專利名稱：：具有經修飾的用于在昆蟲細胞中產生aav的aav-rep78翻譯起始密碼子的載體的制作方法
技術領域：
：本發明涉及昆蟲細胞中腺伴隨病毒的生產，以及病毒Rep蛋白表達和穩定性提高的腺伴隨病毒，所述提高增加了昆蟲細胞中腺伴隨病毒載體的產量。
背景技術：
：腺伴隨病毒(AAV)被認為是用于人類基因治療的最有前景的病毒載體之一。AAV具有有效感染人類分裂及非分裂細胞的能力，AAV病毒基因組整合進宿主細胞基因組的一個單染色體位點，而且最重要的是，即使很多人帶有AAV，但其跟任何疾病都無關。由于這些優點，人們正在血友病B、惡性黑素瘤、嚢性纖維化和其他疾病的基因治療臨床試驗中對重組腺伴隨病毒(rAAV)進行評價。所有支持AAV體外復制的宿主細胞都源自哺乳動物細胞類型。因此，用于基因治療的rAAV至今主要是在哺乳動物細胞系上生產的，例如293細胞、C0S細胞、HeLa細胞、KB細胞和其他哺乳動物細胞系(參見如US6，156，303、US5，387，484、US5，741，683、US5，691，176、US5，688，676、US20020081721、WO00/47757、WO00/24916和WO96/17947)。rAAV載體通常在這種哺乳動物培養系統中的生產是通過提供含有側翼帶有AAV復制原點(末端反向重復序列即ITR)的治療基因的DNA質粒，AAV復制蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的基因，以及病毒粒子或結構蛋白VP1、VP2和VP3的基因。另外，還提供一種含有腺病毒早期基因(E2A、E40RF6、VARNA)的質粒以加強AAV基因的表達和提高載體的產量(參見如Grimmetal.，1998，Hum.GeneTher.2745-2760)。然而，在大多數這些哺乳動物細胞培養系統中，每個細胞產生的AAV顆粒的數量的數量級為104個顆粒(在Clark,2002，KidneyInt.^i(Supp1.1):9-15中有所綜述)。對于臨床研究，可能需要1015個以上的rAAV顆粒。為了產生此數量的rAAV顆粒，需要轉染和培養大約1()H個培養的人類293細胞，相當于5000個175cm2培養瓶的細胞，這意味著要轉染多至10"個293細胞。因此，使用哺乳動物細胞培養系統進行大規模rAAV生產以獲得臨床試驗的材料已被證明是非常麻煩的，商業,的生產甚至是不可行的。另外總存在一種危險，即在哺乳動物細胞培養中生產的用于臨床的載體會被哺乳動物宿主細胞中存在的不想要的(或許是致病的)材料所污染。為了克服這些哺乳動物生產系統中的問題，最近開發了一種使用昆蟲細胞的AAV生產系統(Urabeetal.,2002，Hum.GeneTher.U:19351943;US20030148506和US20040197895)。對昆蟲細胞中的AAV生產，必須做一些修飾以獲得正確比例的AAV衣殼蛋白(VP1、VP2和VP3)，其依靠兩種剪接受體位點的輪換使用和VP2起始密碼子ACG的次優使用，該密碼子不能被昆蟲細胞準確地復制。為了在昆蟲細胞中模擬衣殼蛋白的正確比例，Urabe等人(2002，見上文)使用了一個轉錄為單個多順反子信使的構建體，該多順反子信使不需要剪接即可表達所有三種VP蛋白，并且其中最上游的起始密碼子被替換為次優起始密碼子ACG。在同時待決的申請(PCT/NL2005/050018)中，本發明人通過在昆蟲細胞中進一步優化AAV衣殼蛋白的比例，還進一步提高了桿狀病毒產生的rAAV載體的感染力。對于Urabe等人(2002，見上文)首先開發的AAV昆蟲細胞表達系統中AAVR印蛋白的表達，使用了含有兩個獨立Rep表達單元(一個用于Rep78，一個用于R印52)的重組桿狀病毒構建體，每個單元都在單獨的昆蟲細胞啟動子(分別為AIEl和PolH啟動子)的控制之下。在這一系統中，因為已知在哺乳動物細胞中，與Rep52相比，R印78的表達豐度較低會有利于較高的載體產量(Lietal.，1997，JVirol.U:5236-43;Grimmetal.，1998,見上文)，因此選擇比PolH啟動子弱;f艮多的啟動子AIEl啟動子用于驅動Rep78表達。然而更近地，Kohlbrenner等人(2005，Mol.TherH:1217-25)報告了Urabe等人使用的表達所述兩種R印蛋白的桿狀病毒構建體具有內在的不穩定性。通過在Urabe的原始載體中切開所述兩種Rep基因的回文取向(palindromicorientation),并設計兩個單獨的桿狀病毒載體表達Rep52和Rep78,Kohlbrenner等人(2005，見上文)提高了所述載體的傳代穩定性。然而，盡管兩個獨立的桿狀病毒Rep構建體可在昆蟲細胞中恒定地表達R印52和Rep78至少五代，但是rAAV載體的產量與Urabe等人(2002，見上文)設計的原始桿狀病毒R印構建體相比要低5-10倍。因此仍然需要克服在昆蟲細胞中大規模(商業化)生產AAV載體的上述嚴重限制。因此提供在昆蟲細胞中穩定和高產(大規模)地生產AAV載體的手段和方法是本發明的一個目標
發明內容定義本文使用的術語"可操作地連接"是指多核苷酸(或多肽)元件功能關系的連接。當使得一個核酸與另一個核#列有功能關系時，它就被"可操作地連接"。例如，如杲轉錄調控序列影響編碼序列的轉錄，則它可操作地連接至所述編碼序列。可操作地連接意味著相連接的DM序列通常是相鄰的，并且在必須連接兩個蛋白編碼區時是相鄰的且在閱讀框中。"表達控制序列"是指調控與其可操作地連接的核苷酸序列表達的核酸序列。當表達控制序列控制和調控核苷酸序列的轉錄和/或翻譯時，則所ii^達控制序列"可操作地連接"至所述核苷^列。因此，表達控制序列可包括啟動子、增強子、內核糖體進入位點(IRES)、轉錄終止子、蛋白編碼基因前面的起始密碼子、內含子剪接信號和終止密碼子。術語"表達控制序列"旨在至少包括被設計以影響表達的序列，也可包括其他的有用元件。例如，前導序列和融合伴隨序列是表達控制序列。該術語也可包括從序列中除去框內或框外不想要的可能的起始密碼子的核酸序列設計。它也可包括除去不想要的可能的剪接位點的核酸序列設計。它包括指導添加polyA尾的序列或多腺苷酸化序列(pA)，polyA尾為mRNA3'末端的一串腺嘌呤殘基，即被稱為polyA序列的序列。它還可被設計用來增強mRNA穩定性。已知昆蟲細胞中影響轉錄和翻^HI定性的表達控制序列例如啟動子，以及實現翻譯的序列例如Kozak序列。表達控制序列具有調節與其可操作地連接的核苷酸序列從而得到更低或更高的表達水平的性質。本文使用的術語"啟動子"或"轉錄調控序列"是指起到控制一個或多個編碼序列轉錄的功能的核酸片段，它位于編碼序列轉錄起始位點轉錄方向的上游，其結構特征在于存在依賴DNA的RNA聚合酶結合位點、轉錄起始位點和任何其他DM序列，包括但不限于轉錄因子結合位點、抑制子和激活子蛋白結合位點和本領域技術人員已知的直接或間接調控啟動子7轉錄量的任何其他核苷酸序列。"構成型"啟動子是在絕大多數生理和發育條件下在絕大多數組織中有活性的啟動子。"誘導型"啟動子是受生理或發育調控例如通過使用化學誘導物調控的啟動子。"組織特異型，，啟動子只在特定類型的組織或細胞中有活性。術語"基本上相同"、"基4^目同"、"基本上相似"和"基本相似"是指兩個肽或兩個核苷酸序列在最優比對例如通過使用默認參數的程序GAP或BESTFIT比對時，至少共有一定百分比的序列同一性(在本文其他地方定義的)。GAP使用Needleman和Wunsch總體比對算法來對兩個序列的全長進行比對，使匹配數目最大并使空位數目最小。通常，GAP使用的默認參數為空位形成罰分=50(核普酸)/8(蛋白)，空位延長罰分=3(核苷酸)/2(蛋白)。對于核苷酸，使用的默認分數矩陣是nwsgapdna;對于蛋白，使用的默認分數矩陣是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)。當然，當認為RM序列與DNA序列基^目似或具有一定程度的序列同一性時，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被認為等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。序列比對和序列同一性百分比得分可使用計算機程序確定，例如GCGWisconsinPackage10.3版，可從AccelrysInc.,9685ScrantonRoad，SanDiego，CA92121-3752，USA獲得；或開i文源碼軟件Emboss的Windows版(目前版本為2.7.1-07)。