專利名稱：：融合伴侶細胞的制作方法
技術領域：
：本發明涉及融合伴侶細胞(fusionpartnercell)以及雜交瘤。
背景技術：
：雜交瘤(融合細胞)被用于利用培養細胞的物質生產中。動物細胞中產生商業上或學術上有用的物質的細胞也很多。但是，一般來說，動物細胞的培養是困難的，在維持物質產生能力的同時長期穩定地培養動物細胞的技術還未確立。于是，提出了下述技術將在生物體外能夠永久地進行穩定的培養的骨髓瘤制成融合伴侶細胞，通過使融合伴侶細胞與產生生理活性物質的細胞發生融合而制成雜交瘤，從而制作出具備培養能力和物質生產能力這兩種特性的細胞。使用細胞融合法的單克隆抗體如下生產對雜交瘤所產生的抗體的產生量和結合性等性質進行試驗，將所選的細胞單一化，然后使細胞增殖，制作出均勻的細胞群體，從而生產單克隆抗體。這些雜交瘤在體外或體內(以腹水的形式)進行培養增殖，為了抗體的大量生產而擴張。用于開發使用細胞融合法的單克隆抗體的方法是已知的(參照非專利文獻l)。單克隆抗體與從抗血清中精制的多克隆抗體相比特異性地優異，在各種免疫學分析方法中成為重要的工具。細胞融合在同種細胞間進行時僅稱作雜交瘤。一般來說，小鼠的單克隆抗體等通過該方法來制作。與此相對，將由某個種類中分離出來、且與來自其他種類的永生化細胞發生融合而成的抗體產生細胞稱作異種雜交瘤。所謂異種雜交的用語與異種間融合以同種意義使用，所制作出的細胞稱作異種雜交瘤。進而，如果是融合三種動物種來源的細胞而成的抗體產生細胞，則也可稱作三體瘤(trioma)。利用該方法制作的單克隆抗體為大鼠或倉鼠的抗體，使小鼠來源的骨髓瘤細胞與預先投予了預定抗原的大鼠或倉鼠的淋巴細胞融合，從而制作小鼠x大鼠或者小鼠x倉鼠的異種雜交瘤。如此獲得的異種雜交瘤經過克隆而獲得各種免疫動物來源的單克隆抗體。目前為止，有關于制作人、兔、牛、羊的單克隆抗體的異種雜交瘤的報道(參照非專利文獻25、專利文獻l、2)。但是，利用異種雜交瘤進行的單克隆抗體的制作隨著進行融合的細胞的生物學系統的種間距離越遠，則越難以產生抗體。例如，在小鼠x兔或者小鼠x人的雜交瘤中，抗體的產生是極其困難的。雜交瘤由于異常的染色體數，并不總是將同樣的染色體對分離給子細胞，有時也會失去這些染色體。非專利文獻1:Waldman,T.,Science252:pl657-1662(簡)非專利文獻2:Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)80:p7308-7312,1983非專利文獻3:Raybould等，Science240:pl788-17卯，1988非專利文獻4:Kennedy等，J.Gen.Virol.69:p3023-3032,1988非專利文獻5:Flynn等，J.Immunol.Methods121:p237-246,1989專利文獻l:美國專利第4634664號說明書專利文獻2;美國專利第4977081號說明書
發明內容本發明的目的在于提供在廣范圍的動物種中能夠更容易地應用利用雜交瘤的穩定的物質生產的技術。具體地說，本發明的目的在于提供對雜交瘤的制作有用的新型融合伴侶及其制作方法。或者，本發明的目的在于提供通過由本發明獲得的融合伴侶與物質生產細胞的融合而獲得的雜交瘤、其制造方法、以及利用該雜交瘤的物質生產方法。利用了細胞融合技術的物質的生產除了小鼠等有限的動物，還存在各種各樣的課題。例如，無法提供可用作細胞融合所用的融合伴侶的細胞是小鼠以外的動物的細胞融合技術的重要課題之一。本發明人等發現，通過使特定的細胞融合，可獲得作為融合伴侶有用的細胞。本發明人等所建立的融合伴侶細胞通過與小鼠以外的細胞融合，形成穩定的雜交瘤。而且確認了如此獲得的雜交瘤在克隆期間也穩定地維持其表型(phenotype)，并且作為物質生產細胞也是有用的，進而完成了本發明。另外，還明確了通過本發明的雜交瘤，能夠產生特異性地識別抗原的抗體。艮P，本發明涉及以下的融合伴侶細胞以及該融合伴侶細胞與物質生產細胞的雜交瘤。或者，本發明涉及這些細胞的制造方法以及利用雜交瘤的6物質的制造方法。一種融合伴侶細胞，其能夠通過將以下的細胞(a)和(b)融合而獲得，(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞；(b)來源于第2動物種、且在細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞。根據[l]所述的融合伴侶細胞，其中，第1動物種為小鼠，骨髓瘤細胞選自以下所示的小鼠骨髓瘤細胞和從這些細胞株誘導的細胞株，MOPC21、P3X63AG8、SP2/0、NS-1、P3.X63AG8.653、F0、S194/5,XXO.BU-l、FOX-NY和SP2/0-Ag14。根據[l]所述的融合伴侶細胞，其中，第2動物種為人，白血病細胞選自以下所示的白血病細胞和從這些細胞株誘導的細胞株，MEG-Ol、HEL、UT-7、M07e、MEG-A2和DAMI。根據[l]所述的融合伴侶細胞，其中，第1細胞為SP2/0-Ag14，第2細胞為MEG-Ol。—種以保藏編號FERMBP-10761保藏的融合伴侶細胞SPYMEG。—種雜交瘤，其能夠通過將以下的細胞(1)禾Q(2)融合而獲得，(1)能夠通過融合下述細胞(a)和(b)而獲得的融合伴侶細胞，(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞、(b)來源于第2動物種且細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞；和，(2)第3細胞。根據[6]所述的雜交瘤，其中，第1動物種為小鼠，骨髓瘤細胞選自以下所示的小鼠骨髓瘤細胞和從這些細胞株誘導的細胞株，MOPC21、P3X63AG8、SP2/0、NS-1、P3.X63AG8,653、F0、S194/5.XXO.BU-l、FOX-NY和SP2/0-Ag14。根據[6]所述的雜交瘤，其中，第2動物種為人，白血病細胞選自以下所示的白血病細胞和從這些細胞株誘導的細胞株，MEG-Ol、HEL、UT-7、M07e、MEG-A2和DAM1。根據[6]所述的雜交瘤，其中，第1細胞為SP2/0-Ag14，第2細胞7為MEG-Ol。根據[6]所述的雜交瘤，其中，融合伴侶細胞是以保藏編號FERMBP-10761保藏的SPYMEG。根據[6]所述的雜交瘤，其中，第3細胞為來源于與第2細胞相同動物種的細胞。根據[ll]所述的雜交瘤，其中，第3細胞為抗體產生細胞。