專利名稱：：確定試樣中蛋白酶活性的方法
技術領域：
：本發明涉及一種方法，以及用于所述方法中的底物和由所述方法產生的4艮道分子(reporter)。具體而言，本發明涉及用于確定試樣中蛋白酶活性的方法，所述方法包括將所述試樣與底物混合，并且通過檢測報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性。本發明還涉及用于確定試樣中蛋白酶活性的方法中的底物和報道分子，所述方法包括將所述試樣與底物混合，并且通過檢測報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性。在另一方面，本發明涉及所述底物和報道分子在確定蛋白酶調節劑(protease—modulators)和4美選蛋白酶調節劑(candidateprotease-modulators)的功效中的用途。在另一方面，本發明涉及所述底物和報道分子在診斷受試者中的疾病或障礙中的用途。
背景技術：
：諸如金屬蛋白酶等蛋白酶能夠切割寬范圍的底物，例如膠原蛋白、粘蛋白(proteoglycan)和纖連蛋白(fibronectin)。因此，諸如金屬蛋白酶等蛋白酶在生物學重要的細胞介質(biologicalimportantcellmediators)(例如月中瘤壞死因子(TNF))的加工或分泌中被認為是重要的；以及在生物學重要的膜蛋白(例如低親和力IgE受體CD23)(更完整的列表，參見N.M.Ho叩er&a/.,(1997)BiochemJ.Hi:265-279)的翻譯后蛋白水解加工或脫落中被認為是重要的。金屬蛋白酶的實例包括基質金屬蛋白酶(MMPs)-例如膠原蛋白酶(MMP1、MMP8、MMP13)、明膠酶(MMP2、MMP9)、溶基質蛋白酶(stromelysins)(MMP3、MMP10、MMP11)、基質溶解因子(matrilysin)(MMP7)、金屬彈性蛋白酶(MMP12)、成釉溶素(enamelysin)(MMP19)、MT-MMPs8(MMP14、MMP15、MMP16、MMP17);reprolysin或釉質溶素(adamalysin)或MDC家族-其包括分泌酶和脫落酶(sheddases),例如TNF轉化酶(ADAM10和TACE);龍壞肽酶家族(astacinfamily)-包括酶，例如溶膠原加工蛋白酶(PCP);以及其它金屬蛋白酶例如可聚蛋白聚糖(aggrecanase)、內皮素轉化酶家族和血管緊張素轉化酶家族。迄今為止，已經使用了數種確定法來確定試樣中蛋白酶(例如金屬蛋白酶)的存在。例如，Hanemaaijer等人(1999,Ann.N.Y.Acad.Sci.,vol878,141-149)披露了確定腫瘤患者的尿中MMP9活性的確定法。所述確定法要求使用MMP9特異性抗體從生物學流體中俘獲MMP9，接著進行洗滌的步驟，然后與修飾的尿激酶(作為底物)和顯色底物一起培養。Bicket等人(1993,Analyticalchemistry212:58-64)披露了熒光肽底物(Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys-(Nma)-NH2),其可被MMP1和MMP9水解。為了確定酶的活性，所述確定法使用熒光肽底物和純化的MMP9或純化的MMP1。Mucha等人(1998,JBiologicalchemistry273:2763-2768)披露了可被MT1-MMP和ST3切割的合成底物。由Mucha等人描述的確定法教導了ST3和MT1-MMP的純化催化結構域和焚光標記底物的用途。Tung等人(1999-BioconjugateChem10:892-896)披露了使用帶有CaD底物間隔區的近紅外焚光(NIRF)探針來確定細胞培養物中組織蛋白酶D的活性。熒光底物Dabcyl-Gaba-Arg-Pro畫Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu(EDANS)-Gly-Lys-NH2(TNO003)用于監測來自類風濕性關節炎患者的滑液(synovialfluid)中溶基質蛋白酶(MMP-3)的活性(B.Beekmanda/,FEBSLetters1997,418(3)，305-309)。WO-A-03/025125披露了對MMP2、MMP9和MT1-MMP(MMP14)特異性的多肽序列。這些多肽序列可與治療部分或診斷劑(諸如熒光團)連接。WO-A-03/102544披露了MMP13特異性的多肽序列，以及熒光標記、比色標記、放射性標記和發光標記與所述多肽序列的連接。現有技術的確定法所存在的問題是底物要求用例如熒光團或放射性標記進行標記。現有技術的確定法所存在的另一問題是檢測到了任意肽鍵的斷裂，然而未檢測到特異性肽鍵的斷裂。一些現有技術的確定法所存在的另一問題是首先需要純化蛋白酶，然后才可檢測所述蛋白酶的活性。此外，現有技術的確定法無法用來確定蛋白酶調節劑的活性。本發明試圖解決/緩解與現有技術相關的一些問題。
發明內容下文提及通式(la)、(lb)、(lc)和(ld)的底物化合物。為了便于引用以及在任何合適的時候，將這些化合物統稱為通式(l)的底物化合物。因而，對通式(l)底物化合物的引用等同地適用于通式(la)、(lb)、(lc)和(ld)的底物化合物。此外，應該注意的是，通式(l)、(la)、(lb)、(lc)或(ld)的化合物優選的方面等同地適用于通式(l)、(la)、(lb)、(lc)或(ld)中的任何其它化合物。在本發明一個寬廣的方面，提供用于確定試樣中蛋白酶活性的方法，所述方法包括以下步驟(i)將所述試樣與底物混合，其中所述底物具有式(la)的結構R2XR(la)其中Ri為烴基(hydrocarbylgroup),R2為第一肽部分(firstpeptidemoiety)，R3為第二肽部分(secondpeptidemoiety),以及X選自O、S和NH;Y,為適當的取代基；以及Y2為適當的取代基；以及(ii)通過檢測具有式H-X-R,的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活10性；其中X選自O、S和NH;以及Rj為烴基。確定試樣中蛋白酶的活性是指定性評價和/或定量評價試樣中蛋白酶的活性。Y,優選為H。Y2優選為H。因而，在本發明一個高度優選的方面，所述底物具有式(lb)的結構其中R,為烴基，R2為第一肽部分，R3為第二肽部分，以及X選自O、S和NH。優選地，R！為單環結構或多環結構(monoorpolycyclicringstructure)。優選地，R,包含l、2或3個烴基環(hydrocarbylring)。在一些情況下，更優選包含2或3個烴基環。若Ri包含2個烴基環，則優選地，這些環為非稠環。若&包含3個烴基環，則優選地，這些環中的2個為稠環。烴基環中的一個或多個可含有雜原子-例如一個或多個N原子。烴基環中的一個或多個可為取代的。烴基環中的一個或多個可為不飽和的。優選地，R2包含至少兩個氨基酸基團，其中所述基團為天然氨基酸基團(aminoacid)或非天然氨基酸基團(unnaturalaminoacid)或它們的組合。優選地，R2包含至少三個氨基酸基團，其中所述基團為天然氨基酸基團或非天然氨基酸基團或者它們的組合。優選地，R3包含至少兩個氨基酸基團，其中所述基團為天然氨基酸基團或非天然氨基酸基團或者它們的組合。對于一些實施方案而言，優選地，R3包含至少三個氨基酸基團，其中所述基團為天然氨基酸基團或非天然氨基酸基團或者它們的組合。因而，在本發明一個優選的方面，所述底物具有式(lc)的結構Xo\Ri(lc)其中R^為烴基，SpS2、S3、S和S3，各自獨立地選自天然氨基酸基團或非天然氨基酸基團；L，為化學鍵或一個或幾個氨基酸基團；L2為化學鍵或一個或幾個氨基酸基團；G,為適當的端基；G2為適當的端基；X為O、S或NH;Y,優選為H;以及Y2優選為H。例如，L,可為一個或多個a、卩.......等等......o)-氨基酸基團，例如(舉例來說)Gly-Gly-Gly或y-丁酰胺。例如，L2可為一個或多個a、卩.......等等......co-氨基酸基團，例如(舉例來說)Gly-Gly-Gly或y-丁酰胺。例如，G!可為端基、保護基、發色團或熒光團。例如，G2可為端基、保護基、發色團或熒光團,在本發明一個優選的方面所述底物具有式(ld)的結構:o<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(Id)其中S!、S2、S3、S和S3，各自獨立地選自天然氨基酸基團或非天然氨基酸基團；L,為化學鍵或一個或幾個氨基酸基團；L2為化學鍵或一個或幾個氨基酸基團；G,為適當的端基;G2為適當的端基；X為O、S或NH;以及R,選自組1:組1:Cl、NC'、0O、OOX、X、x、xCICF。oN、、NO、、XNHX、X13其中組1中的X表示式(ld)底物的其余部分。其它方面本發明的一個方面提供了用于確定蛋白酶調節劑功效的方法'其中所述方法包括以下步驟(i)將所述的蛋白酶調節劑連同蛋白酶與具有式(l)的底物混合，以及(ii)通過檢測如本申請定義的具有式H-X-R,的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性。按照這種方法，可制備和/或然后配制更多的蛋白酶調節劑。配制步驟可包括以下操作中的一種或多種對所述蛋白酶調節劑進行衍生化；使所述蛋白酶調節劑形成前藥；將蛋白酶調節劑與一種或多種藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合。本發明的另一方面提供了用于確定候選蛋白酶調節劑功效的方法，其中所述方法包括以下步驟(i)將所述的候選蛋白酶調節劑連同蛋白酶與具有式(l)的底物混合，以及(ii)通過檢測如本申請定義的具有式H-X-R!的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性。按照這種方法，可制備和/或然后配制更多的候選蛋白酶調節劑。配制步驟可包括以下操作中的一種或多種對所述蛋白酶調節劑進行衍生化；使蛋白酶調節劑形成前藥；將蛋白酶調節劑與一種或多種藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合。本發明的另一方面提供了用于鑒別蛋白酶調節劑的方法，其中所述方法包括以下步驟(i)將所述的候選蛋白酶調節劑連同蛋白酶與具有式(l)的底物混合，以及(ii)通過檢測如本申請定義的具有式H-X-R,的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性。本發明的另一方面提供了一種方法，所述方法包括以下步驟鑒別蛋白酶調節劑，制備更多的經鑒別的蛋白酶調節劑和/或然后配制更多的經鑒別的蛋白酶調節劑；其中所述的鑒別部分包括以下步驟(i)將所述的候選蛋白酶調節劑連同蛋白酶與具有式(l)的底物混合，以及(ii)通過^r測如本申請定義的具有式H-X-Ri的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性。配制步驟可包括以下操作中的一種或多種對所述蛋白酶調節劑進行衍生化；使蛋白酶調節劑形成前藥；將蛋白酶調節劑與一種或多種藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合。在另一方面，本發明提供了具有式(l)的底物。在另一方面，本發明提供了在羰基和-NH-CH(X-R,)-基團之間的肽^:處能夠被蛋白酶斷裂的底物；其中R,為烴基并且X選自O、S和NH。在另一方面，本發明提供了具有式H-X-R,的報道分子，其中R!為烴基并且X選自O、S和NH;以及其中所述報道分子衍生自式(l)的底物。在另一方面，本發明提供了具有式H-X-R!的報道分子，其中R,為烴基并且X選自O、S和NH;以及其中R,選自組1:(組l)其中組l中的X表示報道分子的其余部分。本發明另一方面提供了用于確定試樣中蛋白酶活性的試劑盒，所述試劑盒包含(i)具有式(l)的底物；以及(ii)用于在試樣中檢測如本申請定義的具有式H-X-R1的報道分子的工具(means)。在另一方面，本發明提供了具有式(l)的底物用于檢測試樣中蛋白酶活性的用途。在另一方面，本申請提供了如本申請定義的具有式的報道分子用于檢測試樣中蛋白酶活性的用途。在另一方面，本申請提供了用于診斷受試者中的疾病或障礙的方法，所述方法包括以下步驟從所述受試者獲得試樣并且通過以下方法確定所述試樣中蛋白酶的活性，所述方法包括以下步驟(i)將所述試樣與具有式(l)的底物混合；(ii)通過檢測如本申請定義的具有式H-X-R,的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性。在另一方面，本發明提供了具有式(l)的底物，其用于診斷受試者中的疾病或障礙。在另一方面，本發明提供了如本申請定義的具有式H-X-R的報道分子，其用于診斷受試者中的疾病或障礙。在另一方面，本發明提供了用于確定試樣中蛋白酶活性的方法，所述方法包括將所述試樣與底物混合，其中所述底物在羰基和-NH-CH(X-R,)-基團之間的肽鍵處能夠被蛋白酶斷裂；以及通過檢測具有式H-X-R,的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性。X和如本申請所定義。在另一方面，本發明提供了用于確定蛋白酶調節劑功效的方法，所述方法包括用蛋白酶調節劑處理試樣和/或從用蛋白酶調節劑處理過的受試者獲得試樣；將所述試樣與底物混合，其中所述底物在羰基和-NH-CH(X-R,)-基團之間的肽鍵處能夠被所述蛋白酶斷裂；以及通過檢測具有式H-X-A的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性。