專利名稱：Cd40激動劑抗體/1型干擾素協同佐劑組合、包含前述的結合物及其作為增強細胞免疫的 ...的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及協同佐劑(synergistic adjuvant)組合， 所述組合可用于增強有相應需要的受試者的免疫。更具體地，本發明 涉及特定的協同佐劑組合，其包含(i) l型干擾素和(ii) CD40激動劑， 例如激動性抗CD40抗體或CD40L多肽或CD40L片段或包含CD40L的結 合物，且任選進一步包括(iii)靶抗原。此外，本發明涉及包含或編碼所述協同佐劑組合的新型蛋 白或DM結合物，例如包含或編碼(i) CD40激動性抗體或可溶性 CD40L蛋白或CD40L片段或CD40L結合物和(i i) 1型干擾素以及任選 (iii)期望的抗原的蛋白和DNA結合物。本發明又進一步提供了新型免疫療法，其包括施用這種協 同佐劑組合或DM或蛋白質結合物來增強抗原特異性細胞免疫，例如 CD8+免疫。特別地，還闡述了包含這些新型佐劑組合和/或多肽結合物 和DNA結合物的組合物用于治療各種慢性疾病(包括癌癥，例如表達 CD40抗原的胂瘤)和用于治療感染性疾病(如HIV感染)、自身免疫疾 病、過敏性和炎性疾病以及用于增強疫苗的效力的用途。本發明還提供了用于減輕CD40激動劑(如CD40L多肽和結合物或激動性CD40抗體)的毒性的新型方法，所述方法通過共施用這 種CD40激動劑和一定量的1型干擾素，所述量足以減輕或預防毒性， 如肝毒性，否則該毒性將會由僅施用CD"激動劑而導致。這促進CD40 激動劑在治療劑量下的施用，否則該治療劑量會基于毒性而被排除。
背景技術：
抗微生物的機體防御系統和對抗其他慢性疾病(如影響細
通過適應性免疫系統的晚期反應來介導。先天性免疫包括識別例如具 有微生物病原體的特征和在哺乳動物細胞上不存在的結構的機制。這 種結構的例子包括細菌脂多糖(LPS)、病毒雙鏈DM以及未甲基化的 CpG DNA核苷酸。先天性免疫反應系統的效應細胞包括嗜中性粒細胞、 巨噬細胞和自然殺傷細胞(M細胞)。除先天性免疫之外，脊推動物(包 括哺乳動物)已經發展免疫防御系統，所述免疫防御系統通過接觸感染 性因子(infectious agent)而被刺激，并隨著每次連續接觸特定抗原 而使量級(magnitude)和有效性增加。由于其適應特異性感染或抗原損 傷的能力，這種免疫防御機制被描述為適應性免疫。有兩種類型的適 應性免疫反應-稱為體液免疫(包括由B淋巴細胞產生的抗體)和細胞 介導的免疫(由T淋巴細胞介導)。已經描述主要T淋巴細胞的兩種類型，CD8+細胞毒性淋巴 細胞(CTL)和CD4輔助細胞(Th細胞)。CD8+ T細胞是效應細胞，它經 由T細胞受體(TCR)識別通過在例如受病毒或細菌感染的細胞上的I 類MHC分子呈遞的外源抗原。識別外源抗原后，CD8+細胞經受活化、 成熟和增殖的過程。這種分化過程導致CTL克隆，所述克隆具有破壞 顯示外源抗原的靶細胞的能力。另一方面，T輔助細胞與體液和細胞 介導的效應子免疫反應形式有關。就體液或抗體免疫反應而言，通過 與Th細胞的相互作用由B淋巴細胞產生抗體。特別地，細胞外抗原(如 循環微生物)由專門的抗原呈遞細胞(APC)接納，并進行處理，然后與 II類主要組織相容性復合物(MHC)分子結合呈遞給CD4+Th細胞。這些Th細胞轉而活化b淋巴細胞，導致抗體產生。相比之下，細胞介導的 或細胞的免疫反應用于中和例如在成功感染靶細胞后居住于細胞內位 置的微生物。外源抗原如微生物抗原在受感染的細胞內合成，并在這 些與I類MHC分子相關的細胞的表面上呈遞(resented)。這些表位的 呈遞導致上述CD8+CTL的刺激-該過程轉而也受CD4+ Th細胞刺激。 Th細胞由至少兩種不同的亞群組成，稱為Thl和Th2細胞。所述Thl 和Th2亞型表示Th細胞的極化群，其在接觸抗原后從共同的前體分化。每種T輔助細胞亞型分泌促進不同的免疫效應的細胞因 子，所述免疫效應彼此相反并且交叉調節相互的擴增和功能。Thl細 胞分泌大量的細胞因子(如干擾素(IFN) y 、腫瘤壞死因子-cc (TNF-cc)、白細胞介素-2(IL-2)和IL-12)和少量的IL-4。 Thl相關細胞因 子促進CD8+細胞毒性T淋巴細胞T淋巴細胞(CTL)活性，并且最通常 與抗細胞內病原體的細胞介導的免疫反應相關。相比之下，Th2細胞 分泌大量的細胞因子(如IL-4、 IL-13和IL-10),但是少量的IFN-y ， 并且促進抗體反應。Th2反應與體液反應(如抵抗炭疽的保護)以及與 蠕蟲感染的消除特別相關。產生的免疫反應是Thl還是Th2驅動的，這主要取決于涉 及的病原體以及取決于細胞環境的因素，如細胞因子。活化T輔助反 應或正確的T輔助亞組的失敗可以不僅導致無能力建立足以抗爭特定 病原體的反應，而且導致產生抗再感染的弱免疫。很多感染性因子是 細胞內病原體，期望在所述病原體中細胞介導的反應(如通過Thl免疫 示例)在保護和/或療法中起重要的作用。而且，對于很多這些感染， 已顯示誘導不適當的Th2反應將消極影響疾病結果。例子包括結核分 枝桿菌(M tuberculosis)、曼氏血吸蟲(s. mansoni)和事與愿違的Th2 樣為主(dominated)的免疫反應。瘤型麻風似乎也具有普遍但不適當的 Th2樣反應的特征。HIV感染代表另一個例子。在那點上，已認為Thl 樣細胞與其他Th細胞群體的比率的下降可在疾病癥狀的進展中起關 鍵作用。已經開發作為抗感染性因子的保護手段、用于保護以抗某些微生物的接種方案(Vaccination protocols)。抗傳染性病原體的接 種方案經常受阻于弱疫苗免疫原性、不適當類型的反應(抗體對細胞介 導的免疫)、缺少誘發長期免疫記憶的能力和/或未能產生抗不同血清 型的給定病原體的免疫。目前接種策略靶向對給定血清型和對很多普 通的病原體(例如病毒血清型或病原體)有特異性的抗體的誘發。必須 在復發的基礎上作出努力以監控哪種血清型在全世界范圍內普遍。這 樣的 一個例子是每年監控被預測為主要傳染性菌林的流感A血清型的 出現。為支持接種方案，已經進一步開發支持抗特異性感染性疾 病的免疫反應的產生的佐劑。例如，鋁鹽已用作相對安全且有效的疫 苗佐劑來增強對某些病原體的抗體反應。這種佐劑的缺點之一是它們 對刺激細胞介導的免疫反應相對無效以及產生主要偏于Th2的免疫反應。目前普遍公認保護性免疫的產生不僅取決于與抗原的接
觸，而且取決于對抗所述抗原的背景情況。存在很多例子，其中在非 炎性情況下將新型抗原引入至宿主產生免疫耐受性，而非長期免疫，
然而在炎性劑(佐劑)的存在下與抗原的接觸誘導了免疫。(Mondino等， 戶藩.， USA 93: 2245 (1996); Pulendran等，/, 歸.188:2075 (1998); Jenkins等，/邁層"/ 1: 443 (1994)和Kearney 等，//ZM7M/7/ 1 : 327 (1994))。眾所周知調節適應性免疫的天然存在的分子是CD40。 CD40 是TNF受體超家族的成員，它對細胞介導的免疫反應的鐠系(spectrum) 是必要的并且對T細胞依賴性體液免疫的發展是必需的(Aruffo等， Ce/7 72:291 (1993); Farrington等，尸馬iV"7 Sci. ， USA
91:1099 (1994); Renshaw等，/ fA77船c/ 180: 1889 (1994))。在它的 固有作用中，在CD4+ T細胞上表達的CD40配體與在DC或B細胞上表 達的CD40相互作用，促進APC活化的增加以及同時進一步活化T細胞 (Liu等，S面'"/邁/z7歸/ 9: 235 (1994); Bishop等，C層M 尸a"or i er 14: 297 (2003))。對于DC， CD40連接(1 igat ion)經典地導致與通過TLR的刺激類似的反應(如上調活化標記物以及產生炎癥細月包因子)(Quezada 等，J/7/2i/ /邁忠W707 22:307 (2004);
0'Sullivan B和Thomas R C"7她/應/7。/ 22: 83 (2003))。它在CD8反應中的重要性通過研究來證實，所述研究顯示APC通過CD40的刺激在缺少CD4細胞的情況下拯救了 CD4依賴性CD8+ T細胞反應(Lefrancois等，/ T/m7mo厶164:725 (2000); Bennett等，#"i/re393:478 (1998); Ridge等，393: 474 (1998); Schoenberger等，yKW"re 393: 474 (1998))。這種發現引起很多推測，即單獨的CD40激動劑在一些疾病環境中可能潛在地拯救未完成的CD8+ T細胞反應。然而，其他研究已證明單獨的CD40刺激不足以促進長期免疫。在一些模型系統中，單獨的抗CD40治療不足以促進長期免疫。特別地，單獨的抗CD40治療可導致無效的炎性細胞因子產生及抗原特異性T細胞的缺失(Mauri等，#"射6:673 (2001); Kedl等，尸roc^〃Jest/ Sc/， USA 98:10811 (2001))以及B細胞反應的終止(Erickson等，/ "/'/2 //^e^ 109:61 3 (2002))。同時，可溶性三聚化的CD40配體已作為CD40途徑的激動劑用于臨床，而對此極少報道，與下列結論一致單獨的CD40刺激未能重建用于長期CD8+ T細胞免疫的所有必要的信號(Vonderheide等，/ 67// ^ co/ 19:3280 (2001))。已有不同研究組報道各種激動性抗體。例如，已報道一種mAb CD復4(5c3) (PharMingen， San Diego California)使CD40與CD40L之間的活化增加約30-40%。 (Schlossman等，Ze由cWe 7>/ /跟1995， 1:547-556)。同時，在美國專利號6， 843，989中SeattleGenetics宣稱提供了使用激動性抗人CD40抗體治療人類的癌的方法。聲稱他們的抗體傳遞刺激信號且具有體內腫瘤活性，所述刺激信號使CD"與CDWL的相互作用增強了至少45%并且增強了 CD40L介導的刺激。他們從S2C6 —即一種先前顯示傳遞有力的促進生長信號至B淋巴細胞的激動性抗人CD40抗體取得這種抗體(Paulie等，1989, /./腳,厶142:590-595)。如在接種方案中或微生物感染期間，為增加適應性免疫反應的有效性，因此開發新型的更有效的疫苗佐劑是重要的。本發明滿足這種需要，并也提供其他優點。同時，開發有效的免疫佐劑是重要的，所述佐劑在不誘發副作用如肝毒性的劑量時有效。特別地，已經由Vanderheide等，/。腳A 25 (7): 876-8833 (2007年3月)報道，0. 3 mg/kg是用于示例性的激動性抗體的最大耐受劑量，并且更高的劑量可誘發副作用，包括靜脈血栓栓塞、3級頭痛、導致毒性效應(如寒戰等)的細胞因子釋放以及短暫的肝毒性。同時，由Vanderheide等，J Clin.Oncol. 19 (23): 4351-3 (2001)報道,該文中描述的hCD40L多肽的最大耐受劑量是0. 1 mg/kg/日，并且當所述多肽以0. 15 mg/kg/日的更高劑量施用時，他們觀察到具有以下特征的肝毒性在治療的殳試者中升高的肝轉氨酶水平為3級或4級。
發明概述在一個實施方案中，本發明包括以下發現組合的某些成分上調樹突狀細胞上的CD70并且誘發免疫上的協同效應，例如它們促進Thl細胞免疫和CD8 T細胞免疫反應。具體來說，本發明包括以下發現當以相同或單獨的組合物組合施用以及進一步任選與期望的抗原組合施用時，1型干擾素和CD40激動劑(如激動性CD40抗體或CD40L多肽或CD40L結合物)通過誘導CD70在CD8+樹突狀細胞上的表達而誘發免疫上的協同效應，而且誘發CD8+T細胞的有效擴增和增加的Thl免疫。基于此發現，本發明提供了可以作為增強免疫的手段施用給有相應需要的受試者的新型佐劑組合。并且，這種佐劑組合可添加至疫苗或與其結合施用以便增強它的效力。與所述發現相關，本發明還提供了編碼(i) 1型千擾素和(ii) CD40激動劑的核酸構建體，所述構建體可任選進一步包括(iii)編碼期望的抗原的核酸序列，當施用給有相應需要的宿主時，任選與抗原結合的所述核酸構建體誘發免疫上的協同效應。這種CD4 0激動劑包括例如，CD40激動性抗體和CD40激動性抗體片段、以及可溶性CD40L和CD40L片段及其結合物與衍生物，如低聚化的CD40L多肽，例如三聚化的CD40L多肽和包含前述的結合物。本發明還提供了多肽結合物，其包含(i)至少一種l型干擾素；(ii)至少一種CD4Q激動劑，如CD40激動性抗體或CD40L多肽或CD40L片段或其結合物或衍生物，如低聚化的CD40L或包含前述的結合物；以及任選(iii)抗原，其中這些成分可以以任何順序直接或間接連接，并且在對有相應需要的受試者施用時誘發免疫上的協同效應。更特別地，本發明提供了核酸構建體，其包含(i)編碼激動性抗人CD40抗體、或人CD40L多肽或片段、其結合物或衍生物的一種或多種基因和(ii)編碼人1型干擾素(例如人oc或人P干擾素)的基因以及任選(iii)編碼抗原的基因，其中針對所述抗原期望誘發增強的細胞免疫反應。還更特別地，本發明提供了新型多肽構建體，其包含(i)激動(agonize)人CD40/CD40L的至少一種激動性抗人CD40抗體或人CD40L多肽或其片段、人cc或(3干擾素、以及任選至少一種抗原，其中針對所述抗原期望誘發增強的細胞免疫反應。