[13]—種制造融合伴侶細胞的方法，其包括以下工序(1)融合以下的細胞(a)禾tl(b)的工序，(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞、(b)來源于第2動物種且細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞；(2)培養在工序(1)中融合而成的細胞，并從培養物中回收融合伴侶細胞的工序。一種制造雜交瘤的方法，其包括以下工序.-(1)使通過[13]記載的方法獲得的融合伴侶細胞與抗體產生細胞進行融合的工序；和(2)培養在工序(1)中融合而成的細胞，并從培養物中回收雜交瘤的工序。—種制造抗體產生細胞的方法，其包括以下工序(1)使通過[13]記載的方法獲得的融合伴侶細胞與抗體產生細胞進行融合而獲得雜交瘤的工序；和(2)將工序(1)中獲得的雜交瘤作為抗體產生細胞回收的工序。[16]根據[15]所述的方法，其還附加性地包括將工序(1)中獲得的雜交瘤進行克隆的工序。—種制造抗體的方法，其包括以下工序(1)使通過[13]記載的方法獲得的融合伴侶細胞與抗體產生細胞進行融合而獲得雜交瘤的工序；和(2)培養在工序(1)中獲得的雜交瘤，并從培養物中回收抗體的工序。根據[17]所述的方法，其還附加性地包括將工序(1)中獲得的雜交瘤進行克隆的工序。[19]一種制造針對感染性疾病(infectiousdisease)的抗體的方法，其包括以下工序(1)將通過[13]記載的方法獲得的融合伴侶細胞與抗體產生細胞進行融合而獲得雜交瘤的工序，所述抗體產生細胞來源于有感染性疾病的病原體抗原的暴露經歷的對象；和(2)培養在工序(1)中獲得的雜交瘤，并從培養物中回收針對感染性疾病的抗體的工序。根據[19]所述的方法，其中，感染性疾病為流感(即流行性感冒)、AIDS或病毒性肝炎中的任一種。或者，本發明涉及可通過融合以下的細胞(a)禾卩(b)而獲得的融合細胞的作為融合伴侶細胞的用途。更具體地說，本發明包括該融合細胞的作為與抗體產生細胞的融合伴侶細胞的用途。(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞；(b)來源于第2動物種且細胞周期中含有Extm-S期的白血病細胞。根據本發明，可以提供通過與異種細胞的細胞融合而形成穩定的雜交瘤的融合伴侶細胞。通過與本發明的融合伴侶細胞的細胞融合而獲得的雜交瘤會穩定地生產物質。特別是，本發明的融合伴侶細胞通過與抗體產生細胞的細胞融合而形成產生來源于抗體產生細胞的抗體的雜交瘤。本發明的融合伴侶細胞的優選方式為通過與人或小鼠的抗體產生細胞的細胞融合而形成產生人抗體或小鼠抗體的雜交瘤。穩定地維持人的抗體產生細胞在以前是比較困難的。因此，提供了穩定地產生人的抗體的細胞是本發明的很大的效果。雜交瘤穩定地維持表型不僅在物質的生產中、而且在細胞的克隆中也是重要的特征。例如，抗體產生細胞為了獲得單克隆抗體而將雜交瘤克隆。細胞的克隆也就是獲得由單一細胞增殖而成的細胞群體。因此，在反復進行單一細胞分裂的過程中，如果細胞的表型不穩定，則目標細胞的克隆是極其困難的。由本發明提供的雜交瘤由于穩定地維持細胞的表型，因此可以容易地進行克隆。圖1為表示MEG-Ol的細胞周期的圖。圖2為表示利用ELISA法的人IgG產生雜交瘤的篩選概念的圖。圖3為比較本發明的融合伴侶細胞SPYMEG和現有的融合伴侶細胞Karpas的形態的照片。圖4為確認克隆K0142(+)、MK16(+)、MK99(+)的各洗脫級分的IgG的照片。圖中的(+)表示ELISA陽性克隆、(-)表示ELISA陰性克隆。圖5為確認各克隆的洗脫級分、透析濃縮后的樣品的IgG的照片。圖6為表示SPYMEG細胞融合的改良方法的工序的圖。圖7為比較細胞融合方法的改良前后的集落形成數、IgG產生克隆數的圖。表示了每4張96孔板的集落形成孔數、IgG產生孔數。通過細胞融合工序的改良，集落形成孔數、IgG產生孔數顯著地增加，其中在流感的篩選中，獲得了多個特異性地識別流感疫苗的抗體。首次成功地確立了特異性地識別抗原的抗體。圖8為表示與流感反應的IgG產生克隆的ELISA中的反應性的圖。圖9為表示利用Western印跡法的對流感疫苗的反應性的圖。圖10為表示精制人IgG(6-19)的SDS-PAGE和反應性的確認的圖。表中的值為致敏了流感HA疫苗的ELISA的值，表示波長450nm處的吸光度。具體實施例方式本發明中的"雜交瘤"是指通過細胞融合獲得的細胞。通常，雜交瘤通過種類不同的細胞或同種的不同個體或組織來源的細胞的融合來制造。或者，使同種的相同細胞彼此融合而成的細胞也包括在雜交瘤中。進而，本發明的雜交瘤包括通過2個以上細胞的融合而獲得的融合細胞。B口，通過對由細胞A和細胞B的細胞融合獲得的雜交瘤a進一步融合細胞C而獲得的融合細胞(3也包括在本發明的雜交瘤中。(細胞A)x(細胞B)呵雜交瘤a]x(細胞C)=[雜交瘤卩]形成融合有上述3種細胞的雜交瘤P的細胞A、細胞B和細胞C所來源的種類是任意的。因此，這些細胞所來源的種類相同的情況和不同的情況均包含在本發明中。有時將通過3種細胞的融合而獲得的雜交瘤特別地10稱作三體瘤。本發明的優選方式中，細胞A(第l細胞)和細胞B(第2細胞)所來源的種類不同，細胞B和細胞C(第3細胞)所來源的種類相同。或者，細胞A和細胞C所來源的種類相同的情況，或者細胞A、細胞B和細胞C為均不同種的來源的情況，均包括在本發明的雜交瘤中。一般來說，特別地將通過細胞融合獲得的可在體外長期容易地培養的細胞稱作雜交瘤。因此，本發明中優選的雜交瘤是指在細胞融合后可以在體外長期容易地培養的細胞。或者，本發明中優選的雜交瘤是指在有限稀釋(limiteddilution)后維持細胞增殖的細胞。換而言之，有限稀釋后維持細胞增殖的細胞包括在細胞融合后可以在體外長期容易地培養的細胞中。進而，本發明中優選的雜交瘤是維持細胞融合所利用的細胞的表型的細胞。本發明中，雜交瘤應維持的細胞的表型包括細胞所具有的生產物質的能力。例如，細胞融合所用的細胞為產生抗體或細胞因子的細胞時，本發明中優選的雜交瘤維持生產這些物質的能力。但是，本發明的雜交瘤并非必須完全地維持細胞融合所用細胞所具備的表型。因此，例如當除了之前所示的抗體以外，也期待維持細胞表面抗原或細胞內蓄積的酶或轉錄因子的產生這些表型時，這些表型也包含在雜交瘤應維持的表型中。但是，當不需要生產這些物質時，即便是失去生產這些物質的能力的細胞，只要維持所需物質的生產，則包含在本發明的雜交瘤中。本發明中的"融合伴侶細胞"是指可以通過與其它細胞融合來制作雜交瘤的細胞。本發明中，優選的融合伴侶細胞通過細胞融合而使在體外的細胞的長期存活成為可能。進而，融合伴侶細胞優選具備用于篩選的適當的選擇標記物。選擇標記物是指在特定的培養條件下可以(或不可以)存活的表型。動物細胞的選擇標記物中已知有由次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶缺乏(以下簡稱為HGPRT缺乏)或胸苷激酶缺乏(以下簡稱為TK缺乏)所帶來的次黃嘌呤-氨基喋呤-胸苷敏感性(以下簡稱為HAT敏感性)等。