X和R,如本申請所定義。在另一方面，本發明提供了用于確定候選蛋白酶調節劑功效的方法，所述方法包括用候選蛋白酶調節劑處理試樣和/或從用候選蛋白酶調節劑處理過的受試者獲得試樣；將所述試樣與底物混合，其中所述底物在羰基和-NH-CH(X-R,)-基團之間的肽鍵處能夠被所述蛋白酶斷裂；以及通過檢測具有式H-X-R,的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性。X和R,如本申請所定義。優點本申請描述的方法能夠檢測試樣中蛋白酶的活性，而不只是試樣中編碼蛋白酶的mRNA水平或多肽本身的水平。意料不到的是，本發明的底物避免了為了確定蛋白酶活性而加至底物中的對熒光標記、發光標記、比色標記(colorimetriclabel)或方文射性標記的需求。意料不到的是，本申請描述的確定方法能夠測量相關化學鍵處的斷裂。在本發明中，當蛋白酶在相關化學鍵處斷裂底物時，這導致了報道分子的產生(即釋放)。若蛋白酶在別處斷裂底物，則不產生報道分子。任何給定蛋白酶的特異性分布主要是由從斷裂位點處兩個方向延伸的底物氨基酸序列確定的。鄰近斷裂化學鍵的任一側的氨基酸通常是最重要的特異性決定子(determinantsforspecificity),盡管重要的決定氨基酸距斷裂位點可遠至6個位置(J.D.A.Tynddletal,2005,Chem.Rev.105,973-999-areviewofsubstraterecognitionbyproteases)。因此,予貞期在特異位點斷裂的；脊在性可隨適當序列的底物長度增加，直到至少這樣的限度當二級結構效應(即，折疊、螺旋構象)開始變得重要時。然而，并不希望受理論束縛，隨著底物長度的增加，存在下述增加的風險，即更長的序列在特異性蛋白酶的斷裂位點之間含有其它蛋白酶的斷裂位點。因而，如本申請描述的檢測特異性化學鍵斷裂的能力有利于促成可通過特異性蛋白酶來確定斷裂的確定。本申請描述的方法允許其它酶存在于試樣中。本申請描述的方法可用于監測蛋白酶調節劑的效應，因為所述方法不需要使用洗滌步驟。本申請描述的確定方法不需要使用對蛋白酶特異性的抗體。本申請描述的方法可使用組織作為試樣。如本申請描述的底物在不存在特異性蛋白酶時，在試樣(例如血清和血漿)中是穩定的。優選的方面蛋白酶調節劑優選為蛋白酶抑制劑。蛋白酶調節劑優選為蛋白酶活化劑。蛋白酶活化劑的一個實例為酵母聚糖(zymosan)。蛋白酶活化劑的其它實例可參見Rivera-MarreroW(2002，AmJPhysiolLungCellMolPhysiol282:L546-L555);Kadishe/"/(1986，Immunol.Res.5:129);Czop"a/(1978,LImmunol.120:1132);Wimams(1996,Clin.Immunother.5:392);Rossa/(1999,Immunopharmacology,42:61);Williamsa/(1978,JReticuloendothel.Soc.23:479);Kokoshis"a/(1978Science199:1340);Itoh(1997,Mediat.Inflamm.6:267);Williams(1997,Mediat.Inflamm.6:247)。候選蛋白酶調節劑優選為候選蛋白酶抑制劑。對于其它實施方案而言，候選蛋白酶調節劑優選為候選蛋白酶活化劑。優選地，試樣選自任何哺乳動物生物液體，例如尿、全血、血漿、血清、滑液、唾液(saliva)、痰(sputum)、支氣管肺泡液(bronchoalveolarfluid)、月S脊、液(cerebrospinalfluid)、鼻灌;先、液(nasallavage)、月申^j"液(lungliningfluid)、淚液(tearfluid)和皮膚水泡液(skinblisterfluids)。試樣優選選自細胞培養物、組織、組織切片和勻漿組織(homogenisedtissue)。蛋白酶優選為哺乳動物基質金屬蛋白酶(MMP)EC3.4.24-。優選地，基質金屬蛋白酶選自MMP1(EC3.4.24.7)、MMP2(EC3.4.24.24)、MMP3(EC3.4.24.17)、MMP8(EC3.4.24.34)、MMP9(EC3.4'24.35)、MMP12(EC3.4.24.65)和MMP13(EC3.4.24-)。所述基質金屬蛋白酶更優選為MMP9(EC3.4.24.35)。在一個供選的更優選的實施方案中，所述基質金屬蛋白質為MMP12(EC3A24.65)。在另一供選的優選的實施方案中，所述基質金屬蛋白質為MMP13(EC3.424-)。烴基RJ尤選選自芳基、雜芳基、芳基氧基芳基、聯芳基(biaryl)、烷基、環烷基、雜環烷基以及它們的衍生基團。R,更優選選自芳基、雜芳基、芳基氧基芳基、聯芳基以及它們的衍生基團。R,優選包含10至25個碳原子，優選包含10至20個碳原子。在一個高度優選的實施方案中，R!選自組l;其中組1中的X表示底物的其余部分。在一個高度優選的實施方案中，R,選自組l;其中組1中的X表示報道分子的其余部分。底物優選為1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R-(4-硝基苯基氨基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基-(3-丙氨酸曱酯。報道分子優選為4-硝基苯胺、聯苯-4-基-曱醇、4-(5-對曱苯基-[l，3,4]。惡二唑-2-基)-苯胺、N-羥基-2-苯基-乙酰胺、聯苯-4-曱酸羥基酰胺或2-(-4-異丁基-苯基)-丙酸(Ibuprofen⑧)。具有式H-X-R,的報道分子更優選為4-硝基苯胺、4-(5-對甲苯基-[1,3，4]噁二唑-2-基)-苯胺或聯苯-4-基-曱醇。在一個高度優選的實施方案中，報道分子為4-硝基苯胺。所述疾病或障礙優選選自類風濕性關節炎、骨關節炎；多發性硬化癥；氣道疾病諸如哞喘、鼻炎、慢性支氣管炎、慢性阻塞性細支氣管炎(chronicobstructivebronchiolitis氣道纖維化和慢性阻塞性肺病(COPD)。所述疾病或障礙更優選為骨關節炎、哮喘或慢性阻塞性肺病(COPD).在一個高度優選的實施方案中，所述疾病或障礙為骨關節炎。在另一個高度優選的實施方案中，所述疾病或障礙為慢性阻塞性肺病(COPD)。圖1.用不同量的酵母聚糖刺激來自健康志愿受試者的全血之后獲得的4-硝基苯胺的平均濃度分布。圖2.用不同量的酵母聚糖刺激來自吸煙者的全血之后獲得的4-硝基苯胺的平均濃度分布。圖3.用不同量的酵母聚糖刺激來自COPD患者的全血之后獲得的4-硝基苯胺的平均濃度分布。20具體實施方式蛋冷^如本申請使用的術語"蛋白酶，，是指水解肽鍵的酶。換言之，蛋白酶是斷裂蛋白質的氨基酸之間的肽鍵(該過程是指溶蛋白性裂解)的酶。蛋白酶還指的是角罕蛋白酶(proteinases)、月太酶或蛋白7jc角罕酶(pr0te0lyticenzymes)。根據酶命名法編號EC3.4，，對蛋白酶進行分類。蛋白酶是根據其活性位點的最顯著的官能團分類的。目前有6類蛋白酶絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。已知蛋白酶的凄史才居庫可見http:〃merops.sanger.ac.uk(Rawlings,N.D.，ToUe,D.P.&Barrett,A丄(2004)M五/OT^:thepeptidasedatabase.A^c/^c爿c油32Databaseissue,D160-D164。金虞蛋白獰金屬蛋白酶(或metalloproteases)在其活性位點中結合金屬離子，諸如Zn"或Ca^。所述離子通常用于配位二至四個側鏈，并且其對于酶的活性而言是必不可少的。離子本身還由一個水分子配位，其對于催化活性而言也是決定性的。金屬蛋白酶纟皮分泌為酶原(pro-enzyme),并且其激活要求斷裂與活性位點鋅原子結合的前肽序列。這種活性可通過用酵母聚糖培養全血細胞來促進。存在金屬蛋白酶的兩種亞族金屬羧基肽酶(EC3.4.17)和基質金屬蛋白酶(MMP,還指的是金屬內切蛋白酶或基質蛋白酶(加atrixins)-EC:3.4.24)。蛋白酶優選為基質金屬蛋白酶(MMP)EC3.4.24,。差,金虞蛋白躇fMM尸s」-五CKW,MMPs為細胞外蛋白酶，其在中性pH起作用以切斷各種各樣的底物(例如基底膜和細胞外基質成分、生長因子和死亡因子、細胞因子，以及細胞和基質粘附分子-Bergersand.CoussensC群，.G麼ADev.200010120;VisseandNagase0>c.i^as.200392827;EgebladandWerbAtoCa"cer20022161)。寬范圍的底物特異性和MMPS的表達模式導致其牽涉在許多不同的進程中，包括正常進程和病理學進程。已經在以下疾病和障礙中發現了MMPs的異常表達哮喘、癌癥、血管生成(angiogenesis)、類風濕性關節炎、骨關節炎(osteorarthritis)、骨質疏松癥、腸炎性疾病(intestinalinflammatorydiseases),牙周病、動脈粥樣硬化、肺氣腫、多發性硬化癥、先兆子癇和十曼性創傷，以及其它疾病和障礙(BergersandCoussensCwr.(ewef.Dev.200010120;VisseandNagaseCVrc.h.200392827;Nelson.&a/./C7/",2000181135)。MMP蛋白的一般結構的組成如下指導細胞分泌的前結構域(predomain)、原結構域(prodomian)、催化結構域和C-末端血紅素蛋白結構域。為了發揮作用，MMPs需要結合Ca"和Zn"離子-只有Zn"在酶的活性位點結合，僅需要Ca"用于維持分子構象。酶的非活化形式或酶原(zymogen)是通過蛋白水解除去原結構域來活化的(WoessnerandNagaseAfefaZ/oprate^seiSJZMRy.2000OxfordUniversityPress)。基于已知基質金屬蛋白酶的結構和功能的考慮，如N.M.Hooper(1994)FEBSLetters1M:l-6中所述，已將MMPs分為家族和亞家族。基質金屬蛋白酶(MMPs)的實例包括膠原蛋白酶(MMP1、MMP8、MMP13)、明膠酶(MMP2、MMP9)、間質溶解素(MMP3、MMP10、MMPll)、基質溶解因子(MMP7)、金屬彈性蛋白酶(MMP12)、釉質溶解素(MMP19)、MT-MMPs(MMP14、MMP15、MMP16、MMP17)。基質金屬蛋白酶優選選自MMP1(EC3.4.24.7)、MMP2(EC3.4.24,24)、MMP3(EC3.4.24.17)、MMP8(EC3.4.24.34)、MMP9(EC3.4.24.35)、MMP12(EC3.4.24.65)和MMP13(EC3.4.24,)。基質金屬蛋白酶更優選選自MMP8(EC3.4.24.34)、MMP9(EC3.4.24.35)、MMP12(EC3.4.24.65)和MMP13(EC3.4,24.畫)。在一個高度優選的實施方案中，所述基質金屬蛋白酶為MMP9(EC3.4.24.35。在另一個高度優選的實施方案中，所述基質金屬蛋白酶為MMP12(EC3.4.24.65)。在另一個高度優選的實施方案中，所述基質金屬蛋白酶為MMP13(EC3.4.24,)。22MMP1，又稱為膠原蛋白酶(EC3.4.24.7),是由Brinckerhoff等人(1987■//wve"79:542-546)鑒別的。膠原蛋白酶是唯一能夠啟動I、II和III型間質膠原蛋白分解的酶。它還可切割VII和X型膠原蛋白。膠原蛋白為體內最豐富的蛋白質，而膠原蛋白酶為遍在酶(ubiquitousenzyme)。UniProt登錄號P03956和P08156,詳述了具有MMP1活性的多肽序列。例如，P03956在約四分之三分子長度(在775-Gly-)從N-末端斷裂三股螺旋。MMP2,又稱為明膠酶2，被分泌為酶原。酶原的切割導致可溶的活性形式產生，所述活性形式進一步被存在于癌細胞表面的受體捕捉(BrooksP.etal.,1996,Cell,31;85(5):683-93)。MMP2由前體形式向成熟形式的活化是復雜的機理，其涉及膜型的MMPs(MT-MMPs)。MT1-MMP(MMP14)為最有力的MMP2活化劑。當MMPs與特異性抑制劑(例如TIMP1和TIMP2)形成復合物時，MMPs的細胞外活性受到抑制。MMP2切割I型明膠和IV、V、VII、X型膠原。UniProt登錄號P08253詳述了具有MMP2活性的多肽序列。例如，P08253切割膠原樣序列Pro-Gln-Gly+Ile-Ala-Gly-Gln。它還在Gly+Leu鍵處切割KiSSl。MMP3(也稱為成纖維細胞溶基質蛋白酶或轉換素)是與膠原蛋白酶(MMPl)密切相關的粘蛋白酶(proteoglycanase)。MMP3是分泌的金屬蛋白酶，主要由結締組織細胞產生的。MMP3具有寬范圍的底物特異性并且能夠降解粘蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白和IV型膠原蛋白，但不能降解間質I型膠原蛋白。UniProt登錄號P08254和Q6GRF8詳述了具有MMP3活性的多肽序列。例如，P08254可降解纖連蛋白；層粘連蛋白；I、III、V和V型明膠；III、IV、X和X型膠原蛋白，以及軟骨粘蛋白。它還可活化前膠原蛋白酶。P08254優選在疏水性殘基處切割。MMP-3的活性已經在從炎性齒齦分離到的成纖維細胞中得到了證明[UittoV.J."a/,1981,J.PeriodontalRes.,Ji:417-424]，并且已將酶水平與齦疾病的嚴重度相關聯[OverallC.M.a/,1987,J.PeriodontalRes.,^:81-88]。