又進一步，本發明提供了佐劑多肽組合物，其包含協同有效量的(i)l型干擾素，優選a或P干擾素；(ii) CD40激動劑，優選激動性CD40抗體或單體或低聚化的可溶性CD40 L多肽或片段或其結合物；以及任選(iii) 一種或多種抗原。本發明還涉及以下發現如果CD40激動劑與1型千擾素或TLR激動劑結合施用，那么可以潛在地減輕CD40激動劑的毒性。因此，由于CD40激動劑可以以比迄今描述的更高的劑量施用，本發明提供了更有效的CD40激動劑療法。例如，如果與1型千擾素或TLR激動劑共施用，CD40L多肽的MTD (最大耐受劑量)可超過0. 1 mg/kg/日至少1. 5倍、更優選至少2-5倍或甚至IO倍或更多，因此允許CD40L多肽以至少約.15 mg/kg/日至1. 0 mg/kg/日的范圍或更高的MTD量施用。這將導致更有效的CD4OL療法，如導致CD40相關的惡性腫瘤的治療和本文公開的其他治療。此外，本發明減少CD40激動劑抗體療法的毒性并且促進比迄今提出的更高的CD40激動劑抗體劑量的施用。具體來說，如上所述，已報道由Vonderheide等，JClin. Immunol. 25 (7): 876-883(2007)報道的激動性CD40L抗體的MTD為0. 3 mg/kg，并且過量劑量導致短暫的肝毒性、靜脈血栓栓塞、3級頭痛以及細胞因子釋放和相關的毒性和不良副作用(如發燒和寒戰等)。與1型千擾素或TLR激動劑結合的CD40激動劑抗體的共施用潛在地允許MTD抗體量大體上增加例如1. 5-15倍或甚至5-10倍，而沒有副作用。因此，用于CD40激動性抗體的MTD量可增加至約.45 mg/kg至約3. G mg/kg或甚至更高。因此本發明包括CD40激動劑與一定量的1型干擾素或TLR激動劑的共施用，所述量足以減少在特定的CD40激動劑劑量下另外潛在地產生的毒性作用，如肝毒性。此外，本發明提供了新型療法，其包括施用包含任何前述的蛋白質或DNA結合物或協同佐劑蛋白的組合物。這些療法包括其作為免疫激動劑(佐劑)以協同增強疫苗的效力的用途以及用于治療其中期望增強的免疫的病癥(如癌癥、感染性病癥、自身免疫病癥、過敏癥、炎性病癥)和基因療法的用途。
如上所述和如下所示，令人驚奇地發現，上述的新型佐劑組合或蛋白質或編碼的DNA結合物相對于僅施用CD40激動劑或l型干擾素誘發免疫上的協同效應和/或潛在地減少或預防不良副作用如肝毒性。這種減少的毒性可以例如基于免疫刺激物的組合對肝轉氨酶水平的影響來確定。明顯地獲得這種協同作用，是因為本發明的佐劑組合令人驚奇地誘導(上調)CD70在體內CD8+樹突狀細胞上的表達從而誘導體內CD8+ T細胞有效的擴增。至少基于這些令人驚奇的對樹突狀細胞以及對CD8+ T細胞免疫和Thl免疫的協同效應，包含這些佐劑組合、核酸構建體或多肽結合物的組合物可作為一種產生以下效應的手段施用給有相應需要的宿主
(i) 相對于僅用任一激動劑的免疫，產生增強的(以指數方式更好)初級和記憶性008+ T細力包反應；
(ii) 誘導抗原特異性CD8+ T細胞的指數擴增，和/或(Hi)產生保護性免疫。因此，可包含蛋白質組合物、或編碼的核酸構建體或包含前述的多肽結合物的這些佐劑組合可用于治療任何疾病或病癥，其中上述已鑒定的增強的細胞免疫反應在治療上是期望的，特別是感染性疾病、增殖性病變(如癌癥、過敏癥、自身免疫病癥、炎性病癥)和其他慢性疾病，其中增強的細胞免疫是期望的治療結果。本發明的優選應用特別包括感染性病癥如HIV感染和癌癥的治療。附圖詳述圖l顯示了在組合的TLR/CD40激動劑免疫后CD8+ T細胞擴增可變地依賴于IFN oc/e 。 WT(頂行)和IFNoc PRKO(底行)用卵清蛋白肽、抗CD40和指定的TLR激動劑免疫。7天后，通過四聚體染色和FACS分析測量脾內的卵清蛋白特異性T細胞反應。在右上象限中的數目表明四聚體染色細胞占總CD8+ T細胞的百分比。圖2顯示了在用與抗CD40組合的IFNoc P依賴性TLR激動
17劑免疫后，IFNoc PRK0宿主的CD4缺失恢復了 CD8+ T細胞反應。如 所示的CD40缺失的或未缺失的WT小鼠和IFN a p RKO小鼠如上所述用 HSV-1肽、抗CD40和PolylC進行免疫。7天后，HSV-1特異性反應通 過四聚體(A)和PolyIC IFNy (B)染色PBL來測定。圖3顯示了抗IFN阻斷了 PolylC/CD40介導的CD8反應， 所述反應通過CD4缺失來恢復。在有和沒有抗IFN和/或CD4缺失下， 將小鼠免疫以對抗卵清蛋白(組合的PolylC/aCD40)。對于抗原特異 性T細胞，如上所述通過四聚體染色來分析第7天PBL。圖4顯示了在組合的TLR/CD40免疫后，在CD4缺失的IFN cc 0111
圖9與在圖7中的實驗類似，顯示了組合的TLR/CD40激動 劑激發在IFN a PRK0小鼠中誘導只在DC上的CD70表達，所述DC 表達耙向的TLR。 IFN a P RKO小鼠用單獨的抗CD40 (aCD40)或與 PolylC(+PolylC)或Pam3Cys (+Pam3Cys)組合進行注射。Pam3Cys是 TLR2激動劑，并且PolylC是TLR3激動劑。24小時后，將脾DC分離， 并且如上所述針對CD7Q表達進行染色。CD8+ DC表達TLR2和3，而 CDllb+DC表達TLR2但不是TLR3。數據表明在缺少IFNa P信號轉導 的情況下，只有直接通過TLR和CD4 0兩者刺激的DC能增加CD7 0表達。
圖10包含比較IL-2/CD40激動劑組合和IFNot/CD40激動 劑組合對來自PBL的抗原特異性(卵清蛋白)T細胞的百分比的效應的 實驗。包含于其中的結果顯示IL-2/CD40激動劑組合不會誘發與IFN oc/CD40激動劑組合相當的對CD8+ T細胞免疫的協同效應。圖11包含在具有注射的黑素瘤細胞的C57BI/6小鼠中的實 驗，顯示IFN a /CD40激動劑組合增加了這種轉移性黑素瘤動物模型中 的存活時間。圖U包含的實驗顯示了在轉移性肺癌的C57BI/6動物模型 中用CD4 0激動劑和I FN a的主題組合佐劑療法保護小鼠免于轉移性肺 癌，如通過在用佐劑組合治療的動物中轉移性結節數的減少所顯示。圖13包含以下實驗其中TIL分析在用主題佐劑組合和適 當對照治療的接種了 B16.F10黑素瘤細胞的C57BI/6小鼠中進行。施 用主題佐劑組合的小鼠顯示增加的TIL數，如圖中的數據所示。圖14包含的實驗顯示了主題CD40激動劑/IFN組合療法產 生抗原特異性效應T細胞，所述效應T細胞浸潤含有肺瘤的小鼠(接種 了 B16.F10黑素瘤細胞的C57BI/6小鼠)的肺。圖15A和15B包含用于實施例的示例性CD40激動性抗體 (FGK. 45)的輕鏈和重鏈序列。圖16包含的示意圖顯示了用于根據本發明的CD40激動性 抗體-抗原-1型IFN結合物在桿狀病毒表達系統中的表達的DNA構建 體的構建。這種構建體將導致與選擇的抗原(例如HIV gag)以及與1型干擾素(oc干擾素)連接的抗CD40抗體的表達。圖17包含用于在桿狀病毒表達系統中產生根據本發明的 CD40抗體-抗原-1型IFN結合物的構建體和用于產生在DNA免疫中使 用的載體的構建體。發明詳述如上所述，本發明主要涉及協同佐劑組合及其用途。在更 詳細地敘述本發明之前，提供了下列定義。由于本領域技術人員可以 了解，所以不必解釋所有術語。在本發明中，術語"激動劑"包括直接結合和活化受體或間 接活化受體的任何本體(entity)，所述間接活化通過與結合該受體的 另一個本體形成復合物或通過引起另一種化合物的修飾來實現，所述
化合物因此直接結合和活化該受體。術語"CD40激動劑"具體包括激動CD40/CD40L和/或增加一 種或多種與CD40或CD40L相關的活性的任何本體。這包括例如，CD40 激動性抗體及其片段、可溶性CD40L及其片段和衍生物(如低聚化(例 如二價三聚化的CD40L))和包含前述任一項的融合蛋白及其通過重組 或蛋白質合成產生的變體。此外，這種CD40激動劑包括小分子以及包 含可取代抗體的RNA或DM分子的CD40適配體。生產的技術及其作為 抗原結合部分的用途可參見，例如美國專利號5， 475， 046; 5, 720， 163; 5， 589， 332和5， 741， 679。這些專利以其全部內容通過引用并入本文。在本發明中，術語"CD40L"或如其在本領域中替代性已知的 "CD1M"包括所有哺乳動物(例如人、大鼠、非人靈長類、鼠科)CD40L 以及其與至少相應的哺乳動物CD4 0 (例如人CD40)多肽結合的片段、變 體、低聚物和結合物。在本發明中，施用的CD40L可包括CD40L多肽 或編碼所述CD40L多肽的DNA。這種CD40L多肽和DNA包括，特別是 如在Immunex美國專利號6,410,711;美國專利號6， 391， 637;美國 專利號5,981， 724;美國專利號5,961, 974和美國公開申請號 20040006006中公開的天然CD40L序列及其片段、變體和低聚物，所
20有這些專利和申請和其中公開的CD40L序列以其全部內容通過引用并 入本文。在本發明中，術語4-lBB激動劑包括激動4-1BB受體的任 何本體如激動性4-1BB抗體和4-1MM多肽及其結合物。這種激動劑潛 在地能與1型干擾素或TLR激動劑共施用以誘發免疫上的協同效應。在本發明中，術語"l型干擾素"包括當與CD40激動劑緊鄰 (proximate)施用或組合施用時誘發增強的CD8+免疫反應的任何1型 干擾素。這包括a干擾素、P干擾素和屬于1型干擾素的其他類型的 干擾素。具體說，這包括e干擾素、^干擾素和t干擾素，如t1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9和10;同時，這包括其變體(如片段)、模擬不 同的1型干擾素分子的結構的共有(consensus )干擾素(如a干擾素)、 其PEG化形式、因重組表達或誘變等具有改變的糖基化的l型干擾素 等等。本領域技術人員很好地知道包括那些可商業獲得的和用作治療 劑的不同l型干擾素。優選1型干擾素包括人1型干擾素，且最優選 人cc干擾素。在本發明的上下文中的術語"協同佐劑"或"協同組合"包括 兩種免疫調節劑如受體激動劑、細胞因子、佐劑多肽的組合，所述組 合與僅施用任一者相比誘發免疫上的協同效應。具體來說，本申請公 開了包含至少一種1型干擾素和CD40激動劑或TLR激動劑和CD40激 動劑或TLR激動劑或1型干擾素和4-1BB激動劑的協同組合。這些協 同組合在共同施用或彼此緊鄰施用后，例如與當CD40激動劑或1型千 擾素在缺少另一部分的情況下施用時相比，誘發免疫上更大的效應。 例如，可通過在體內樹突狀細胞上的CD70的上調證明更大的效應，當 僅施用任一免疫調節劑或激動劑時不會發生所述上調。在本發明中的"共施用"是指在一定情況下施用不同本體-
碼的結合物以使所述本體(例如CD4 0激動劑和1型干擾素)誘發免疫上 的協同效應以及例如導致上調在樹突狀細胞上的CD70和/或減少不良 副作用如肝毒性。這些部分可以以相同或不同組合物施用，所述組合物若單獨與另一種組合物緊鄰施用，通常在相互的24小時內、更通常 在相互的約l-8小時內、并且甚至更通常在相互的l-4小時內或接近 同時施用。相對量是實現期望的協同作用的劑量。此外，如果以DNA 結合物的形式施用，那么激動劑可包含于相同或不同的載體中，如質 粒或重組病毒栽體(如腺病毒或疫苗載體)。"疫苗"是指在單獨施用或與本發明的佐劑組合的結合施用 時導致免疫上的抗原特異性效應的組合物。這包括賦予保護的預防性 疫苗和治療性疫苗。術語"抗體"是指完整抗體或其結合片段，所述結合片段與 用于特異性結合的完整抗體竟爭。結合片段通過重組DNA技術或通過 完整抗體的酶促或化學裂解產生。結合片段包括Fab、 Fab'、 F(ab)2、 Fv和單鏈抗體。這包括，特別是嵌合的、人、人源化的、雙特異性的 和非人抗體。此外，這些抗體和片段包括其變體，所述變體經改變以 影響一種或多種性質如裂解、糖基化、效應子作用等。如上所述，非常需要開發和實施能產生有效的抗原-特異性 T細胞免疫并且不會遭受不期望的副作用如肝毒性的新疫苗佐劑和/ 或佐劑制劑。
它們的效力的新型佐劑來滿足這種需要。這些佐劑通常包括至少一種 l型干擾素、優選oc或P人干擾素、至少一種CD40激動劑(抗CD40抗 體或其片段)或可溶性CD40L多肽。本發明提供了通過施用至少一種CD40激動劑(優選CD40 激動性抗體或可溶性CD40L) 、 1型千擾素(如人ot或P干擾素)和任選 靶抗原(例如腫瘤抗原、自身抗原、變應原或病毒抗原)的組合在有相 應需要的受試者中誘發增強的細胞免疫反應的方法。這些部分通過誘 發在CD8+樹突狀細胞上的CD70表達，誘發細胞免疫上的協同效應。 特別是，這種組合誘導下列(i)產生的初級和記憶性CD8+T細胞反 應比單獨的任一激動劑的指數增加；(ii) CD8+ T細胞的指數擴增以 及(iii)應誘發保護性免疫。如下文所示，當僅施用任一 CD40激動性抗體或1型干擾素時，在CD8+樹突狀細胞上的CD70表達的誘導不會 發生。因此，CD40激動劑/IFN組合令人驚奇地協同誘導在CD8+ DC 上的CD70表達以及體內CD8+ T細胞的有效擴增。關于這個發現，本發明進一步提供了編碼促進細胞免疫的 新型協同激動性多肽結合物的DNA構建體，所述構建體包含(i)編碼 CD40激動劑、優選CD40激動性抗體或其片段或可溶性CD40L或片段 或衍生物的DNA以及(U)編碼1型干擾素例如cc或P干擾素的DM， 所述構建體優選進一步包括(iii)編碼期望的抗原的DNA。本發明進一步提供了誘發細胞免疫上的協同效應的協同蛋 白質結合物，所述結合物包含CD40激動劑(優選激動性CD40抗體或片 段或CD40L的片段)、1型干擾素和任選期望的耙抗原。本發明進一步提供了包含這些DM構建體的組合物，所述 組合物當對宿主(優選人)施用時可用于產生增強的抗原特異性細胞免 疫反應。本發明進一步提供了包含編碼所述新型協同激動性多肽組 合的DM構建體的表達載體和宿主細胞，所述構建體包含(i)編碼特 異性CD40激動劑、優選CD40激動性抗體或抗體片段或CD40L的片段 的一種或多種DNA; (U)編碼1型干擾素、優選cc或P干擾素的一種 或多種DM以及(iii)優選編碼抗原(如病毒或腫瘤抗原)的DNA，
其中針對所述抗原期望誘發增強的抗原特異性細胞免疫反應。本發明又提供了使用所述載體和宿主細胞產生包含所述新
型協同IFN/CD40激動劑/抗原多肽結合物的組合物(優選激動性CD40