或者，相似度或同一性百分比可通過檢索數據庫例如FASTA、BLAST等獲得。本發明的編碼細小病毒Rep蛋白的核苷酸序列也可按照它們分別與核苷酸序列SEQIDN0.10在溫和或優選地在嚴格雜交條件下的雜交能力來定義。本文定義的嚴格雜交條件是使具有至少約25個核苷酸，優選約50個核苷酸、75個核苷酸或100個核苷酸，并且最優選約200個或更多核苷酸的核酸序列在約651C的溫度下和在含約1M鹽的溶液,優選6xSSC溶液或任何其他含有相當的離子強度的溶液中雜交；并且，在65匸下和含約0.1M或更少的鹽的溶液，優選O.2xSSC溶液或任何其他含有相當的離子強度的溶液中漂洗。優選地，雜交過夜進行，即進行至少10小時，并優選地進行至少1小時的漂洗，其中至少換2次漂洗液。這些條件通常使具有約90。/。或更高序列同一性的序列特異性地雜交。本文定義的溫和條件是使至少有約50個核苷酸，優選約200個或更多核苷酸的核酸序列在約45C的溫度下和含約1M鹽的溶液，優選6xSSC溶液或任何其他含有相當的離子強度的溶液中雜交；并且，在室溫下和含約1M鹽的溶液，優選6xSSC溶液或任何其他含有相當的離子強度的溶液中漂洗。優選地，雜交過夜進行，即進行至少10小時，并優選地進行至少1小時的漂洗，其中至少換2次漂洗液。這些條件通常使具有最高至50%序列同一性的序列特異性地雜交。本領域技術人員能夠修改這些雜交條件，以特異性地識別同一性在50%和90%之間的序列。具體實施例方式本發明涉及動物細小病毒、特別是依賴病毒如感染性人類或猿AAV及其組分(如動物細小病毒基因組)用作在哺乳動物細胞中導入和/或表達核酸的載體的用途。具體而言，本發明涉及這種細小病毒載體在昆蟲細胞中產生時其產量的提高。細小病毒科的病毒是小DNA動物病毒。細小病毒科可被分為兩個亞科感染脊推動物的細小病毒亞科和感染昆蟲的濃核病毒亞科。細小病毒亞科的成員在本文中被稱為細小病毒并包括依賴病毒屬。正如可從其屬名推斷的，依賴病毒的成員很特殊，因為它們通常需要與輔助病毒如腺病毒或皰瘆病毒共感染以在細胞培養中生產性感染。依賴病毒屬包括通常感染人類(如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或靈長類動物(如血清型1和4)的AAV，和感染其他溫血動物的相關病毒(例如，牛、狗、馬和羊腺伴隨病毒)。關于細小病毒和細小病毒科的其他成員的更多信息在KennethI.Berns,"Parvoviridae:TheVirusesandTheirImplication,"FieldsVirology(3dEd.1996)第69章中有描述。為方便起見，本文將借助AAV進一步例證和描述本發明。然而應理解本發明不限于AAV，而是可同樣地應用于其他細小病毒。所有已知的AAV血清型的基因組排列都非常相似。AAV的基因組是長度小于約5000核苷酸(nt)的線性單鏈DNA分子。末端反向重復序列(ITR)位于非結構復制蛋白(Rep)和結構蛋白(VP)的獨特編碼核苷酸序列的側翼。VP蛋白(VP1、VP2和VP3)形成衣殼。末端的145個nt是自身互補的并且具有可形成一個能量穩定的形成T形發夾的分子內雙鏈的結構。這些發夾結構作為細胞DM聚合酶復合體的引物，具有病毒DM復制原點的功能。wtAAV感染哺乳動物細胞后，R印基因(即Rep78和Rep52)分別通過P5啟動子和P19啟動子表達，并且兩個R印蛋白都在病毒基因組復制中起作用。R印ORF的剪接事件實際導致了四個R印蛋白(即Rep78、R印68、Rep52和Rep40)的表達。然而，已顯示哺乳動物細胞中編碼Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA對AAV載體生產U夠的。昆蟲細胞中的Rep78和R印52蛋白對AAV載體生產也是足夠的。本文中的"重組細小病毒或AAV載體"(或"rAVV載體")是指含有一個或多個側翼有細小病毒或AAV的末端反向重復序列(ITR)的目的多核苷^列、目的基因或"轉基因"的載體。當這種rAAV載體在表達AAVrep和cap基因產物(即AAVRep和Cap蛋白)的昆蟲宿主細胞中存在時，它們可被復制并裝配到感染性病毒顆粒中。當rAAV載體被整合到更大的核酸構建體(例如，染色體或另一用于克隆或轉染的載體如質粒或桿狀病毒)中時，那么rAAV載體通常被稱為"前栽體"，它在存在AAV裝配功能和必要輔助功能的情況下可通過復制和殼體化被"挽救"。本發明的第一方面涉及含有開放閱讀框的核苷酸序列，所述開放閱讀框含有編碼動物細小病毒R印蛋白的核苷酸序列，其中細小病毒Rep78蛋白的翻譯起始密碼子是次優起始密碼子。次優起始密碼子優選地是實現部分外顯子跳躍的起始密碼子。本文中的部分外顯子跳躍被理解為指至少部分核糖體不在Rep78蛋白的次優起始密碼子而在一個更下游的起始密碼子起始翻譯，其中優選地更下游的起始密碼子是R印52蛋白的起始密碼子。次優起始密碼子優選地在核苷酸序列在昆蟲細胞中表達時實現部分外顯子跳躍。優選地，使用桿狀病毒表達，次優起始密碼子在昆蟲細胞中實現部分外顯子跳躍，從而優選在感染后約20-40小時，更優選在約30-40小時，在昆蟲細胞中產生的R印78和R印52的摩爾比范圍為1:10到10:1、1:5到5:1或1:3到3:1。R印78和Rep52的摩爾比可通過實施例1.1,3所述的蛋白質印跡測定，優選地使用識別Rep78和Rep52兩者的共有表位的單克隆抗體，或使用實施例1.1.3所描述的抗體。本文使用的術語"次優起始密碼子"不僅指三核苷^始密碼子自身，還指它的背景。因此，次優起始密碼子可由在次優背景例如非Kozak背景中的"最優"ATG密碼子組成。然而，更優選三核苷^始密碼子自身是次優(即不是ATG)的次優起始密碼子。本文中的次優被理解為指所述密碼子與在同樣背景中的正常ATG密碼子相比，在翻譯起始中的效率較低。10優選地，次優密碼子的效率比同樣背景下的正常ATG密碼子的效率低90%、80%、60%、40%或20%。技術人員清楚比較翻譯起始的相對效率的方法。優選的次優起始密碼子可從ACG、TTG、CTG和GTG中選擇。更優選為ACG。編碼動物細小病毒R印蛋白的核苷酸序列，在本文中被理解為編碼非結構Rep蛋白例如Rep78和R印52的核苷^列，所述非結構Rep蛋白對于在昆蟲細胞中生產細小病毒栽體而言是必需的且很充足。動物細小病毒核苷酸序列優選地來自依賴病毒，更優選地來自人類或猿腺伴隨病毒(AAV),最優選地來自通常感染人類(如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或靈長類(如血清型1和4)的AAV。編碼動物細小病毒Rep蛋白的核苷酸序列的一個實例在SEQIDNo.10中給出，它描繪了AAV血清型2的序列基因組中編碼R印蛋白的一部分。R印78編碼序列包括核苷酸11-1876，R印52編碼序列包括核苷酸683-1876。應理解R印78和Rep52蛋白的精確分子量，以及翻譯起始密碼子的精確位置，可能隨細小病毒的不同而有所不同。然而，技術人員懂得如何識別AAV-2以外的其他細小病毒核苷^列的相應位置。因而，編碼動物細小病毒Rep蛋白的核苷^列也可是定義為如下的核苷酸序列a)編碼具有性質如下的多肽的核普酸序列所述多肽含有與氨基^f列SEQIDNO.11具有至少50%、60%、70%、80%、88%、89%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的#^酸序列；b)與SEQIDNO.10的11-1876位核苷酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、81%、82%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷^列；c)其互補鏈與(a)或(b)的核酸分子序列雜交的核苷酸序列；d)由于遺傳密碼的筒并性，與(c)的核酸分子序列不同的核苷酸序列。優選地，編碼對在昆蟲細胞中生產細小病毒載體而言是必需的且很充足的動物細小病毒R印蛋白的核苷^列。本發明的更優選的核苷酸序列包括含有SEQ.IDNO:7的9核苷^f列或與SEQ.IDNO:7基本同源的核苷酸序列的表達控制序列，所ii^達調控序列位于編碼細小病毒Rep78蛋白的核苷酸序列的起始密碼子的上游，與SEQ.IDNO:7的核苷酸序列基本一致且可幫助增加細小病毒R印78蛋白表達的序列是例如與SEQ.IDNO:7的9核苷酸序列具有至少60%、70%、80°/。