HAT敏感性的細胞無法在HAT選擇培養基中進行DNA合成而死亡，但當與正常的細胞融合時，由于可以利用正常細胞的補救途徑來繼續DNA的合成，因此在HAT選擇培養基中也會增殖。HGPRT缺乏或TK缺乏的細胞分別可以在含有6-硫鳥嘌呤、8-氮鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)或5'-溴脫氧尿苷的培養基中選擇。正常的細胞由于將這些嘧啶類似物攝入到DNA中，因此會死亡，但缺乏這些酶的細胞由于不會攝入這些嘧啶類似物，因此可以在選擇培養基中存活。另外，被稱作G418耐受性的選擇標記物通過新霉素耐受性基因，形成針對2-脫氧鏈霉胺系抗生素(慶大霉素類似物)的耐受性。本發明提供可通過融合以下的細胞(a)禾P(b)而獲得的融合伴侶細胞(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞、(b)來源于第2動物種且細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞。另外，本發明還提供包含以下工序的制造融合伴侶細胞的方法(1)融合以下的細胞(a)和(b)的工序，(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞、(b)來源于第2動物種且細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞；和，(2)培養在工序(1)中融合的細胞，并從培養物中回收融合伴侶細胞的工序。本發明中，來源于第1動物種的骨髓瘤細胞是指來源于可單獨地克隆的骨髓瘤的細胞。可單獨地克隆是指在人工的培養環境下從1個細胞就可以開始增殖并維持增殖。本發明中，來源于第1動物種的骨髓瘤細胞只要是可通過與白血病細胞的細胞融合而形成融合伴侶的細胞，則可以利用各種細胞。例如，作為可用作本發明的骨髓瘤細胞的公知的細胞，可以列舉出以下的細胞株。以下所示細胞株的一覽中，ATCC表示美國標準生物品收藏中心(AmericanTissueandCultureCollection)的保藏編號，JCRB表示JCRB細胞庫(日本細胞庫，JapaneseCollectionofResearchBioresources)的保藏編號。因此，這些細胞株均可以由該細胞庫獲得分售。另外，JCRB細胞庫的細胞株通過日本科學研究資源庫(HumanScienceResearchResourcesBank,HSRRB)獲得分售。12MOPC21(ATCC編號HB-8411)P3X63AG8(ATCC編號T1B9)SP2/0(ATCC編號CRL1581)NS-1(ATCC編號TIB18)P3.X63AG8.653(ATCC編號CRL1580)F0(ATCC編號CRL1646)S194/5.XXO.BU-1(ATCC編號CRL1580)FOX-NY(ATCC編號CRL1732)SP2/0-Ag14(JCRB編號0029)這些細胞株中具備之前所述的優選特征的是一組小鼠骨髓瘤細胞株、或者從這些小鼠骨髓瘤細胞株誘導的細胞株。誘導的細胞株是指導入藥劑耐受性等附加表型后重新進行克隆而得到的細胞株。本發明的來源于第2動物種的白血病細胞是指細胞周期中含有Extm-S期的白血病細胞。一般來說，對于真核細胞，由以下的循環構成細胞周期。持續細胞增殖的細胞通過重復G1期M期的循環來繼續細胞分裂。另一方面，當停止細胞增殖時，成為M期后稱為GO期的穩定狀態，細胞周期停止。-[Gl期]-[S期]畫[G2期]-[M期]-這些各細胞周期中，S期為進行核酸合成的期間。此時認為構成染色體的基因組DNA被復制，做好細胞分裂的準備。倍增的基因組DNA在M期通過有絲分裂而分離為2個細胞。然而，在特定細胞中，在進行基因組DNA的復制后，觀察到細胞分裂不進行的現象。將完成DNA的合成但未移向M期的細胞分裂的期間命名為Extra-S期。在未分裂的細胞中，所合成的基因組DNA蓄積，觀察到細胞中的DNA的增加。例如，本發明中優選的白血病細胞MEG-01的平均染色體數為2n=104，遠遠多于正常細胞(2n=46)。這是由于MEG-01在增加基因組DNA的細胞周期中含有Extra-S期，從而具有使染色體成為倍數體的性質(Oncogenel3:p695-703，1996)(圖1)。這樣，在本發明中，通過使用細胞周期中含有Extm-S期、從而具有使染色體成為倍數體的性質的白血病細胞，可以期待防止來源于抗體產生細胞的染色體從異種雜交瘤上脫落的效果。本發明的細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞來源于與上述骨髓瘤不同的動物種，且優選為來源于與后述的第3細胞的來源種類相同種的白血病細胞。白血病細胞可以由具有白血病的個體的造血組織或末梢血中獲得。造血組織包括骨髓、脾臟或者淋巴結等。白血病例如可以列舉出巨核細胞系白血病。例如，通過用Ficoll法離心分離末梢血并回收特定比重的細胞級分，從而可以分離白細胞或者單核細胞等。進一步分離的白血病細胞的細胞周期中含有Extra-S期可以將細胞染色體的增加作為指標來進行確認。染色體的增加例如可以通過經12-氧沖四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)處理的細胞的倍數性(染色體總數)的增加來確認。倍數性的增加可以通過流式細胞儀或者倍數性分析儀來檢測。或者，還可將公知的白血病細胞用于本發明。例如，作為可作為本發明的來源于第2動物種的白血病細胞利用的公知的細胞，可以列舉出以下的細胞株。MEG-01和HEL為人的巨核細胞系白血病細胞株(Blood66:pl384-1392，1985、J.Clin.Invest.85:pl072-1084)。MEG-01(ATCC編號CRL-2021)HEL(JCRB編號0062)UT-7(N.Komatsuetal.CancerRes,51:341-348，1991)M07e(AvanziGCetal.JCellPhysiol.1990Dec;145(3):458-64.)MEG-A2(JCRB編號IFO50478)DAM1(Blood89:p4238,1997)特別是MEG-01作為選擇標記物具有有用的8AG耐受性。另外，由于MEG-01本身不產生免疫球蛋白，因此作為與抗體產生細胞的雜交瘤的制作用融合伴侶是優選的。本發明的融合伴侶細胞可以通過將來源于第1動物種的骨髓瘤細胞與來源于第2動物種且細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞進行細胞融合而獲得。