抗體/抗原/1型干擾素多肽結合物)的方法。進一步本發明提供了對期望在其中誘發抗原特異性細胞免
疫反應的宿主施用所述DNA構建體或組合物和包含前述任一項的運載
體(vehic 1 e)的方法，所述宿主是例如在優選減少或消除不期望的副作
用(如肝毒性)的情況下患有慢性疾病如癌癥或感染性或過敏性病癥的人.。本發明又進一步提供了包含所述新型協同IFN/CD40激動劑抗原多肽結合物的組合物，所述組合物適于對宿主施用以便誘發增 強的抗原特異性細胞免疫反應。本發明也提供了適于治療用途的組合物，其包含至少一種 l型干擾素、至少一種CD40激動劑和任選耙抗原的組合，所述組合物 當對需要這種施用的宿主施用時誘發細胞免疫上的協同效應。本發明也提供了免疫療法的新型方法，所述方法包括對需 要這種治療的宿主施用所述新型協同激動劑-抗原多肽結合物或編碼 所述多肽結合物的DNA或包含至少一種1型干擾素、至少一種CD40 激動劑和任選至少 一種靶抗原的一種或多種組合物以誘發增強的(抗 原特異性)細胞免疫反應。在優選的實施方案中，將對患有癌癥、感 染(特別是例如涉及病毒、細菌或寄生蟲的慢性感染性疾病)或自身免 疫、炎性或過敏性病癥或處于發展上述疾病的危險中的受試者施用這 些組合物和結合物。例如，本發明可用于誘發抗HIV的抗原特異性細 胞免疫反應。HIV是其中保護性免疫幾乎確定需要產生有效和長時間 的抗病毒的細胞免疫反應的疾病的/>認的例子。
CD70的本發明協同佐;組合來增強疫^ (特別是用;誘導保護性細胞 免疫反應的疫苗)的效力的方法。在優選的實施方案中，這種佐劑包含 本文公開的特異性佐劑和任選可進一步包含另一種佐劑如TLR(例如 TLR1、 TLR2、 TLR3、 TLR4、 TLR5、 TLR6、 TLR7、 TLR8、 TLR9、 TLR10 或TLRll)。理想地，這一額外的佐劑將在有相應需要的受試者中進一 步誘導樹突狀細胞的CD70表達并且導致進一步增強的免疫反應。本發明是發明人早期論證的擴充，所述論證是在toll 樣受體(TLR)和CD40 二者的激動劑的存在下用抗原的免疫(組合的 TLR/CD40激動劑免疫)誘發抗原特異性CD8+ T細胞的有力擴增。從這 種疫苗接種形式誘發的反應以指數方式大于由單獨的任一激動劑誘發 的反應，并且遠遠優于通過常規方法進行的疫苗接種。觀察到組合的 TLR/CD"激動劑免疫產生有效的初級和次級CD8+T細胞反應，僅在2 次免疫后在循環中達到50-70%抗原特異性T細胞。然而，不同于發明
24人的早期發明，本協同組合包含1型干擾素和CD4G激動劑或4-1BB 激動劑的組合。已經令人驚奇地發現TLR/CD40激動性抗體組合和1 型干擾素/CD40激動性抗體組合二者都誘導在CD8+DC上的CD70表達， 并由此誘發體內CD8+ T細胞的有效擴增。因此，CD40途徑表面上與 提供誘導協同性增強的DC活化并由此有效誘導抗原特異性細胞免疫 的TLR和1型IFN信號轉導途徑二者整合(integrated)。為誘發細胞免疫上的協同效應，CD40激動劑、l型干擾素 和抗原(若存在)優選作為單獨(discrete)的多肽部分施用，所述部分
以任一順序單獨施用或彼此同時施用。是否獲得協同作用可通過各種 方式來檢測，例如基于施用條件下樹突狀細胞上的CD70表達的上調。 可選擇地，這些部分可以作為單個多肽融合物或包含這兩種或三種單 獨的本體的結合物施用，或以編碼所述兩種或三種單獨的本體的一種 或多種DNA結合物的形式施用。本發明的后兩個實施方案在以多肽或 DNA為基礎的疫苗的情況下有益，因為潛在地僅僅一種活性劑需要進 行配制并且對需要治療的受試者(例如患有HIV感染或癌癥的個體)施 用。
它們的效力的新型佐劑二滿i這種需要:':些佐劑通常包括至少一種
1型干擾素(優選oc或P人干擾素)、至少一種CD40激動劑(抗CD40抗 體或其片段或可溶性CD40L多肽)和優選至少一種抗原(如腫瘤抗原或 病毒抗原)，其中針對所述抗原期望誘發增強的抗原特異性細胞免疫。 在本發明優選的實施方案中，這些多肽部分將包含于單個多肽結合物 中或將通過核酸構建體編碼，所述構建體在宿主細胞中體外表達后或
合物的表達。 1型干擾素和CD40激動劑(例如激動性CD40抗體)的施用 量包含在組合或共施用中通過誘導樹突狀細胞上的CD70表達和增加 抗原特異性CD8+T細胞數目來產生協同效應的量。理想地，所述劑量不會導致不良副作用如肝毒性，所述肝毒性例如可基于肝轉氨酶水平
進行檢測。就1型干擾素而言，含量可從約1 x 1(^單位的活性(U)至 約lxl(TU、更通常從約l(TU至約10811變化。激動性抗體或CD40L多 肽的含量可從約.OOOOl克至約5克、更通常從約.OOl克至約l克變化。 如上所述，優選的MTD超過0. 3 mg/kg且可在約0. 45 mg/kg至約3 mg/kg的范圍內。如果治療方法涉及抗原的施用，那么這可以以在 約.0001克至約50克、更通常從約.1克至約IO克的范圍內的量施用。 如所述，這些部分可以以相同或不同制劑施用。如果單獨施用，這些 部分可以以任何順序通常在相互的幾小時內，更通常大體上緊鄰及時 施用。如所述，CD40激動劑包括激動CD40/CD40L相互作用的任 何部分。通常這些部分是CD40激動性抗體或激動性CD40L多肽。如所 述，這些抗體包括，例如人抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性 抗體、scFvs、特異性激動CD40/CD40L結合相互作用的抗體片段。更 優選，抗體包含嵌合的、完全人或人源化CD40抗體。人CD40L和其他哺乳動物的CD40L多肽是眾所周知的并且 可得的，包括其可溶性形式、低聚化的CD40L多肽，如最初由Immunex (現在Amgen)報道的三聚化的CD40L。人和鼠科CD40L的序列也是已知 的，并且可商業獲得的(參見上述通過引用并入的Immunex專利)。如 上所述，CD40L劑量通常為至少0. lmg/kg/日、更通常從至少約0. 15 至1. Omg/kg/日。與當CD40L多肽在缺少1型干擾素或TLR激動劑下 施用時相比，選擇MTD以便沒有觀察到不良副作用(如肝毒性)和增加 的肝轉氨酶水平或使它們減至最小或可以忽略不計。如所述，l型干擾素可以是當與CD40激動劑緊鄰施用或組 合施用時誘發細胞免疫上的協同效應的任何1型干擾素或變體或片 段。這樣的干擾素可包括a干擾素、P干擾素、干擾素T(如Tl、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10)、干擾素w 、干擾素s 、干擾素《等，特 別是其變體和片段。這特別包括PEG化干擾素和共有干擾素以及具有 改變的(非天然或無糖基化(aglycosylated))糖基化的干擾素。
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盡管本發明人和別人先前已報道TLR激動劑與抗CD40激動 劑協同作用導致CD8+T細胞免疫的極度增強；但是這些早期研究還未 提出1型千擾素和CD40激動劑(如激動性抗體)也產生細胞免疫上的協 同效應。令人驚奇的是，本發明人已發現CD40途徑與用于誘導DC活 化有效細胞免疫的TLR和1型IFN信號轉導途徑二者整合。此外，這 些早期研究并未揭示CD70在此過程中的作用。由于涉及TLR激動劑/CD4Q激動劑組合的早期研究需要抗 原、TLR激動劑和CD40激動劑的單獨施用，所以早期研究也還未提出 主題DNA或多肽結合物。相比之下，本發明在某些實施方案中提供了 DNA構建體和包含兩個或三個不同部分的兩部分(bipartite)或三部 分(tripartite)多肽或在單個DNA中編碼這些兩個或三個部分的DNA 或多肽分子，例如包含CD40激動性抗體、oc干擾素和抗原的結合物。 這將使其用于預防或治療疫苗用途或用于在治療其中期望增強細胞免 疫的疾病(例如癌癥或自身免疫病癥)中增強細胞免疫的用途簡單化 (因為僅一種分子本體需要以藥學上可接受的形式進行配制與施用)。 這在治療慢性疾病或病癥(其中可能需要大量的佐劑用于有效預防或 治療免疫)的情況下特別有利。組合的IFN/CD40激動劑免疫(僅使用分子試劑)獨特地產 生一定量級的CD8+T細胞反應，所述量級先前僅在用感染性因子激發 后可獲得(Ahonen等，J Exp Med 199:775 (2004))。因此，本發明 提供了抗HIV和其他慢性感染性疾病(包括病毒、細菌、真菌或寄生蟲) 以及增殖性疾病(如癌癥、自身免疫疾病、過敏性病癥和炎性疾病)的 有效疫苗的開發，其中有效的治療需要僅組合的IFN(l型)/CD40激動 劑免疫或上調樹突狀細胞上的CD70表達的其他佐劑組合能產生的細 胞免疫的數量和質量。
發明應用本發明在本文示例了以蛋白質和DNA 二者為基礎的疫苗， 所述疫苗包含下列組合(i)至少一種CD40激動劑，例如激動性抗CD40抗體或CD40L多肽；(ii)任選至少一種靶抗原(例如HIV Gag) 和(iii)至少一種1型干擾素(例如oc干擾素)。HIV Gag40是適當的 模型抗原，因為HIV是其中增強的細胞免疫反應具有顯著的治療潛力 的慢性感染性疾病。然而，本發明包括含有任何抗原的如所述的結合 物的構建，其中針對所述抗原在治療上期望增強的細胞免疫反應。在 優選的實施方案中，至少一種靶抗原包含于含有至少一種l型干擾素 和至少一種CD40激動劑的施用的組合物中，或包含于含有這些部分的 多肽結合物中或由編碼這些部分的DNA結合物編碼。然而，在一些實 施方案中，包含1型干擾素和抗CD40抗體的結合物可與抗原分開單獨 施用，或宿主可自然地接觸抗原。此外，在一些實施方案中所有三個 部分(即抗CD40抗體、1型千擾素和抗原)可以以單獨分離的本體共施 用。優選所有這些部分大體上同時施用以便實現期望的細胞免疫的協 同增強，而沒有不良副作用如肝毒性、靜脈血栓栓塞、細胞因子毒性 和/或頭痛。然而，這些部分可以以誘發導致CD8+ T細胞擴增增強和 誘導在CD8+DC上的CD70表達的細胞免疫上的協同效應的任何順序施 用。示例性抗原包括但不限于細菌、病毒、寄生蟲、變應原、 自身抗原和肺瘤相關的抗原。如果使用以DNA為基礎的疫苗，那么抗 原通常由施用的DM構建體的序列編碼。可選擇地，如果抗原作為結 合物施用，那么抗原通常是包含于施用的結合物中的蛋白質。更進一 步，如果抗原與CD40激動劑和1型干擾素部分分開施用，那么抗原可 采用任何形式。具體來說，抗原可包括蛋白抗原、肽、完全滅活的生 物體等。可用于本發明的抗原的特定例子包括來自甲型、乙型、丙 型或丁型肝炎、流感病毒、利斯特氏菌屬U/Wer/a)、肉毒梭狀芽孢 桿菌(670S"2V/M7 、結核病、土拉菌病、重型天花(天花)、
病毒性出血熱、鼠疫耶爾森菌(鼠疫)、HIV、皰瘆、乳頭瘤病毒的抗原 和其他與感染性因子有關的抗原。其他抗原包括與腫瘤細胞有關的抗 原，與自身免疫病癥、過敏癥和哞喘有關的抗原。這種抗原與主題激動劑組合1型干擾素和抗CD40抗體結合的施用可用于治療性或預防性 疫苗，所述疫苗用于賦予抗這些疾病病癥的免疫。在一些實施方案中，本方法和組合物可通過包括來自感染 性因子的抗原用于治療處于患上感染的危險或患有感染的個體。感染 是指歸因于外源性生物體或在宿主內復制的因子在宿主中的存在的疾
病或病癥。處于患有感染的危險的受試者是易于發展感染的受試者。 這種個體可包括，例如與感染性生物體或因子具有已知接觸或疑似接
觸的受試者。處于患上感染的危險的受試者也包括患有與建立對感染 性因子或生物體的免疫反應的能力受損相關的病癥的受試者，例如患 有先天性或獲得性免疫缺陷的受試者、正經受放射或化療的受試者、 患有燒傷的受試者、患有外傷性損傷的受試者、正經受外科手術或其 他侵入性醫療操作或牙科治療的受試者、或類似免疫受損的個體。可用本發明的疫苗組合物治療或預防的感染包括細菌、病 毒、真菌或寄生蟲。其他不常見類型的感染也包括立克次體 (r/de〃s/ae)、 支原體(/z /co; /smy)和病原體(agents )引起的羊 瘙癢病(scrapie)、牛海綿樣腦病(BSE)以及朊病毒病(例如庫魯病 (kuru)和克雅病(Creutzfeldt-Jacob disease))。感染人的細菌、病 毒、真菌或寄生蟲的例子是已知的。感染可以是急性的、亞急性的、 慢性或潛在的，并且它可以是局部的或全身的。此外，感染可在宿主 中感染性生物體的因子的生活周期的至少一個階段期間主要是細胞內 或細胞外的。可使用主題疫苗和方法對抗的細菌感染包括革蘭氏陰性和 革蘭氏陽性菌。革蘭氏陽性菌的例子包括但不限于巴氏桿菌屬 (戶a"e"re/7s)物種、葡萄球菌屬(57a/ A//ococc/)物種和鏈球菌屬 (&re;7,ococci)物種。革蘭氏陰性菌的例子包括但不限于大腸桿菌 (&c力er/c力/s co//)、假單胞菌屬(Ae"化/z7o/7a力物種和沙門氏菌屬 /邁o/ e/7a)物種。感染性細菌的特定例子包括但不限于幽門螺桿菌 (〃e7/幽"er /7/7or/'力、布氏疏螺旋體(5orre"a 6w,^/c r/er/)、 嗜肺性軍團病菌Ue《/o/2e/7a jW7e咖o/7力27/a)、 分枝桿菌屬U(FCo6acfer/s)物種(例如結核分枝桿菌(# "6eT"Cw7oi /力、鳥分枝 桿菌(#. <37/咖)、胞內分枝桿菌(#. //2"ace////are)、堪薩斯分枝 桿菌(￥. i:a/7sa〃)、戈登分枝桿菌(M ^ /^o/3fle))、金黃色葡萄球菌 (iYfl/ / /70coccw5" (3盯eiAy)、 淋病奈瑟氏球菌 (iye/5^e"'a 《0/7orr力oeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(;Ve/^e"'fl /z e/7//7^7〃？/s)、單核 細胞增生利斯特氏菌U/"er/s邁o/7oc/f oge/7e")、酉良膿鏈球菌 (S"一ococcf/s / /o，es) (A 組鏈球菌屬)、無乳鏈球菌 (iYre;^ococci^ s^s/sc〃se) (B組鏈球菌屬)、鏈J求菌屬(草綠色組)、 糞鏈球菌 (5Yre;^cocci^尸aeca7/5")、 牛鏈球菌("re/^ococci/s 6o"51)、 鏈球菌屬(Streptococcus) (aenorobic spp.)