或90%同一性的序列。正如本領域技術人員非常理解在昆蟲細胞中可被識別的推定剪接位點的消除一樣，本領域的技術人員還非常理解，其他細小病毒的R印蛋白編碼序列中除了R印78和Rep52翻譯起始位點之外的可能的餘溪的翻譯起始位點的消除。為野生型細小病毒序列在昆蟲細胞中正確表達的多種修飾可通過應用熟知的遺傳工程技術達成，如SambrookandRussell(2001)"MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rdedition)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork中所描述的。本領域的技術人員了解能夠增加R印蛋白產量的多種Rep蛋白編碼區的各種進一步修飾。這些修飾都在本發明的范圍之內。在另一方面，本發明涉及含有編碼上迷細小病毒R印蛋白的核苷i^列的核酸構建體。優選地，在該構建體中，編碼細小病毒Rep蛋白的核普酸序列與用于昆蟲細胞表達的表達控制序列可操作地連接。這些表達控制序列至少包括在昆蟲細胞中有活性的啟動子。本領域技術人員已知的在昆蟲宿主細胞中表達外源基因的技術可用于實施本發明。昆蟲細胞中分子工程和多肽表達的方法學在文獻中有所描述，如SummersandSmith.1986.AManualofMethodsforBaculovirusVectorsandInsectCultureProcedures,TexasAgriculturalExperimentalStationBull.No.7555，CollegeStation,Tex.;Luckow,1991.Prokopetal.,CloningandExpressionofHeterologousGenesinInsectCellswithBaculovirusVectors'RecombinantDMTechnologyandApplications,97—152;King:LA.andR.D.Possee，1992,Thebaculovirusexpressionsystem,ChapmanandHall,UnitedKingdom;O'Reilly,D.R.,L.K.Miller,V.A.Luckow，1992，BaculovirusExpressionVectors:ALaboratoryManual,NewYork;W.H.FreemanandRichardson,C.D.，1995，BaculovirusExpressionProtocols,MethodsinMolecularBiology,volume39;US4，745，051;US2003148506和W003/074714。對本發明編碼細小病毒Rep蛋白的核苷^列的轉錄特別合適的啟動子為例如多角體啟動子。然而，本領域也已知其他在昆蟲細胞中有活性的啟動子，例如，p10、p35、IE-1或厶IE-1啟動子，以及上面文獻中描述的其他啟動子。12優選地，用于在昆蟲細胞中表達細小病毒R印蛋白的核酸構建體是昆蟲細胞相容的載體。"昆蟲細胞相容的載體"或"載體"的含義是能夠多產地轉化或轉染昆蟲或昆蟲細胞的核酸分子。示例性生物學載體包括質粒、線性核酸分子和重組病毒。只要是昆蟲細胞相容的，任何栽體都可被使用。所述載體可能整合進昆蟲細胞基因組，但所述載體在昆蟲細胞中的存在并不需要是永久的，瞬間游離栽體也包括在內。所述載體可以用已知的任何方法例如細胞化學處理、電穿孔或感染來導入。在一個優選的實施方案中，所述載體是桿狀病毒、病毒載體或質粒。在一個更優選的實施方案中，所述栽體是桿狀病毒，即所述構建體是桿狀病毒載體。桿狀病毒載體及它們的使用方法在上面引用的昆蟲細胞分子工程學的參考文獻中有所描述。本發明的另一方面涉及含有不超過一種類型核苷酸序列的昆蟲細胞，所述核苷酸序列含有編碼細小病毒R印蛋白的單個開放閱讀框。優選地，所述單個開放閱讀框編碼一種或多種細小病毒Rep蛋白，更優選地，所述開放閱讀框編碼所有細小病毒Rep蛋白，最優選地，所述開放閱讀框編碼全長R印78蛋白，優選地，至少R印52和R印78在昆蟲細胞中都可由此開放閱讀框表達。本文中可理解的是，所述昆蟲細胞可含有單一類型核苷酸序列一個以上的拷貝，例如在多拷貝游離載體中的單一類型核苷^列一個以上的拷貝，但是這些拷貝基本是同一個核酸分子的多個拷貝，或至少是編碼同一個Rep氨基酸序列的核酸分子，例如只是由于遺傳密碼簡并性而相互不同的核酸分子。只存在單一類型編碼細小病毒Rep蛋白的核酸分子避免了可能存在于含有Rep序列的不同類型載體中的同源序列之間的重組，所述重組會產生影響昆蟲細胞中細小病毒的生產水平(的穩定性)的缺陷型R印表ii^J建體。優選地，在昆蟲細胞中，含有編碼一種或多種細小病毒R印蛋白的單個開放閱讀框的核苷酸序列是核酸構建體的一部接。更優選的昆蟲細胞含有作為"第一"核苷酸序列的如上定:的編碼細小病毒R印蛋白的核苷酸序列，優選為帶有如上定義的次優起始密碼子的編碼序列，或如上定義的核酸構建體；或所述昆蟲細胞含有作為"第一"核酸構建體的如上定義的含有這類核苷酸序列的核酸構建體。任何可復制重組細小病毒(rAVV)載體并可以在培養物中培養的昆蟲細胞都可按照本發明使用。例如，所用細胞系可來自草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)、果錄細胞系，或墳子細胞系，例如白故伊蚊(Aedesalbopictu)衍生細胞系。優選的昆蟲細胞或細胞系是來自易被桿狀病毒感染的昆蟲種類的細胞，包括例如Se301、SelZD2109、SeUCRl、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5Bl-4、MG-1、Tn368、HzAml、Ha2302、Hz2E5、HighFive(Invitrogen，CA，USA)和ej^re5SF+(US6,103,526;ProteinSciencesCorp.,CT，USA)。本發明優選的昆蟲細胞，除了上述"第一"核苷酸序列或核酸構建體，還含有a)含有至少一個細小病毒末端反向重復(ITR)核苷酸序列的笫二核苷酸序列；和b)含有與用于昆蟲細胞表達的表達控制序列可操作地連接的細小病毒Cap蛋白編碼序列的第三核苷酸序列。在本發明的上下文中，"至少一個細小病毒ITR核苷酸序列"被理解為指回文序列，含有大部分互補、對稱排列的也被稱為"A"、"B"和"C"區的序列。ITR作為復制原點，即一個在復制中有"順式"作用的位點，亦即作為反式作用復制蛋白例如R印78(或Rep68)的識別位點，所述反式作用復制蛋白識別回文結構和回文結構內部的特異序列。ITR序列對稱性的一個例外是ITR的"D"區。它是獨特的(在一個ITR內部無互補序列)。單鏈DNA的切口出現在A區和D區的癡^處。它是新DNA合成起始的區域。D區一般位于回文結構的一側并為核酸復制步驟提供方向性。在哺乳動物細胞中復制的細小病毒一般有兩個ITR序列。然而，可以設計一個ITR使結合位點位于A區的兩條鏈上，并且D區對稱分布，在回文結構的每側各一個。隨后，在雙鏈環形DNA模板(如質粒)上，Rep78或Rep68輔助的核酸復制在兩個方向上進行，并且單個ITR即可滿足環形載體上的細小病毒復制。因此，一個ITR核苷酸序列可用于本發明的上下文中。然而，優選地,使用兩個或另一偶數個規則的ITR。最優選地，使用兩個ITR序列。一個優選的細小病毒ITR是AAVITR。由于安全原因，可能需要構建在初始導入細胞后不能再繁殖的重組細小病毒(rAAV)載體。這種限制不想要的載體在受者中的繁殖的安全機制可通過使用如US2003148506所述的帶有嵌合ITR的rAAV提供。14在生產重組細小病毒(rAAV)栽體的昆蟲細胞中使用的核酸構建體的數量在本發明中沒有限制。例如，l個、2個、3個、4個、5個或更多個獨立的構建體可用于按照本發明的方法在昆蟲細胞中生產rAAV。如果使用了5個構建體，則一個構建體編碼AAVVP1,另一個構建體編碼AAVVP2，又一個構建體編碼AAVVP3,再一個構建體編碼如上定義的Rep蛋白，最后一個構建體含有至少一個AAVITR。如果使用不到5個構建體，則這些構建體可含有至少一個AAVITR以及VP1、VP2、VP3和Rep蛋白編碼序列的各種組合。優選地，使用兩個或三個構建體，更優選地使用如上所述的兩個構建體。