細胞融合可以利用聚乙二醇(PEG法)或電融合法等公知的細胞融合技術。聚乙二醇法的操作如下。首先，將骨髓瘤細胞與白血病細胞的細胞比就各個特定的融合條件進行最優化。對于聚乙二醇(PEG)的濃度，本領域技術人員可以根據PEG的分子量等條件來選擇最佳的條件。例如，35%的PEG1500(Aldrich、Milwaukee、Wisconsin)是用于一般的細胞融合的條件之一。用1.5分鐘的時間慢慢將lmL的35%PEG1500加入細胞團塊/細胞混合物中后，緩慢地用不含血清的培養基、然后用含血清的培養基進行稀釋，從而進行細胞融合。為了使細胞融合變得容易而同樣地可使用的其它方法包括電融合。該方法中，將細胞置于特殊的緩沖液中，通過施加電場使細胞排列。排列后的細胞與其它細胞的接觸機會增加，可以有效地使細胞融合。將融合混合物在含有例如15%胎牛血清的HB-GRO培養基(IrvineScientific,SantaAna，California)150ml中制成細胞密度為8xl()5細胞/mL，以2,105細胞/孔分散于96孔板中。將細胞在5~10%(:02氣氛下、37"C下孵育，制成8AG耐受性，從而可以獲得融合伴侶細胞。所得融合伴侶細胞可以根據需要進行克隆。克隆后的融合伴侶細胞在雜交瘤的制造中有助于維持重現性。例如，可以分別使用SP2/0-Agl4作為來源于第1動物種的骨髓瘤細胞、使用MEG-01作為來源于第2動物種且細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞。如此提供的融合伴侶細胞其本身可長期穩定地傳代，成為用于從抗體產生細胞獲得單克隆抗體的普遍的融合伴侶細胞。即，與小鼠的同種雜交瘤中確立的小鼠骨髓瘤同樣，作為可以利用小鼠以外的生物種來源的抗體產生細胞來穩定地獲得雜交瘤的融合伴侶是有用的。通過本發明獲得的融合伴侶細胞中，通過將小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0-Ag14與人白血病細胞株MEG-01融合而獲得的融合伴侶細胞SPYMEG以保藏編號FERMBP-10761保藏在專利生物保藏中心(InternationalPatentOrganismDepositary)。(a)保藏機構的名稱和地址名稱獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心地址日本茨城縣筑波市東l丁目1番1號中央第6(郵編305-8566)(b)保藏日平成18年(2006年)2月24日(c)保藏編號FERMBP-10761(由平成18年2月24日保藏的FERMP-20816轉移)15本發明涉及可以使用上述融合伴侶細胞獲得的雜交瘤。即，本發明提供可通過融合以下的細胞(1)和(2)而獲得的雜交瘤。(1)可以通過融合下述的細胞(a)和(b)而獲得的融合伴侶細胞，(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞、(b)來源于第2動物種且細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞；和，(2)第3細胞。另外，本發明還提供包括以下工序的制造雜交瘤的方法(1)融合下述的細胞(a)和(b)的工序，(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞、(b)來源于第2動物種且細胞周期中含有Extm-S期的白血病細胞；(2)培養在工序(1)中融合的細胞，并從培養物中回收融合伴侶細胞的工序；(3)使第3細胞與工序(2)中回收的融合伴侶細胞融合的工序；以及，(4)培養在工序(3)中融合的細胞，并從培養物中回收雜交瘤的工序。本發明的第3細胞為與第1細胞或第2細胞同種來源或者不同種來源的細胞。具體地例如可以利用來源于人、兔、小鼠、大鼠、牛、山羊和綿羊等的細胞。更具體地說，當使用通過小鼠來源的骨髓瘤(第1細胞)和人來源的白血病細胞(第2細胞)而獲得的融合伴侶時，作為第3細胞優選的細胞為人或小鼠來源的細胞。特別是可以利用人來源的細胞作為第3細胞，這是本發明的融合伴侶細胞的很大優點。本發明的第3細胞是可以期待最終能夠長期培養的細胞。更具體地說，例如可將具有生產目標物質的能力的細胞作為第3細胞來使用。通過將這種細胞與本發明的融合伴侶進行細胞融合，可以獲得能夠長期地維持具有目標表型的細胞的雜交瘤。一般將通過制成雜交瘤而使細胞能夠長期間維持的形式稱作永生化。本發明中，可以將產生目標生理活性物質的任意細胞作為第3細胞利用。本發明中優選的生理活性物質可以列舉出抗體。即，抗體產生細胞作為本發明的第3細胞是優選的。抗體產生細胞例如可以列舉出白細胞(末梢淋巴細胞)、脾細胞等。從生物體采集這些細胞的方法是公知的。作為第3細胞，更具體地可以列舉出來源于有感染性疾病的病原體抗原的暴露經歷的對象的抗體產生細胞。有感染性疾病的病原體抗原的暴露經歷的對象可以列舉出接種了感染性疾病的病原體抗原(疫苗)的對象、或者有感染性疾病的感染經歷的對象等。本發明中，感染性疾病并無特別限定，優選可以列舉出流感、AIDS、HCV或HBV等病毒性肝炎等。特別是末梢血淋巴細胞作為本發明的抗體產生細胞是優選的。末梢血淋巴細胞可以通過采血容易地獲得。通過根據本發明將小鼠的末梢血淋巴細胞制成雜交瘤，可以容易地獲得產生小鼠抗體的雜交瘤。進而，通過根據本發明將人的末梢血淋巴細胞制成雜交瘤，可以容易地獲得產生人抗體的雜交瘤。本發明中，融合伴侶和第3細胞可以通過與上述第1細胞和第2細胞的細胞融合相同的方法來進行細胞融合。細胞融合可以利用PEG法或電融合法。例如，在使用作為本發明的融合伴侶的SPYMEG進行與人末梢血淋巴細胞的細胞融合時，優選的條件可以列舉出以下條件。首先，所融合的末梢血白細胞(PBL)的細胞數優選調整至lxl07108個。以2:110:1的比例混合SPYMEG和PBL，先離心分離使其沉淀，除去上清液。在所回收的細胞級分中加入聚乙二醇(PEG)使細胞融合。細胞融合所用的PEG的濃度為30%~70%、優選為4060%、更優選為50%。根據細胞數，將0.1mL2.0mL、優選0.6mL1.0mL的PEG溶液用60秒~90秒的時間用吸管加入細胞中，同時進行攪拌混合。加完PEG溶液后，在該狀態下用吸管攪拌混合2分鐘~3分鐘。之后，進一步用30秒~60秒的時間一點點地加入1014mL的無血清培養基，同時進行攪拌混合。之后，加入無血清培養基并進行離心分離。離心后除去上清，用無血清培養基洗滌細胞1次。在HAT培養基(15%FBS、HAT(x50)、RPMI中)混懸洗滌后的細胞，接種于96孔板中。對于無血清培養基和PEG，本領域技術人員可以適當利用通常的細胞融合中所使用的那些。