、肺炎鏈球 菌(5Yre/^ococc"s /7/ ewz7o;3/ae)、 病原性彎曲桿菌屬0 a Moge/n'c C<3/z /j//o^3"er)物種、腸球菌屬(A/^erococcM)物種、流感嗜血桿菌 (/^ey77o;7/ /7i/51 2'/ /7we/7zae)、 炭癥芽抱軒菌(^3c/7/ys <2/7f力yac/i0 、 白喉棒桿菌 (Cor// e6<s"er2'M7 ^//^Aeri'se)、 棒狀桿菌屬 (Car//7e6<sc^W"y77)物種、豬紅斑丹毒絲菌(AiT^/pe/o^r/i /"力"5^o; "力/e)、產氣莢膜梭菌(C/o5^r/fZ/wz7 per尸W/7ge/7i0 、破傷風 梭菌("o"r油'"/T7 r"a/ /)、產氣腸桿菌(紐ero6a"er aerogenes)、 肺炎克雷伯氏菌(f/e^/e/7a p/7ewz o/7/'ae)、 多殺巴斯德氏菌 (尸a"eyre"a /Z7i/"(9c油)、類桿菌屬C5a"ero2Ve力物種、具核梭 ^f干菌(尸〃so6acfer/wz7 /3￡/c/eafM7)、念珠狀鏈軒菌(i7rej^o6ac/7/i/s /wo" / 7 /尸or/z72' s)、梅毒密螺旋體(7"re/ o/7e歷a / / /f/w邁)、極細密螺 體(rre/7one邁a perfe/2f/e)、鉤端蟲累旋體屬Ue/^os/72'/s)、立克》欠氏體 屬0 i'de"Wa)和衣氏放線菌(/4c〃/ o/n7ces /srae/")。引起人類感染的病毒的例子包括但不限于逆轉錄病毒科 (Retroviridae)(例如人類缺陷性病毒，如HIV-1(也稱為HTLV-III) 、 HIV-II、 LAC或IDLV-III/LAV或HIV-III以及其他分離抹，如 HIV-LP)、小RNA病毒科(尸/c^r77aw'r/c^e)(例如脊髄灰質炎病毒 (; 0"諮X 甲型肝炎、腸道病毒(eWeror/riAyes)、人類柯薩奇 病毒(力i/歷a/7 Corsacir/e y/rwses)、 鼻病毒(/"力y; 07/rwses)、 艾柯病
30毒(ec/ c^/riAse力)、杯狀病毒科(Cfl/Wr/cTae)(例如導致胃腸炎的 菌林)、披膜病毒科(7b^s (例如馬腦炎病毒(e《"/力e
e/ ce; 力a7/〃s Wrwses)、 風滲病毒(/i/6e"a 7/r^e力)、黃病毒科 (Flaviviridae)(例如登革病毒(^/7^/e r/ri/ses)、 腦炎病毒 (e/2cep力a/"/s y/ri/ses)、 黃熱病毒(/e7/cw ,eyer "'rwse51))、 冠 狀病毒科(Coro"a"'r油e)(例如冠狀病毒(coronaviruses))、彈狀病 毒甘牛(j 力a6(/on'ryc/ae)(夯寸^口 ；K 5包'I"生孑L病毒Oes/cw7ar sfo/z7a^ F7.ri/i"es0 、 狂犬病毒 (ra6/es "'了t^es))、纖絲病毒科 (尸/7oK/r/c^e)(<列i口依》皮^立病毒(A6o/a n'ri/ses))、 副點病毒科 (尸ars/z7/義o7/r/cfae)(例i口副；危感病毒(para /力/7i/e/7zs Writes)、凡恩 腺炎病毒O,s "'r"se力、麻滲病毒(/z ea57es K/rw力、呼吸道合胞 病毒 (re，'r"o/y s/z c/〃a/F/'ri/s))、正勦病毒科 (。rf力o/z77iow'r/^ae) 0f列i口5危感病毒(//7/7ye/7za r/ri/seiO)、 布尼亞 病毒考牛e)(<列i口 、漢Jt旦病毒(y^ /aa/ 7/r〃5"e力、布尼亞病 毒Oi7"ga "'r^e力、白蛉熱病毒(/7力/eo6c^/ri^e5^和yVa/ro病毒))、 沙4立病毒牙牛Ure/za "'r/dae)(出血熱病毒(力e范orr力(S^7c 尸e7er y/r^e力)，呼腸孤病毒科Weor/r/Vae)(例in呼腸病毒 (/eoy/,i/5^))、環狀病毒(0r62'K2.ri/ses)、輪狀病毒(>由7/rMe力)、 雙RNA病毒科("/邁ae)、嗜肝DNA病毒科(T7epactea 7/WcTae)(乙 型肝炎病毒)、細小病毒科(Parvoviridae)(細小病毒 (/7ar^^yrzAye力)、乳多空病毒科(戶a/70M7/r/c^e)(乳頭瘤病毒 (/ a/ y"o則 Wri/5^)、 多瘤病毒(/^//0邁<2 r/'riAye力)、腺病毒科 (Jcfe刀o"V/^ge)(腺病毒 (flde/2,'/VA^))、皰滲病毒科 (/fei7 ey/r7tfae)(例:i口單純痕滲病毒(力er/7es si邁/7/e" K/rw《)(HSV) I 和 II、 水痘帶狀皰滲病毒(yar/ce"fl zo"er r/ri/力、痘病毒(/ clt "r,s))和虹彩病毒科(/r油r/r!Vae)(例如非洲豬瘋病毒 U尸,/ca/2頻'/7e尸e, y/_ri/s))和未分類病毒(例如海綿狀腦病的致 病因子(etiologic agents)、 丁型肝炎的因子、非甲型非乙型肝炎的 因子(l類腸道傳播；2類胃腸外傳播如丙型肝炎)；諾沃克(Norwalk)及相關的病毒和星狀病毒U"/w/z^e力)。真菌的例子包括曲霉菌屬G^; er^7/i^)物種、粗球孢子菌 (Cocc2'd(97Ves /邁yz /〃s)、新型隱球菌(Ciy/^ococci/s / eo尸or邁a/7i0 、 白色念珠菌(Ca/^/cTa a/6/ca/7力及其他念珠菌屬物種、皮炎芽生菌 (5/a"咖/c" der邁"油'力、莢膜組織胞漿菌 W"o/ /am3 ca戸w/a f咖)、沙目艮衣原體(C力/諸/d/a 〃力、諾卡氏菌屬
(vVoc<srfi!7<s)物種和卡氏肺孑包子蟲(戶/2ei/邁oc7"、 car2'"http://)。寄生蟲包括但不限于血源性和/或組織寄生蟲，如田鼠巴貝 蟲(觸es/a邁/cro〃)、分歧巴貝蟲(5由"'d/離,力、溶組織內 阿米巴(f/^咖oe6a力/"o7/〃ca)、藍氏賈第蟲(67sr^ 7s/z7W/s)，熱 帶利什曼原蟲Ue/s力鵬/7/a "0;7ycs)、利什曼原蟲屬Ue/s力鵬"/a)物 種、巴西利什曼原蟲"e2、力邁a/7/a ^az/Z/e/zs/s)、杜氏利什曼原蟲 Ue/s力/z7a/72'a dw70Kcto/)、 惡寸生癡原蟲(■P/as/z/od/wz/尸a/c/; arwz7)、 三 日癡原蟲(/7as/z7od/wz7 /z a/sr/ae)、 卵形癡原蟲(戶/as7z oc^'"yz7 ora/e)、 間日癡原蟲(/Vas/zwd/wz 、岡'J地弓形蟲(7b義0;7/S57Z7(3 g0/^//)、
岡比亞錐蟲(7y/;7s/ oso/z/a ^ayz 6/e/^e)、 羅德'西亞錐蟲(rr//7 s/2C^cw<3 r力c^e"'e/^e)(非洲睡眠病)、克式錐蟲(77777a/ oso/z7a cr〃z/)('洽力口 斯病(Chagus， disease))和岡'J地弓形蟲(7b;ro/7/(gs/77a go/2tf//)、 扁蟲 (flat worms)和蟲回蟲(round worms)。如所述，本發明包括主題協同組合或包含或編碼這種協同 組合的蛋白質或DM結合物在治療增殖性疾病如癌癥中的用途。癌癥 是不受控制的妨礙身體器官和系統的正常功能的細胞生長的病癥。患 有癌癥的受試者是具有客觀可測量的存在于受試者機體內的癌癥細胞 的受試者。處于發展癌癥的危險中的受試者是易于發展癌癥(例如基于 家族史、遺傳傾向)的受試者、接觸放射或其他引起癌癥的試劑的受試 者。從其原先部位遷移并且接種重要器官的癌癥可通過受影響器官的 功能退化最終導致受試者的死亡。造血性癌癥(如白血病)能竟爭得過 受試者的正常的造血室，因此導致造血衰竭(以貧血癥、血小板減少癥 和中性粒細胞減少癥的形式)，最終導致死亡。
轉移是不同于原發性肺瘤部位的癌細胞的區域，由癌細胞 從原發性腫瘤散布至身體的其他部分產生。當診新原發性肺瘤實體的 時候，可針對轉移的存在對受試者進行監控。除了監控特定癥狀之外， 經常通過磁共振成像(MRI)、計算機斷層攝影術(CT)、掃描、血液和血 小板計數、肝功能研究、胸部X射線和骨掃描的單獨或組合使用，檢 測轉移。本發明的組合物、蛋白質結合物和DNA疫苗可通過包含肺 瘤相關抗原(TAA)或編碼其的DNA用于治療多種癌癥或處于發展癌癥 (包括表達和不表達CD40的癌癥)的危險中的受試者。這是在腫瘤細 胞中表達的抗原。這種癌癥的例子包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵 巢癌、宮頸癌、皮膚癌、黑素瘤、結腸癌、胃癌、肝癌、食道癌、腎 癌、咽喉癌、甲狀腺癌、胰腺癌、睪丸癌、腦癌、骨癌和血癌(如白 血病、慢性淋巴細胞性白血病)等。本發明的疫苗接種方法可用于刺 激免疫反應以通過抑制或延緩胂瘤的生長或減少腫瘤的大小來治療腫 瘤。腫瘤相關抗原也可以是主要(但不限于)由腫瘤細胞表達的抗原。其他的癌癥包括但不限于基底細胞癌、膽道癌、膀胱癌、 骨癌、腦和中樞神經系統(CNS)癌、宮頸癌、絨毛膜癌、結腸直腸癌、 結締組織癌、消化系統癌、子宮內膜癌、食道癌、眼癌、頭頸癌、胃 癌、上皮內腫瘤、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌(小細胞、大細胞)、淋巴 瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)；黑素瘤；神經母細胞瘤； 口腔癌(例如唇、舌頭、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；視網膜母細胞瘤； 橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統癌；肉瘤；皮膚癌；胃癌；睪丸癌； 甲狀腺癌；子宮癌；泌尿系統癌；以及其他癌和肉瘤。本發明的組合物、蛋白質結合物和DNA也可用于治療自身 免疫疾病，如多發性硬化癥、類風濕性關節炎、1型糖尿病、牛皮癬 或其他自身免疫病癥。潛在地能用本發明的疫苗和免疫佐劑治療的其 他自身免疫疾病包括克羅恩氏病和其他炎性腸疾病(如潰瘍性結腸 炎)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫腦脊髓炎、重癥肌無力(MG)、 橋本曱狀腺炎、肺出血腎炎綜合征(Goodpasture's syndrome)、天皰
33瘡、格雷夫斯病(Graves disease)、自身免疫性溶血性貧血、自身免 疫性血小板減少性紫癜、具有抗膠原抗體的硬皮病、混合性結締組織 病、多發性肌炎(polypyositis )、惡性貧血、自發性阿狄森氏病 (Addison's disease)、自身免疫相關的不孕癥、腎小球腎炎(例如新 月體性腎小球腎炎、增殖性腎小球腎炎)、大皰性類天皰瘡、干燥綜合 征(Sjogren's syndrome)、銀屑病關節炎、胰島素耐受性、自身免疫 糖尿病(l型糖尿病；胰島素依賴性糖尿病)、自身免疫性肝炎、自身 免疫性血友病、自身免疫性淋巴增生綜合征(ALPS)、自身免疫性肝炎、 自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴增生綜合征、自身免疫性葡萄膜 視網膜炎和格林-巴利綜合征(Guillain-Bare syndrome)。近來，動脈 硬化和阿爾茨海默病已經公認為自身免疫疾病。因此，在本發明的實 施方案中，抗原是自身抗原，其中針對所述抗原宿主誘發不必要的促 進組織破壞和正常組織損傷的免疫反應。本發明的組合物、蛋白質結合物和DM疫苗還可用于治療 哞喘和過敏性疾病和炎性疾病。哞喘是呼吸系統病癥，其特征在于
(但不限于)與特應性或過敏性癥狀相關。過敏癥是對物質(變應原)的 后天性超敏反應。過敏性病癥包括濕滲、過敏性鼻炎或鼻炎、花粉熱、 支氣管哮喘、蕁麻滲和食物過敏癥以及其他特應性病癥。變應原是可 在易感性受試者中誘導過敏性或哞喘反應的物質。存在很多變應原， 包括花粉、昆蟲毒液、動物皮屑、粉塵、真菌孢子和藥物。天然和植物變應原的例子包括特異于下列屬的蛋白質犬 屬、表皮螨屬(Dermatophagoides)、貓屬、豕草屬(Arabrosia)、黑麥 草屬(Lotium)、柳杉屬(Cryptomeria)、鏈格孢屬(Alternaria)、榿 木屬(Aider)、赤楊屬(Alinus)、樺木屬(Betula)、櫟屬(Quercus)、 木犀欖屬(01ea)、蒿屬(Artemisia)、車前屬(Plantago)、墻草屬 (Parietaria)、小蠊屬(Blatella)、蜜蜂屬(Apis)、柏屬(Cupressus)、 檢屬(Juniperus)、金鐘柏屬(Thuya)、扁柏屬(Chamaecyparis)、 大 蠊屬(Periplanet)、冰草屬(Agopyron)、黑麥屬(Secale)、小麥屬(Triticum)、鴨茅屬(Dactylis)、羊茅屬(Festuca)、早熟禾屬(Poa)、 燕麥屬(A織a)、絨毛草屬(Holcus)、黃花茅屬(Anthoxanthum)、燕 麥草屬(Arrhenatherum)、剪股穎屬(Agrostis)、梯牧草屬(Phleum)、 藤草屬(Phalaris)、雀稗屬(Paspalum)、高梁屬(Sorghum)和雀麥屬