如果使用兩個構建體，則優選地，所述昆蟲細胞含有(a)如上定義的用于Rep蛋白表達的第一核酸構建體，該構建體還含有如上面(b)所定義的第三核苷酸序列(含有與至少一個用于昆蟲細胞表達的表達控制序列可操作地連接的細小病毒Cap蛋白編碼序列，另見下文)；和(c)含有如上面(a)定義的第二核苷酸序列的笫二核酸構建體(含有至少一個細小病毒/AAVITR核苷酸序列)。如果使用三個構建體，優選地，配置與使用兩種構建體時相同，除了使用分別的構建體表達衣殼蛋白和表達Rep蛋白。每種構建體中的序列相互之間可為任意次序。例如，如果一個構建體含有ITR和一個含有編碼VP衣殼蛋白的核苷酸序列的0RF，則VPORF可以位于該構建體上，從而使得ITR序列之間的DM復制時，VPORF被復制或不被復制。再例如，Rep編碼序列和/或含有編碼VP衣殼蛋白的核苷酸序列的ORF可按任何次序位于構建體上。應理解，同樣地，所述第二、第三和其他核酸構建體優選地是昆蟲細胞相容的栽體，優選為如上所述的桿狀病毒載體。或者，在本發明的昆蟲細胞中，第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和笫四核苷酸序列以及任選的其他核苷酸序列中的一個或多個可穩定地整合到昆蟲細胞的基因組中。本領域的技術人員了解如何將核苷酸序列穩定地導入昆蟲基因組中，以及如何識別在基因組中有這種核苷酸序列的細胞。可通過例如使用含有與昆蟲基因組的區域高度同源的核苷M列的載體來幫助整合到基因組中。將核苷^f列引入基因組的另一種方法是使用特殊序列，如轉座子。本發明中，含有細小病毒衣殼(Cap)蛋白編碼序列的第三核苷酸序列在本文中被理解為含有編碼三種細小病毒衣殼蛋白VP1、VP2和VP3中的每一種的序列。含有衣殼蛋白編碼序列的第三核苷酸序列可以多種形式存在，例如可使用分別針對衣殼蛋白VP1、VP2和VP3中的每一種的編碼序列，其中每個編碼序列與用于昆蟲細胞表達的表達控制序列可操作地連接。然而，更優選地，第三核苷酸序列含有編碼所有三種動物細小病毒(AAV)衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的單個開放閱讀框，其中衣殼蛋白VP1翻譯的起始密碼子是非ATG的次優起始密碼子，例如如Urabeetal.(2002，見上文)所述。VP1衣殼蛋白的次優起始密碼子可以是上文定義的Rep78蛋白的次優起始密碼子。更優選的衣殼蛋白VP1的次優起始密碼子可選自ACG、TTG、CTG和GTG,其中CTG和GTG是最優選的。優選的用于衣殼蛋白表達的第三核苷酸序列還包括表達控制序列，它含有SEQ.IDN0:7的9核苷酸序列或與SEQ.IDN0:7基本同源的核苷酸序列，位于編碼衣殼蛋白VP1的核苷酸序列的起始密碼子的上游。與SEQ.IDNO:7的核苷酸序列基本同一且有助于提高VP1表達的序列為例如與SEQ.IDNO:7的9核苷酸序列具有至少60%、70%、80%或90°/。同一性的序列。更優選的用于表達衣殼蛋白的第三核苷,列還更優選地包含對編碼衣殼蛋白VP1的核苷酸序列的選自12位核苷酸的C、21位核苷酸的A和24位核苷酸的C(l位是翻譯起始密碼子的第一個核苷酸；參見SEQIDNO.1)的至少一個修飾。正如本領域的技術人員非常理解在昆蟲細胞中可被識別的推定剪接位點的消除一樣，本領域的技術人員還非常理解翻譯其他血清型VP1的可能的發溪的翻譯起始密碼子的消除。技術人員了解對VP編碼區的多種其他修飾，這些修飾能夠增加VP和病毒粒子的產量或產生其他所需效果，例如改變向性或減少病毒粒子的抗原性。這些修飾都在本發明的范圍之內。優選地，本發明編碼細小病毒衣殼蛋白的核苷^f列與用于昆蟲細胞表達的表達控制序列可操作地連接，所&達控制序列至少包括一個在昆蟲細胞中有活性的啟動子。這類控制序列和用于在昆蟲宿主細胞中表達細小病毒衣殼蛋白的其他技術和材料(如載體)已經在上面Rep蛋白部分描述過。在本發明的一個優選的實施方案中，存在于本發明昆蟲細胞中的第二核苷酸序列，即含有至少一個細小病毒(AAV)ITR的序列，還含有至少一個編碼目的基因產物的核苷酸序列，其中優選地，所述至少一個編碼目的基因產物的核苷酸序列整合到在昆蟲細胞中產生的重組細小病毒(rAAV)載體的基因組中。優選地，所述至少一個編碼目的基因產物的核苷酸序列是用于在哺乳動物細胞中表達的序列。優選地，第二核苷酸序列含有兩個細小病毒(AAV)ITR核苷酸序列，且其中所述至少一個編碼目的基因產物的核苷酸序列位于兩個細小病毒(AAV)ITR核香酸序列之間。優選地，如果編碼目的基因產物的核苷酸序列(用于在哺乳動物細胞中表達)位于兩個規則ITR之間或位于經改造的具有兩個D區的一個ITR的任一側時，那么它會整合到在昆蟲細胞中產生的重組細小病毒(rAAV)載體中。因此本文上面定義的第二核苷酸序列可含有一個編碼至少一個在哺乳動物細胞中表達的"目的基因產物"的核苷酸序列，其位置使其可整合到在昆蟲細胞中復制的重組細小病毒(rAAV)載體中。任何核苷酸序列都可被整合，以隨后在用根據本發明產生的重組細小病毒(rAAV)載體轉染的哺乳動物細胞中表達。可編碼例如一個蛋白的核苷酸序列可表達出RNAi試劑，即能夠進行RNA干擾的RNA分子，例如shRNA(短發夾RNA)或siRNA(短干擾RM)。"siRNA"指小干擾RM，它是對哺乳動物細胞無毒的短雙鏈RNA(Elbashiretal.，2001，Nature494-98;Caplenetal.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9742-47)。在一個優選的實施方案中，第二核苷酸序列可含有兩個核苷酸序列，且每一個都編碼一個在哺乳動物細胞中表達的目的基因產物。編碼目的基因產物的兩個核苷^列的每一個的位置都可使其可被整合到在昆蟲細胞中復制的重組細小病毒(rAAV)載體中。在哺乳動物細胞中表達的目的產物可以是治療用基因產物。治療用基因產物可以是多肽或MA分子(siRNA)或其他基因產物，所迷其他基因產物在靶細胞中表達時可提供想要的治療效果，例如消除不想要的活性，如除去感染的細胞或補足基因缺陷(如導致酶活缺失的缺陷)。治療用多肽基因產物的實例包括CFTR、IX因子、脂蛋白脂肪酶(LPL,優選為LPLS447X;參見W001/00220)、栽脂蛋白Al、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UGT)、視網膜色素變性GTP酶調節因子相互作用蛋白(RP-GRIP)和細胞因子或白細胞介素例如IL-IO。另外或此外，作為第二基因產物，本文上面定義的第二核苷酸序列可含有編碼用作標記蛋白的多肽的核苷酸序列，以測定細胞轉化和表達。用于此目的的合適的標記蛋白為例如熒光蛋白GFP和選擇性標記基因HSV胸苷激酶(用于HAT培養基上的選擇)、細菌潮霉素B磷酸轉移酶(用于對潮霉素B的選擇)、Tn5氨基糖苷磷酸轉移酶(用于對G418的選擇)和二氳葉酸還原酶(DHFR)(用于對曱氨蝶呤的選擇)、CD20(低親和性神經生長因子基因)。獲得這些標記基因的來源和其使用方法見SambrookandRussel(2001)"MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rdedition)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork。另外，本文上面定義的第二核苷酸序列可含有編碼可用作故障保險機制的多肽的核苷酸序列，在認為必要時，所述多肽使得可以用由本發明的重組細小病毒(rAAV)載體轉導的細胞來治愈受試者。這種通常被稱為自殺基因的核苷i^列編碼能夠將前藥轉變為有毒物質的蛋白，所述有毒物質能夠殺死所述蛋白在其中表達的轉基因細胞。這種自殺基因的合適的實例包括例如大腸桿菌(Aco/Z)胞嘧咬脫氨酶基因或單純皰疹病毒、巨細胞病毒和水痘帶狀皰滲病毒的胸苷激酶基因之一，在這些實例中，更昔洛韋可用作殺死受試者中轉基因細胞的前藥(參見例如Clairetal.，1987，Antimicrob.AgentsChemother.H:844-849)。在另一個實施方案中，一個目的基因產物可以是AAV蛋白。特別是R印蛋白，如Rep78或R印68,或其功能片段。編碼Rep78和/或Rep68的核苷酸序列，如果存在于本發明重組細小病毒(rAAV)載體的基因組中并在被所述載體轉導的哺乳動物細胞中表達，則可使重組細小病毒(rAAV)載體整合到經轉導的哺乳動物細胞的基因組中。Rep78和/或Rep68在rAAV轉導或感染的哺乳動物細胞中的表達，可通過允許經所述重組細小病毒(rAAV)載體引入細胞的其他目的基因產物長期或永久地表達，而有利于所述載體的某些應用。