例如，本發明的細胞融合中可以利用以下的培養基和PEG。17PEG:PEG1500(Aldrich、Milwaukee、Wisconsin)HAT:HAT添加(50x)(GIBCO制、目錄號No.21060-017)無血清培養基RPMI1640(SIGMA帝ij、目錄號NoR8758)除此以外，抗體產生細胞還可從免疫動物獲得。預先將任意的抗原與適當的佐劑一起對免疫動物免疫。抗原還可以與載體蛋白相結合而成為免疫原。用于獲得免疫原的載體蛋白可以使用鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)等。免疫動物一般利用兔、小鼠、大鼠、山羊或綿羊等。作為佐劑，一般使用Freund的完全佐劑(FCA)等(Adv.Tubercl.Res.,1:130-148，1956)。利用ELISA或Ouchterlony法追蹤抗體效價，確認抗體效價充分地上升后，摘出抗體產生細胞并使該細胞分散，從而制成細胞融合所使用的抗體產生細胞。與人同樣，通過回收脾細胞或末梢血淋巴細胞，可以回收抗體產生細胞。如此獲得的抗體產生細胞通過與本發明的融合伴侶進行融合，可以制成本發明的雜交瘤。這樣，本發明的雜交瘤的制造方法中，通過在第3細胞中使用抗體產生細胞，可以制造抗體。即，本發明提供包括以下工序的制造抗體的方法(1)通過以下的工序獲得融合伴侶細胞的工序，(A)將以下的細胞(a)禾n(b)融合的工序，(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞、(b)來源于第2動物種且細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞，(B)培養在工序(A)中融合的細胞，并從培養物中回收融合伴侶細胞的工序；(2)使抗體產生細胞與工序(1)中獲得的融合伴侶細胞融合，從而獲得雜交瘤的工序；以及，(3)培養在工序(2)中獲得的雜交瘤，并從培養物中回收抗體的工序。或者，本發明涉及對上述抗體的制造有用的產生抗體的細胞的制造方法。即，本發明提供包括以下工序的制造抗體產生細胞的方法(1)通過以下的工序獲得融合伴侶細胞的工序，(A)將以下的細胞(a)和(b)融合的工序，(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞、(b)來源于第2動物種且細胞周期中含有Extm-S期的白血病細胞，(B)培養在工序(A)中融合的細胞，并從培養物中回收融合伴侶細胞的工序；(2)使抗體產生細胞與工序(1)中獲得的融合伴侶細胞再融合，從而獲得雜交瘤的工序；以及，(3)將工序(2)中獲得的雜交瘤作為抗體產生細胞回收的工序。通過使用本發明的融合伴侶細胞，可以獲得穩定地產生抗體的雜交瘤。雜交瘤通過在適當的培養基中培養，可以優先地使細胞融合成功的細胞增殖。例如，使用本發明的SPYMEG作為融合伴侶細胞時，可以利用含有HAT的選擇培養基。在本發明的抗體制造方法或者抗體產生細胞的制造方法中，雜交瘤可以進行克隆。將雜交瘤進行克隆的方法是公知的。即，通過有限稀釋法可以將雜交瘤進行克隆。經有限稀釋的雜交瘤理論上形成從1個細胞增殖而成的細胞群體。如此獲得的細胞群體為具有均勻的遺傳特征的細胞群體、即克隆。由經克隆化的雜交瘤獲得的抗體稱作單克隆抗體。單克隆抗體是具有高度均勻的抗原結合表型的抗體。艮P，本發明提供包括以下工序的單克隆抗體的制造方法(1)通過以下的工序獲得融合伴侶細胞的工序，(A)將以下的細胞(a)禾B(b)融合的工序，(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞、(b)來源于第2動物種且細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞，(B)培養在工序(A)中融合的細胞，并從培養物中回收融合伴侶細胞的工序；(2)使抗體產生細胞與工序(1)中獲得的融合伴侶細胞融合而制成雜交瘤，并將產生目標抗體的雜交瘤進行克隆的工序；以及，(3)培養工序(2)中經克隆的雜交瘤，并從培養物中回收單克隆抗體的工序。或者，本發明涉及對上述抗體的制造有用的產生抗體的細胞的制造方法。即，本發明提供包括以下工序的制造抗體產生細胞的方法(1)通過以下的工序獲得融合伴侶細胞的工序，(A)將以下的細胞(a)禾n(b)融合的工序，(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞、(b)來源于第2動物種且細胞周期中含有Extm-S期的白血病細胞，(B)培養在工序(A)中融合的細胞，并從培養物中回收融合伴侶細胞的工序；(2)使抗體產生細胞與工序(1)中獲得的融合伴侶細胞再融合，從而獲得雜交瘤的工序；以及，(3)將工序(2)中獲得的雜交瘤作為抗體產生細胞回收的工序。本發明中，可以將抗體產生細胞進行克隆。通過將產生目標抗體的抗體產生細胞進行克隆，可以制成產生單克隆抗體的細胞。即，本發明提供包括以下工序的產生單克隆抗體的雜交瘤的制造方法(1)通過以下的工序獲得融合伴侶細胞的工序，(A)將以下的細胞(a)和(b)融合的工序，(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞、(b)來源于第2動物種且細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞，(B)培養在工序(A)中融合的細胞，并從培養物中回收融合伴侶細胞的工序；(2)使抗體產生細胞與工序(1)中獲得的融合伴侶細胞再融合而制成雜交瘤，并將產生目標抗體的雜交瘤進行克隆的工序；以及，(3)將工序(2)中經克隆的雜交瘤作為抗體產生細胞回收的工序。本發明的雜交瘤是在體外具有穩定的抗體產生能力的抗體產生細胞。因此，雖為異種雜交瘤，但在適當培養基中在細胞增殖的同時，抗體產生能力也維持。因此，在克隆的過程中失去必要的克隆的可能性較低。而且，已建立的雜交瘤克隆也可穩定地維持。通過由本發明獲得的雜交瘤或者其克隆的培養，可以產生抗體或單克20隆抗體。使用無血清培養基或低濃度血清培養基等作為培養基時，抗體的精制變得容易，因此優選。基本的動物細胞培養基己知有DMEM培養基、RPMI1640培養基或ASF培養基103等。另外，還可接種于裸鼠或SCID小鼠的腹腔，以腹水的形式回收單克隆抗體。當向培養基中加入血清時，可以以510y。v/v利用胎牛血清(以下簡稱為FCS)。另外，當在這些培養基中培養本發明的雜交瘤時，添加公知的抗體產生增強因子是有利的。在體外增強抗體產生的成分已知有例如D-青霉胺、乙酰乙酸、雙胍類、維生素K5、N-乙酰谷氨酸(特開平8-70858)、白細胞介素6(Nature,324:6092，73-6;1986)、糖醇(特開平2-200177)、脂多糖(特開平4-20294)、佛波酯(特開平1-171494)或丁酸(hyridomeVol.4，No.1，p63;1985)等。