(Bromis)。應理解，本發明的組合物、蛋白質結合物和DNA疫苗可與 其他用于治療特定病癥(如感染性疾病、癌癥或自身免疫病癥)的療法 組合。例如在癌癥的情況下，本發明方法可與化療或放射療法組合。制備作為疫苗的組合物的方法為本領域技術人員所公知。 蛋白質結合物或DNA的有效量不但可憑經驗確定，而且可以以在動物 模型中的免疫有效量為根據。應考慮的因素包括抗原性、制劑、施用 途徑、施用的免疫劑量的數量、個體的身體健康狀況、體重和年齡等。 這類因素為本領域技術人員所公知，并且可由本領域技術人員確定(參 見，例如Paoletti和Mclnnes編輯,Vaccines, from Concept to Clinic: A Guide to the Development and Clinical Testing of Vaccines for Human Use CRC Press (1999))。如本文所乂>開，應理 解，主題DM或蛋白質結合物可單獨施用或與其他佐劑結合施用。此 外，主題佐劑可添加至現有疫苗或與其結合施用以增強它們的效力。 例如，這些佐劑可用于增強病毒疫苗(如最近批準的用于宮頸癌的HPV 疫苗)的效力。它們也可與其他佐劑組合。本發明的DNA和蛋白質結合物可通過本領域已知的任何方 法局部或全身施用，所述方法包括但不限于肌內、靜脈內、皮內、皮 下、腹膜內、鼻內、口服或其他膜途徑。其他的途徑包括顱內(例如 腦池內或室內)、眶內、眼、嚢內、推管內和局部施用。本發明的佐劑 和疫苗組合物可以在適當的非毒性藥物載體中施用，或可以在微嚢或 持續釋放的植入物中配制。本發明的免疫原性組合物可多次施用(若需 要)以維持期望的細胞免疫反應。適當的途徑、制劑和免疫時間表可由 本領域技術人員確定。在本發明的方法中，一些例子的抗原和1型IFN/CD40激動劑結合物可單獨施用或組合在相同的制劑中。在一些例子中，包括若 干抗原可能是有用的。這些組合物可單獨施用或以實現期望的細胞免 疫協同增強的任何順序組合施用。通常，這些組合物在相互的短時間 內，即在相互的約幾天或幾小時內、更通常在約半小時至1小時內施 用以促進治療方案。在一些例子中，在結合物或DNA中包括促進親和純化的部 分可能是有益的。這種部分包括相對小的分子，其不會干擾結合物中 多肽的功能。可選擇地，標簽可通過裂解去除。這類標簽的例子包括 多組氨酸標簽、血凝素標簽、麥芽糖酶結合蛋白、凝集素、谷胱甘肽 -S轉移酶、抗生物素蛋白等。其他適合的親和標簽包括FLAG、綠色焚 光蛋白(GFP) 、 myc等。主題佐劑組合和蛋白質或DNA結合物與生理上可接受的載 體如生理鹽水一起施用。組合物也可包括另一種栽體或賦形劑，如緩 沖劑(例如檸檬酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽和碳酸氫鹽)、氨基酸、尿素、 醇、抗壞血酸、磷脂類、蛋白質(如血清白蛋白)、乙二胺四乙酸、氯 化鈉或其他鹽、脂質體、甘露醇、山梨醇、甘油等。本發明的試劑可 根據相應的施用途徑以各種方法配制。例如可制備液體制劑用于攝取 (ingestion)或注射，可制備凝膠或程序(procedure)用于攝取、吸入 或局部應用。用于制備這些制劑的方法眾所周知的，并且可參見例如 "Remington's Pharmaceutical Sciences," 第 18 版， Mack Publishing Company, Easton Pa。如所述，本發明包括以DM為基礎的疫苗。這些DNA可以 以棵露DNA施用，或可包含在表達栽體中。此外，主題核酸序列可在 移植物的移植之前引入至移植物的細胞中。這種DNA優選是人源化的 以促進在人受試者中的表達。主題多肽結合物可進一步包括"標記(marker)"或"報告子 (reporter)"。標記或報告子分子的例子包括P內酰胺酶、氯霉素乙酰 轉移酶、腺苷脫氨酶、氨基糖苷磷酸轉移酶、二氫葉酸還原酶、潮霉 素B-磷酸轉移酶、胸苷激酶、lacZ和黃噪呤鳥噪呤磷酸核糖基轉移酶等。主題核酸構建體可包含于能指導其表達的任何載體中，例 如用載體轉導的細胞。由于發明人具有非常多的使用桿狀病毒載體的 經驗，他們在本文示例了這種栽體。可使用的其他載體包括在細菌中 使用的以T7為基礎的栽體、酵母表達栽體、哺乳動物表達載體、病毒 表達載體等。病毒栽體包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關的載體、皰 滲病毒、猿猴病毒40和牛乳頭狀瘤病毒栽體。
例如孩i生物、才直物和動物細月包，例如原核生物(prokaryote) ， do大腸 桿菌、枯草芽孢桿菌等；昆蟲細胞，如Sf21細胞；酵母細胞，如酵母 菌屬、念珠菌屬、克魯維酵母屬、裂殖酵母菌屬 (Schizzosaccharomyces )和畢赤酵母菌屬；以及噴乳動物細月包，6口 COS、 HEK293、 CHO、 BHK、 NIH 3T3、 HeLa等。本領域技術人員可容易 地選擇適當的用于特定表達系統的組份，所述組分包括表達栽體、啟 動子、選擇標記以及適于期望細胞或生物體的類型。各種表達系統的 選擇和使用可參見例如Ausubel等，"Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley和Sons, New York, N.Y. (1993); 以及Pouwels等，Cloning Vectors: A Laboratory Manual", 1985 Suppl. 1987)中。還提供了包含并且表達主題DNA構建體的真核細胞。
在細胞移植的情況下，細胞可通過移植程序或用導管介導 的注射程序通過血管壁來施用。在一些情況下，細胞可通過釋放進入 脈管系統來施用，細胞隨后從所述脈管系統通過血流分布和/或遷移進 入周圍組織。主題多肽結合物或DM構建體包含或編碼激動性抗CD40 抗體或CD40L或其片段，所述片段特異性結合或激動CD40和CD40L 的結合，優選鼠科或人CD40。從廣義上看，本文所用的術語"抗體，'用 于包括多克隆和單克隆抗體以及其抗原結合片段。這包括，例如Fab、 F(ab0 2、 Fd和Fv片段。此外，術語"抗體"包括天然抗體和非天然存在的抗體如單
37鏈抗體、嵌合抗體、雙功能和人源化抗體。優選用于本發明的是嵌合、
人源化和完全人抗體。用于合成嵌合、人源化、CDR嫁接的、單鏈和 雙功能抗體的方法為本領域技術人員眾所周知。此外，特異針對CD40 的激動性抗體是廣為人知的且可獲得的，并且可以通過用CD40抗原 (優選人CD40)免疫適合的宿主來制備。抗鼠CD40抗體(FGK45)的使用在實施例中示例。選擇這種 抗體，是因為抗人CD40抗體不會特異性結合鼠科CD40并且體內研究 使用嚙齒動物。在人治療的情況下，所選的激動性CD40抗體特異性結 合人CD40。特異針對人CD40的激動性CD40抗體在本領域中也是已知 的，并且可通過已知方法來制備。可選擇地，CD40激動劑可包含CD40L 的片段或包含前述的融合蛋白，其激動人CD40與CD40L的相互作用。如所述，本發明的協同組合包含至少一種1型干擾素或其 片段或變體，所述片段或變體與CD40激動劑協同作用以誘導在CD8+ DC上的CD70表達并且誘發體內CD8+T細胞的有效擴增。這包括，例 如oc干擾素、(3干擾素、co千擾素、T千擾素、^干擾素和e干擾素 等以及其功能性變體和片段。應理解，在本文提供的本發明定義內也提供了不會實質上 影響本發明各種實施方案的活性的變更。
發明人的理論如上所述，迄今測試的所有TLR激動劑與抗CD40協同作用 誘導CD8+T細胞免疫。但是，觀察到一些TLR激動劑/抗CD40組合(對 于TLR 3、 7、 9)展示為增強CD8+ T細胞擴增對I型干擾素(IFNct p) 有極大的依賴性，而其他TLR/CD40激動劑組合(對于TLR2和5)則沒 有。令人驚奇的是，CD4細胞的缺失消除了來自TLR3-或-7/CD40激動 劑組合的產生008+ T細胞反應的IFNoi P需求。這些數據共同地向發 明人表明在組合的TLR/CD"激動劑免疫后IFNoc 0和CD4細胞在調節 CD8+ T細胞反應中的作用。基于這些觀察，發明人猜測DC上的TNF配體的誘導依賴于 或獨立于IFNa卩，且這決定了隨后CD8+ T細胞反應對IFNct P的依賴性。因為可通過CD4缺失恢復IFNot 0依賴性008+ T細胞反應，所 以猜測通過調節T細胞負面影響CD70在DC上的表達或CD8+ T細胞反 應。因此我們提出了一個機制，藉此，在組合的TLR(3、 7或9)/CD40 激動劑免疫后，IFNoc P通過完成一種或多種下列功能來影響CD8+ T 細胞反應i)直接擴增對含有CD70的APC的CD8+T細胞反應(CD8 T 細胞中心)；ii)直接活化DC以表達TNF配體(DC中心)；iii)抑制 抗APC TNF配體表達或CD8+ T細胞擴增的調節CD4+T細胞活性(Treg 中心)。與抗CD40的在誘導CD8+ T細胞擴增中的協同活性是所有檢測 的TLR激動劑的特性，所述TLR激動劑目前包括TLR1/2、 2/6、 3、 4、 5、 7和9的激動劑。這些數據共同地證實了組合的TLR/CD40激動劑 免疫可重建所有必需的信號以誘發有效的初級008+ T細胞反應。為確定TLR和CD40之間協同作用的細胞和分子需求，通過 阻斷或用抗體缺失在敲除小鼠和/或缺失各種細胞類型或因子的小鼠 中進行很多實驗。這些研究證實了完整的CD40和TLR信號轉導途徑的 必要性(使用CD40KO和MyD88KO小鼠)。盡管這種協同作用不依賴于 CD4細胞、IFNy、 IL-12或IL-23，但是觀察到協同作用對IFN ot 0的 可變的依賴性取決于所用的TLR激動劑。Ahonen， C. L. ， C. L. Doxsee， S. M. McGurran， T. R. Riter， W. F. Wade， R. J. Barth， J. P. Vasilakos， R. J. Noelle和R. M. Kedl. 2004. Combined TLR and CD40 triggering induces potent CD8+ T cell expansion with variable dependence on type I IFN / ~射199:775。觀察到 對IFNcc P的依賴性程度似乎與給定的TLR誘導IFNot |3的量相關。因 此，用抗CD40與TLR 3、 7或9的激動劑組合免疫的IFNoc P受體敲 除(IFNot PR KO)小鼠未能產生CD8+ T細胞反應。相反地，用抗CD40 與TLR 2或5的激動劑組合免疫的IFNoc P R K0小鼠確實產生CD8+ T 細胞反應。如在隨后的實施例中所示，這些數據向發明人表明IFNoc P潛在地可能在產生適應性免疫中起遠大于先前所認識的作用。在開始時，應強調IFNa P在產生T細胞反應中的精確作 用很難預測與闡明。這種困難部分是由于IFNa P對T細胞功能的很多影響似乎是間接的。IFNot P增強了 APC活化的很多方面，包括MHC 分子在大多數細胞類型上的提高。Tough, D. F. 2004. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Zei/ir Z戸/7力o邁a 45:257; Le Bon, A.和D. F. Tough. 2002. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Cii〃 一./ J/zm //7o7 14:432. 最 近，已顯示IFNa P促進外源性抗原的APC加工進入I類途徑-稱為 交叉敏化(cross-priming)的過程。Le Bon， A. ， N. Etchart， C. Rossmann， M. Ashton， S. Hou， D. Gewert， P. Borrow和D. F. Tough. 2003. Cross- priming of CD8+ T cell stimulated by virus-induced type I interferon. 組/邁羅o/ 4:1009. 這允許在施用夕卜源性蛋 白抗原后產生CD8+ T細胞反應。IFNcc P也對T細胞活化和增殖有其 他的影響。高水平的IFNoc P也誘導幼稚CD8 T細胞的部分活化以及 記憶性CD8 T細胞的增殖。Tough, D. F" S. Sun， X. Zhang和J. Sprent. 1999. Stimulation of naive and memory T cell by Cytokines. T/zmzmo/化k 170:39; Sprent, J. , X. Zhang， S. Sun 和D. Tough. 2000. T-cell proliferation in vivo and the role of cytokines.池7os 7Ya/7s A Soc Zo/ cT ^腸/ S". 355: 317; Sprent, J. 2003. Turnover of memory-phenotype CD8+ T cell, l/crc^es1 5: 227; Zhang, X. ， S. Sun， I. H訓g， D. F. Tough和J. Sprent. 1998. Potent and selective stimulation of memory-phenotype CD8+ T cell in vivo by IL-15. /順隨？/ 8:591; Tough, D. F. 和J. Sprent.1998. Bystander stimulation of T cell in vivo by cytokines, 「et /邁邁w3oJ /邁/HW3o; "力o7 63:123。 IFNoc P對幼稚T細胞的影響可部分通過APC介導，盡管 IFNcc P直接刺激幼稚T細胞存活。Marrack， P. ， J. Kappler和T. Mitchell. 1999. Type I interferons keep activated T cell alive. / ^r; 189: 521; Marrack, P. ， T. Mitchell, J. Bender, D. Hildeman, R. Kedl， L Teague和J， Kappler. 1998. T-cel 1 survival.