在本發明的重組細小病毒(rAAV)載體中，至少一個編碼在哺乳動物細胞中表達的目的基因產物的核苷酸序列，優選地與至少一個哺乳動物細胞相容的表達控制序列例如啟動子可操作地連接。本領域已知許多這類啟動子(見SambrookandRussel，2001，見上文)。可使用在許多種細胞中廣a達的構成型啟動子，例如CMV啟動子。然而，更優選的啟動子是誘導型的、組織特異的、細胞種類特異的或細胞周期特異的。例如，對于肝臟特異性表達，啟動子可選自ocl-抗胰蛋白酶啟動子、曱狀腺激素結合球蛋白啟動子、白蛋白啟動子、LPS(甲狀腺素結合球蛋白)啟動子、HCR-ApoCII雜交啟動子、HCR-hAAT雜交啟動子和栽脂蛋白E啟動子。其18他實例包括用于腫瘤選擇性一一特別是神經細胞腫瘤選擇性一一表達的E2F啟動子(Parretal.，1997，Nat.Med.3:1145-9)或用于在單核血細胞中4吏用的IL-2啟動子(Hagenbaughetal.，1997，JExpMed;185:2101-10)。AAV能感染多種哺乳動物細胞。參見如Tratschinetal.(1985，Mol.CellBiol.互3251-3260)和GrimmetaL(1999，Hum.GeneTher.n:2445-2450)。然而，人類滑膜成纖維細胞的AAV轉導明顯比類似的鼠細胞更有效(Jenningsetal.，ArthritisRes，3:1，2001)，且AAV的細胞營養機能在各血清型中不同。參見如Davidsonetal.(2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,^:3428-3432)，該文獻討論了AAV2、AAV4和AAV5在哺乳動物CNS細胞向性和轉導效率方面的不同。可用于本發明以在昆蟲細胞中生產重組AAV載體的AAV序列可源自任何AAV血清型的基因組。通常，MV血清型具有在M酸和核酸水平上有明顯的同源性的基因組序列，提供一系列相同的遺傳功能，產生在生理和功能上基本等價、并通過幾乎相同的機制進行復制和裝配的病毒粒子。對于各種AAV血清型的基因組序列和基因組相似度的綜述，參見如GenBank登陸號U89790;GenBank登陸號J01901;GenBank登陸號AF043303;GenBank登陸號AF085716;Chlorinietal.(1997,J.Vir.71:6823-33);Srivastavaetal.(1983，J.Vir.45:555-64);Chlorinietal.(1999，J.Vir.73:1309-1319);Rutledgeetal.(1998，J.Vir.72:309-319)和Wuetal.(2000，J.Vir.74:8635-47)。AAV血清型1、2、3、4和5是用于本發明上下文中的AAV核苷酸序列的優選來源。優選地，用于本發明上下文中的AAVITR序列源自AAV1、AAV2和/或AAV4。同樣，R印(Rep78和Rep52)編碼序列優選地源自AAV1、AAV2和/或AAV4。然而，用于本發明上下文的編碼衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的序列可選自已知的42種血清型的任何血清型，更優選地選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9或通過例如衣殼改組(capsidshuffling)技術和AAV衣殼文庫獲得的新開發的AAV樣顆粒。AAVR印和ITR序列在大多數血清型中是特別保守的。各種AAV血清型的R印78蛋白有例如超過89。yd的同一性，并且AAV2、AAV3A、AAV3B和AAV6之間在基因組水平的總核苷酸序列的同一性為約82%(Bantel-Schaaletal.，1999，J.Virol.，73(2):939-947)。另外，在哺乳動物細胞中產生AAV顆粒方面，已知許多AAV血清型的Rep序列和ITR與其他血清型的相應序列是有效交叉互補的(即功能可替代的)。US2003148506才艮道了AAVRep和ITR序列與在昆蟲細胞中的其他AAVRep和ITR序列是有效交叉互補的。已知AAVVP蛋白決定AAV病毒粒子的細胞營養機能。不同AAV血清型的VP蛋白編碼序列的保守性明顯比R印蛋白和基因的要低。R印和ITR序列與其他血清型的相應序列交叉互補的能力可^:得產生假型rAAV顆粒，該顆粒包含一種血清型(如AAV3)的衣殼蛋白和另一種AAV血清型(如AAV2)的R印和/或ITR序列。這種假型rAAV顆粒是本發明的一部分。經修飾的"AAV"序列也可用于本發明的上下文中，如用于在昆蟲細胞中產生rAAV載體。這種經修飾的序列例如包括與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或MV9至少有約70。/"至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高核苷酸和/或#^酸序列同一性(例如具有約75-99%核*酸序列同一性的序列)的序列，ITR、Rep或VP可用于代替野生型AAVITR、Rep或VP序列。盡管在許多方面與其他AAV血清型相似，AAV5與其他人類和猿AAV血清型的不同比其他已知的人類和^jfe清型要大。因此，rAAV5在昆蟲細胞中的生產與其他血清型的生產不同。當^f吏用本發明的方法來生產rAAV5時，優選地，一種或多種構建體(總之在超過一種構建體的情況下)含有一個含有AAV5ITR的核苷酸序列、一個含有AAV5Rep編碼序列的核苷酸序列(即含有AAV5R印78的核苷酸序列)。這種ITR和Rep序列可根據需要被修飾，以在昆蟲細胞中有效生產rAAV5或假型rAAV5載體。例如可修飾Rep序列的起始密碼子，可修飾或除去VP剪接位點，和/或可修飾VP1起始密碼子和附近核苷酸，從而提高rAAV5載體在昆蟲細胞中的生產。因此，本發明另一方面涉及在昆蟲細胞中生產重組細小病毒(rAAV)粒子(含有如上定義的重組細小病毒(rAAV)載體)的方法。優選地，所述方法包括以下步驟(a)在產生重組細小病毒(rAAV)載體的條件下培養如本文上面定義的昆蟲細胞；并(b)回收所述重組細小病毒(rAAV)載體。在此，應理解以所述方法生產的重組細小病毒(rAAV)載體優選為一種感染性細小病毒或AAV病毒粒子，它含有重組細小病毒(rAAV)載體核酸。本領域熟知培養昆蟲細胞的培養條件以及昆蟲細胞培養中異源產物的生產，這些例如在上面引用的昆蟲細胞分子工程學參考文獻中有所描述。優選地，所述方法還包括使用抗AAV抗體(優選固定化抗體)對重組細小病毒(rAAV)載體(或含有所述載體的病毒粒子)進行親和純化的步驟。所述抗AAV抗體優選為單克隆抗體。一種特別合適的抗體是一種單鏈駝科動物(cameloid)抗體或其片段，可例如從駱駝或美洲駝獲得(參見如Muyldermans，2001,Biotechnol.74:277-302)。用于AAV親和純4匕的抗體優選為一種與rAAV衣殼蛋白上的表位特異結合的抗體，因此優選地，所it^位為在多種AAV血清型的衣殼蛋白上存在的表位。如所述抗體可基于與AAV2衣殼特異性結合產生或選擇，但同時它也可與AAV1、AAV3和AAV5衣殼特異性結合。本發明另一方面涉及使用上述核酸構建體和細胞，在上述本發明的方法中生產的rAAV病毒粒子。優選地，所述rAAV病毒粒子在其基因組中包含至少一個編碼目的基因產物的核普酸序列，其中所述至少一個核苷,列不是天然AAV核苷酸序列，并且其中在AAVVP1、VP2和VP3衣殼蛋白的比例中，VP1的量為(a)至少為VP2量的100°/。、105%、110%、120%、150%、200%或400%;或(b)至少為VP3量的8%、10%、10.5%、11%、12%、15%、20%或40%;或(c)至少為(a)和(b)共同定義的。優選地，使用識別VP1、VP2和VP3中的每一種所共有的表位的抗體來測定VP1、VP2和VP3的量。本領域有多種可對VP1、VP2和/或VP3的相對量進行定量的免疫試趙參見如UsingAntibodies,E.HarlowandD.Lane,1999，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)。一種可識另3三種衣殼蛋白中的每一種所共有的表位的合適抗體為例如小鼠抗CapBl抗體(可從Progen,Germany購得)。