如此獲得的單克隆抗體可以通過利用硫酸銨、硫酸鈉等的鹽析法、離子交換色譜法、凝膠過濾法或者親和色譜法等進行精制。以下通過實施例具體地說明本發明，但本發明并非局限于這些實施例。另外，本說明書中引用的全部現有技術文獻均作為參考編入本說明書中。實施例[實施例1]融合伴侶細胞的制作根據常規方法用PEG使在RPMI+5%FCS(普通培養基)的培養液中培養的SP2/0-Ag-14(3xl07)和MEG-Ol(3~6xl07)的細胞進行融合。在普通培養基(RPMI+5°/。FCS)中培養融合細胞3天，在第3天用不含FCS的RPMI溶液培養19天。在第19天用含有8AG的普通培養基進行有限稀釋，并培養5天。由于融合細胞發生了增殖，因此取其作為融合伴侶細胞SPYMEG。SPYMEG以保藏編號FERMBP-10761(由FERMP-20816轉移)在2006年2月24日保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心。SPYMEG為8AG耐受性，用HAT培養基培養時死亡。利用PEG法制作異種雜交瘤21a)人末梢血白細胞的回收(比重離心法)以每次10mL將肝素采血的人末梢血40mL分注于50mL的管中，加入25mL滅菌PBC并混合，疊置于以每次15mL分注有HISTOPAQUE(SIGMAH8889)的50mL管中，在800rpm、室溫下離心30分鐘。離心后回收白細胞層。b)融合伴侶細胞(SPYMEG)的回收回收在75cm2培養燒瓶中增殖的SPYMEG(培養基10%FBS-RPMI)。c)細胞融合混合回收的人末梢血白細胞和SPYMEG，以達到2:110:l的比例，進行離心(從末梢血40mL獲得48xl(^個。SPYMEG使用4個75cn^培養燒瓶的量)。在團塊中加入0.61.0mL的50%PEG(PEG4000、MERCKCatNo.1097270100，用RPMI(RPMI1640、SIGMA、CatNo.R8758)等量稀釋)，進行細胞融合。用RPMI無血清添加培養基洗滌后，在15%FBS(EQUITECH-BIOINCLot.SFB30-1548)-HAT(HAT添加(BM-condimed、rocheCatNo.663573)(50x)、GIBCOCatNo.21060-017)1%BM培養基160mL中懸浮，并接種于8張96孔板中。接種開始3天后更換培養基，在確認雜交瘤的集落形成的階段(2~3周后)從96孔板中采樣培養上清，進行1次篩選。IgG精制方案以1滴/秒的流速將樣品(培養上清)上樣，回收通過液。用PBS/0.1%NaN3以最大流速洗柱(洗滌直至用吸光度計測達到A280=0.05以下)。用柱床體積的25倍量的0.17M甘氨酸-HC1緩沖液(pH為2.3)以全速的流速進行解離。使用級分收集器將解離物收集于試管中。在試管中預先放入有解離物量(mL)的1/5以上的lMTris-HCl緩沖液(pH為8.0)。解離物和中和用lMTris-HCl緩沖液(pH為8.0)盡量迅速地混合。測定各級分的A280后，尋找有蛋白的級分，集中A280=0.1以上的級分。集中后用pH試紙確認了pH為8.0。集中的級分用12.5%凝膠、樣品緩沖液(2ME+)進行SDS-PAGE，檢驗純度。每個帶道的樣品量為5昭，以前的批次也等量電泳，進行比較。裝于透析管中，用回收體積的100倍以上的PBS或PBS/0.1%NaN3以每次6小時以上透析3次以上。濃縮結束后用去離子水充分地洗滌透析管，充分地揉搓透析管，將附著在管壁上的蛋白質溶解，將濃縮液從管取出。之后測定濃度。或者，還可以不使用級分收集器，而是集中解離物并在1個量筒、燒杯等中邊攪拌邊回收。此時也放入解離物回收量(mL)的1/5以上的中和用1MTris-HCl緩沖液(pH為8.0)，回收后用pH試紙確認pH為8.0。如果pH為8.0以下時，加入中和用緩沖液，立即使pH為8.0。利用ELISA法測定人IgGa)致敏板的制作用致敏用緩沖液(PBS)將兔抗人IgG多克隆抗體稀釋至10jig/mL，按5(HU/孔分注到微孔板(NuncMaxiSorp)中。在4。C下靜置1晚。除去致敏用緩沖液，揮去水分。按100fil/孔分注封閉用緩沖液(PBS中含1%BSA、0.1%NaN3)，并在4"C下靜置1晚。b)ELISA法將雜交瘤培養上清按50^1/孔分注到致敏微孔板(a中準備的板)中，在室溫下靜置反應1小時。除去反應液，用洗滌用緩沖液(0.05%Tween20/PBS)洗滌3次后，揮去水分。稀釋識別抗體(過氧化物酶系，5000倍稀釋后使用，抗人IgGPOD識別多克隆抗體)，按50pl/孔分注后，在室溫下靜置l小時。調制酶底物液(四甲基聯苯胺溶液)。除去板的識別抗體，用洗滌用緩沖液洗滌3次后，揮去水分。按50pl/孔分注酶底物液。在室溫下反應15分鐘左右。按50|11/孔分注反應停止液(2N硫酸)。利用酶標儀(platereader)測定吸光度(主波長A450/副波長A620)。將本試驗中使用的ELISA法的概念圖示于圖2。利用Western印跡法來確認人IgG等量混合lmg/mL的抗體溶液和樣品緩沖液，煮沸5分鐘。將10H1(抗體5昭)上樣于12.5%凝膠。進行SDS-PAGE，轉印于PVDF膜(immobilon-PcatNo.IPVHOOOlO)，在4。C下用0/N的2。/。脫脂奶粉/PBS進行封閉。作為檢測用抗體，使用抗大鼠IgGPODx2500的10。/。BlockAce/PBS，在室溫下處理1小時。用緩沖液(0.05。/。Tween20的PBS)洗滌3次。底物使用PIERCE(SupersignalWestPico化學發光底物、code.34080)，曝光1分鐘，并進行顯影。膠片使用HyperfilmECLAmershamBioscienceCatNo.RPN3103K，顯影液使用RENDOL(富士膠片)，停止液使用3%醋酸，定影液使用RENFIX(富士膠片)。結果a)融合伴侶細胞的制作將所制作的融合伴侶細胞SYPMEG和現有的人融合伴侶細胞Karpas(AbrahamKarpasetal.,ProcNatlAcadSciUSA.2001Feb13;98(4):1799-1804)進行比較觀察(圖3)。SPYMEG為與一般的骨髓瘤細胞同樣的球形細胞，與Karpas相比粘著性弱。進而，增殖能力高(未顯示數據)。由此可知，SPYMEG作為融合伴侶細胞的性能高于Karpas。進而，所確立的融合伴侶細胞SPYMEF在冷凍后復蘇，即便進行lOOmL培養(培養1個月)時產生能力也不會消失，是穩定的(未顯示數據)。