40//腳M^ 165: 279。這種存活活性依賴于T細胞中的STAT1，表明 必須涉及T細胞中的直接IFNoc P信號轉導。Marrack， P. ， J. Kappler 和T. Mitchell. 1999. Type I interferons keep activated T cell alive. / ^r; #ed 189: 521。最近，已經顯示IFNcx直接作用于幼稚 CD8+ T細胞(與抗原和B7介導的共刺激相呼應)以促進增殖、效應子功 能和^己憶的發展。Curtsinger， J. M. ， J. 0. Valenzuela， P. Agarwal， D. Lins和M. F. Mescher. 2005。 I型IFN提供了對CD8 T細胞的第三信號以刺激克隆擴增 和分化。/7/m7"/2o/ 174: 4465。相比之下，別人已證實IFNoc |3對CD8+ 記憶性T細胞的增殖的影響是間接的。這種增殖通過從其他細胞類型 產生IL-15而發生，并且選擇性誘導記憶性CD8而不是CD4 T細胞的 增殖。Zhang, X. ， S. Sun， I. H薩g， D. F. Tough和J. Sprent. 1998. Potent and selective stimulation of memory-phenotype CD8+ T cell in vivo by IL-15. /卿m/0" 8: 591; Sprent， J. ， X. Zhang, S. S叫和D. Tough. 1999. T-cell turnover in vivo and the role of cytokines. /邁/z Mo/丄e〃 65:21。因此，在T細胞活化和增殖的 啟動中，已經觀察到IFNa P對T細胞的間接和直接影響。相比之下，關于I型IFN對調節T細胞的發展和功能的影 響的數據極少。 一份報告證實使用IFNoc和IL-10的組合可體外產生 人調節細胞。Levings， M. K. ， R. Sangregorio， F. Galbiati， S. Squadrone， R. de Waal Malefyt和M. G. Roncarolo. 2001. IFN-a and IL-10 induce the differentiation of human type 1 T regulatory cells. / /邁則/70/ 166:5530。如上文所述，且由遵循以下發明性發現的實施例中的數據 支持1型干擾素和CD40激動劑組合誘發細胞免疫上的協同效應并且 上調樹突狀細胞上的0070并且提供008+ T細胞的指數擴增，允許更 有效的對抗某些疾病的疫苗的開發，所述疾病的治療似乎需要主題新 型佐劑組合誘發的細胞免疫的數量和質量。
出于示例的目的，提供下列實施例。但是應理解，本發明 的范圍由權利要求確定。
在某些下列實施例中使用的材料與方法C57BL/6、 IFNoc卩R K0或CD4缺失的IFNot P R KO小鼠用 模型抗原免疫。簡要來說，與TLR激動劑(50 ug Pam3Cys、 25 yg MALP-2、 100 jugPolyIC、 150 jag 27609、 50 MgCpG 1826或25 m g鞭毛蛋白)、抗CD40抗體FGK45 (50 iag)或兩者組合，i.p.注射 0. 1-0. 5 mg全蛋白(卵清蛋白或HSV糖蛋白B[HSVgB])或50 ug肽(對 于卵清蛋白為SIINFEKL,對于HSVgB為SSIFFARL，對于痘苗病毒B8R 為TSYKSEFV)。卵清蛋白購自Sigma Corporation (St. Louis, M0), 并且如前所述，使用TritonX-114 LPS解毒方法學去除污染的LPS。 Adam, 0. ， A. Vercellone， F. Paul, P. F. Mo證n和G. Puzo. 1995. A nondegradative route for the removal of endotoxin from exopolysaccharides, j/m/ A/ocAe/w 225: 321。 i口前,斤述并由賓西'法 尼亞大學的Dr. Roselyn Eisenberg友好提供，全HSVgB蛋白通過在 桿狀病毒中表達和在鎳柱上純化來制備。Bender, F. C， J. C. Whitbeck, M. Ponce de Leon, H. Lou， R. J. Eisenberg和G. H. Cohen. 2003. Specific association of glycoprotein B with lipid rafts during herpes simplex virus entry. / K/ro/ 77: 9542。 所用的TLR 激動劑如通過材料運送協議(27609-3M Pharmaceuticals)提供的購買 (Pam3Cys-InVivogen、 MALP-2-Alexis Biochemicals 、 PolylC-Amersham/GE Healthcare、 CpG 1826-Invitrogen)，或內部 合成(鞭毛蛋白)。已經通過Limulus測定法針對LPS污染測試每種TLR 激動劑，并且發現體內注射量的LPS活性少于5 IU(約50-300 ng)。 注射這種量的LPS對體內脾樹突狀細胞沒有可觀察到的影響(數據未 顯示)。在內部分離的鞭毛蛋白的情況下，使用如上所迷的用于卵清蛋 白解毒的相同方案去除污染的LPS。選擇這些TLR激動劑用于我們的實驗出于兩個主要原因。 其一，次級淋巴組織中的主要DC亞群是CD8 +和CDllb + DC，且它們表達共同的和獨特的TLR。所選的TLR激動劑直接刺激CD8+ DC (PolylC-TLR3) 、 CDllb+ DC (27609-TLR7和鞭毛蛋白-TLR5)或兩種DC 亞群(Pam3Cys/MALP-2、 TLR2刺激)。其二，所選的分子代表與抗CD40 組合用于誘導008+ T細胞反應的TLR激動劑，所述激動劑為IFNoc P 依賴性(polyIC、 27609 、 CpG 1826)或IFN ct P不依賴性(Malp-2、 Pam3Cys、鞭毛蛋白)。在有或沒有阻斷CD70(FR70)、 OX40L/CD134 (RM13札)或 41BBL/ CD137L(TKS-l)的抗體的共施用下，進行所述的免疫。每2天 i. p.施用250 ug抗體足以阻斷這些配體/受體相互作用的各種相互作 用(參見圖5)。使用這種方案進行阻斷實驗，之后類似的實驗用于確 定產生對CD8+ T細胞反應的影響(如果有)所必需的阻斷抗體的最小 量。為了監控抗原特異性CD8+T細胞反應，免疫后5-7天，將 外周血和/或脾細胞分離，并且如先前所述用H-2KVSIINFEKL或 H—2Kb/SSIFFARLMHC四聚體染色。Kedl， R. M. ， M. Jordan, T. Potter, J. Kappler, P. Marrack和S. Dow. 2001. C詣stimulation accelerates deletion of tumor-specific CD8 (+) T cell in the absence of tumor-antigen vaccination, 尸roc yVa〃 Jcad 5W ^4 98:10811; Kedl， R. M. ， W. A. Rees， D. A. Hildeman， B. Schaefer， T. Mitchell, J. Kappler和P. Marrack. 2000. T eel 1 Compete for Access to Antigen—bearing Antigen-presenting Cells, /. ^r; . Afed. 192:1105; Kedl， R. M. ， B. C. Schaefer, J. W. Kappler和P, Marrack. 2002. T cell down-modulate peptide-MHC complexes on APCs in vivo. 3: 27。通過作為細胞的效應子細胞因子產生能力的指示劑(indicator) 的細胞內干擾素Y(IC IFNy)染色，分析CD8+T細胞。IC IFNy染色 已在文獻中廣泛利用，且如所述進行。此外，作為抗原特異性溶解功 能的指示，分析抗原刺激后的CD107a表達。CD 107a (LAMP-1)是溶解 顆粒(lytic granule)的膜蛋白成分，并且抗原刺激后其在T細胞的質 膜上的識別是溶解顆粒的胞吐作用的指示。如先前所述進行組合的四
43聚體和CD107a染色。簡要來說，在37。C下用MHC四聚體溫育細胞30 分鐘。然后加入抗原性肽(l ug/ml)和抗CD107a- FITC抗體持續一個 小時，之后由于抗體結合的CD107a內化至溶酶體，將1 ug/ml莫能 菌素(monensin)加至細胞以抑制FITC熒光的破壞。在37。C下將細胞 再溫育3-4小時，用抗CD8的抗體染色，沖洗，固定并且用FACS分析。 如上所述，在組合的TLR2-或-5/CD40激動劑免疫期間IFNcc PR KO 小鼠同樣地用CD70、 41BBL、 OX-40L和CD30L的阻斷抗體注射。CD8+T 細胞反應的量級和功能通過如上所述的四聚體和IC IFNy染色以及 PBL和/或脾細胞的FACS分析來測定。為了測定初次免疫期間TNF配體對記憶性CD8+ T細胞的發 展的阻斷的影響，使免疫小鼠休息至少60天，用相同免疫再激發，且 如上所述分析次級反應。在IFNoc (3RK0小鼠、CD4缺失的IFNoc P R K0 小鼠中進行實驗，正常和CD4缺失的B6小鼠作為對照。在完整的IFN a 0RKO小鼠中分析產生IFNa 0依賴性CD8+T細胞反應的TLR/CD40 組合。在CD4缺失的IFNa PRKO小鼠中，測試IFNa P依賴性和IFN a P獨立性的TLR/CD40組合兩者。在初次免疫后，使代表性CD4缺失 的和免疫的小鼠休息至少60天，然后通過組合的TLR/CD40激動劑免 疫再激發。這些實驗用于確定在IFNa (3缺陷型(CD4缺失或未缺失) 宿主免疫后初級和記憶性CD8+ T細胞反應是否依賴于CD70和/或其他 TNF配體。
實施例1 :
在組合的TLR/CD40激動劑免疫后CD8+ T細胞擴增證實對IFNa (3的可變的依賴性當所有TLR激動劑與抗CD40協同以促進CD8+ T細胞擴增 時，發明人觀察到從某些TLR激動劑/抗CD40組合中誘發的CD8+ T細 胞反應完全依賴于IFNa P 。基于此，如上所述在包含于圖1和2中 的實驗中，在不同組合的TLR/CD40激動劑的情況下，發明人用肽抗原 免疫干擾素cc P受體敲除(IFNcc ，R K0)小鼠。在包含于圖1中的實驗中，組合的TLR/CD40激動劑施用之后，在用卵清蛋白肽、抗CD40和指示的TLR激動劑免疫的agonmice(底 行)中測量CD8+T細胞擴增。7天后，通過四聚體染色和FACS分析在 脾中測量卵清蛋白特異性T細胞反應。在右上象限的數目表示四聚體 染色細胞占總CD8+細胞的百分比。在包含于圖2中的實驗中，顯示在用IFNoc P依賴性TLR 激動劑與激動性抗CD40的組合免疫后，IFNoc PRKO宿主的CD4缺失 恢復了 CD8+ T細胞反應。如圖2所示，WT和IFNct (3R KO小鼠(CD4 缺失的或未缺失的)用HSV-1肽、激動性抗CD40抗體和polyIC免疫。 7天后，HSV-1特異性反應通過四聚體(A)和IC IFNy (B)染色的PBL 細胞來測定。如包含于圖2中的結果所示，對用TLR 3、 7或9激動劑與 抗CD40組合的免疫的CD8+ T細胞反應在這些小鼠中完全消除(圖2)。 相比之下，對剩余的TLR/CD40激動劑組合的CD8+T細胞反應僅僅部分 依賴于(TLR4/CD40)或相對獨立于(TLR2/6/CD40激動劑)IFNot P (圖 1)。在其他實驗中，TLR1/2激動劑Pam3Cys和TLR5激動劑鞭毛蛋白 當與抗CD40組合使用時，在IFNoc卩R KO小鼠中也產生與Wt小鼠相 當的CD8+ T細胞反應(數據未顯示)。這些結果證實與TLR 2或5激動 劑組合的抗CD40誘發IFNa P獨立性CD8+ T細胞反應，而與TLR 3、 7或9激動劑組合的抗CD40誘發IFNoc P依賴性CD8+ T細胞反應。因 此，可認為TLR 2或5激動劑與CD40途徑的協同作用是IFNa P獨立 性的。相反，可認為TLR 3、 7或9激動劑與CD40途徑的協同作用是 IFNoc P依賴性的。這些數據向發明人表明IFNa P通過信號轉導直接 經由T細胞、含有抗原的APC或兩者在產生CD8+T細胞反應中的作用。實施例2
在組合的TLR/CD40激動劑免疫后CD8+ T細胞擴增在CD4缺失的 IFNa PR KO宿主中恢復在IFNoc PR KO小鼠中缺限的CD8+ T細胞反應似乎向發明 人表明IFNa P在通過上述的某些TLR/CD40激動劑組合誘發的反應中 的主要作用。如在圖2的實驗中所示，在與組合的TLR/CD40激動劑結合的肽免疫前1天，通過注射抗CD4抗體GK1.5使Wt和IFNcx P R K0 小鼠缺失CD4+T細胞(圖2)。在組合的TLR/CD40激動劑免疫后7天， 處死小鼠，并且分離PBL和脾細胞，然后通過四聚體和細胞內IFNy 染色分析。用肽和PolylC/抗CD40的免疫未能在IFNcc PRKO小鼠中 產生CD8+T細胞反應。但是，就抗原特異性T細胞的數目(占總CD8+T 細胞的百分比，圖2A)和功能(圖2B)而言，CD4缺失在IFNocPR KO 小鼠中恢復了 CD8+ T細胞反應。這對測試的所有TLR/CD40激動劑組 合(TLR2、 5和7)是真實的，其中對IFNoc P獨立性TLR/CD40激動劑 組合(即TLR2)的CD8+ T細胞反應甚至比沒有CD4缺失的對照增強(數 據未顯示)。因此，在組合的TLR/CD4Q激動劑免疫后，IFNoc KO 小鼠中的008+ T細胞反應在CD4缺失后增強。發明人對這些發現關心的是它們是否是生理上相關的或 僅僅是對IFNa PR KO宿主是唯一的。因此在有和沒有CD4缺失下， 在使用阻斷IFNa P的多克隆兔抗IFN抗體的wt宿主中進行了實驗。如在圖3中所示，抗IFN阻斷PolylC/CD40介導的CD8反 應，所述反應通過CD4缺失而恢復。在此實驗中，在有和沒有抗IFN 和/或CD4缺失下，使小鼠免疫抗卵清蛋白(組合的PolylC/抗CD40)。 在第7天，針對百分比抗原特異性T細胞通過在上述材料與方法中所 述的四聚體染色來分析PBL。如在圖3中所示，對于用組合的PolylC/aCD40免疫的wt 小鼠，抗FNcc P抗體顯著減少CD8+ T細胞反應的量級(圖3)。與在 IFNct KO小鼠中看到的結果一致，抗IFN處理的小鼠的CD4缺失 完全恢復CD8+T細胞反應。因此，在IFNcc PR KO宿主和在用IFNoc P缺失的抗體注射的wt宿主中，在組合的TLR/CD40激動劑免疫之后， CD4缺失似乎減輕了 CD8+ T細胞反應對IFNoc P的依賴性。這些結果 向發明人表明1)在用某些TLR/CD40激動劑組合免疫后，CD4+ T細 胞亞群調節IFNa卩R KO小鼠中的CD8+ T細胞反應；2)在用這些 TLR/CD40激動劑組合免疫后，IFNct 0可在抑制該004+ T細胞群的調 節能力中起作用；和3)其他TLR/CD40激動劑組合(例如TLR2或5)