一種本發明的優選的rAAV病毒粒子是在其基因組中含有至少一個編碼目的基因產物的核苷酸序列的病毒粒子，其中所述至少一個核苷酸序列不是天然AAV核苷酸序列，且其中所述AAV病毒粒子含有一種VPl衣殼蛋白，它1位氮基酸為亮氨酸或纈氨酸。一種本發明更優選的AAV病毒粒子具有上面定義的衣殼蛋白比例，并含有一種其1位氨基酸為亮氨酸或纈氨酸的VPl衣殼蛋白。在本文件及其權利要求中，動詞"含有"及其各種形式是用其非限制21性的含義表示包括該詞之后的項目，但并不排除未專門提到的項目。另外，用"一"或"一個"(不定冠詞"a"或"an")提及的要素不排除多個該要素存在的可能性，除非上下文明確要求有一個且只能有一個該要素。因此"一"或"一個"(不定冠詞"a"或"an")通常是指"至少一個"。圖1:A)野生型AAV基因組中R印表達的組織結構。Rep78和Rep52基因分別由P5和P19啟動子表達。Rep68和Rep40(分別為R印78和Rep52的剪接變體)的表達未給出。這兩種表達單元都含有ATG起始位點。B)本發明的構建體具有在單一啟動子(例如多角體(PolH)啟動子)控制下的R印0RF。因為Rep78的起始密碼子ATG#:轉化為備用ACG起始密碼子并被核糖體部分跳過，因此上述單一啟動子驅動Rep78和Rep52兩者的表達。C)Urabeetal.(2002，見上文)的原始構建體獨立地通過兩個不同的啟動子(分別為AIEl和polH)驅動Rep78和Rep52。圖2:從在昆蟲細胞中傳代5次的重組桿狀病毒表達的Rep蛋白的蛋白印跡分析。Urabeetal.，2002i殳計的原始桿狀病毒(原始REP/Bac-to-Bac)在5次傳代中Rep78/52的表達緩慢下降。插入在桿狀病毒骨架PSC中的Urabeetal.,2002設計的Rep78和52表達單元(原始REP/PSC)在昆蟲細胞中傳代后R印78/52的表達發生了下降。然而，PSC骨架中帶有含ACG起始密碼子的REP表達單元的桿狀病毒(REP-ACG/PSC)在至少5次傳代中其Rep78/52的表達是穩定的。Western雜交分析如實施例1.1.3所述進行。圖3:表l結果的曲線圖。圖4:昆蟲細胞中各種rAAV構建體穩定性的比較。如上面實施例1所述，在SF+細胞中生產rAAV。對于所有生產而言，含有ITR的桿狀病毒和含有衣殼基因的桿狀病毒是相同的，世代數與含有Rep基因的桿狀病毒的相同。使用了4種不同的含有Rep基因的桿狀病毒1)REP-ACG/PSC;2)SLR:Urabeetal.(2002，見上文)的原始構建體；3)Rep52+Rep78(B2B):兩種獨立的Bac-to-Bac桿狀病毒，一種含有Rep78基因，另一種含有Rep52基因；4)R印52+Rep78(PSC):兩種獨立的ProteinSciences桿狀病毒，一種含有R印78基因，另一種含有R印52基因。圖5:最高達傳代8次的REP-ACG/PSC桿狀病毒構建體的穩定性。如上面實施例1所述，在SF+細胞中生產rAAV。圖6:傳代作用對Urabeetal.(2002，見上文)的原始構建體和本發明的REP-ACG/PSC構建體的對Rep蛋白表達的影響的比較。桿狀病毒傳代和蛋白印跡的進行如實施例1所述。在rep桿狀病毒正常傳代的過程中，向SF細胞加入桿狀病毒后40小時取樣并進行蛋白印跡。實施例實施例1:R印構建體1.1.材料和方法1.1.1桿狀病毒質粒構建為從單獨的雙順反子信^吏RM表達R印78和R印52,將位于表達載體pFastBacDualSLR(Urabeetal.，2002，見上文)上的Rep78的ATG起始密碼子轉變為ACG。所用的上游引物是BamHI5'-cgcggatcctgttaagACGGCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTC-3'(SEQIDNO.8)正向引物序列PCR反應中使用的3，-引物位于REP78基因的側翼并含有Xbal位點(TCTAGA):Xbal5'-AGGCTCTAGATTCGAAAGCGGCCCG-3'(SEQIDNO,9》反向引物序列通過PCR(反應體積50lxPfxAmp.緩沖液，0.3mMdNTP，lmMMgS04,150mM正向引物，150mM反向引物，2x增強溶液，模板50ng23(pFastBacDualSUO，1UPlati畫Pfx(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA))，使用以下實驗方案來擴增上述引物對之間的序列95X:、5min的1個循環；95X:、15s,55t:、30s，72*C、2min的35個循環；721C、10min的1個循環；4t:齡存)。使用ZeroBluntT0P0PCR克隆試劑盒(Invitrogen)將PCR產物克隆到PCR-bluntII-TOPO中。再利用限制位點Spel和Xbal將Rep78亞克隆到pFastBacDual(Invitrogen)中。最終將突變的Rep表達盒克隆到(使用限制性酶BstZ171和AvrII)桿狀病毒表達構建體(用EcoRV和Xbal切開)pPSCIO(ProteinSciencesCorporation,Meriden，CT，USA)中。Baseclear，Leiden,theNetherlands對所述構建體的序列進行了確i人分析。1.1.2重組桿狀病毒生產使用GeneXpressBaculoKIT(ProteinSciencesCorporation)生產源自苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核型多角體病毒(AcNPV)的重組桿狀病毒。轉染如下進行在一個圓底14ml試管中將200nlGRACE培養基與6ju1Cellfectine(Invitrogen)混合，并在一個Eppendorf管中將200piGRACE培養基與50ji1病毒DM(ProteinSciences)和2pg轉移質粒(REP)混合。將E卯endorf管中的容納物加入上述試管并小心混合。室溫培育30分鐘之后將1,300piGRACE加入至轉染混合物中。用GRACE培養基清洗T25燒瓶中的昆蟲細胞，并將轉染混合物逐滴加入細胞層。在28X:培育6小時后，小心加入添加有10%FBS的SF900II血清，并將T25燒瓶置于28"C溫箱中5天，然后收獲重組桿狀病毒。1.1.3蛋白印跡分析用桿狀病毒-REP感染昆蟲細胞(SF+)。在感染細胞后16、40和64小時取樣品，通過加入0.IV10xTRIS裂解緩沖液(1.5MNaCl，0.5MTRIS，0.01MMgCl，1%TRITONX-100,pH8.5，過濾滅菌)裂解細胞，在搖床(Innova44，NewBrunswick)中于28tl下培育30分鐘。通過與Benzonase在37"C培育30分鐘降解游離的MA和RNA。對細胞裂解物進行離心(1，900xg;15min;40。在上清液樣品中加入NuPAGELDS樣品緩沖液(4x，Invitrogen),然后上樣到4-12%的Bis-Tris膠(120V)上。蛋白質在PVDF膜(BioRad)上印膜30分鐘，IOV(半干印跡)。Western免疫化學通過用Superblock-PBS封閉緩沖液(PIERCE)封閉膜并隨后用小鼠抗Rep(303.9，Progen，Germany;稀釋度1:50)和兔抗小鼠-HRP歸0，稀釋度1:500)培育來進行。用發光底物(lumi-lightplusWestern-blottingsubstrate)(Roche)通過化學發光染色使Rep蛋白可見。1.2結果將新設計的本發明的R印構建體(REP-ACG/PSC)與1)PSC桿狀病毒骨架中和2)Bac-to-Bac桿狀病毒骨架中的原始Rep構建體(Urabeetal.，2002)的性能進行對比。所有三種構建體都進行連續傳代直至第5代。使用第2、3、4和5代R印構建體以及第2、3、4和5代各代的AAV-LPL和AAV-Cap重組桿狀病泰這里使用的AAV-LPL和AAV-Cap重組桿狀病毒如下面實施例2中所述)進行AAV1-LPL生產實驗。用qPCR測定AAV1-LPL的產量，如表l所示。Urabeetal.，2002設計的原始桿狀病毒(原始REP/Bac-to-Bac)的AAV產量在5次傳代中迅速下降。插入在桿狀病毒骨架PSC中的Urabeetal.，2002i殳計的Rep表達單元(原始REP/PSC)導致了在昆蟲細胞中傳代后也發生了AAV產量的下降。