b)融合有SYPMEG和人末梢血白細胞的雜交瘤(抗體產生細胞)的制作表1表示由融合SYPMEG和人末梢血白細胞而獲得的雜交瘤(抗體產生細胞)產生IgG。將雜交瘤接種于8張96孔微孔板(768孔)，顯示形成了集落的孔數、其中產生了IgG的孔數、以及其中在培養3周以上時維持了IgG的產生的孔數。利用ELISA法進行篩選。由此結果可知，通過本試驗制作了產生IgG的雜交瘤。另外，從現有的融合伴侶細胞Karpas無法獲得IgG產生克隆。由此說明，SYPMEG是與Karpas相比可更高效地制作雜交瘤的融合伴侶細胞。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>將IgG產生克隆添加于蛋白質G柱后，對洗脫時的各洗脫級分利用SDS-PAGE禾nWestern印跡法進行確認(圖4)。圖中的(+)表示ELISA陽性克隆、(-)表示ELISA陰性克隆。K0142級分2為ELISA陽性，用SDS-PAGE也確認了人IgG的存在，但用Western印跡法無法確認信號。認為此次是由于某種原因而無法檢測。進而，確認了各克隆的洗脫級分、透析濃縮后的樣品(圖5)。利用SDS-PAGE在ELISA陰性克隆中也確認了認為是IgG的H鏈、L鏈的條帶，但使用抗人IgG抗體的Western印跡法的結果是未檢測到，因此猜測是FBS來源的IgG。在ELISA陰性克隆的帶道5上檢測到了條帶，但由于陰性的判斷是培養上清的ELISA的結果，因此認為該克隆產生了極少量的IgG。另外，由此次的結果可知，SPYMEG本身也不產生人IgG。表2表示由顯示陽性的各克隆培養上清得到的精制IgG的產量。由培養上清100mL得到的精制IgG計算出的培養上清中的人IgG濃度為2ll|ig/mL。確認是與通常的小鼠雜交瘤基本相同的濃度。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>[實施例7]異種雜交瘤的制作方法的改良在[實施例2]中，將末梢血用PBS稀釋，疊置于HISTPAQUE并進行離心，但為了獲得純度更高的白細胞(B細胞)，將末梢血與HetaSep(HETASTARCH)混合，進行除去紅細胞的前處理，然后利用疊置于HISTPAQUE的方法來回收人末梢血白細胞(圖6)。具體地說，將來源于接種了流感HA疫苗的患者的末梢血約10ml放入15ml管中，加入2~3ml的HetaSep(StemCellTechnologiesIncCAT#07906)。進行顛倒攪拌，并在室溫下靜置l小時。回收靜置后的上清(橙色)，用巴氏吸管按照不要擾亂界面的方式緩慢地在15ml管中疊置于HISTPAQUE。在1800rpm、室溫下離心分離30分鐘，離心分離后，用巴氏吸管將溶液的正中間區域出現的白色帶的層(白細胞層)回收于50ml管中。加入30ml左右的無血清培養基DMEM，在1600rpm下離心分離8分鐘以進行洗漆。利用[實施例2]中記載的方法，進行所回收的人末梢血白細胞與融合伴侶細胞SPYMEG的細胞融合。作為細胞融合的基礎培養基，使用無血清培養基DMEM來代替RPMI。對于所制作的異種雜交瘤，利用[實施例3]和[實施例4]中記載的方法，進行IgG的精制和利用ELISA法的人IgG的測定。結果，通過對異種雜交瘤的制作方法加以改良，確認了利用細胞融合獲得的集落的形成數和IgG產生克隆數均有所增加(圖7)。對流感疫苗的反應性的確認確認通過[實施例7]的方法制作的IgG產生克隆對流感疫苗的反應性。具體地說，通過以下的工序，用夾心ELISA來確認致敏了流感疫苗的板和未進行任何致敏而僅進行了封閉的板(除去非特異性反應的克隆)中的克隆的IgG產生。將用PBS稀釋30倍的流感疫苗以50|11/孔分注到ELISA板中，并靜置1晚(致敏)。作為流感疫苗，使用流感HA疫苗(化學和血液療法研究所，日本)。該制劑如下調制將流感病毒的A型和B型株分別單獨地在發育雞蛋中培養，利用蔗糖密度梯度離心法等將含有增殖了的病毒的尿囊液進行精制濃縮后，利用醚等來處理病毒粒子，制成血凝素(以下為HA)級分懸浮液，用福爾馬林進行惰化后，使用磷酸鹽緩沖氯化鈉溶液，按照各株病毒的HA含有規定量的方式進行稀釋，從而調制。除去溶液，按200pl/孔加入封閉緩沖液，并靜置l晚(封閉)。除去封閉緩沖液，按50pl/孔加入雜交瘤的培養上清，在室溫下反應l小時。除去上清，用0.05。/。TweenPBS洗滌3次。以5000倍稀釋加入抗人IgGHRP識別抗體(MBL:206)，在室溫下反應1小時。洗滌3次后，以每孔50^1加入顯色底物，使其顯色15分鐘，加入反應停止液，用酶標儀測定吸光度(OD450)。結果確認了有IO個克隆左右對流感疫苗產生反應(圖8)。通過本發明的異種雜交瘤，成功地確立了抗原特異性反應的人抗體。利用Western印跡法來確認人IgG將流感HA疫苗作為樣品，確認人IgG產生雜交瘤的培養上清的Western印跡法的反應性。等量混合流感HA疫苗和樣品緩沖液，煮沸5分鐘。將20pK疫苗lOpl)上樣于12.5%凝膠。進行SDS-PAGE，轉印于PVDF膜(immobilon-PcatNo.IPVH00010)，在4。C下用0/N的2。/。脫脂奶粉/PBS進行封閉。作為檢測用抗體，使用抗人IgGHRP(MBLcode206)x3000的10%BlockAce/PBS，并在室溫下處理1小時。用緩沖液(0.05%Tween20的PBS)洗漆3次。底物使用PIERCE(SupersignalWestPico化學發光底物、code.34080)，曝光1分鐘，并進行顯影。膠片使用HyperfilmECLAmershamBioscienceCatNo.RPN3103K，顯影液使用RENDOL(富士膠片)，停止液使用3%醋酸，定影液使用RENFIX(富士膠片)。結果，在克隆(6-19)中檢測到了特異性的條帶(圖9)。[實施例10]精制人IgG(6-19)的SDS-PAGE和反應性的確認首先，利用以下的工序，從[實施例9]的在Western印跡法中顯示了反應性的人IgG產生雜交瘤的培養上清中精制對流感HA疫苗產生反應的人IgG。以1滴/秒的流量將培養上清上樣，回收通過液。用PBS/0.1%NaN3-PBS以最大流速洗柱(蛋白質G瓊脂糖ProteinGSepharose4FastFlowCatNo:17-0618-03)(洗滌直至用吸光度計測得A280=0.05以下)。用柱床體積的2~5倍量的0.17M甘氨酸-HCl緩沖液(pH為2.3)以全速的流速進行解離。使用級分收集器將解離物收集于試管中。在試管中預先放入解離物量(ml)的1/5以上的中和用緩沖液1MTris-HCl緩沖液(pH為8.0)，將解離物和緩沖液迅速地混合。測定各級分的A280后，將檢測出蛋白質的級分中A280=0.1以上的級分集中。