MMP-3還由多種慢性潰瘍中的基質角質化細胞產生[Saarialho-KereU.K.""/，1994，J.Clin.Invest"24:79-88]。在與很可能代表增生表皮位點的創傷邊緣臨近但末端遠離的基質角質化細胞中檢測到MMP-3mRNA和多肽。因而，MMP-3可能阻止表皮愈合。幾位研究者已證明在來自患風濕癥和骨關節炎的患者滑液中的MMP-3,與對照組相比一致升高[WalakovitsL.A.a1992,ArthritisRheum"11:35-42;ZafamllahM.da/，1993，J.Rheumatol"2^:693-697]。MMP-8(膠原蛋白酶-2或嗜中性粒細胞膠原蛋白酶)優先在嗜中性粒細胞中表達。研究表明MMP-8也在其它細胞(諸如骨關節炎軟骨細胞)中表達[Shlopova/,1997,ArthritisRheum,處2065]。UniProt登錄號P22894和Q45F99詳述了具有MMP8活性的多肽序列。例如，P22894可降解原纖維I、n和n型膠原。此外，它在三股螺旋結構域切割間質膠原蛋白。由嗜中性粒細胞產生的MMPs可？1起組織再造(tissueremodelling),因此阻斷MMP-8對纖維化疾病(例如肺纖維化)和退4H生疾病(諸如肺氣肺)應具有正性效應。還已經發現MMP-8在骨關節炎中被上調，從而表明阻斷MMP-8對這種疾病也可能是有益的。MMP9(明膠酶B;92kDIV型膠原蛋白酶；92kD明膠酶)是分泌性蛋白質，其是在1989年首先被純化，然后克隆并排序[S.M.Wilhelm"a/(1989)J.BiolChem.264(29):17213-17221;publishederratuminJ.BiolChem.(19卯)265(36):22570]。UniProt登錄號P14780、Q8N725，Q9H4Z1和Q3LR70詳述了具有MMP9活性的多肽序列。例如，P14780在Gly-切割KiSSl。P14780切割I型和V型明膠以及IV型和V型膠原蛋白。Vu和Werb(1998)對蛋白酶MMP9進行了綜述(In:24MatriXMetalloproteinases.1998.EditedbyW.C.Parks&R.RMecham.ppll5-148.AcademicPress.ISBN0-12-545090-7)。以下要點來自T.H.Vu&Z.Werb(1998)的這篇綜述。MMP9的表達通常受限于幾種細胞類型，包括滋養母細胞、破骨細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞。然而，MMP9的表達可在這些相同細胞中和其它細胞類型中由一些介質引起，包括使細胞與生長因子或細胞因子接觸。這些是常常在啟動炎癥應答中牽涉的相同介質。如同其它分泌性的MMPs一樣，MMP9被釋;故為無活性的酶原，隨后酶原被切割，形成酶促的活性酶。這種體內活化所需的蛋白酶是未知的。活性MMP9相對于非活性酶的平衡通過與一種天然存在的蛋白TIMP-1(金屬蛋白酶-1的組織抑制劑)相互作用在體內進一步得到調節。TIMP-1與MMP9的C-末端區結合，導致MMP9的催化結構域的抑制作用。ProMMP9的誘發表達的平衡、ProMMP9至活性MMP9的切割和TIMP-1的存在結合在一起，以確定存在于局部位點的催化活性MMP9的量。蛋白水解活性MMP9攻擊包括明膠、彈性蛋白和天然IV型和V型膠原蛋白的底物；它對天然I型膠原、粘蛋白或層粘連蛋白沒有活性。MMP9牽涉在各種生理學和病理過程中。生理學作用包括在胚胎移植的最初階段胚胎滋養母細胞經過子宮上皮侵入；在骨生長發育中的一些作用；和炎癥細胞從脈管系統遞送到組織。已經在以下疾病中觀察到MMP9表達增加，例如COPD、哞喘、關節炎、腫瘤轉移、阿爾茲海默氏病、多發性硬化癥，以及在導致急性冠狀病癥(諸如心肌梗塞)的動脈粥樣硬化中的斑塊破裂(plaquerupture),由此使MMP9牽涉在疾病進程中。MMP12,又稱為巨噬細胞彈性酶或金屬彈性蛋白酶，最初由Sh叩iro等人在小鼠中克隆出(1992,JournalofBiologicalChemistry巡4664),并且在1995年由同一'卜組在人類中克隆出(Belaaouaij"a/1995,JbiolChem270:14568-14575)。UniProt登錄號P39900詳述了具有MMP12活性的多肽序列。MMP12優先在活化巨噬細胞中表達，并且已經表明由來自吸煙者的肺巨噬細胞中分泌(Shapiro&a/,1993,JournalofBiologicalChemistry,巡:23824),以及從動脈粥樣硬化病變的泡沫細胞中分泌(Matsumoto"a/，1998,AmJPathol153:109)。COPD的小鼠模型基于用香煙挑戰小鼠，使小鼠吸煙六個月，每天兩支香煙，每周六天。在這種處理后野生型小鼠產生了肺氣胂。當在該模型中對MMP12基因敲除小鼠進行測試時，它們沒有出現顯著的肺氣腫，這表明MMP12是COPD發病機理的關鍵酶。MMPs例如MMP12在COPD(肺氣腫和支氣管炎)中的作用已經，在Anderson和Shinagawa，1999，CurrentOpinioninAnti-inflammatoryandImmunomodulatoryInvestigationalDrugs1(1):29-38中進行了討論。Matetzky等人(2000)披露，吸煙增加了在人類的頸動脈斑點中的巨噬細胞滲透和巨噬細胞衍生的MMP-12的表達(MatetzkyS，FishbeinMC"a/.，Circulation102:(18)'36-39Suppl.S,Oct31,2000)。MMP13，或膠原蛋白酶3，最初是從衍生自乳房腫瘤的cDNA文庫中克隆而得到的(J.M.P.Freije(1994)JournalofBiologicalChemistry269(24):16766畫16773)。UniProt登錄號P45452和Q6NWN6詳述了具有MMP13活性的多肽序列。對由寬范圍組織得到的RNAs的分析表明，MMP13表達受限于乳腺癌，因為在以下組織中未發現MMP13:乳腺纖維腺瘤、正常或靜止乳腺、胎盤、肝臟、卯巢、子宮、前列腺或腮腺或乳腺癌細胞系(T47-D、MCF-7和ZR75-1)。在該觀察之后，在下列中檢測到MMP13:轉化的表皮角質化細胞(Johansson"g/"1997CellGrowthDiffer.§(2}:243-250)、鱗狀細胞癌(ohansson"a/.,(1997)Am.J.Pathol.151(2):499-508)和表皮肺瘤(irolaa/.，(1997)J.Invest.Dermatol.109(2):225-231)。這些結果表明，MMP13是由轉化的上皮細胞分泌的，并且可能牽涉在肺瘤轉移相關的細胞外基質降解和細胞-基質作用(尤其是正如在乳腺浸潤性癌損傷中和皮膚癌中惡性上皮生長中觀察到的)。最近出版的數據暗示，MMP13在其它結締組織的更新中起作用。例如，與MMP13的底物特異性以及用于降解II型膠原優先一致的是(MitchellWa/.,1996J.Clin.Invest.97(3):761-768;Knauper&a/.,1996TheBiochemical26Journal^21:1544-1550),已經假設MMP13在以下方面起到作用初期成骨和骨骼再造(Stahle-Backdahl"a/.,1997Lab.Invest.76(5):717-728;Johanssonef"/.，1997Dev.Dyn.2Q8(3):387-397);在破壞性關節疾病例如類風濕性關節炎和骨關節炎(Wernickee/o/.，1996J.Rheumatol.21:590-595;Mitchell"a/.,1996J.Clin.Invest.97D):761-768:Lindye/a/.,1997ArthritisRheum頓8):1391-1399);以及髖關節置換術的無菌松弛(asepticloosening)(Imai"a/.,1998J.BoneJointSurg.Br.,、:701-710、。MMP13也牽涉在慢性成人牙周炎中(因為它已局限于慢性炎性粘膜人牙齦組織的上皮(V.J.Uitto"a/.，1998Am.J.Pathol152(6):1489-1499))和慢性創傷中膠原基質再造中(Vaalamoa/.，1997J.Invest.Dermatol.109(1):96-101)。^浙和孩道^f如本申請使用的術語"底物，，是指具有式(l)的化合物-即通式(la)、(lb)、(lc)或(ld)的化合物。如本申請使用的術語"報道分子"是指具有式H-X-Ri的化合物；其中&為烴基；R2為第一肽部分；R3為第二肽部分；以及X選自O、S和NH。X優選為S。在一個供選的實施方案中，X優選為NH。烴基R,優選選自芳基、雜芳基、芳基氧基芳基、聯芳基、烷基、環烷基、雜環烷基以及它們的衍生基團。R,更優選選自芳基、雜芳基、芳基氧基芳基、聯芳基以及它們的衍生基團。在一個高度優選的實施方案中，Ri選自組i，其中組1中的X表示底物的其余部分。在一個高度優選的實施方案中，R,選自組l,其中組1中的X表示具有式H-X-R,的報道分子的其余部分。録如本申請使用的術語"烴基，，表示至少包含C和H，以及可任選包含一個或多個其它適當取代基的基團。所述取代基的實例可包括鹵素-、烷氧基-、羥基-、硝基、烴基團(hydrocarbongroup)、酰氨基、氨基甲酸酯基、酯基(例如酰基)、氰基、N-酰基、環狀基團等等。取代基除了可為環狀基團外，取代基的組合還可形成環狀基團。若烴基包含不止一個C,則這些碳沒有必要彼此相連。例如，至少兩個石友可通過適當的元素或基團相連。因而，爛基可含有雜原子。適當的雜原子對本領域技術人員而言是顯見的，并且包括，例如硫、氮、氧、硅和磷。例如，烴基可選自芳基、芳基氧基芳基、聯芳基、烷基、環烷基、雜環基以及它們的衍生基團。例如，烴基可選自吡啶基或嘧吱基。遂顛在本申請中術語"烴"表示烷基、烯基、炔基、酰基的任何一種，所述基團可為直鏈的、支化的或環狀的，或為芳基。術語"烴基團"還包括任選被取代的基團。若烴為具有一個或多個取代基的支化結構，則可在烴骨架上或直鏈上進行取代；或者可在烴骨架上和直鏈上進行取代。染絲在本申請中術語"雜環基"表示環中包含至少一個碳原子和至少一個雜原子的環狀環。雜環基可為雜環烷基或雜芳基。適當的雜原子對本領域技術人員而言是顯見的，并且包括，例如硫、氮、氧、硅和磷。雜環可任選被一個或多個適當的取代基取代。所述取代基的實例可包括卣素-、烷氧基-、卣素取代的烷氧基-、羥基-、硝基、烴基、酰氨基、氨基曱酸酯基、烷基氨基曱酸酯基、酯基、氰基、N-酰基或環狀基團，例如芳基等等。除了取代基可為環狀基團外，取代基的組合可形成環狀基團。在本發明的一個實施方案中，所述化合物可以是衍生物。如本申請使用的術語"衍生物"包括化合物的化學修飾。所述化學修飾的示例可以是用以下基團代替氫卣素、烷氧基、鹵素取代的烷氧基、羥基、硝基、烴基、酰氨基、氨基甲酸酯基、烷基氨基曱酸酯基、酯基諸如酰基、氰基、N-酰基或環狀基團例如芳基。賴差本發明的化合物可含有除本申請說明的環系之外的取代基。此外本申請說明的環系是作為通式給出的，并且應如此解釋。在給定環部分上缺失任何具體說明的取代基，這表明環部分可被任何部分取代，其中H僅僅是給出的示例。環系可含有一個或多個不飽和度，例如在一些方面，環系的一個或多個環為芳族的。環系可為碳環或可含有一個或多個雜原子。厥命為、第一肽部分(112)和第二肽部分(R3)包含肽部分(peptidicmoieties)。如本申請使用的肽部分是包含一個或多個經肽鍵相連的氨基酸的基團。氨基酸可為一種或多種天然氨基酸或一種或多種非天然氨基酸或者它們的組合。優選的氨基酸實例為a-氨基酸單元。肽部分可進一步包含一個或多個P-、y-、-或5-氨基酸單元。氨基酸單元可在末端經端基、保護基、發色團或熒光團封端(cap)。若底物除攜帶報道分子基團之外，還攜帶發色團或熒光團，則底物可用于在相同試樣中同時或分別確定在任何化學鍵和特異性化學鍵的斷裂。Rz優選為二肽、三肽或四肽。R^尤選為二肽、三"太或四肽。R2優選為三肽S3-S2-S1,其中S3選自脯氨酸或甘氨酸，S2選自亮氨酸、環己基丙氨酸(cyclohexylalanine)、苯丙氨酸、酪氨酸，以及S1選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸或組氨酸。R2更優選為脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸。可供選擇地，R2更優選為甘氨酸-亮氨酸-丙氨酸。R3優選為二肽S2，-S3',其中S2'選自亮氨酸、環己基丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸，以及S3，選自甘氨酸、(3-丙氨酸或缺省。R3更優選為亮氨酸-P-丙氨酸。端差在一些實施方案中，底物可包含端基以消除N-末端和/或C-末端的電荷。所述端基還可為可特異性除去的保護基。適當的端基和保護基對本領域技術人員而言是顯見的。所述端基和保護基以及加入和/或從底物中除去它們的方法可通過常規技術實現，例如"ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis"byTWGreeneandPGMWuts,JohnWileyandSonsInc.(1991)中，和P丄Kocienski，in"Protectinggroups",GeorgThiemeVerlag(1994)中所描述適當的N-末端端基(式lc和ld中的Gl)包括乙酰基、苯甲酰基、叔丁氧羰基、芐氧羰基和芴曱氧羰基。