然而，PSC骨架中具有含ACG起始密碼子的REP表達單元的桿狀病毒(REP-ACG/PSC)的AAV產量在至少5代中穩定。因此，只有用含有REP-ACG構建體的桿狀病毒才能在幾代(如2-5)中得到可重現的AAV-LPL產量。代數原始REP/PSCvg/mlREP-ACG/PSCvg/ml原始REP/Bac_to-Bacvg/ml25.38E+093.04E+093.62E+1039.57E+094.77E+097.28E+0941.66E+097.81E+097.59E+0857.35E+089.90E+092.03E+08表1:使用幾代桿狀病毒構建體生產rAAV病毒粒子用編碼第2、3、4或5代的LPL載體單元、編碼第2、3、4或5代的Rep表達單元和編碼第2、3、4或5代的Cap表達單元的三種重組桿狀病毒感染Sf9細胞。三天后收獲細胞并用qPCR測定AAV產量(每ml載體基因組；vg/ml)。25<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>2002設計的原始桿狀病毒(原始REP/Bac-to-Bac)顯示顯著量的第五代重組桿狀病毒的Rep序列有缺失。插入在桿狀病毒骨架PSC中的Urabeetal.，2002設計的R印78和52的表達單元(原始REP/PSC)表現出重組桿狀病毒非常早且顯著的損失。然而，PSC骨架中具有含ACG起始密碼子的REP表達單元的桿狀病毒(REP-ACG/PSC)(克隆C4和A3)表明在至少5代中為穩定的重組桿狀病毒。實施例2:Cap構建體2.1.1桿狀病毒質粒構建體為了從單個多順反子信使RNA表達VP1、VP2和VP3，如Urabeeta1.,2002(見上文)所述，設計了桿狀病毒-AAV-Cap構建體。簡言之，將VP1的ATG起始密碼子突變為ACG。11位上可能的ATG起始密碼子被改為ACG。VP1起始密碼子下游的剪接受體位點被破壞(21位和24位突變)。突變的Cap表達盒被克隆到帶有BamHl/StuI限制位點的桿狀病毒表達構建體pFastBacDual(pFBDAAVlVPmll)中。此質粒(pFBDAAVlVPmll)是引入VP1替代起始密碼子的起始材料。Urabeetal(2002，見上文H吏用的目的在于引入上述突變的正向引物是BamHI11121245'-cgcggatcctgttaagACGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'(SEQIDNO,1)下面的正向引物用于以pFBDAAVlVPmll(Urabeetal.，2002，見上文)為起始材料制備表，建體5'-cgcggatcctgttaagTTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'(SEQIDNO,2》5'-cgcggatcctgttaagATTGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'(SEQ工DNCU3)5'-cgcggatcctgttaagGTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'(SEQIDNO，4〉5'-cgcggatcctgttaagCTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCG&TTGGCTd(SEQIDNO.5)使用上述正向引物的PCR反應中用的反向引物被定位到VP1起始密碼子下游約230bp處并含有一個特殊的StuI位點(AGGCCT)。5'-GTCGTAGGCCTTGTCGTGCTCGAGGGCCGC-3'(SEQIDNO,6)用上述正向和反向引物對通過PCR擴增片段。用BamHI和Stul消化PCR產物后，PCR產物被亞克隆到pFBDAAVlvpmll的BamHI/Stul位點，產生多個待測的桿狀病毒-AAV-Cap構建體。該DM構建體在Baseclear，Leiden,theNetherlands通過序歹'J分析確認。2.1.2重組桿狀病毒的生產用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(Invitrogen)生產了源自苜蓿4艮紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)的重組桿狀病毒。通過感染每ml2xl06個Sf9細胞來擴增rBac-Cap,moi為O.1。感染后三天，通過離心沉降細胞，回收含有病毒的上清液。。2.1.3重組AAV的生產用Urabeetal.，2002的三種重組桿狀病毒生產rAAV批次。然而，對于此研究，一種桿狀病毒含有轉基因LPLS447X的表達構建體。從該轉基因表達的治療用活性試劑是人類脂蛋白脂肪酶的天然存在的變體，它是一個448個氨基酸的單鏈。所述LPf變體在蛋白C末端有2個M酸缺失。第二種桿狀病毒含有AAV復制基因Rep78和Rep52的表達構建體。第三種桿狀病毒含有AAV1衣殼序列，其中VP1的起始密碼子要么是ACG，要么是TTG、CTG、GTG。根據Grimmetal.，1998(Noveltoolsforproductionandpurificationofrecombinantadeno-associatedvirusvectors.HumGeneTher.1998Dec10;9(18):2745-60)生產用質粒轉染系統產生的哺乳動物-rAAV各批次。2.1.3蛋白印跡分析用桿狀病毒-Cap感染昆蟲細胞。感染后三天，細胞被離心(3，000g;15min)。用0.22umMillex過濾器過濾上清液。在上清液樣品中加入NuPAGELDS樣品緩沖液(Invitrogen)，然后上樣到4-12°/。的Bis-Tris膠上。在100V下跑膠。蛋白質在IOOV、350mA下于硝酸纖維素膜(BioRad)上印膜l小時。Western免疫化學是通過用1%Marvel脫脂奶粉封閉膜并隨后用小鼠抗Cap(Bl，Progen，Germany;稀釋度l:50)和兔抗小鼠HRP歸0，稀釋度1:100)培育來進行的。用發光底物(lumi-lightplusWestern-blottingsubstrate)(Roche)進行化學發光染色l吏VPl、VP2、VP3可見。2.1.4生化測量用放射性甘油三油酸酯乳液底物如前所述測定人類LPLS447X活性(Nilsson-EhleandScholtz，1976)。用雞IgY和小鼠5D2抗hLPL抗體進行夾心酶聯免疫分析測定人類LPL，x免疫活性物質(Liuetal.，2000)。4吏用商業試劑盒按照廠商說明書(BoehringerMannheim,#450032)測量血漿甘油三酸酯水平。2.2結果2.2.1重組桿狀病毒的構建為了在Urabeetal(2002，見上文)i殳計的桿狀病毒質粒中引入不同的可替代的用于VPl表達的起始密碼子，設計了一系列含有BamHI限制位點的上游引物，并用TTG、ATT、GTG或CTG密碼子替代VPl的ACG起始密碼子。用這些引物結合含有StuI位點的下游引物進行PCR,得到亞克隆到pFBDVPmll(Bac-Cap)的BamHI/StuI位點的擴增片段。產生的桿狀病毒質粒用于通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統制備重組桿狀病毒。制備的重組桿狀病毒感染昆蟲細胞以生產AAV衣殼。感染后三天，用蛋白印跡測定不同批次桿狀病毒的病毒蛋白表達。從蛋白印跡可清楚地看出，含有VP1的TTG起始密碼子的桿狀病毒構建體表達此蛋白的水平比以前用ACG起始密碼子的構建體要高，用TTG密碼子的VP1和VP2之間的比例是1:1,接近于對野生型AAV的報道(未給出)。2.2.2各rAAV批次對培養細胞的感染為了研究源自使用TTG起始密碼子的重組桿狀病毒的AAV衣殼的感染性，生產了rAAV。同時也通過用質粒轉染哺乳動物HEK293細胞生產了一批rAAV。兩批rAAV的載體基因組滴度都用qPCR測定。此滴度用于在微滴定板中以增加的moi感染HEK293細胞。感染后兩天，在感染細胞的培養基上進行轉基因產物(LPLS"7x)的定量測定(LPy定量測定)。該測定表明用桿狀病毒生產的rAAV所產生的LPy的量接近于用質粒生產的rAAV所產生的LPL(未給出)。2.2.3小鼠中各rAAV批次的注射桿狀病毒生產系統和常規哺乳動物質粒生產系統所生產的各rAAV批次經肌內注射到小鼠中以觀察體內LPLS447X蛋白活性和甘油三酸酯饑餓。