集中后用pH試紙確認了pH為8.0。集中的部分用12.5%凝膠、樣品緩沖液(2ME+)進行SDS-PAGE，檢驗純度(圖10)。將集中的級分裝于透析管中，用回收體積的100倍以上的PBS或PBS/0.1%NaN3，以每次6小時以上透析3次。濃縮結束后用去離子水充分地洗滌透析管，充分地揉搓透析管，將附著在管壁上的蛋白質溶解，將濃縮液從管中取出。之后，對濃縮液進行濃度的測定。由以上的結果確認了從培養上清200ml中獲得2.5mg的精制IgG(圖10)，且結合活性也得以保持。本發明對于利用動物細胞的物質生產是有用的。具體地說，通過與本發明的融合伴侶的細胞融合，可以將生產有用物質的細胞制成在體外容易培養的雜交瘤。作為產生有用物質的細胞，可以列舉出抗體產生細胞。艮口，本發明作為抗體的制造方法是有用的。特別是本發明可以以人抗體產生細胞作為材料來制造雜交瘤。通過本發明獲得的雜交瘤穩定地產生人抗體。例如，在從感染性疾病恢復的患者的血液中，產生將病原體或病原體所產生的毒素進行中和的抗體的細胞的存在的可能性較高。如果通過本發明將這種患者的抗體產生細胞制成雜交瘤，則可以產生對感染性疾病的治療有用的抗體。作為可通過本發明獲得治療用抗體的感染性疾病，例如可以列舉出流感、AIDS、HCV或HBV等病毒性肝炎等。或者，在癌癥患者的抗體產生細胞中，有可能存在產生對癌細胞具有抑制作用的抗體的細胞。如果通過本發明將這種抗體產生細胞制成雜交瘤，則可以獲得對癌癥治療有效的抗體。根據本發明的抗體制造方法，可以利用人的抗體產生細胞來獲得人的抗體。人抗體由于可以安全地投予給人，因此作為治療用的抗體是優選的。為了將從一般用作單克隆抗體的制造工具的小鼠獲得的抗體用于人的治療而必須要進行嵌合化或人源化等修飾，而與此相比可知，本發明的抗體制造方法作為治療用抗體的制造方法是有用的。29權利要求1.一種融合伴侶細胞，其能夠通過將下述的細胞(a)和(b)進行融合而獲得(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞；和，(b)來源于第2動物種且在細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞。2.權利要求1所述的融合伴侶細胞，其中，第l動物種為小鼠，骨髓瘤細胞選自以下所示的小鼠骨髓瘤細胞和從這些細胞株誘導的細胞株MOPC21、P3X63AG8、SP2/0、NS-1、P3.X63AG8.653、F0、S194/5.XXO.BU-l、FOX-NY和SP2/0-Ag14。3.權利要求1所述的融合伴侶細胞，其中，第2動物種為人，白血病細胞選自以下所示的白血病細胞和從這些細胞株誘導的細胞株MEG陽Ol、HEL、UT-7、M07e、MEG-A2和DAMI。4.權利要求1所述的融合伴侶細胞，其中，第1細胞為SP2/0-Ag14，第2細胞為MEG-01。5.以保藏編號FERMBP-10761保藏的融合伴侶細胞SPYMEG。6.—種雜交瘤，其能夠通過將下述的細胞(1)和(2)進行融合而獲得(1)能夠通過將下述的細胞(a)和(b)進行融合而獲得的融合伴侶細胞(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞；禾口，(b)來源于第2動物種且在細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞;以及，(2)第3細胞。7.權利要求6所述的雜交瘤，其中，第l動物種為小鼠，骨髓瘤細胞選自以下所示的小鼠骨髓瘤細胞和從這些細胞株誘導的細胞株MOPC21、P3X63AG8、SP2/0、NS-1、P3.X63AG8.653、F0、S194/5.XXO.BU-I、FOX-NY禾HSP2/0-Ag14。8.權利要求6所述的雜交瘤，其中，第2動物種為人，白血病細胞選自以下所示的白血病細胞和從這些細胞株誘導的細胞株MEG-Ol、HEL、UT-7、M07e、MEG-A2和DAM1。9.權利要求6所述的雜交瘤，其中，第1細胞為SP2/0-Ag14，第2細胞為MEG-Ol。10.權利要求6所述的雜交瘤，其中，融合伴侶細胞是以保藏編號FERMBP-10761保藏的SPYMEG。11.權利要求6所述的雜交瘤，其中，第3細胞為來源于與第2細胞相同動物種的細胞。12.權利要求ll所述的雜交瘤，其中，第3細胞為抗體產生細胞。13.—種制造融合伴侶細胞的方法，其包括下述工序(1)將下述的細胞(a)和(b)進行融合的工序(a)來源于第1動物種的骨髓瘤細胞、和(b)來源于第2動物種且在細胞周期中含有Extra-S期的白血病細胞；以及，(2)培養在工序(1)中融合的細胞，并從培養物中回收融合伴侶細胞的工序。14.一種制造雜交瘤的方法，其包括下述工序(1)使通過權利要求13所述的方法獲得的融合伴侶細胞與抗體產生細胞進行融合的工序；禾口，(2)培養在工序(1)中融合的細胞，并從培養物中回收雜交瘤的工序。15.—種制造抗體產生細胞的方法，其包括下述工序(1)使通過權利要求13所述的方法獲得的融合伴侶細胞與抗體產生細胞進行融合而獲得雜交瘤的工序；禾口，(2)將工序(1)中獲得的雜交瘤作為抗體產生細胞回收的工序。16.權利要求15所述的方法，其還附加性地包括將工序(1)中獲得的雜交瘤進行克隆的工序。17.—種制造抗體的方法，其包括下述工序(1)使通過權利要求13所述的方法獲得的融合伴侶細胞與抗體產生細胞進行融合而獲得雜交瘤的工序；禾口，(2)培養在工序(1)中獲得的雜交瘤，并從培養物中回收抗體的工序。18.權利要求17所述的方法，其還附加性地包括將工序(1)中獲得的雜交瘤進行克隆的工序。19.一種制造針對感染性疾病的抗體的方法，其包括下述工序(1)使通過權利要求13所述的方法獲得的融合伴侶細胞與抗體產生細胞進行融合而獲得雜交瘤的工序，所述抗體產生細胞來源于有感染性疾病的病原體抗原的暴露經歷的對象；禾口，(2)培養在工序(1)中獲得的雜交瘤，并從培養物中回收針對感染性疾病的抗體的工序。20.權利要求19所述的方法，其中，感染性疾病為流感、AIDS或病毒性肝炎中的任一種。全文摘要本發明提供融合伴侶細胞。通過將來源于第1動物種的骨髓瘤細胞與來源于第2動物種且細胞周期中具有Extra-S期、并具有使染色體為多倍體的性質的白血病細胞進行融合，從而制作能夠與小鼠以外的種制作異種雜交瘤的融合伴侶細胞。通過使該融合伴侶細胞與小鼠以外的物質產生細胞進行融合來制作異種雜交瘤，從而可以進行穩定的物質生產。文檔編號C12N5/00GK101466828SQ20078002211公開日2009年6月24日申請日期2007年4月13日優先權日2006年4月13日發明者兼田瑞穗,山本正雅申請人:株式會社醫學生物學研究所;山本正雅