46能避免由調節004+ T細胞以IFNot 13獨立性的方式的抑制。這些結果證實組合的TLR/CD40激動劑免疫能誘發有效的 初級和次級CD8+ T細胞反應，所述細胞反應取決于所用的TLR激動劑 顯示對IFNot P令人感興趣的可變的依賴性。這些發現向發明人表明 IFNoc P在CD8+T細胞反應中的作用比先前所認識的更直接。也顯示， 組合的TLR/CD40激動劑免疫獨特地誘導了 CD70在DC上的上調，其中 在WT小鼠中隨后的CD8+ T細胞反應似乎主要依賴于CD70。這些初步 數據表明CD70在活化的APC上表達的增加以及隨后抗原特異性T細 胞通過CD27的刺激是，對組合的TLR/CD40激動劑免疫響應的CD8+ T 細胞反應的形成和存活的主要檢測點。然而，更令人驚奇的是，我們 觀察到通過缺失宿主的CD4+T細胞，可以拯救IFNa 0RKO(圖2)和FT 小鼠(圖3)中的IFNct 0依賴性008+ T細胞反應。這些結果表明IFN cc P影響CD8+T細胞反應可能是出于以下原因1)調節CD8+T細胞 對表達TNFL的APC的反應；2)調節APC活化和TNF配體表達；3)抑 制CD4+T細胞調節功能，所述功能抑制TNF配體的APC表達或對含有 TNFL的APC響應的CD8+ T細胞擴增；4)上述的任何組合。下列實 施例通過系統性檢測以下內容最終確定這些假設的準確性i) IFNcx 0在介導CD8+T細胞反應中的作用；ii) IFNa P在DC活化中的作用； 以及iii) IFNcc P在CD4+調節細胞功能中的作用，所有檢測都在組合 的TLR/CD40激動劑免疫之后。
實施例3
用于IFN a P R KO中的CD8+反應的TNF配體的作用
如在包含于圖4中的實驗所示，WT小鼠中通過組合的 TLR/CD40激動劑免疫產生的CD8+ T細胞反應依賴于CD70 (參見圖4)。 在此實驗中，在組合的TLR/CD40免疫之后，在缺失CD4的IFNot PRKO 宿主中測定CD8+T細胞反應，并且結果顯示其主要依賴于CD70。 IFN ot P R KO小鼠缺失CD4細胞，并且如上所述用HSV-1肽、PolyIC和抗 CD40抗體免疫。然后，如在圖1中，小鼠用抗TNF配體抗體注射。在 第7天，再通過四聚體染色分析PBL。
如在前述實驗中所示，IFNcc PR KO小鼠中的CD8+T細胞 反應是獨特的，因為該細胞反應僅可通過不刺激IFNoc P的TLR/CD40 激動劑組合或在TLR/CD4Q激動劑免疫之前通過IFNoc P R KO宿主的 CD4缺失來誘發。圖4中的結果進一步表明CD70在IFNoc P R KO小鼠 的CD8+T細胞反應中起必要的作用。應注意，雖然在此實驗中抗CD70 阻斷了反應約10倍，但是其他TNFL抗體抑制了 CD8+T細胞反應僅達 2倍。這表明與wt小鼠(圖l)不同，多TNF配體可能對IFNa 0 R KO 小鼠中的CD8+ T細胞反應的量級至少有一些影響。圖4中顯示的數據 是用最小量的阻斷抗體注射達到的。實施例4
材料與方法最早由 Southampton General Hospital 的 Dr. Aymen A卜Shamkhani描述的(Rowley, T. F.和A. A卜Shamkhani. 2004. Stimulation by soluble CD70 promotes strong primary and secondary CD8+ cytotoxic T cell responses in vivo. / //ZM7i//7o/ 1 72: 6039)，可溶性C謂/Ig融合蛋白(sCD70Ig)的注射通過體內CD27 成功提供了 T細胞的激動性刺激物。由Dr. Al-Shamkhani友好提供的 這種試劑與TLR和CD40刺激組合注射入IFNa PR K0宿主中。開始， 我們嘗試通過額外注射sCD70Ig試劑來拯救對IFNa p依賴性 TLR/CD40激動劑組合的CD8+ T細胞反應。在起初抗原激發后第7天， 再次分析CD8+ T細胞反應。Dr. Al-Shamkhani的實驗室的數據已確 定在抗原激發后第2-4天每天250 ug sCD70Ig的注射為CD8+ T細 胞擴增提供了最佳的CD70介導的信號(私人交流)。我們已證實 sCD70Ig注射的這一時程在WT小鼠中增加了對單獨的TLR激動劑的 CD8+ T細胞反應(數據未顯示)。用抗原和TLR激動劑、抗CD40或兩 者在笫0天i. p.激發小鼠。在抗原注射后第2、 3、和4天，我們i. p. 注射250 ug sCD7GIg，然后在初次抗原激發后第7天分析血液和/或 脾中的CD8+ T細胞反應。根據在圖4中顯示的數據，清楚的是，IFNocPRKO宿主的CD4缺失使它們對TLR/CD40刺激的任何組合反應。如在圖4中所示， CD70阻斷消除了 TLR激動劑和CD40激動劑之間誘導CD8+ T細胞反應 的協同作用。在實驗中，小鼠用抗CD40+ZTLR-激動劑的指定組合激發。 小鼠的代表性亞群用抗CD70阻斷抗體FR70注射(下層的圓點圖)。圖 "顯示了代表性四聚體染色，圖4B顯示了每組3只小鼠的平均值和 標準偏差，并且圖4C顯示了其中小鼠如在5A中所述進行免疫，但給 予抗CD70的0、 1或2次注射。在24小時分離DC，并且分析每個亞 群中的DC數(頂部圖)和CD70染色(底部圖)。可看到，在組合的TLR/CD40激動劑免疫后WT小鼠中的 CD8+T細胞反應依賴于CD70(圖4)。上述的以及在圖4中顯示的數據 表明對于至少缺失CD4的IFNa P R KO宿主而言也是這樣的。在圖4 中的結果也表明多TNF配體可在不同程度上參與IFNct PR KO宿主中 的CD8+ T細胞反應。實施例5在wt小鼠中在重組IFNa+/-抗CD40后的免疫細胞反應
為了在用IFNot P依賴性TLR/CD40激動劑組合免疫后確定
單獨的IFNa P的作用是否足以誘發008+ T細胞擴增，使用下列材料
與方法完成實驗。 材料與方法簡要來說，從PolyIC刺激的B細胞cDNA中克隆新型IFN a序列。在誘導的亞型中選擇IFNa亞型，因為它沒有糖基化序列， 因此可在昆蟲細胞中表達而不必擔心異常的糖基化。出于親和純化目 的，將TCRCot表位標簽加至C末端，并且將該序列克隆入pBac載體 (Invitrogen)的p10啟動子部位。產生重組桿狀病毒，并且在感染Hi5 細胞后，通過親和和尺寸色i脊法從上清液純化重組IFNoc。基于I類 MHC在APC上的上調，在體外和體內證實IFNa的活性(數據未顯示)。先前已公開重組IFNoc在疫苗環境(vaccine setting)中的 用途(Le Bon， A.和D. F. Tough. 2002. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Cwrr j、巡"i2c;/
4914: 432)并且類似的方案最初用于在此提出的研究中。野生型小鼠用與 104-106單位的IFNoc結合的抗原和抗CD40如上所述進行引發。然后將 所得到的008+ T細胞反應與用組合的TLR(3、 7或9)/CD40激動劑免 疫的小鼠比較，以確定是否IFNcc可以與抗CD40協同作用達到與誘發 CD8+ T細胞擴增的TLR刺激相同的程度。其他對照小鼠僅用IFNct或 抗CD40注射。如上所述，分析CD8+T細胞反應。如在包含于圖5中的實驗中所示，所得的數據顯示重組IFN a和抗CD40在免疫上有協同效應。在3次注射lxl()5單位IFN、單 次注射1 x 106單位IFN、單獨的抗CD40或與任一 IFN給藥方案結合 的抗CD40的情況下小鼠用抗原免疫。單獨的IFN或CD40刺激可檢測 的CD8+ T細胞反應，而組合的IFN/CD40協同作用產生與對 PolylC/CD40免疫響應所觀察到的類似的CD8+ T細胞反應(圖5)。更特別地，這個實驗揭示了 1型干擾素和激動性CD40抗體 的組合施用與單獨任一者的施用相比，誘導抗原特異性CD8+和T細胞 的指數擴增。小鼠用卵清蛋白和抗CD40、 poly IC或重組IFN的指定 組合i.p.注射。對于IFN注射，給予小鼠3次連續的每日1><105單位 IFN的注射(從抗原注射的那天開始)，或抗原注射的同時單一注射1 xl(T單位IFN。 7天后，處死小鼠，并且來自外周血液或脾的細胞用 四聚體進行染色，以鑒別卵清蛋白特異性008+ T細胞的擴增的量級。 通過FACS分析細胞，并且在CD8+B220事件上對顯示的數據門控 (gated)。在圖5-(A)中是四聚體染色的圓點盤，圖5(B)是兩個百分 比四聚體和血液中CD8+細胞占總CD8+ T細胞的平均值和標準偏差(來 自2只個體小鼠)。包含在圖5中的數據顯示了重組l型干擾素與CD40協同作 用達到與TLR/CD40刺激類似的程度，這些結果進一步證實在桿狀病毒 中產生的重組IFN在體內運行良好。此外，這些結果顯示了組合的IFN ot/CD4 0刺激可協同作用達到與TLR/CD40刺激在促進CD8+ T細胞擴 增中類似的量級。實施例61型干擾素和CD40抗體的組合施用誘導CD70+在DC上的表達包含在前述實驗中的數據表明IFNot &依賴性是由DC和/ 或CD4+ Tregs對IFNa P的反應確定。發明人猜測CD70涉及以下機 理在組合的IFNcc/CD40激動劑免疫的情況下，IFNaP誘發這種有 效的CD8+ T細胞免疫。先前實施例的結果特別揭示了 CD40激動劑和 1型千擾素誘發CD8+免疫上的協同效應(參見圖5)。這些數據顯示了 組合的IFNoc/CD40刺激對相應的CD8+ T細胞(而不是APC)的最終效 應。進行下列實驗以檢測組合的IFNa/CD40刺激是否誘導CD70和/ 或其他TNF配體在含有抗原的DC亞群上表達。使用上述的重組IFNct， iWT B6小鼠用與1 04-1 06單位的 IFNcc結合的抗原和抗CD40如上所述進行引發。作為對照，小鼠用單 獨的抗CD40、單獨的IFNa或組合的PolyIC/抗CD40(增加DC中CD70 表達的陽性對照)免疫。引發后6-48小時，處死代表性小鼠，用膠原 酶消化脾，并且對DC染色且通過FACS分析。就TNF配體CD70、 41BBL、 OX-40L、 CD30L和GITRL的表達評價DC。將所得的DC表型與用組合的 TLR3、 7或9/CD40激動劑免疫的小鼠比較，以確定是否IFNa可以與 抗CD4 Q協同作用達到與誘發CD8+ T細胞擴增的TLR刺激相同的程度。 其他對照小鼠僅用IFNa或抗CD40注射。為測定IFNa對抗原加工和 不同亞群的呈遞的影響，如上所述，小鼠用與重組IFNot +/-抗CD40 結合的熒光抗原激發。如上所述，測定抗原攝入、抗原呈遞、DC活化 和TNFL表達。這些實^r測定獨立的IFNa和與抗CD40結合的IFNa怎 樣影響抗原呈遞、DC TNFL表達、以及〔08+ T細胞擴增。如在包含于圖6中的實驗中所示，1型干擾素和激動性CD40 抗體的組合施用誘導體內CD8+ T細胞上的CD70表達，而單獨任一者 的施用沒有。在實驗中，小鼠用單獨的抗CD40抗體、PolyIC (陽性對 照)、重組a干擾素或抗CD40抗體和1型干擾素注射。18小時后將脾 DC分離，并且分析它們的CD70表達。在圖7的右上象限中的數目表 示CD70染色的平均熒光強度。這數據也顯示，與PolylC/CD40激動劑 施用類似，CD40/IFN同樣增加了 CD70在CD8— DC上的表達。
51
因此，數據(圖6)證實IFNct/CD40免疫成功地誘發CD8+T 細胞反應，并且顯示就抗原攝入、抗原呈遞和/或TNFL上調而言，注 射IFNcc/抗CD40的小鼠中的DC與來自組合TLR/CD40激動劑免疫的 對照的DC類似。特別是，在組合的IFNoc/aCD40免疫后，在一個或 多個DC亞群上增加了 CD70，盡管沒有用單獨的任一刺激物的激發。實施例7在有和沒有CD40激動性抗體下增加的IFNoc量的組合施用
在包含于圖7中的實驗中，如在前述實施例中所述注射小 鼠，但是在有和沒有激動性CD40抗體下用增加量的l型干擾素注射。 圖中的數據表示為兩只個體小鼠之間的平均CD70MFI，并且誤差條表 示標準偏差。這些數據同樣揭示了 1型干擾素和CD40激動劑的組合施 用增加了體內DC上的CD70表達，而當1型干擾素和CD40激動劑每種 在沒有另一種的情況下施用時，則沒有增加。
實施例8抗原特異性T細胞在用減少劑量的I FN a和CD4 0激動劑或 抗CD70免疫的小鼠中的百分比在包含于圖8中的實驗中，小鼠用抗CD40抗體、如本文所 述的在不同減少的劑量下的IFNct和抗CD40抗體、以及polylC與CD40 抗體、cc干擾素與抗CD40抗體免疫。可從包含于其中的數據看到，抗 原(卵清蛋白)特異性T細胞的數目隨IFNcc劑量的降低呈指數減少， 而用IFN/PolylC和IFNa/CD40激動劑的抗原特異性細胞的數目大體 上相同(參見圖8)。因此，圖6和圖7和圖8的數據顯示外源性添加 的IFNa可以與抗CD40協同作用，并且上調CD70在DC上的表達，導 致抗原特異性T細胞的擴增。實施例9來自用TLR/CD40激動劑組合的IFNoc PR KO小鼠的DC上 的CD70表達
為了證明在具有外源性添加的IFNcc的圖6和圖7中所示的結果 與外源性IFN相關，如在圖9中所述，在IFNoc P R小鼠中進行實驗。如在此所示完成實驗，其中小鼠用轉移的骨髓成功地進行重建(在這種
情況下，BM表達GFP +/-Bel-2，圖9)并且在重建后8周免疫后，小 鼠產生免疫反應(未顯示)。如在圖9的實驗中所示，組合的TLR/CD40激動劑施用激發 在IFNa(3 R KO小鼠中誘導了僅在表達耙向TLR的DC上的CD70表達。 在實驗中，IFNa PR小鼠用單獨的抗CD40抗體或與PolyIC或Pam3Cys 組合的抗CD40抗體注射。Pam3Cys是TLR2激動劑，并且polyIC是TLR3 激動劑。24小時后，將脾DC分離，并且如前所述針對CD70表達將其 染色。CD8+ DC表達TLR2和TLR3，而CDllb+DC表達TLR2但不表達 TLR3。這些數據表明在沒有IFNcc 0信號轉導下，僅直接通過TLR和 CD40 二者刺激的DC能增加CD70表達。這些數據與先前數據組合進一步表明CD7G表達的這種增 加涉及CD『T細胞的共同擴增。實施例10 1型IFN/CD40組合對抗原特異性T細胞數目的效應與 IL-2/CD40激動劑組合對抗原特異性T細胞數目的效應比較設計在圖10中的實驗以比較IL-2(另一種細胞因子)和1 型干擾素當與CD40激動劑組合時的效應。如上所述，認為用IFNa /CD4G激動劑組合達到的協同效應是真正未意料到的，并且用其他細 胞因子/CD40激動劑組合不能觀察到協同效應。在此實驗中，比較1型IFN/CD40抗體、IL-2/CD40抗體、 單獨的IL-2、單獨的IFNoc以及單獨的CD40激動劑的效應。這個包含 在圖10中的結果顯示了 IL-2和IFN/CD40組合對抗原特異性T細胞免 疫細胞的百分比不產生類似的效應。其中，小鼠用與抗CD40 (50 mg) 重組IFNoc (lxl06U)、 IL-2 (lxl06U)IL-2和C謂、或單獨的相同 劑量的IFN和CD40激動劑組合的卵清蛋白(300 mg)注射。7天后取外 周血，并用Kb/ova四聚體染色以鑒別抗原特異性T細胞的百分比。在 圓點圖中的數目是在指定的橢圓形圖框中的總CD8+ T細胞的百分比 (四聚體+)。條線圖是2只小鼠每次注射的平均值和標準偏差。在此的結果顯示了在相同量的CD40激動劑下且當兩種細胞因子在相同活性 水平下施用時，抗原特異性T細胞在施用IFN/CD40組合的動物中的數 目大大高于在施用IL-2/CD40組合的動物中的數目。這進一步證明了 用IFN/CD40激動劑組合實現的協同作用是未意料到的。
實施例11 IFNoc和CD40激動劑對轉移性黑素瘤中的存活時間的效應
在該實驗中,在第0天C57BI/6小鼠靜脈內接種100， 000 B16.F10黑素瘤細胞。4天后，小鼠接受100微克腫瘤肽(5 V) 、 100 微克的抗CD40和1 x 1(T單位oc干擾素。如在此所示，施用抗CD40/IFN 組合的小鼠具有實質上更長的存活時間。這些數據進一步支持主題佐 劑組合在腫瘤疫苗和癌癥療法中的潛在應用。
實施例12 CD4Q激動劑/IFNoc組合對轉移性肺癌t的效應