在注射后3天、7天和2周^Lik樣并測定。在病毒給予之后的3天和7天之間，取自用哺乳動物rAAV注射的小鼠和用桿狀病毒-rAAV注射的一只小鼠的血漿都從乳狀變為完全澄清。取自一只注射桿狀病毒-rAAV的小鼠的血漿仍然相對呈乳狀但脂肪水平明顯降低。所有處理小鼠的甘油三酸酯的水平分別降低(未給出)。在第14天，在用哺乳動物-AAV和桿狀病毒-(TTG)-AAV處理的小鼠中TG水平都降低了96%。病毒給予后兩周取得的血漿樣品顯示出用桿狀病毒-AAV和哺乳動物-AAV處理的小鼠的LPLS447X活性接近(未給出)。實施例3:具有經修飾的Rep78起始密碼子的rAAV構建體在昆蟲細胞中的穩、定性3.1各種rAAV構建體在昆蟲細胞中的穩定性的比較如上面實施例l所述，在SF+細胞中生產rAAV。對于所有生產而言，含有ITR的桿狀病毒和含有衣殼基因的桿狀病毒是相同的，代數與含有R印基因的桿狀病毒的相同。使用了4種不同的含有R印基因的桿狀病毒:1)REP-ACG/PSC;2)SLR:Urabeetal.(2002，見上文)的原始構建體;3)Rep52+R印78(B2B):兩種獨立的Bac-to-Bac桿狀病毒，一種含有R印78基因，另一種4、有Rep52基因；4)Rep52+Rep78(PSC):兩種獨立的ProteinSciences桿狀病毒，一種^^有Rep78基因，另一種含有Rep52基因。結果如圖4所示。在桿狀病毒的第5代，使用本發明的REP-ACG/PSC生產的rAAV已經相對原始Rep構建體和分用的Rep構建體提高了10倍以上。3.2最高至第8代桿狀病毒構建體的穩定性如上面實施例1所述，在SF+細胞中生產rAAV。對于所有生產而言，含有ITR的桿狀病毒和含有衣殼基因的桿狀病毒是相同的，代數與REP-ACG/PSC桿狀病毒的相同。結果如圖5所示。REP-ACG/PSC桿狀病毒可保持穩定到至少第8代。REP-ACG/PSC的rAAV生產滴度可保持穩定最高到至少第8代桿狀病毒。3.3傳代對Rep蛋白表達的影響對Urabeetal.(2002，見上文)的原始構建體與本發明的REP-ACG/PSC構建體的傳代數對R印蛋白表達的影響進行了比較。桿狀病毒傳代和蛋白印跡的進行如實施例1所述。在rep桿狀病毒正常傳代的過程中，向SF細胞加入桿狀病毒后40小時取樣并進行蛋白印跡。圖6清楚地表明，對于原始Urabe構建體(SLR)而言，較高的世代中的Rep表達與較早的世代中的相比減弱，而對于REP-ACG/PSC構建體而言，較高的世代中的Rep表達與較低的世代中的Rep表達保持一致。3權利要求1.一個含有開放閱讀框的核苷酸序列，所述開放閱讀框含有編碼細小病毒Rep蛋白的核苷酸序列，其中細小病毒Rep78蛋白的翻譯起始密碼子是可在昆蟲細胞中表達時實現部分外顯子跳躍的起始密碼子。2.根據權利要求l的核苷酸序列，其中所述起始密碼子選自ACG、TTG、CTG和GTG。3.根據權利要求1或2的核苷酸序列，其中所述核苦酸序列含有表達控制序列，所^達控制序列含有SEQ.IDNO:7的9核苷酸序列或與SEQ.IDNO:7基本同源的核苷酸序列，位于編碼AAVR印78蛋白的核苷酸序列的起始密碼子的上游。4.根據權利要求1-3任一項的核苷酸序列，其中所述細小病毒R印蛋白是腺伴隨病毒(AAV)R印蛋白。5.—種含有權利要求1-4任一項的核苷酸序列的核酸構建體，其中所述核苷酸序列與用于昆蟲細胞表達的表達控制序列可操作地連接。6.根據權利要求5的核酸構建體，其中所述核苷酸序列與多角體啟動子可操作地連接。7.根據權利要求5或6的核酸構建體，其中所述構建體是昆蟲細胞相容的載體，優選為桿狀病毒載體。8.—種含有不超過一種類型核苷酸序列的昆蟲細胞，所述核苷酸序列含有編碼一種或多種細小病毒Rep蛋白的單個開放閱讀框。9.根據權利要求8的昆蟲細胞，其中所述單個開放閱讀框編碼全長Rep78蛋白。10.根據權利要求8或9的昆蟲細胞，其中所述含有編碼一種或多種細小病毒R印蛋白的單個開放閱讀框的核苷酸序列是一個核酸構建體的一部分，所述核酸構建體中所述核苷酸序列與用于昆蟲細胞表達的表達控制序列可操作地連接。11.根據權利要求8-IO任一項的昆蟲細胞，其中所迷昆蟲細胞含有如權利要求1-4任一項所定義的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列含有編碼一種或多種細小病毒Rep蛋白的單個開放閱讀框；或含有如權利要求5-7任一項所定義的第一核酸構建體，其中所述核苷酸序列與用于昆蟲細胞表達的表達控制序列可操作地連接。12.根據權利要求11的昆蟲細胞，其中所述昆蟲細胞還含有a)含有至少一個細小病毒末端反向重復(ITR)核苷酸序列的第二核苷酸序列；和b)含有細小病毒衣殼蛋白編碼序列的第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列與用于昆蟲細胞表達的表達控制序列可操作地連接。13.根據權利要求12的昆蟲細胞，其中所述昆蟲細胞含有a)根據權利要求5-7任一項的第一核酸構建體，其中所述第一核酸構建體還含有如權利要求9的(b)所定義的第三核苷酸序列；和b)含有如權利要求9的(a)所定義的笫二核苷酸序列的第二核酸構建體。14.根據權利要求13的昆蟲細胞，其中所述第二核酸構建體是昆蟲細胞相容的載體，優選為桿狀病毒載體。15.根據權利要求12-14任一項的昆蟲細胞，其中所述第二核苷*列還含有至少一種編碼目的基因產物的核苷酸序列，并且其中所述至少一種編碼目的基因產物的核普酸序列被整合到在昆蟲細胞中產生的細小病毒載體的基因組中。16.根據權利要求15的昆蟲細胞，其中所述第二核苷酸序列含有兩個細小病毒ITR核苷酸序列，且其中所述至少一個編碼目的基因產物的核苷酸序列位于兩個細小病毒ITR核苷酸序列之間。17.根據權利要求12-16任一項的昆蟲細胞，其中所述第三核苷^f列含有開放閱讀框，所述開放閱讀框含有編碼細小病毒衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的核苷酸序列，其中所述細小病毒衣殼蛋白VP1的翻譯起始密碼子選自ACG、TTG、CTG和GTG。18.根據權利要求17的昆蟲細胞，其中所述第三核苷酸序列含有表達控制序列，所#達控制序列含有SEQ.IDNO:7的9核苷*列或與SEQ.IDNO:7基本同源的核苷酸序列，位于編碼細小病毒VP1衣殼蛋白的核苷酸序列的起始密碼子的上游。19.根據權利要求17或18的昆蟲細胞，其中所述笫三核苷酸序列還包含對編碼細小病毒衣殼蛋白VP1的核普酸序列的選自12位核苷酸的C、21位核苷酸的A和24位核苷酸的C的至少一個《務飾。20.根據權利要求12-19任一項的昆蟲細胞，其中所述第一核苷#列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列中的至少一個被穩定地整合到所述昆蟲細胞的基因組中。21.根據權利要求8-20任一項的昆蟲細胞，其中所述細小病毒為AAV。22.—種在昆蟲細胞中生產重組細小病毒粒子的方法，所述病毒粒子含有如權利要求12、15和16任一項所定義的第二核苷酸序列，所述方法包括如下步驟a)在產生重組細小病毒粒子的條件下培養如權利要求12-21任一項定義的昆蟲細胞；并b)回收所述重組細小病毒粒子。23.根據權利要求22的方法，還包括使用抗細小病毒抗體，優選使用固定化抗體，對所述病毒粒子進行親和純化的步驟。24.根據權利要求23的方法，其中所述抗細小病毒抗體為單鏈駝科動物抗體或其片段。25.根據權利要求22-24任一項的方法，其中所述重組細小病毒粒子是重組AAV病毒粒子。全文摘要本發明涉及用于在昆蟲細胞中生產重組細小病毒(如腺伴隨病毒)載體的核酸構建體，以及含有這種構建體的昆蟲細胞，以及用所述細胞生產重組細小病毒粒子的方法。所述昆蟲細胞優選地含有編碼細小病毒Rep蛋白的第一核苷酸序列，其中細小病毒Rep78蛋白的翻譯起始密碼子是可在昆蟲細胞表達時實現部分外顯子跳躍的次優起始密碼子。所述昆蟲細胞還含有第二核苷酸序列，它含有至少一個細小病毒(AAV)末端反向重復(ITR)核苷酸序列；和第三核苷酸序列，它含有編碼細小病毒衣殼蛋白的序列。文檔編號C12N5/10GK101506369SQ200780030443公開日2009年8月12日申請日期2007年6月20日優先權日2006年6月21日發明者A·C·貝克,D·J·比斯曼斯,S·J·P·哈斯特,W·T·J·M·C·赫門斯申請人:阿姆斯特丹分子治療股份有限公司