適當的C-末端端基(式lc和Id中的G2)包括曱酯、乙酯、叔丁酯、曱基和苯基酰胺酰胺。本發明的底物化合物可通過標準化學技術制備。例如，式II的合成塊可如下制備-諸如通過Paulitz等人在J.Org.Chem.,1997，62(24)，8474-8中描述的技術制備，然后用于制備式(l)的化合物。其中R,為烴基或聚苯乙烯聚合物，SI選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和組氨酸，任選適當的時候被保護，Ptn為端基，優選為保護基，X選自O、S和NH;可供選擇地，可調整它們的制備以連接巰基衍生的聚合物，優選為聚苯乙歸o優選地，式II的合成塊可通過以下方式制備使N-保護的氨基酸單位酰胺Ptn-Sl-NH2與乙醛酸反應，然后用硫醇R1-SH和酸催化劑諸如硫酸處理中間體式II的組成部分可為可溶的和/或聚合的。優選地，Ptn為芴曱氧羰基(Fmoc)。可通過標準肽合成方法將式II的組成部分引入式Ie底物的全長前體中。30肽合成的一般原則以及氨基酸單位側鏈的保護策略可為本領域技術人員所應用并熟知。涉及主題的一般教科書包括"PrinciplesofPeptideSynthesis"byM.Bodansky(Springer-Verlag1984)和"SolidPhasePeptideSynthesis:APracticalApproach"byE.AthertonandR.C.Shepperd(IRLPress,OxfordUniversityPress1989)。a)利用在連接的固體載體上的固相肽合成器，制備底物。N-保護基優選為Fmoc;Pol為聚合載體，優選為聚苯乙烯珠，G,、G2、"、L2、S,、S2、S3、S2，、Ss，如式Id中所定義。處AS3,結合幼結合部分II"2、N;/俁;i盧UNIN—賊保fzS2'丄2、N-脫保護H，N,2、PolM-W/l承fH2N、S''L2、Po|-H，hjz2'S，'2、Pol-p結合S2H結合S3H2N、S「NY^N-S2:S3'、、P。iN-脫財H2fS2'S,2、p。，認財s人s、R1R10On結合卄HW^r^srNY^^S2''5/1"2^-脫保^H2N"1、S:TS2-《NY^N^2:S3''L2、P。IS、R1^、o結合G1,S2,N、人，S，'丄，，合G2G,Z卜Sf2、S「^"^N,2.S3'L2、H純化，由聚合物載體釋故^純化、R1O乂L，、>|、^i^^S,'丄，G廣1《2《^j^、z、'2'G2S、IeR1b)利用單肽、二肽、三肽和四肽等組成的溶液合成制備底物。N-保護基，Ptn優選為Fmoc;G!、G2、L!、L2、S2、S3、S2，、S3，如式Id中所定義。c)可供選擇地，當R,為固體載體例如聚苯乙烯時，式II的合成部分可在兩個方向都增長。N-保護基Ptn優選為Fmoc;G,、G2、L,、L2、S,、S2、S3、S2，、S3，如式Id中所定義。31<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>這導致了式lc肽的形成，其中R!優選為聚苯乙烯聚合物。可供選擇地，R,為選自組1中的結構的報道分子取代基，在所述情況下，肽構成了式ld的底物，其中X為S。N-保護基Ptn優選為Fmoc;G,、G2、L,、L2、S、S2、S3、S2，、S3，如式Id中所定義。當肽具有所需的序列和適當的端基封端(如果需要的話)時，通過標準方法將其從固體載體中釋放，其中當使用方法a)時，最后在切斷末端進行修飾，或用親硫試劑(優選為N-碘代琥珀酰亞胺(NIS))處理方法b)和c)(步驟d)的產物，然后使其與過量的式H-X-Ri的乙醇、苯酚、硫醇或胺反應，獲得式ld的底物。優選將這些產物分離為其非對映異構體，因為比其它立體異構體相比，-XRo殘基的立體化學對應為天然底物的立體化學的肽能夠被十分有效地切割。3R1-XHOIeSiIdX、R1若在引入-XR,后進一步的修飾是期望的，則所需的保護基處理優選為非酸性條件和偶聯反應(couplingreaction)。可供選擇地，R,-X基團可通過氯或溴衍生物(lf)進行置換〇l一s，一n、義々s，'—，l,Cl2或Br2OIe、R1If/s2'丄2、n'2's。'2g.R)-XH堿,l卜，s2,n/^/s2'丄2、g<1、sr2-s:T、'z'2、X、idR1任選地，若式(l)的取代基XR,為式II和III的SR!，則步驟(d)的硫醇置換反應是不必要的。勿教戚參以Z蘭孩道分子具有式(1)的本發明底物能夠被蛋白酶切割。換言之所述底物能夠被蛋白酶進行酶消化(enzymaticallydigested)。由于具有式(1)的底物被蛋白酶斷裂，形成了具有式H-X-R,的報道分子。所述酶反應表示如下切割o\HOHOII7\ifjl蛋白酶/III-NH3+H2。,Ix\x、切割箭頭表示蛋白酶的作用位點。當具有式(i)的底物在有關的化學鍵被斷裂時，得到的中間體化合物(v)是不穩定的中間體，其中X為雜原子(O、S或NH)。中間體化合物V中的氨基為給電子基團，并且使側鏈的化學鍵-XR,變得不穩定，其快速被水解。這導致了化合物vn(即報道分子)的形成。若蛋白酶在別處切割底物，則不產生化合物式vn(即報道分子)。因而底物中的X和R,與報道分子中的X和R,相同。如本申請使用的術語"釋放，，是指如本申請描述的底物被蛋白酶進行酶消化后，產生上述酶反應中描述的報道分子。如本申請使用的術語"有關化學鍵(bondofinterest)，，是指式(l)底物中被蛋白酶切割并導致報道分子H-X-R,形成的化學鍵。有關化學鍵在羰基和NH-CH(X-RO基團之間。33孩道分子的y會豸如本申請使用的術語"蛋白酶的活性"是指蛋白酶的酶活性。可通過將試樣與具有式(l)的底物混合，并且檢測具有式H-X-R,的報道分子的存在來確定試樣中蛋白酶的活性。優選將混合物培養5至120分鐘之間，更優選將所述反應混合物培養約30分鐘。在一個高度優選的實施方案中，一旦將具有式(l)的底物加至試樣中，將所述反應混合物培養約15分鐘。優選將混合物在15至4(TC的溫度之間培養。更優選將混合物在約37°C培養。可通過以下方法檢測試樣中具有式H-X-R,的報道分子的存在利用HPLC、LC-UV、LC-MS或熒光測量(若R1為熒光團，并且在底物中別處存在猝滅基團或反之亦然)。因此如本申請使用的術語"用于檢測報道分子的方法"是指用于檢測試樣中具有式H-X-R,報道分子的存在的適當方法，例如HPLC和LC-MS。HPLC和LC-MS是本領域熟知的技術(參見例如，SnyderandKirkland-In加ductiontoModernLiquidChromatography,Secondedition,JohnWiley&Sons,Inc.1979(HPLC);和JurgenHGross-MassSpectrometry,Atextbook,SpringerVerlag2004(LC-MS))。為了確定試樣中蛋白酶活性的量，可將在與具有式(l)的底物混合的試樣中給定時期產生的具有式H-X-R,報道分子的量，同在與具有式(l)的底物混合并用已知量的蛋白酶處理的對照試樣中給定時期產生的具有式H-X-R!報道分子的量進行比較。優選將混合物培養5至120分鐘之間，更優選將所述反應混合物培養約30分鐘，在一個高度優選的實施方案中，一旦將具有式(l)的底物加至試樣中，將所述反應混合物培養約15分鐘。若在試樣中不存在能夠作用于具有式(l)的底物的有關化學鍵的蛋白酶，則與具有式(l)的底物混合的試樣將不會產生具有式H-X-R,的報道分子。具有式(l)的底物優選為l-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基—01_11_(4_硝基苯基氨基)-甘氨酰基七-亮氨酰基-|3-丙氨酸曱酯。此處具有式H-X-R,的報道分子為4-硝基苯胺。可供選擇地，具有式(l)的底物優選為l-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R-[4-(5-對甲苯基-[l，3，4]。惡二唑-2-基)-苯基氨基]-甘氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酸。此處具有式H-X-R,的報道分子為4-(5-對甲苯基-[1，3，4]碌、二唑-2-基)-苯胺。可供選擇地，具有式(l)的底物優選為l-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R-(4-硝基苯基氨基)-甘氨酰基-N-苯基-L-苯基丙氨酰胺。A手性此處具有式H-X-R4的報道分子為4-硝基苯胺。可供選擇地，具有式(l)的底物優選為1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-S-(聯苯-4-基曱氧基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酸甲酯。丄手性此處具有式H-X-R,的報道分子為聯苯-4-基-曱醇。可供選擇地，具有式(l)的底物優選為l-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R-(4-硝基苯基氨基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酸曱酯。35此處具有式H-X-R的報道分子為4-硝基苯胺。如本申請使用的術語"蛋白酶調節劑，，是指具有以下能力的任何化合物或組合物i者如藥物組合物■(i)增加蛋白酶的活性或增加一種或多種蛋白酶的釋放-即其為蛋白酶活化劑；或(ii)降低蛋白酶的活性或降低一種或多種蛋白酶的釋放-即其為蛋白酶抑制劑。蛋白酶調節劑可為激動劑或拮抗劑。蛋白酶調節劑優選為蛋白酶活化劑。蛋白酶活化劑的實例為酵母聚糖。并不希望受理論束縛，向全血中加入酵母聚糖(酵母細胞壁p—葡聚糖)使得含有蛋白酶(諸如MMP-8和MMP-9)的細胞內顆粒進行活化和脫粒。并不希望受理論束縛，可通過例如使蛋白酶活化劑與蛋白酶結合來增加蛋白酶的活性，與對照試樣相比，所述的蛋白酶活化劑使蛋白酶與它的底物更有效地結合，因此增加肽斷裂的量。可供選擇地，蛋白酶活化劑可通過例如將原蛋白酶切割為蛋白酶來增加蛋白酶的活性。可供選擇地，蛋白酶活化劑可增加蛋白酶的釋放。在一個供選的實施方案中，蛋白酶調節劑優選為蛋白酶抑制劑。并不希望受理論束綽，在另一實施方案中，可通過例如使蛋白酶抑制劑與蛋白酶結合來降低蛋白酶的活性，與對照試樣相比，所述的蛋白酶抑制劑使蛋白酶與它的底物更弱地結合，因此降低肽斷裂的量。可供選擇地，蛋白酶抑制劑可通過抑制原蛋白酶斷裂為蛋白酶來降低蛋白酶的活性。可供選擇地，蛋白酶活化劑可降低蛋白酶的釋放。蛋白酶抑制劑優選選自MMP1蛋白酶抑制劑、MMP2抑制劑、MMP3蛋白酶抑制劑、MMP8蛋白酶抑制劑、MMP9蛋白酶抑制劑、MMP12蛋白酶抑制劑和MMP13蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑更優選選自MMP8蛋白酶抑制劑、MMP9蛋白酶抑制劑和MMP12蛋白酶抑制劑。在一個高度優選的實施方案中，蛋白酶抑制劑為MMP9蛋白酶抑制劑。在另一個高度優選的實施方案中，蛋白酶抑制劑為MMP13蛋白酶抑制劑。在另一個高度優選的實施方案中，蛋白酶抑制劑為MMP12蛋白酶抑制劑。許多金屬蛋白酶抑制劑是已知的(參見例如MMP抑制劑的綜述(BeckettR.RandWhittal(erM.，1998,Exp.Opin.Ther.Patents,§￡1}:259-282))。對抑制多種金屬蛋白酶而言，不同種類的化合物可能具有不同程度的功效和選才奪性。如本申請使用的術語"候選蛋白酶調節劑，，是指評價其增加蛋白酶活性或降低蛋白酶活性能力的任何組合物，諸如藥物組合物。候選蛋白酶調節劑優選為候選蛋白酶抑制劑。候選蛋白酶抑制劑優選選自MMP1候選蛋白酶抑制劑、MMP2候選蛋白酶抑制劑、MMP3候選蛋白酶抑制劑、MMP8候選蛋白酶抑制劑、MMP9候選蛋白酶抑制劑、MMP12候選蛋白酶抑制劑和MMP13候選蛋白酶抑制劑。候選蛋白酶抑制劑更優選選自MMP8候選蛋白酶抑制劑、MMP9候選蛋白酶抑制劑、MMP12候選蛋白酶抑制劑和MMP13候選蛋白酶抑制劑。在一個高度優選的實施方案中，候選蛋白酶抑制劑為MM9抑制劑。在另一個高度優選的實施方案中，候選蛋白酶抑制劑為MMP13蛋白酶抑制劑。在另一個高度優選的實施方案中，候選蛋白酶抑制劑為MMP12蛋白酶抑制劑。在一個供選的實施方案中，候選蛋白酶調節劑優選為候選蛋白酶活化劑。候選蛋白酶活化劑更優選選自MMP8候選蛋白酶活化劑、MMP9^f'美選蛋白酶活化劑和MMP12候選蛋白酶活化劑。金屬蛋白酶被視為在正常發育和生理學組織再造和修復中起著關鍵性作用。此外，它們被視為在調節炎癥細胞的動力學和機能中起著重要作用。已將金屬蛋白酶與許多疾病或病癥相關聯(參見，例如Doherty"a/，ExpertOpin.Ther.Patents2002;12(5):594-604)。抑制一種或多種金屬蛋白酶的活性在某些疾病或病癥中可能是充分有益的。金屬蛋白酶抑制劑可用于治療與細胞外基質的失控降解和再造(uncontrolleddegradationoftheextracellularmatrixandremodelling)相關的多種炎性疾病相關的疾病。所述疾病和障礙包括類風濕性關節炎、骨關節炎、痛風、系統性紅斑狼瘡(SLE)、胃腸道炎癥(尤其是炎性腸病、潰瘍性結腸炎和胃炎)、皮膚炎癥(尤其是牛皮癬、濕疹、皮炎)。