的制備方法獲得的活化淋巴細胞凍存很長一段時間后，解凍和復蘇時，這些細胞的生存能力和活性得到保持。因此，當淋巴細胞來源的人體患有需要施予該細胞的疾病時，根據本發明的活化淋巴細胞可用作細胞免疫治療劑，通過從患者或健康人的外周血中分離淋巴細胞，體外增殖和活化該分離的淋巴細胞，然后將該活化淋巴細胞施予自體患者，或者通過凍存活化淋巴細胞，凍存的細胞解凍和復蘇后施予自體患者。本發明的細胞免疫治療組合物可以本領域已知的普通配方例如注射液的形式制備，也可外科手術般地直接植入癌癥部位或在靜脈給藥后轉移到癌癥部位。根據本發明的組合物的劑量可以不同，取決于疾病類型，給藥途徑，患者年齡和性別以及疾病的嚴重程度，但本發明的組合物優選給藥劑量為成人lxl071011細胞。根據本發明，通過在抗-CD3抗體、IFN-y和IL-2存在下培養人外周血淋巴細胞，可以大量制備高效毒性細胞。根據本發明的制備方法增殖的活化淋巴細胞包括003-0056+(天然殺傷細胞標記)細胞和CD3+CD56+細胞，且可以大量培養。CD3-CD56+細胞是LAK細胞的主要成分，CD3+CD56+細胞是CIK細胞的主要成分。因此，比起單獨使用LAK細胞和CIK細胞，根據本發明的淋巴細胞可顯示出明顯較高的抗癌作用。實施例參考以下實施例，對本發明作進一步詳細描述。然而，應理解的是這些實施例旨在說明本發明，不應解釋為限制本發明的范圍。實施例l:淋巴細胞的血液采集和分離無菌狀態下從人體靜脈采集10100ml外周血。至于血液采集容器，可使用含抗凝血劑如肝素或EDTA的血液采集管或袋。然后，將血液注入50ml離心管中，與等量的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)混合均勻。50ml離心管中加入Histopaque-1077溶液(Sigma)，使Histopaque-1077溶液與PBS稀釋的血液比率為h21:4。然后，將PBS稀釋的血液緩慢加入到離心管中，使液面不分散。然后將混合物于室溫、轉速400Xg條件下離心分離，分離出淋巴細胞部分。然后將該部分用適量的磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌3次。最后離心洗滌之后，除去上清液，淋巴細胞沉淀均勻懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中，用臺盼藍溶液測定淋巴細胞的數量。結果顯示細胞總數為2.0X1(^2.0X108。實施例2:抗-CD3抗體固定化瓶的制備將抗體(Orthodone0KT3注射液，Ortho生物技術制造)加到PBS中制備得到濃度為5嗎/m的10ml抗-CD3抗體溶液，將抗體溶液加入到培養瓶中，該培養瓶底部表面積為225cm2，可使溶液在底面均勻分布。次日，用真空泵(suctionpump)吸取瓶中的抗體溶液，用PBS洗滌三次，由此制得抗-CD3抗體固定化瓶。實施例3:活化淋巴細胞的培養本發明中，在兩種不同的培養條件下比較活化淋巴細胞增殖率和激活。為此，將淋巴細胞懸浮液加入至50ml各種適宜培養基(Gl:AIM-V(GIBGO,USA);G2:CeIIGro(CeIIGenix);G3:KBM(KohjinBio);G4:X畫Vivo(Cambrex))中混合均勻，每種培養基包含1000U/mlIFN-y(Leucogen,LGLifeSciences)和15%的人血清。然后，每種培養基在37。C和5。/。C02條件下，于細胞培養瓶中進行培養。培養24小時后，采集每一瓶中的培養基，并轉移至新的225-cn^的T-瓶中，并向各瓶中加入500U/mlIL-2(Proleukin,CHIRON公司)禾口50ng/ml抗CD-30抗體(Orthoclone，Ortho生物技術公司)。同時，在用實施例2制備的抗^03抗體固定化瓶進行培養和用含有抗-CD3抗體的培養基進行培養的情況之間，比較細胞的增殖率和激活。5天后，采集各瓶中的培養基，并轉移至225cm2T-瓶中。然后，在各瓶中加入50ml含IL-2的培養基(以下，指"培養基")，并于37'C，5%(302存在下進行培養。4天后，在各瓶中加入100ml培養基，于37"C，5%032存在下進行培養。在此培養期間，每隔23天加入500U/mlIL-2。在培養的1415天，增加瓶的數目，以便防止活化淋巴細胞擁擠，細胞在37"，5%0)2存在下培養21天，得到5.0x1085.0X1(T活化淋巴細胞。圖24顯示在培養的21天，用流式細胞儀分析活化淋巴細胞中的表面抗原所得的結果。具體地，圖2顯示表面抗原CD3和CD56的分析結果，圖3顯示表面抗原NKG2D和CD56的分析結果，圖4顯示表面抗原CD16和CD56的分析結果。圖24中，在培養基中培養淋巴細胞，G1為AIM-V培養基，G2為GellGro培養基，G3為Vivo培養基，G4為KBM培養基。此外，用抗CD-3抗體固定化瓶分析培養21天的每一測試組中活化淋巴細胞的表面抗原CD3和CD56，表面抗原NKG2D和CD56，以及表面抗原CD16和CD56。