在圖12中的實驗顯示了主題CD40激動劑/IFNcc組合保護 小鼠免于轉移性肺癌。在這個實驗中，在第0天C57BI/6小鼠靜脈內 接種100， 000 B16. F10黑素瘤細胞。四天后，小鼠接受IOG微克腫瘤 肽(5V)、 100微克抗CD40抗體、100微克S-27609 (TLR7激動劑)和1 xl(T單位a干擾素。腫瘤激發后21天處死小鼠，從其中移除肺，并 且通過解剖顯微鏡計數轉移性結節。在圖的A圖中顯示在肺收荻的當 天代表性肺的數字圖像。在B圖中顯示肺轉移的計數，其中N= 7-8 只小鼠每組。這些結果顯示了 CD4 0激動劑/1 FN a組合相對于其他治療 的保護性效應。實施例13含有肺瘤的肺的腫瘤浸潤分析進行在圖13中顯示的實驗，其中進行含有腫瘤的肺的 TIL(腫瘤浸潤淋巴細胞)分析。在第0天C57BI/6小鼠靜脈內接種 100， OOQ B16.F10黑素瘤細胞。五天后，如其中所示，小鼠接受100 微克腫瘤肽(5V)、 1QQ微克抗CD40和1 x l(T單位干擾素ot。腫瘤激 發后20天處死小鼠。移除肺，并且通過Percoll梯度離心法分離TIL。隨后對細胞進行流式細胞分析以研究浸潤CD4(13A和13D)、 CD8(13B 和13E)和FoxP3+細胞(13C和13F)的相對和絕對數。在實驗中，N= 4 只小鼠每組。實施例14組合免疫療法對在含有腫瘤的小鼠中浸潤肺的CD8+ T細胞 的效應在包含于圖14中的實驗中，分析主題組合免疫療法對浸潤 含有腫瘤的小鼠的肺的抗原特異性效應CD8+T細胞的產生的效應。在 實驗中，其中在第0天C57BI/6小鼠靜脈內接種100， 000 B16. F10黑 素瘤細胞。五天后，小鼠接受如所指示的100微克胂瘤肽(5V)、 100 微克抗CD40和1 x 106單位干擾素0(。腫瘤激發后20天處死小鼠并移 除肺，并且通過Percoll梯度離心法再次分離TIL。隨后用1微克/mL rhIL-2和布雷菲德菌素(brefeldin)A刺激細胞12-18小時，然后進行 細胞內細胞因子染色。細胞首先用CD8和CD44的抗體標記，然后固定， 且在用IFNg染色之前使之可滲透。陽性細胞通過減去用不相關 (SIINFEKL)肽對照觀察到的背景值來計算，然后作為 CD8+CD44+IFNg+T細胞的百分比陽性(14A)或絕對數目(14B)繪圖。在 實驗中，N= 4只小鼠每組。圖中的結果揭示了由于主題IFN/CD40激動劑組合的施用， 抗原特異性CD8+T細胞的數目增加。這些結果進一步證明了主題佐劑 組合在癌癥疫苗和其中期望這種免疫增強的其他療法中的效力。作為最后的注釋，為了進一步描述本發明，本申請包含圖 15，其包含用于實施例和圖16、 17的示例性激動性抗體的序列，其中 所述圖16、 17圖解式地描述了適于產生根據本發明的DNA構建體和多 肽結合物的方法與材料，例如使用桿狀病毒表達系統。應理解，本發明并不限于上文列出的實施方案，并且將權 利保留至示例性實施方案和在下述權利要求的范圍內的所有變更。對本文引用的期刊、專利和其他公開物的各種參考包括了 本領域的現狀，并且如同其全部內容通過引用并入本文。
5權利要求
1. 一種核酸構建體，其包含(i)至少一種編碼CD40激動劑的核酸序列；(ii)任選編碼期望的抗原的核酸序列；和(iii)編碼1型干擾素的核酸序列；其中所述序列(i)、(ii)(如存在)和(iii)可操作地連接至相同或不同的轉錄調節序列，且進一步其中所述序列(i)、(ii)和(iii)任選地通過連接體序列和/或IRES隔開。
2. 根據權利要求1所述的核酸構建體，其中所述多肽l型干擾素選自干擾素 OC、 (3、 T、 s、 C和w。
3. 根據權利要求1所述的核酸構建體，其中所述l型干擾素是ot干擾素。
4. 根據權利要求3所述的核酸構建體，其中所述1型干擾素是P干擾素。
5. 根據權利要求1所述的核酸構建體，其中所述CD40激動劑是抗 CD40抗體或激動性CD40抗體片段。
6. 根據權利要求1所述的核酸構建體，其中所述CD40激動劑是CD40L。
7. 根據權利要求6所迷的核酸構建體，其中所述CD40L是人、鼠 科、大鼠或靈長類CD40L。
8. 根據權利要求7所述的核酸構建體，其中所述CD40L是人CD40L 或可溶性人CD40L片段、可溶性CD40L低聚物或結合人CD40的CD40L 變體或結合物。
9. 根據權利要求5所述的核酸構建體，其中所述抗體是嵌合抗體。
10. 根據權利要求5所述的核酸構建體，其中所述抗體是人源化抗體。
11. 根據權利要求5所述的核酸構建體，其中所述抗體是人抗體。
12. 根據權利要求5所述的核酸構建體，其中所述抗體是單鏈免疫球蛋白。
13. 根據權利要求5所述的核酸構建體，其中所述抗體包含人重鏈 和輕鏈恒定區。
14. 根據權利要求5所述的核酸構建體，其中所述抗體選自IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4。
15. 根據權利要求5所述的核酸構建體，其中所述抗體由可操作地白重鏈的核酸序列編碼。
16. 根據權利要求15所述的核酸構建體，其中所述免疫球蛋白輕 鏈和免疫球蛋白重鏈序列被IRES間插。
17. 根據權利要求i所述的核酸構建體，其中所述抗原序列(n)編碼病毒、細菌、真菌或寄生蟲抗原。
18. 根據權利要求1所述的核酸構建體，其中所述抗原序列(ii) 編碼人抗原。
19. 根據權利要求18所述的核酸構建體，其中所述人抗原是癌癥 抗原、自身抗原或其表達與慢性人類疾病相關或有關的其他人抗原。
20. 根據權利要求17所述的核酸構建體，其中所述病毒抗原特異 于選自下列的病毒HIV、皰疹病毒、乳頭瘤病毒、依波拉病毒、小RNA 病毒、腸道病毒、麻滲病毒、腮腺炎病毒、禽流感病毒、狂犬病毒、VSV、 登革病毒、肝炎病毒、鼻病毒、黃熱病毒、布尼亞病毒、多瘤病毒、冠 狀病毒、風滲病毒、艾柯病毒、痘病毒、水痘帶狀皰瘆病毒、非洲豬瘟 病毒、流感病毒和副流感病毒。
21. 根據權利要求3所述的核酸構建體，其中所述oc干擾素是任選 可PEG化的人oc干擾素。
22. 根據權利要求17所述的核酸構建體，其中所述細菌抗原來源 于選自下列的細菌沙門氏菌屬(Salmonella)、埃希氏菌屬(Escherichia )、假單胞菌屬(Pseudomonas )、芽孢桿菌屬(Bacillus )、 弧菌屬(Vibrio)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬 (Hel iobacter )、歐文氏菌屬(Erwinia)、疏螺旋體屬(Borrelia)、暗^f干菌屬(Pelobacter )、梭菌屬(Clostridium)、 沙雷氏菌屬 (Serratia )、黃單胞菌屬(Xanothomonas )、耶爾森氏菌屬(Yersinia )、 伯克霍爾德氏菌屬(Burkholdia)、利斯特氏菌屬(Listeria)、志賀 氏菌屬(Shigella)、巴斯德氏菌屬(Pasteurel la )、腸桿菌屬 (Enterobacter )、 棒狀桿菌屬(Corynebacterium )和鏈球菌屬 (Streptococcus )
23. 根據權利要求17所述的核酸構建體，其中所述寄生蟲抗原來 源于選自下列的寄生蟲巴貝蟲屬(Babesia )、阿米巴屬(Entomoeba )、 利什曼原蟲屬(Leishmania)、 癥原蟲屬(Plasmodium)、 錐蟲屬(Trypanosoma)、 弓開j蟲屬(Toxoplasma)、 賈第蟲屬(Giarda)、 扁蟲和i回蟲。
24. 根據權利要求17所述的核酸構建體，其中所述真菌抗原來源 于選自下列的真菌曲霉菌屬(Aspergillus )、球孢子菌屬(Coccidoides )、隱球菌屬(Cryptococcus )、念珠菌屬(Candida)、 諾卡氏菌屬(Nocardia)、 肺孑包子蟲屬(Pneumocystis)和衣原體屬 (Chlamydia )。
25. 根據權利要求1所述的核酸構建體，其中所述抗原是腫瘤抗原。
26. 根據權利要求25所述的核酸構建體，其中所述腫瘤抗原是肺 肺瘤抗原。
27. 根據權利要求1所述的核酸構建體，其中所述抗原是由選自下 列的人類癌癥表達的癌癥抗原前列腺癌、胰腺癌、腦癌、肺癌(小細 胞或大細胞)、骨癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌、皮膚癌、 淋巴癌、白血病、結腸癌、曱狀腺癌、宮頸癌、頭頸癌、肉瘤、神經膠 質癌和膽嚢癌。
28. 根據權利要求1所述的核酸構建體，其中所述抗原是自身抗 原，所述自身抗原的表達與自身免疫疾病相關。
29. —種表達載體，其包含根據權利要求1所述的核酸構建體。
30. 根據權利要求29所述的表達栽體，其選自質粒、重組病毒和附加型載體。
31. —種重組宿主細胞或非人動物，其表達根據權利要求1所述的 核酸構建體。
32. 根據權利要求31所述的重組宿主細胞，其選自細菌細胞、酵 母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、禽細胞和兩棲動物細胞。
33. 根據權利要求31所述的重組宿主細胞，其是人細胞。
34. —種蛋白質結合物，其由于根據權利要求1-30中任一項所述 的核酸構建體或載體的表達而產生。
35. 根據權利要求34所述的蛋白質結合物，其包含抗CD40抗體、 人cc干擾素和抗原，所述抗原的表達與疾病病癥相關。
36. 根據權利要求35所述的蛋白質結合物，其中所述疾病選自癌 癥、過敏癥、自身免疫疾病、感染性疾病和炎性病癥。
37. 根據權利要求36所述的蛋白質結合物，其包含HIV抗原。
38. 根據權利要求37所述的蛋白質結合物，其中所述HIV抗原是Gag。
39. —種誘發增強的細胞免疫反應的方法，所述方法通過施用根據 權利要求1-28中任一項所述的核酸構建體或包含所述核酸構建體的載 體或宿主細胞實現。
40. 根據權利要求39所述的方法，其中所述施用導致下列的至少 一種(i) 相對于施用僅編碼CD40激動劑或1型干擾素的DNA，增強的 初級和記憶性008+ T細力包反應；(ii) 誘導抗原特異性〔08+ T細胞的指數擴增；(iii) 在CD4缺陷型宿主中產生與正常(非CD4缺陷型)宿主相當的 保護性免疫反應；和(iv) 誘導CD70在樹突狀細胞上的表達。
41. 根據權利要求39所述的方法，其中增強的細胞免疫反應特異 針對選自病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、自身抗原、變應原和癌癥抗 原的抗原。
42. 根據權利要求41所述的方法，其中所述抗原是HIV抗原。
43. 根據權利要求42所述的方法，其中所述HIV抗原是gag或env。
44. 根據權利要求41所述的方法，其中所述抗原是人腫瘤表達的抗原。
45. —種在有相應需要的受試者中誘發增強的CD8+ T細胞免疫反 應的方法，所述方法包括施用協同有效量的(i)至少一種CD40激動劑、 (ii)至少一種1型干擾素和任選(iii)至少一種其表達與特定疾病相 關的抗原，或包含這些部分的多肽結合物，其中這些部分包含在相同或 單獨的藥學上可接受的組合物中。
46. 根據權利要求45所述的方法，其中所述CD40激動劑、1型干 擾素和如果存在的抗原包含在相同的組合物中。
47. 根據權利要求45所述的方法，其中所述CD40激動劑和1型干 擾素包含在單獨的組合物中。
48. 根據權利要求45所述的方法，其中所述CD40激動劑是抗CD40 抗體。
49. 根據權利要求45所述的方法，其中所述CD40激動劑是CD40L 多肽。
50. 根據權利要求49所述的方法，其中所述CD40L多肽包括可溶 性CD40L多肽、其片段或低聚化CD40L多肽或包含前述任一項的結合物。
51. 根據權利要求50所述的方法，其中所述CD40L包括人CD40L 或可溶性片段、低聚物或與人CD40結合的包含前述的結合物。
52. 根據權利要求45所述的方法，其中所述1型干擾素選自oc、 0、 oc/P、 e、 t、 (o或C干擾素或其變體或片段或PEG化形式。
53. 根據權利要求45所述的方法，其中所述疾病選自癌癥、過敏 癥、炎性疾病、感染性疾病和自身免疫疾病。
54. 根據權利要求53所述的方法，其中所述感染性疾病由病毒、 細菌、真菌或寄生蟲引起。
55. 根據權利要求54所述的方法，其中所述病毒是HIV。
56. 根據權利要求45所述的方法，其中所述施用導致下列的至少 一種(i) 相對于僅施用CD40激動劑或1型干擾素，誘發實質上增強的初 級和記憶性008+ T細胞反應；(ii) 誘導抗原特異性008+ T細胞的指數擴增；和(iii) 在CD4缺陷型宿主中產生與正常(非CD4缺陷型)宿主相當的 保護性免疫反應；和(iv) 誘導CD70在樹突狀細胞上的表達。
57. 根據權利要求56所述的方法，其用于治療病毒感染或癌癥。
58. 根據權利要求39所述的方法，其中通過粘膜、局部、口服、 靜脈內、肌內、鼻內、陰道、直腸、瘤內、鞘內或眼內施用所述核酸構建體。
59. 根據權利要求42所述的方法，其中通過粘膜、局部、口服、 靜脈內、肌內、鼻內、陰道、直腸、瘤內、鞘內或眼內施用所述多肽結合物。
60. —種適于用于人治療中誘發增強的CD8+ T細胞免疫反應的組 合物，其包含協同有效量的(U至少一種CD40激動劑、(ii)至少一種 l型干擾素和(iii)任選至少一種抗原。
61. 根據權利要求60所述的組合物，其中所述CD40激動劑是激動 性抗CD40抗體或激動性抗CD40抗體片段。
62. 根據權利要求61所述的組合物，其中所述激動性抗CD40抗體 是人、嵌合、人源化或單鏈抗體。
63. 根據權利要求61所述的組合物，其中所述激動性抗CD40抗體 是IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4。
64. 根據權利要求60所述的組合物，其中所述CD40激動劑是CD40L 多肽。
65. 根據權利要求64所述的組合物，其中所述CD40L多肽是可溶 性人CD40L片段、其低聚物或包含前述的結合物。
66. 根據權利要求60所述的組合物，其包含人腫瘤抗原或自身抗原。
67. 根據權利要求60所述的組合物，其包含細菌、病毒或真菌抗原。
68. 根據權利要求60所述的組合物，其中所述l型干擾素是人a或(3干擾素。
69. 根據權利要求68所述的組合物，其中所述干擾素是共有oc干 擾素或PEG化的a或P干擾素。
70. 根據權利要求60所述的組合物，其包含變應原。
71. —種增強疫苗組合物的效力的方法，其包括與至少一種CD40 激動劑和至少一種1型干擾素結合添加或施用所述疫苗。
72. 根據權利要求71所述的方法，其中所述CD40激動劑是CD40 激動性抗體或其片段。
73. 根據權利要求71所述的方法，其中所述1型干擾素是人a干 擾素或人(3干擾素。
74. 根據權利要求71所述的方法，其中所述添加或組合的施用誘 導增強的特異針對包含在所述疫苗中的抗原的CD8+ T細胞免疫。
75. 根據權利要求74所述的方法，所述方法誘導CD70在樹突狀細 胞上的表達。
76. —種減輕CD4Q激動劑的毒性的方法，所述方法通過施用與一 定量的1型干擾素或TLR激動劑結合的所述激動劑實現，所述量足以相 對于當在缺少所述1型干擾素或TLR激動劑下施用CD40激動劑時減少 或消除肝毒性。
77. 根據權利要求76所述的方法，其中所述CD40激動劑是CD40 激動性抗體或片段或CD40L多肽。
78. 根據權利要求76所述的方法，其中減少的肝毒性基于肝轉氨 酶水平測定。
79. 根據權利要求76所述的方法，所述方法提供了所述CD40激動劑 的最大耐受劑量(MTD)，其比在缺少所述1型干擾素或TLR激動劑下導致 肝轉氨酶水平的相同增加的MTD高約l. 5-10倍。
全文摘要
提供了包含協同有效量的至少一種1型干擾素和至少一種CD40激動劑的協同佐劑，其中這些部分可以在相同或單獨的組合物中。此外，提供了包含1型干擾素/CD40激動劑/抗原組合的融合蛋白和DNA結合物。還提供了這些組合物、蛋白質和DNA結合物作為用于治療各種慢性疾病(如HIV感染)和用于增強疫苗(預防性和治療性)的效力的免疫佐劑的用途。
文檔編號C12N1/20GK101479375SQ200780024076
公開日2009年7月8日 申請日期2007年5月3日 優先權日2006年5月3日
發明者C·豪盧茲扎克, P·J·桑切斯, R·凱德爾 申請人:科羅拉多州立大學董事會