此外金屬蛋白酶抑制劑可用于治療腫瘤生長和轉移；骨再吸收疾病(諸如骨質疏松癥和佩吉特病(Paget，sdisease));異常血管生成相關的疾病；糖尿病相關的膠原再造增強；牙周病(諸如齦炎)；角膜潰瘍；皮膚潰瘍；術后病癥(諸如結腸吻合術(colonicanastomosis));皮膚創傷愈合；中樞和外周神經系統脫髓鞘性疾病(諸如多發性硬化癥)；阿爾茲海默氏病；在心血管疾病諸如再狹窄、動脈粥樣硬化和主動脈動脈瘤中觀察到的細胞外基質再造；肝纖維化；氣道疾病諸如哞喘、鼻炎、慢性支氣管炎、慢性阻塞性細支氣管炎、氣道纖維化和慢性阻塞性肺病(COPD)。慢性阻塞性肺病(COPD)是有關一組呼吸道疾病的術語，這些呼吸道疾病的特征在于氣流阻塞或限制。術語"COPD"包括的病癥包括慢性支氣管炎、肺氣腫和支氣管擴張。COPD可引起心搏過速(快速的心率)、癲癇發作(seizures)、昏迷、呼吸停止和死亡。COPD的特征還在于力口重(exacerbations)，其通常表現出慢性癥狀的快速進程。一直以來，加重的顯著特征在于呼吸急促、喘鳴以及產生痰。COPD通常是由吸煙引起的。試岸試樣優選為離體試樣。試樣優選為生物液體。試樣優選為哺乳動物的生物液體。試樣更優選選自尿、全血、血漿、血清、滑液、唾液、痰、支氣管肺泡液、腦脊液、鼻灌洗液、肺村液、淚液和皮膚水泡液。在一個供選的實施方案中，試樣選自組織切片、生檢試樣(biopsysample)、細胞培養物和勾漿組織。試樣更優選為細胞培養物或勻漿組織。在一個實施方案中，優選地，試樣從用蛋白酶調節劑處理的受試者獲<曰付。在一個供選的實施方案中，優選地，從受試者獲得試樣中之后，試樣用蛋白酶調節劑處理。在一個實施方案中，試樣優選從用候選蛋白酶調節劑處理的受試者獲得。在一個供選的實施方案中，優選地，從受試者獲得試樣中之后，試樣用候選蛋白酶調節劑處理。如本申請使用的術語"使蛋白酶與蛋白酶調節劑接觸"是指用蛋白酶調節劑處理試樣。試樣可從用蛋白酶調節劑處理過的受試者獲得-例如，患者可正處于蛋白酶抑制劑的藥物組合物的療程中。可供選擇地，試樣可為離體試樣(諸如生物液體、生檢試樣或細胞培養物)，將所述離體試樣與蛋白酶調節劑在體外混合-例如，試樣可從未接受藥物組合物，即蛋白酶調節劑治療的患者中獲得。如本申請使用的術語"使蛋白酶與候選蛋白酶調節劑接觸"是指用候選蛋白酶調節劑處理試樣。試樣可為離體試樣(諸如生物液體、生檢試樣或細胞培養物)，將所述離體試樣與候選蛋白酶調節劑在體外混合-例如，試樣可從未接受藥物組合物治療的患者中獲得。可供選擇地，試樣可從用候選蛋白酶調節劑處理的受試者獲得-例如，患者可正處于藥物組合物，即候選蛋白酶抑制劑的療程中。如本申請使用的術語"確定蛋白酶調節劑的功效"是指將與蛋白酶調節劑接觸的試樣，同未與蛋白酶調節劑接觸的試樣進行比較和/或與不同的蛋白酶調節劑接觸的試樣進行比較。與未處理的試樣相比，蛋白酶抑制劑會在給定的時期內給定的試樣中產生較低的蛋白酶活性。在本發明中，通過以下方式監測試樣中蛋白酶活性將試樣與具有式(l)的底物混合并且檢測在給定時期內報道分子H-X-R,的生成(對于功效研究而言，不應使反應完全進行)。因此，與未處理的試樣相比，用蛋白酶抑制劑處理的試樣會導致在給定時期內存在較少的報道分子。此外，與用不同的蛋白酶抑制劑(第二種蛋白酶抑制劑)處理的試樣相比，用蛋白酶抑制劑(第一種蛋白酶抑制劑)處理的試樣導致在給定時期內存在較少的報道分子，表明第一種蛋白酶抑制劑相比第二種蛋白酶抑制劑是更有效的蛋白酶抑制劑，反之亦然。與未處理的試樣相比，蛋白酶活化劑會在給定的時期內給定的試樣中產生較高的蛋白酶活性。在本發明中，通過以下方式監測試樣中蛋白酶活性將試樣與具有式(l)的底物混合并且檢測在給定時期內報道分子H-X-R,39的生成(對于功效研究而言，不應使反應完全進行)。因此，與未處理的試才羊相比，用蛋白酶活化劑處理的試樣會導致在給定時期內存在更多的報道分子。此外，與用不同的蛋白酶活化劑(第二種蛋白酶活化劑)處理的試樣相比，用蛋白酶活化劑(第一種蛋白酶活化劑)處理的試樣導致在給定時期內存在更多的報道分子，表明第一種蛋白酶活化劑相比第二種蛋白酶活化劑是更有效的蛋白酶活化劑，反之亦然。如本申請使用的術語"確定候選蛋白酶調節劑的功效，，是指將與候選蛋白酶調節劑接觸的試樣，同未與候選蛋白酶調節劑接觸的試樣進行比較和/或與已知的候選蛋白酶調節劑接觸的試樣進行比較。在本發明中，通過以下方式監測試樣中蛋白酶活性將試樣與具有式(l)的底物混合并且檢測在給定時期內報道分子H-X-R,的生成(對于功效研究而言，不應使反應完全進行)。因此，與未處理的試樣相比，用期望的候選蛋白酶抑制劑處理的試樣會導致在給定時期內存在較少的報道分子。此外，與用已知的蛋白酶抑制劑處理的試樣相比，用候選蛋白酶抑制劑處理的試樣導致在給定時期內存在較少的報道分子，表明所述的候選物是更有效的蛋白酶抑制劑，反之亦然。然而，與未處理的試樣相比，用期望的候選蛋白酶活化劑處理的試樣會導致在給定時期內存在更多的報道分子。此外，與用已知的蛋白酶活化劑處理的試樣相比，用候選蛋白酶活化劑處理的試樣導致在給定時期內存在更多的報道分子，表明所述候選物是更有效的蛋白酶活化劑，反之亦然。如本申請使用的術語"診斷疾病或障礙"是指確定來自受試者的試樣中蛋白酶活性水平，并且將所述蛋白酶活性水平與來自已知患有所述疾病或障礙的受試者的試樣中蛋白酶活性水平進行比較和來自未患有所述疾病或障礙的受試者的試樣中蛋白酶活性水平進行比較。例如，可測量和比較來自患有COPD的受試者、吸煙的受試者和不吸煙的受試者的試樣中的MMP活性水平。因此可^H則出吸煙以及處于早期COPD的受試者。本申請描述的方法還可用來確定受試者中一段時間內疾病的進程。此外，本申請描述的方法可用于確定受試者對于用蛋白酶抑制劑治療的響應。在另一方面，本申請描述的方法可用于確定蛋白酶調節劑的量(即劑量)，即應當對受試者給藥以實現有利的效果(停止疾病或障礙的進程或逆轉40疾病或障礙的進程)的劑量。所述疾病或障礙優選選自類風濕性關節炎；骨關節炎；痛風；系統性紅斑狼瘉(SLE);胃腸道炎癥(尤其是炎性腸病、潰瘍性結腸炎和胃炎)；皮膚炎癥(尤其是牛皮癬、濕疹、皮炎)；腫瘤生長；腫瘤轉移；骨再吸收疾病(諸如骨質疏松癥和佩吉特病(Paget，sdisease));異常血管生成相關的疾病；糖尿病相關的膠原再造增強；牙周病(諸如齦炎)；角膜潰瘍；皮膚潰瘍；手術后病癥(諸如結腸吻合術)；皮膚創傷愈合；中樞和外周神經系統脫髓鞘性疾病(諸如多發性硬化癥)；阿爾茲海默氏病；在心血管疾病諸如再狹窄、動脈粥樣硬化和主動脈動脈瘤中觀察到的細胞外基質再造；肝纖維化；氣道疾病諸如哮喘、鼻炎、慢性支氣管炎、慢性阻塞性細支氣管炎、氣道纖維化和慢性阻塞性肺病(COPD)。所述疾病或障礙優選選自類風濕性關節炎、骨關節炎；多發性硬化癥;氣道疾病諸如哮喘、鼻炎、慢性支氣管炎、慢性阻塞性細支氣管炎、氣道纖維化和慢性阻塞性肺病(COPD)。所述疾病或障礙更優選為骨關節炎、哮喘或慢性阻塞性肺病(COPD)。在一個高度優選的實施方案中，所述疾病或障礙為骨關節炎。在另一個高度優選的實施方案中，所述疾病或障礙為慢性阻塞性肺病(COPD)。實施例借助以下的實施例并且參照以下的結構和附圖來進一步描述本發明4-硝基苯胺的結構l-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a(4-硝基苯基氨基)-L-甘氨酰基-L-亮氨酰基各丙氨酸曱酯的結構,對斷裂底物以產生報道分子位置的化學鍵進行強調顯示。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>C16-4-硝基苯胺的結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>在實施例中使用的縮寫包括DCM二氯曱烷；THF四氫p夫喃；MeCN乙腈；MeOH曱醇；DMFN,N-二曱基曱酰胺；EtOAc乙酸乙酯；IPA2-丙醇；Et20乙醚；DMSOD6-氘化二甲基亞砜；CD3CN氘化乙腈；CD3OD氘化曱醇；TFA三氟乙酸；TfOH三氟甲磺酸；AcOH乙酸；DIEAN-乙基二異丙胺；HATU0-(7-氮雜苯并三唑-l-基)-N，N,N，，N，-四曱基銀:H久LC/MS液相色譜/質譜；TLC薄層色譜。^教辨浙務在實施例中，在VarianUnity/"ova400MHz或VarianMercw^-VX300MHz設備上記錄'H-NMR和13C-NMR光譜。使用二曱基亞砜-d6(SH2.50ppm,5C39.5ppm)、乙腈-山(&1.95ppm,5c118.2,1.3ppm)、曱醇-山(5H3.31ppm,5C49.0ppm)或吡啶-ds(5H8.71，7.55，7.19ppm,5C149.9，135.5，123.5ppm)的中央溶劑峰作為內標(intemalreferences)。在裝備有APCI電離室(ionizationchamber)或ES電離室的Agilent1100LC-MS系統上獲得低分辨率質鐠。使用從Merck獲得的TLC板(玻璃板上吸附有硅膠60254)進行薄層色譜。使用Seebach溶液使TLC斑點顯影，所述Seebach溶液是由25g磷鉬酸、10gCe(SO4)2.H2O、60mL濃H2SO4和940mLH2O制備的。硅膠60的粒度為0.040-0.063mm,獲自Merck。使用Gilson分析或半制備系統進行HPLC。實施例中使用的條件如下。HPLC系統A:KromasilKR-100-7-C18,250x20mm柱，等度溶劑系統62%的MeOH/H20，溶劑流速為6mL/min,并且在UV=220nm進行檢測。HPLC系統B:Kromasil100-C18-5^n150x4.6mm柱，溶劑A:H20/MeOH(=80/20)B:MeOH,歷時20分鐘使用20%B至90%B的梯度液，流速為0.6mL/min，并且在UV=220nm進行檢測。HPLC系統C:Kromasil100-C18-5pm150x4.6mm柱，溶劑A:H2O+0.1%TFAB:MeCN+0.1%TFA,歷時15分鐘使用10%B至90%B的梯度液，流速為lmL/min,并且在UV=220nm進行檢測。HPLC系統D:Kromasil100-5C-18,250x20mm,流速6.0ml/min.，洗脫液75%MeOH，25%H20,UV=220nm。HPLC系統E:KromasilKR-100-5-C18，250x20mm柱，等度溶劑系統82%MeOH/H20,溶劑流速為6mL/min,并且在UV=220nm進行檢測。HPLC系統F:Kromasil100-C18-5pm150x4.6mm柱，等度溶劑系統80。/。MeOH/H20,溶劑流速為lmL/min.并且在UV=220nm進行4全測.HPLC系統G:KromasilKR-100-5-C18,250x20mm柱，等度溶劑系統85%MeOH/H20,溶劑流速為6mL/min,并且在UV=220nm進行檢溯寸。HPLC系統H:Kromasil100-C18-5pm150x4.6mm柱，等度溶劑系統85%MeOH/H20,溶劑流速為lmL/min，并且在UV=220nm進行檢測。HPLC系統I:Kromasil100-C18-5jim150x4.6mm柱，歷時30min梯度液為5%MeCN/H2O+0.1%TFA至100%MeCN+0.1%TFA，溶劑流速為lmL/min,并且在UV=220nm進行檢測。HPLC系統J:Kromasil100-C18-10pm250x50mm柱，等度溶劑系統52%MeCN/H20,溶劑流速為50mL/min,并且在UV=254nm進4亍才企測。HPLC系統K:Kromasil100-C18-5|im150x4.6廳柱，歷時20min梯度液為5%MeCN/H20至60%MeCN，然后為等度溶劑系統60%MeCN,溶劑流速為lmL/min，并且在UV=254nm進行檢測。所有溶劑和市售試劑為實驗室級別的并且按收到原樣使用。非市售試劑是使用本領域已知的操作合成的。實滋夢/丄/^浙的浙務；^乙教差-1-腐扇教差-丄-老扇翁差#扇教差a)(2-氨基-2-氧代乙基)氨基曱酸(9&芴-9-基甲基)酯(=Fmoc-Gly-NH2)將甘氨酰胺鹽酸鹽(ll,05g;100mmol)和NaHC03(16.8g;200mmol)溶于水(150mL)中，當不再生成C02(g)時得到了澄清溶液。加入丙酮(100mL)，然后將溶液在水/水浴上冷卻。將Fmoc-N-羥基琥珀酰亞胺(32g;95mmol)溶于丙酮(400mL)中然后緩慢加到反應混合物中，形成了漿料。加入結束后移除水水浴，然后將漿料在室溫攪拌3天。經蒸發除去溶劑，然后將殘余的無色固體懸浮于水(lL)中。將漿料攪拌1小時，經過濾收集固體產物然后用水PxS00mL)洗滌。在+30°0減壓干燥至恒重。得到28.1g(收率為100%)副題化合物，其為無色固體。HPLC系統C:R產10.09min，純度97%.APCI掘m/z:297.2[固+]'H-NMR(CD3OD):57.80(2H,d),7.67(2H,d)，7.39(2H，t),7.31(2H,t),4.39(2H,d),4.23(1H,t)，3.76(2H,s)ppm.b)iV-r(9i/-芴-9-基曱氧基)羰基l甘氨酰基-a-R，S-(乙硫基)-甘氨酸將Fmoc-Gly-NH2(14g;47mmol)和乙醛酸一水合物(8.7g;94mmo1)懸浮于丙酮(400mL)和H20(5mL)中。將漿料加熱至回流，形成輕^l不透明的溶液。48小時后，加入另一批乙醛酸一水合物(8.7g;94mmo1)，然后再繼續加熱回流24小時。蒸發丙酮得到油狀物，將其用H20(200mL)處理，然后用EtOAc(3x200mL)萃取得到的漿料。然后將有機相用5%NaHC03(水溶液)(400mL+200mL+100mL)萃取。棄去有機相。使用濃HC1將含有期望中間體A4(9/Z-芴-9-基曱氧基)羰基]甘氨酰基-a-R,S-(羥基)-甘氨酸的堿性水相小心酸化至pH為1-1.5,形成了漿料。