結果是，各表面抗原的表達都幾乎類似于含有抗-CD3抗體培養基中完成的淋巴細胞的培養情況。根據本發明的制備方法，在制備活化淋巴細胞的過程中，即使當在抗-CD3抗體、IL-2和IFN-Y存在下培養凍存的外周血淋巴細胞時，淋巴細胞的增殖和活化也能很好地進行。實施例4:活化淋巴細胞中免疫抑制性丁細胞€04+/€025+的比率本發明中，004+(025+細胞為免疫抑制性丁細胞，導致免疫耐受。用流式細胞儀在培養過程的不同時間點對其表達進行分析。圖7顯示了在培養0天，14天和21天用流式細胞儀分析活化淋巴細胞中的表面抗原CD4和CD25所得的結果。如圖7所見，CD4和CD25的表達水平隨培養時間推移而開始降低，在培養21天后降低至正常水平(小于5%)。實施例5:活化淋巴細胞的凍存采集和離心步驟3所得的每一測試組中培養21天的活化淋巴細胞，然后除去各培養基，得到活化淋巴細胞沉淀。活化淋巴細胞沉淀與細胞保存液(培養基199'含715o/。畫SO，0.110%五-淀粉(penta-starch)，O.卜腦肝磷脂以及120%白蛋白)充分混合，根據培養條件將1.0ml淋巴細胞溶液分配至10個細胞保存管(Coming)中。然后用可控速率冷凍系統以-rC/min的速率將該細胞保存管冷卻至-9(TC，轉移并儲存在氮氣罐中。實施例6:凍存的活化淋巴細胞的解凍和分析儲存60天后，從步驟(4)中凍存的管的每一測試組中取出3支管，在恒溫水浴中解凍14分鐘，用培養基洗滌3次除去細胞保存液，并懸浮于培養基中。然后，用臺盼藍溶液測定細胞的活性，測定結果顯示細胞存活率為7080%范圍內，取決于培養條件(見表l)。同時，上述的不同條件下培養的各種活化淋巴細胞懸浮液在T-75cn^瓶中于37。C、5%002存在下培養2-3天，再測定活化淋巴細胞的存活率，測定結果顯示細胞存活率高于95%。此外，對淋巴細胞中表面抗原CD3，CD16，CD56和NKG2D的分析結果顯示，淋巴細胞中各表面抗原的比率在淋巴細胞凍存前后幾乎相同。從該結果可看出，活化淋巴細胞的長期凍存對活化淋巴細胞的活性無明顯影響(見圖5)。表h細胞凍存前后，不同測試組的細胞存活率<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>工業應用性為了克服現有方法中制備活化淋巴細胞的缺陷，本發明提供一種制備方法，通過培養從人外周血分離的淋巴細胞，在抗CD-3抗體，IL-2和IFN-Y存在下，大量培養對腫瘤細胞和感染病毒的細胞具有很強殺傷能力的CD56+和NKG2D+細胞。這樣，根據本發明的方法增殖和激活的淋巴細胞可用作細胞免疫治療劑，大大增強抗癌作用。此外，根據本發明，通過增殖和激活健康人的外周血活淋巴細胞所得的活化淋巴細胞可以冷凍和長期保存，一段時間后，當活化淋巴細胞來源的人體患有需要施予免疫細胞的疾病時，保存的活化淋巴細胞就可作為細胞免疫治療劑，用以治療該疾病。權利要求1.一種制備活化淋巴細胞的方法，包括以下步驟從外周血中采集和分離淋巴細胞；在白細胞介素-2，γ-干擾素和抗CD-3抗體存在下，體外培養該淋巴細胞，制備活化淋巴細胞；將該活化淋巴細胞凍存一給定時間；和解凍和復蘇凍存步驟的淋巴細胞。2.根據權利要求1所述的方法，其中該活化淋巴細胞為CD56+和NKG2D+。3.根據權利要求2所述的方法，其中該活化淋巴細胞除CD56+和NKG2D+外，進一步包括CD16+。4.根據權利要求1所述的方法，其中該活化細胞中CD4+禾qCD25+比率為36%。5.根據權利要求1所述的方法，其中將抗CD-3抗體在使用前固定于培養容器中。6.根據權利要求1所述的方法，其中凍存用冷凍管或冷凍袋進行，細胞密度為0.510.0x107細胞/冷凍管或0.0510.0x101()細胞/冷凍袋。7.用于培養活化淋巴細胞的培養基組合物，該組合物包括抗-CD3抗體，白細胞介素-2和y干擾素。8.—種細胞免疫治療組合物，包括以權利要求l所述的制備方法增殖的活化淋巴細胞作為活性成分。全文摘要本發明揭示了一種制備活化淋巴細胞的方法，包括從外周血中分離淋巴細胞，體外增殖和活化分離的淋巴細胞。根據所揭示的方法，通過在抗-CD3抗體，IFN-γ和IL-2存在下培養人外周血淋巴細胞，可以大量制備高效毒性細胞。根據所揭示的制備方法增殖的活化淋巴細胞包括CD3-CD56+(天然殺傷細胞標記)細胞和CD3+CD56+細胞，它們可以大量培養。CD3-CD56+細胞是LAK細胞的主要成分，CD3+CD56+細胞是CIK細胞的主要成分。因此，比起單獨使用LAK細胞和CIK細胞，本發明的淋巴細胞可顯示出明顯較高的抗癌作用。文檔編號C12N5/02GK101506356SQ200780031143公開日2009年8月12日申請日期2007年4月18日優先權日2006年8月23日發明者姜治德,孫哲勛,孫永玉,安慶出,崔成僖,張政洙,樸恩卿,樸淳元,樸秞秀,李炅奎,李白天,潘貞花,金柱寅,金源碩申請人:比內克斯有限公司