用EtOAc(4x200mL)萃取酸性水相，有機相用鹽水洗滌，并經Na2S04干燥，過濾然后蒸發得到泡沫油狀物。將該油狀物用DCM(200mL)處理，然后經過濾收集得到的固體物質。將固體物質再溶于MeOH和THF中，然后蒸發得到粗產物Aq(9//-芴-9-基曱氧基)羰基]甘氨酰基-a-R,S-(羥基)-甘氨酸。該粗產物沒有進行進一步純化，其直接用于下一步。得到14.4g粗的中間體，其為無色固體。純度是使用HPLC系統C:R產9.56min確定的，純度為68%。將粗產物Aq(9/f-芴-9-基曱氧基)羰基]甘氨酰基-a-R，S-(羥基)-甘氨酸(14.4g)溶于AcOH(250mL)和濃H2S04(2.5mL)中。將乙硫醇(15mL;0.2mol)在室溫加到攪拌的溶液中。21小時后，將反應混合物緩慢倒入1L碎冰中，形成固體，當冰溶化時得到了漿料。經過濾收集固體產物，然后用水(250mL)洗滌。然后將固體物質用Et20、接著用庚烷最后再用Et20洗滌，然后將其減壓干燥至恒重。得到10.2g(52。/。)副題化合物，其為無色固體。HPLC系統C:Rt=l1.46min，純度92.5%.APCI-MSm/z:415.2[Mlf]'H-濯R(DMSO-D6):S13.23(1H，brs),8.63(1H,d)，7.89(2H,d),7.7145(2H,d),7.55(1H,t),7.42(2H,t)，7.33(2H,t),5.36(1H，d),4.28(2H，d),4.23(1H,t)，3.70(2H,d),2.62(2H,m)，1.78(3H,t)ppm.13C-NMR(DMSO-D6):5169.60，168.59,156.26，143.65，140.53,127.47,126.92，125.08，119.96，65.66,52.76,46.58,43.07,23.93，14.49ppm.c)1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R,S-(乙硫基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基冬丙氨酸曱酯使用Pioneer肽合成系統，以及由TentaGelSPHBLeuFmoc開始在固相上部分合成了副題化合物。遵循為使用Fmoc-氨基酸而開發的標準肽合成方案。將,[(9//-芴-9-基曱氧基)羰基]甘氨酰基-a-R，S-(乙硫基)-甘氨酸用1,3-二異丙基碳二亞胺活化。使用市售的Fmoc-L-Leu-OPfp和Fmoc-L-Pro-OPfp。使用含有25%乙酸肝和5%吡咬的DMF溶液進行N-酰化。使用95%TFA/H20將1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R,S-(乙硫基)-甘氨酰基-L-亮氨酸從樹脂上切割并冷凍干燥。最后用HATU和DIEA的DMF溶液進行與(3-丙氨酸曱酯的偶聯。在帶有KromasilKR-100-7-C18，250x50.8mm柱的Gilson制備性HPLC系統上進行最終肽(fmalpeptide)的純化。將最終肽冷凍干燥并使用裝備有ES電離室的Agilent1100LC-MS系統上進行分析。使用WatersSymmetry柱，CI85pm2.1x30mm,UV=220nm，歷時lOmin梯度液為10-90%MeCN/H2O+0.1%TFA,流速為0.6mL/min。非對映異構體混合物不經進一步純化就使用。R產4.54min.ES-MSm/z:643.3[Mtf]Rt=4.67min.ES-MSm/z:643.3[Mf]d)1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R，S-(4-硝基苯基氨基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基-B-丙氨酸曱酯將1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R，S-(乙硫基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基-，-丙氨酸曱酯(500mg;0.78mmol)和4-硝基苯胺(215mg;1.56mmol)溶于DCM(20mL)和THF(15mL)中，得到黃色不透明溶液。加入A分子篩，然后將混合物在保護性氬氣氣氛下在室溫攪拌60min。加入N-碘代琥珀酰亞胺(197mg;0.88mmol)和TfOH(2pL;22|imol)。將反應混合物在室溫攪拌2.5小時。使用10°/。Na2S203(水溶液)(15mL)將反應混合物淬滅，然后使用DCM(30mL)轉移到分液漏斗中。加入鹽水然后分離出下層的淺黃色有機相。水相用DCM萃取直到無色。合并的黃色有機溶液經Na2S04干燥，過濾然后蒸發。將殘余物質溶于少量的DCM中，然后將其加至短的Si-60硅膠柱上，使用EtOAc洗出雜質(包括未反應的4-硝基苯胺)，然后使用EtOAc/MeOH=5/3和MeOH洗出產物。蒸發溶劑得到黃色固體。然后將該物質再次經過短的Si-60硅膠柱(如上所述)過濾。得到339mg粗產物，其為兩種非對映異構體的混合物。在TLC(Si-60,DCM/IPA-9/l)上得到兩個展開的黃色斑點，分別為R產0.48和R產0.32。該產物在酸性條件下是不穩定的。e)1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R-(4-硝基苯基氨基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基-l3-丙氨酸曱酯使用HPLC系統A將l-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R，S-(4-硝基苯基氨基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基-(3-丙氨酸曱酯(339mg)的粗制的非對映異構體混合物分離并進一步純化。"較快的，，非對映異構體收集在39-45min的級份中，"較慢的，，非對映異構體收集在54-62min之間的級份。蒸發MeOH然后將水性殘余物冷凍干燥，得到標題化合物及其非對映異構體，其為黃色粉末。該產物在酸性條件下是不穩定的。假定"較快，，洗脫出的非對映異構體具有"L-樣(L-like)"R-立體化學，因為它快速被MMPs斷裂，從而釋放4-硝基苯胺，而"較慢的，，非對映異構體并非如此。得到標題化合物，127mg(22Q/。)"較快的"L-樣非對映異構體。HPLC系統B:R產16.07min，純度>99%。TLC(Si-60,DCM/IPA=9/1):RF=0.31'H-NMR(CD3CN):58.06(2H,d),7.68(1H，d)，7.65(1H,t),7.36(1H,d),7.13(1H，d),6.92(1H，brt)，6.79(2H,d)，6.41(1H，d),5.69(1H,t),4.25(1H,q)，4.11(1H,dt)，4.02(1H，dd),3.89(1H,dd),3.67(1H,dd)，3.62(1H,m),3.61(3H,s)，3.49(1H，m)，3.37(2H,m)，2.47(2H，t)，2.11(1H，m),2.03(3H，s),1.96-1.8347(3H,m)，1.68-1.50(6H，m),0.93-0.84(12H,m)ppm.13C-NMR(CD3CN):5174.63,173.86，172.84,172.45，172.34,171.36，168.29,152.11,139.70,126.62,113.44,62.07,61.27,53.99,53.39,52.10,49.23,43.69,41.50,39.71,35.93,34,48,30.20,25.65,25.56,25.32,23.41,23.20，22.96:21.84,21.39ppm得到95mg(17%)"較慢"D-樣非對映異構體。HPLC系統B:R產16.98min.純度>99%.TLC(Si-60,DCM:IPA=9:1):RF=0.46'H-函R(CD3CN):58.06(2H,d),7.78(1H,d),7.69(1H,brt),7.63(1H,d),7.22(1H,d),7.02(1H,brt),6.81(2H,d)，6.47(1H，d),5.80(1H,t)，4.28-4.17(3H，m),3.75(2H,d)，3.65(3H，s)，3.63(1H，m),3.52(1H，m),3.46(1H,m),3.34(1H,m),2.52(2H,dt),2.20(1H,m)，1.97(2H,m),1.94(1H,m)，1.89(3H,s),1.82-1.50(6H,m),0.98-0.82(12H,m)ppm13C-NMR(CD3CN):5175.00,174.90,173.06,172.91，172.68,171.24,168.71,152.56,139.63，126.84，113.21,62.18,60.72,53.81,52.85,52.25,49.36,44.73，41.19，38.94,36.18，34.48,30.54，25.72,25.66,25.60,23.46，23.38,22.81:21.63,21.58ppm^參的劍務；J-乙磁差-丄-庸處凝差-丄-^凌凝差^^翁差普/-^-^^笨差祟差>#瘋教差-￡畫老扇翁差#扇^^游a)iV-r(9/f-芴-9-基曱氣基)羰基l甘氨酰基-a-R，S-(乙疏基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酸曱酯將A4(9/f-芴-9-基曱氧基)羰基]甘氨酰基-a-R，S-(乙硫基)-甘氨酸(2.09g;5.04mmo1)溶于DMF(75ml)中，加入HBTU(2.87g;7.57mmol)和DIEA(0.9ml;5.26mmol)。向該溶液加入L-亮氨酰基-甘氨酸甲酯鹽酸鹽(1.37g;5.74mmol)和另外的D正A(1.9ml;11.1mmol)。將淡黃色混合物在室溫攪拌5小時。對紅色反應混合物進行蒸發以除去DMF,將得到的紅色油狀物溶于EtOAc中，用5。/。KHS04、鹽水、5%NaHC03和鹽水洗滌，然后經Na2S04干燥。過濾并蒸發后，使用快速色譜法在Si-60硅膠上對橙色油狀粗產物進行純化(使用EtOAc:庚烷(5:2)作為洗脫液)。收集到副題化合物，其為淡黃色油狀物，然后將其溶于乙醚中并蒸發，得到泡沫狀物，其固化為淡黃色粉末，得到2.31g(77。/。)兩種可能的非對映異構體1:1的混合物。TLCSi-60,EtOAc:庚烷(5:l)R尸0.37+0.39'H-NMR(CDCl3):58.59+8.46(總計1H,d+d),7.卯+7.83(總計1H，brt+brt),7.75-7.70(3H,brd)，7.59+7.56(總計2H,d+d),7.37(2H,t),7,28(2H,m),6.61+6.33(總計1H，brt+brt),5.99+5.91(總計1H,d+d)，4.90-4.75(1H,m),4.46-3.76(7H,m)，3,54+3.50(總計3H,s+s),2,83-2.59(2H,m),1.80-1.60(3H,m),1.30-116(3H，m),0.98-0.88(6H,m)ppm.13C-NMR(CDC13):S172.49+172.16,169.88+169.86,168.78+168.70，168.20+168.09,156.78+156.70,143.95+143.84+143.70+143.62,141.18+141.17+141.13,127.67,127.03,125.16+125.12+125.08,119.90,67.33,54.46+54.25,52.06，51.90+51.60,46,98,44.33+44.25,42.25+42.13，41.05+40.95,24.70+24.57,24.29+23.77,23.02+22.63+22.46+21.99,14.35+14.27ppm.b)甘氨酰基-a-R,S-(乙硫基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酸曱酯鹽酸鹽將A4(9/Z-芴-9-基曱氧基)羰基]甘氨酰基-a-R,S-(乙硫基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酸甲酯(2.80g;4.68mmol)溶于DMF(100ml)中，然后加入20%哌咬/DMF溶液(60ml)。在TLCSi-60(用EtOAc:庚烷(4:l)展開)上監視反應，20min后反應結束。對反應混合物進行蒸發，將殘余物溶于最少量的DCM中，然后經過Si-60硅膠過濾，使用更多的DCM以洗掉快速移動的雜質，然后使用MeOH作為溶劑，將有機堿形式的產物從硅膠中萃取出。然后將產物用HCl/乙醚處理，以定量收率得到副題化合物。淡黃色產物為吸濕性的，并且與空氣接觸時變為粘性的。iH-NMR(吡啶-d5):510.47+10.20(總計1H，d+d),10.12+9.92(總計1H,d+d),9.91+9.75(總計1H,t+t),9.55-9.00(3H，brs)，6.46+6.42(總計1H，d+d)，5.27-5.16(1H,m)，4.76+4.73+4.61(總計2H，s+d+d),4.36-4.14(總計2H，m),3.48(3H,s),2.95-2.74(2H,m),2.12-1.92(3H,m),1.14+1.09(總計3H,t+t),0.94+0.85+0.83(總計6H,d+d+d)ppm.'3C-NMR(吡啶-d5):5173.60+173.44,171.03+170.91,168.79+168.69,167.50+167.25,55.63+55.39,52.97+52.82,51.77+51.74,42.13+41.87，41.99+41.49,41.81+41.38,25.12+25.08，24.79+24.49,23.33+23.13,22.01+21.72,14.76+14.64ppm.c)1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R,S-〖乙硫基V甘氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酸曱酯將甘氨酰基-a-R,S-(乙硫基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酸曱酯鹽酸鹽(106mg;0.26mmol)、N-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酸(74mg;0.27mmol)和HBTU(159mg;0.42mmol)溶于DMF(5ml)中。向攪拌的淡黃色溶液中加入D正A(0.14ml;0.82mmo1),J吏反應在室溫進4亍21小時。對暗紅色;:容液進行蒸發以除去溶劑，將紅色油狀殘余物溶于DCM(50ml)中，然后用5%KHSO4(3x40ml)、鹽水(50ml)、5%NaHC03(3x40ml)和鹽水(50ml)洗滌，經MgS04干燥，過濾并蒸發得到紅色固體粗產物(103mg)。用快速色譜法在Si-60硅膠上對其進行純化，使用DCM:IPA(10:1)作為洗脫液，直到收集到快速移動的雜質，然后將洗脫液變為DCM:IPA(10:2)。收集含有產物的級份，然后蒸發得到副題化合物(77mg，47%)，其為淡黃色粉末。分析性HPLC系統柱Kromasil100-5C18,150x4.6mm,流速為l.Oml/min.,梯度液為100%H20:MeOH80:20(0-0.5min)、100%MeOH(0.5-6min)、100%MeOH(6-7min.),UV=220nm.非對映異構體保留時間為Rt=6.40和6.62min。!H-薩R(吡啶-D5):59.98-9.10(5H,m),6.36+6.22(總計1H，d+d)，5.15-5.04(1H，m),5.04-4.90(1H，m)，4.75-4.58(1H，m),4.50-4.00(4H，m)3.55+3.54(總計3H,s+s)，3.51-3.39+3.29-3.16(1H+1H,m+m),2.91-2.70(2H,m),2.35-1.52(IOH，m)，1.91(3H,s),1,20-1.02(3H,m),0.92-0.62(12H,m)ppm."C-NMR(吡啶-D5):5173.88,173.85，173.34，173.49，173.29，173.24，170.96,170,84，170.46,170.33,169.74,169.44,168.93,168.79，60.92，60.85,55.47,55.22,52.59，52.51，52.42，52.40,51.80,51.79,48.42,48.38,43.54，43.50:41.76,41.75,41.48,41.48,40.84，40.77,29.88,29.82,25.21,25.21,25.09，25.05:24.95,24.94,24.71,24.38,23.23，23.19,23.16,22.99,22.53,22.50,21.91,21.63:21.60,21.57,14.78，14.78ppm.d)1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-cc-R-(4-灘基苯基氨基V甘氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酸曱酯將1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-ot-R,S-(乙硫基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酸甲酯的非對映異構體混合物(0.10g;0.16mmol)溶于DCM(9ml)和DMF(1ml)中，得到淡黃色溶液。加入對硝基苯胺(0.03g;0.24mmol)和粉碎的3A分子篩。將黃色溶液在氮氣下在室溫攪拌兩小時。加入溶于無水THF(lml)中的N-碘代琥珀酰亞胺(0.05g;0.21mmol)，接著直接加入三氟曱磺酸(2inl;22pmo1)。在TLC(使用Si-60,DCM:IPA(10:1)展開)監視反應。3小時后，將紅色反應混合物過濾以除去分子篩，將濾餅用DCM和MeOH洗滌，然后蒸發溶劑，將殘余物溶于DCM中，然后用10%Na2S203(20ml)洗滌，分離黃色的相，將黃色水相用DCM(10ml)反萃取一次。將合并的有機相鹽水洗滌，干燥(MgS04)，過濾并蒸發溶劑，得到黃色粗產物。使用以下操作對純化和分離非對映異構體。首先經快速色譜法在Si-60硅膠上對粗產物進行純化，使用DCM:IPA(10:1)洗脫液，分離出兩種非對映異構體。然后使用反相HPLC系統D對含有產物的級份進一步純化，在12.58min和15.17min收集到非對映異構體。蒸發MeOH并對水性殘余物進行冷凍干燥，得到標題化合物及其非對映異構體，其為黃色粉末。產物在酸性條件下是不穩定的。假定"較快，，洗脫出的非對映異構體具有"L-樣"R-立體化學，因為它快速被MMPs斷裂，釋放出4-硝基苯胺，而"較慢的，，非對映異構體并非如此。得到標題化合物，10mg(9。/。)"較快的"L-樣非對映異構體。HPLC系統D:Rt=12.58min.TLC(Si-60，DCM:IPA=10:1):R產0.27!H-NMR(吡啶-D5):59.89(1H,d),9.57(1H，t),9.48(1H，d),9.24(1H,d),9.23(1H,t)，8.19(1H，d),8.10(2H,d),6.97(2H,d)，6.44(1H,t),5.16-5.06(IH，m)，4.95-4.88(1H,m),4.65-4.59(1H，m)，4.43-4.10(4H，m)，3.55(3H，s)，3.50-3.43+3.26-3,18(1H+1H,m+m)，2.30-1.55(10H,m)，1,90(3H,s),0.85-0.72(12H，m)ppm.^C-NMR(吡啶-D5):5173.82，173.58,173.33,171.02,170.93,170.66,168.76,152.54,138.89，126.31，112.91,61.14，61.02,52.78,52.74,51.81，48.45，43.45，41.47,41.42，40.29,29.94，25.23,25.09,24.96,23.16，23.14，22.52，21.77，21.49ppm.得到18mg(16%)"較慢的"D-樣非對映異構體。HPLC系統D:Rt=15.17min.TLC(Si-60,DCM:IPA=10:1):RF=0.48'H-薩R(吡啶-D5):59.50(1H,d),9.34(1H,t),9.22(1H，d),9.18(1H,t),9.05(1H,d),8.18(1H,d),8.11(2H,d),7.04(2H，d),6.63(1H,t)，5.09-5.00(1H,m),4.89-4.80(1H，m)，4.68-4.61(1H，m)，4.41-4.32+4.25-4.13(2H+2H,m+m)，3.58(3H,s)，3.54-3.46+3.29-3.20(1H+1H，m+m)，2.22-1.66(10H,m)，1.91(3H,s)，0.88-0.74(12H，m)ppm.'3C-NMR(吡啶-D5):5174.36，173.61,173.48,170.99(2C),170.86，168.99，152.71,138.95,126.38,112.93，61.04，60.82,52.99,52.33,51.84,48.47,43.95,41.59,41.26,39.82,29.85,25.19,25.10，25.00，23.12(2C)，22.42，21.68,21.56ppm,滋辦/.3^教的樹務；/-乙教差-丄-庸桌教差-1-^扇應差#歲教差普5^聯恭各差產薦差>^^瘋差-丄-^扇鷹差#:歲凝^謬,將l-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R，S-(乙硫基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酸曱酯的非對映異構體混合物(30mg;0.048mmol)溶于DCM(2mL)和DMF(0.3mL)中。加入聯苯-4-基曱醇(14.5mg;0.079mmol)和粉碎的3A分子篩。將漿料在氮氣下在室溫攪拌40分鐘。加入溶于無水THF(0.2mL)中的N-橫代琥珀酰亞胺(12mg;0.053mmol),接著加入三氟甲磺酸(0.001mL;0.011mmol)。將棕紅色漿料在室溫攪拌3.5小時。通過加入10%Na2S203(2mL)將反應淬滅，對無色混合物進4亍過濾，然后用另外的DCM(2mL)稀釋并分離有機相。用DCM萃取水相(2x2mL),52合并的有機相經3A分子篩干燥，過濾然后蒸發得到粗產物。使用HPLC系統E進行純化。產物在酸性條件下是不穩定的。假定"較慢，，洗脫出的非對映異構體具有"L-樣"R-立體化學，因為它快速被MMPs斷裂，釋放出聯苯-4-基曱醇，而"較快的，，非對映異構體并非如此。得到標題化合物，6.5mg"較慢，，L-樣非對映異構體。HPLC系統F:Rt=4.64min.'H-NMR(吡啶-D5):59.82(1H.d),9.46(1H，t),9.35(1H,d),9.33(1H,t),9.09(1H,d),7.65-7.47(6H,m),7.43(2H，t),7.33(1H，t),6.31(1H,d)，5.12(1H，m)，4.95(1H，m),5.00+4.85(1H+1H,d+d),4.69(1H,dd),4.45(2H，ddd),4.31+4.12(1H+IH,dd+dd)，3.53(3H，s),3.49+3.22(1H+1H，m+m),2.33-1.54(麗,m),1.95(3H，s),0.88-0.70(12H,m)ppm.得到10mg"較快的"D-樣非對映異構體。HPLC系統F:Rt=4.30min.'H-畫R(吡啶-D5):59.88(1H,d),9.66(1H，t)，9.25(1H,d),9.15(1H,t)，9.12(1H,d)，7.65-7.50(6H，m)，7.43(2H，t)，7.33(1H，t),6.30(1H,d),5.13(1H,m),5.01(1H,m)，4.99+4.84(1H+1H,d+d),4.71(1H,dd)，4.47+4.32(1H+1H,dd+dd)，4.37+4.18(1H+1H,dd+dd)，3.54(3H,s)，3.46+3.21(1H+1H,m+m),2.30-1.60(IOH，m),1.92(3H，s),0.88-0.70(12H，m)ppm《滋辨丄4_/-乙應差-丄^^,應差-丄-^扇教差#桌教差--^/(「5-^^^差-〃，>^/嗯二^-2-差>多差扇差/-#扇翁差-1-^扇魔差#f游遵循實施例1.3中描述的操作，得到粗產物，對其如下進一步純化。將粗的非對映異構體混合物溶于DCM中，然后加至Si-60柱上，然后使用53EtOAc洗出快速移動的雜質，所述雜質包括未反應的4-(5-對曱苯基-[l，3,4]。惡二唑-2-基)-苯胺。然后將產物用EtOAc:MeOH=5:l洗脫。TLC(Si-60)Rf=0.27。TLC(Si-60，DCM:IPA=8:1)Rf=0.3+0.5^f吏用HPLC系統G分離非對映異構體。在12.75min收集到較快洗脫出的非對映異構體。在15.22min收集到較慢洗脫出的非對映異構體。蒸發MeOH,然后對水性殘余物進行冷凍干燥，得到標題化合物及其非對映異構體，其為無色粉末。產物在酸性條件下是不穩定的。假定"較快，，洗脫出的非對映異構體具有"L-樣，，R-立體化學，因為它快速被MMPs斷裂，釋放出4-(5-對曱苯基-[1,3,4]噁二唑-2-基)-苯胺，而"較慢的，，非對映異構體并非如此。得到標題化合物，14.4mg(36。/。)"較快的"L-樣非對映異構體。HPLC系統H:Rt=2.64min.TLC(Si-60，DCM:IPA=8:1):RF=0.3H-畫R(吡啶畫D5):59.85(1H，d)，9.55(1H,t)，9.40(IH,d),9.24(IH,t)，9.23(IH,d)，8.10(2H，d),8.02(2H,d)，7.48(1H，d)，7.28(2H,d)，7.12(2H,d),6.47(1H，t)，5.13(IH,m)，4.94(1H，m),4.63(IH,dd),4.39(2H,d),4.35+4.18(IH+IH,dd+dd),3.56(3H,s)，3.46+3.22(IH+IH,m+m)，2.24(3H，s),1.92(3H，s),2.20-1.65(IOH，m)，0.88-0.70(12H,m)ppm.得到3.1mg(8%)"較慢的"D-樣非對映異構體。HPLC系統H:Rt=3.21min.TLC(Si-60，DCM:IPA=8:1):RF=0.5H-NMR(吡啶-D5):59.46(IH,d),9.27(IH,t)，9.25(IH,d)，9.20(IH,t),9.05(IH,d)，8.11(2H,d),8.04(2H,d)，7.51(1H，d),7.28(2H,d),7.21(2H,d)，6.65(IH,t),5.09(IH,m),4.85(IH,m),4.67(IH，dd),4.39+4.24(IH+IH,dd+dd),4.38+4.19(IH+1H，dd+dd),3.59(3H,s)，3.50+3.25(IH+IH,m+m)，2.24(3H,s)，1.93(3H,s),2.22-1.67(IOH，m),0.87-0.76(12H,m)ppm.,滋辦丄5^橫的賴備/-乙教差-1-肅扇魔差-丄-^^戚差#扇戚差__及_^_^差^:差^^一伊我應差-N-苯差-丄-多差丙凌應麼a)1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R,S-(乙硫基)-甘氨酰基-,苯基-L-苯基丙氨酰胺.遵循實施例1.2a-c中概述的操作，但將步驟1.2a中的N-末端氨基酸用7V-苯基-L-苯基丙氨酰胺取代，合成了l-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R，S-(乙硫基)-甘氨酰基-W-苯基-L-苯基丙氨酰胺的非對映異構體混合物。HPLC系統I:Rt=18.9min.ES-MSm/z:667.4[MH+]b)l-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R-(4-硝基苯基氨基)-甘氨酰基-7V-苯基-L-苯基丙氨酰胺如實施例1.2d中所描述來進行化合物1.5a與4-硝基苯胺的反應。將含有非對映異構體混合物的粗產物純化，然后使用HPLC系統J分離。蒸發MeCN然后冷凍干燥水性殘余物，得到標題化合物及其非對映異構體，其為黃色粉末。產物在酸性條件下是不穩定的。假定"較快"洗脫出的非對映異構體具有"L-樣"R-立體化學，因為它快速被MMPs斷裂，釋放出4-硝基苯胺，而"較慢的"非對映異構體并非如此。得到標題化合物，為"較快的"L-樣非對映異構體。HPLC系統K:Rt=23.20min.'H-畫R(吡啶匿D5):511.02(1H,s),9.95(1H,d),9.74(1H,d),9.24(1H，d)9.23(1H,t),8.28(1H,d),8.08(2H，d)，7.92(2H,d)，7.36-6.90(IOH，m),6.49(1H,t),5.29(1H，m),4.98(1H,m)，4.63(1H,dd),4.39+4.31(1H+1H,dd+dd),3.48+3.30(1H+1H,m+m)，3.45+3.21(1H+1H，m+m)，1.88(3H，s)，2.20-1.65(7H，m),0.81(3H，d),0.72(3H,d)ppm.!3C-畫R(吡啶-D5):S173.96,173.52,171.11,170.66,170,50,168.67，152.59,139.74,138.93,137.86,129.81,129.19,128.80,127.03,126.32，124.21,120,59,112.91,61.14,61.03,56,62,52.72,48.46,43.39，40.39,38.67,29.94,25.23,25.09,23.14，22.51,21.48ppm.得到"較慢的"D-樣非對映異構體。HPLC系統K:Rt=23.96min."H-NMR(吡咬-D5):511.05(1H,s),9.41(1H，d),9.16(2H,d+t),8.94(1H:d)，8.10(3H,m),7.89(2H,d)，7.40-7.08(8H，m),6.99(2H,d),6.48(1H,t),5.20(m，m),4.92(1H,m)，4.62(1H，dd)，4.37+4.18(1H+1H，dd+dd)，3.55+3.37(1H+1H,dd+dd)，3.35+3.13(1H+1H,m+m)，1.84(3H，s),2.20-1.63(7H，m),0.85(3H，d),0.83(3H,d)ppm."C-麗R(p比啶-D5):5174.70,173.67，171.23，171.01，170.91，168.95，152.80,139.58，138.89，137.99,129.80,129.20，128.85,127.11,126.42,124.38，120.73,112.77,61.15，60.68，57.16，52.13,48.40,44.28，39.53，38.48，30.01，25.12(2C)，23.19,22.32,21.64ppm.霧滋辦2-^趟^W蛋冷雜i溯^教^夢^浙^活^為了確定底物對于多種MMPs的特異性，對標準酶法確定進行調整以監測報道分子的釋;^丈。經實施例3a中描述的LC-MS方法，或經實施例4描述的LC-UV方法對才艮道分子進行分析。純化的原MMP8購自Calbiochem。所述酶(為10嗎/ml)經1mM的對氨基-苯基-乙酸汞(APMA)在35。C活化2.5h。活化的酶能夠用于如下監測底物的活性在35°C(80%H20)，在存在抑制劑或不存在抑制劑的條件下，將MMP8(200ng/ml的最終濃度)在確定緩沖液(0.1M"Tris-HC1"(商標)緩沖液，pH7.5,含0.1MNaCl、30mMCaCl2、0.040mMZnCl和0.05%(w/v)、"Brij35"(商標)清凈劑)中，用實施例1的底物之一(12.51^M)培養90分鐘。通過使用實施例3a的方法測量報道分子4-硝基苯胺的釋放來確定活性。對重組體人MMP9催化結構域進行了表達，然后經Zn螯合物柱色譜法接著經氧肟S良鹽親和力(hydroxamateaffinity)柱色譜法進行純化。所述酶能夠用于如下監測底物的活性將MMP9(5ng/ml最終濃度)與實施例1的底物之一(5jiM)在確定緩沖液(0.1M"Tris-HCr(商標)緩沖液，pH為7.3,含有0.1MNaCl、20mMCaCl2、0.020mMZnCl以及0.05%(w/v)的"Brij35"(商標)洗滌劑)中，在存在或不存在抑制劑的情況下，在室溫(RT)培養30分鐘。通過使用實施例3a的方法測量報道分子4-硝基苯胺的釋放來確定活性。對重組體人MMP12催化結構域進行表達，然后如ParkarA.A.aa/,(2000)，ProteinExpressionandPurification,20，152所描述進行純化。纟屯化的酶能夠用于如下監測底物的活性將MMP12(50ng/ml最終濃度)與實施例1的底物之一(10pM)在確定緩沖液(0.1M"Tris-HCr(商標)緩沖液，pH為7.3，含有0.1MNaCl、20mMCaCl2、0,020mMZnCl以及0.05%(w/v)的"Brij35"(商標)洗滌劑)中，在存在或不存在抑制劑的情況下，在室溫培養60分鐘。通過使用實施例3a的方法測量報道分子4-硝基苯胺的釋放來確定活性。可對重組體人MMP14催化結構域進行表達，然后如byParkarA.A."a/,(2000),ProteinExpressionandPurification,2^,152所描述進4亍純化。純4b的酶能夠如下監測底物的活性將MMP14(10ng/ml最終濃度)與實施例1的底物之一(10nM)在確定緩沖液(0.1M"Tris-HCl"(商標)緩沖液，pH為7.5，含有O.lMNaCl、20mMCaCl2、0.020mMZnCl以及0.05%(w/v)的"Brij35"(商標)洗涂劑)中，在存在或不存在抑制劑的情況下，在室溫培養60分鐘。通過使用實施例3a的方法測量報道分子4-硝基苯胺的釋放來確定活性。可對重組體人MMP19催化結構域進4亍表達，然后如ParkarA.A.d(2000),ProteinExpressionandPurification,逃:152所述進行純化。純化的酶能夠用于如下監測底物的活性將MMP19(40ng/ml最終濃度)與實施例1的底物之一(5iiM)在確定緩沖液(0.1M"Tris-HCl"(商標)緩沖液，pH為7.3，含有O.lMNaCl、20mMCaCl2、0.020mMZnCl以及0.05%(w/v)的"Brij35"(商標)洗滌劑)中，在存在或不存在抑制劑的情況下，在35。C培養120分鐘。通過使用實施例3a的方法測量報道分子4-硝基苯胺的釋放來確定活性。使用經表達并純化的原MMP對其它基質金屬蛋白酶(包括MMP9)的實驗方案描述在，例如C.GrahamKnighta/.,(1992)FEBSLett"296(3)，263-266中。表la.人MMPs對30|iM1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基57-a-R-(4-硝基苯基氨基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基-(3-丙氨酸曱酯(實施例l.l)的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>用*表示的來源是由阿斯利康(AstraZeneca)自制的。表lbMMPs對所選擇的底物的活性活性，單位/s(molRxH/molEnz*s)<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>^滋鄉畫Jfl-炎^丄C-M^/MS確定i^^^4-^T差^^麼辦務試#用酵母聚糖(o、50、300、600、900和1200pg/mL)刺激肝素化的全血試樣(lmL),渦旋，然后在37。C培養15分鐘。離心分離后收集血漿，與底物(10iiM)混合，然后在37。C培養60分鐘。將曱醇(300nL)(使用("C)6-4-硝基苯胺(1^M)作為內標)加到100pL等份的上述混合物中，然后離心除去析出的蛋白質。將上清液(100(iL)用水(100pL)稀釋，然后將萃取物直接注入HPLC柱中。戎凌必效通過將4-硝基苯胺摻入空白血漿中得到在1.4和2976nM之間的各種濃度，由jt匕產生七點才交準曲纟戔(sevenpointcalibrationcurve)。然后4吏才交準i式才羊沉淀并根據上述方法進行稀釋。還產生了未摻入4-硝基苯胺的血漿試樣并用作空白血漿。丄C-M5/MS系鍵LC-MS系統由兩個梯度泵、等度泵、自動注射器和三四極(triquadropole)質鐠儀(ScieXAPI3000)組成。將試樣注入保留基質組分的前置柱(,2，2x10mm)上，然后將柱用乙醇反洗。通過以下方式進行最終洗脫在6分鐘內梯度液(C,r柱，2x40mm)，B為0°/。變至100%,接著平衡1.5分鐘。移動相A:MeOH:50mMNH4AcpH4.0(2:98)，B:MeOH:50mMNH4AcpH4.0(90:10)。通過多反應檢觀寸(multiplereactionmonitoring,MRM)進行才企測。對于4畫硝基苯胺，使用139.1的m/z以及在122.2的碎片進行檢測，而對于地塞米松，使用393.1的m/z以及在373.0的碎片進行檢測。措對于所有校準試樣計算比例(4-硝基苯胺的面積/內標的面積)并相對濃度來標繪。然后從校準曲線計算所有未知試樣。實磁^J6-遽i^^浙取々,悉者益^試岸^的心席差末虔采確定全血^MMP9的活絲這項工作的目的是通過分析血漿試樣中的4-硝基苯胺來確定血樣中MMP9的活性，所述的血漿試樣取自中度COPD患者、無癥狀吸煙者和健康志愿受試者。^7f"遂LC-MS確;tj&,試岸尹^^^哀展的參l和才法使用了如下的物質二曱基亞石風，獲自FisherScientific,Loughborough,UK.曱醇205級別，獲自RomilLtd.,Waterbeach,UK.HPLC級的乙腈，獲自FisherScientific,Loughborough,UK.氨7K(0.88,35%),HPLC級，獲自FisherScientific,Loughborough,UK.4-硝基苯胺，代號18，531-0,獲自AldrichChemicalCo.Milwaukee,USA.6-4-硝基苯胺，獲自MedicinalChemistryAstraZenecaR&DChamwood。[13(3]6-4-硝基苯胺可通過對市售的。C6N-苯乙酰胺進行硝化和水解來獲得。l-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R-(4-硝基苯基氨基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基-(3-丙氨酸曱酉旨-如實施例1.1中所述來生成。59對照人血漿(肝素鋰)，獲自CharterhouseClinicalResearchUnit,London,水是由MilliQpurificationsystem,Millipore，Watford,UK新鮮配制的。襲f使用了以下的裝置UnicamUV300系歹'jUV/Vis分光光度計，來自SpectronicUnicam,Cambridge,UK.帶有專用數據系統的ScieXAPI150ex質譜儀，來自AppliedBiosystems,Warrington,Cheshire,UK.HPllOO溶劑脫氣裝置，HP1100二元梯度泵，HP1100恒溫自動采樣器和HP1100柱加熱爐，來自AgilentTechnologiesLtd.,Altrincham,Cheshire,UK.Luna苯基-己基HPLC柱(5pm,50x2.0mm)(Phenomenex，零件編號00B4257-B0).Luna苯基-丙基HPLC安全保護柱(4.0x2.0mm)(Phenomenex，零件編號AJO-4350).本申請使用的試劑為本領域已知的。對務農雀試摔和jf控賴試岸1.制備校準試樣使用適當的移液管，制備濃度為0.050、0.100、0.200、0.500、1.00、2.00、5.00和10.0的4-硝基笨胺的血漿校準試樣，如表1中所示。使用渦旋混合器充分混合。表l制備血漿校〉1l標準物4-硝基苯胺在校準試樣中的濃度0iM)儲備溶液或校準標準物儲備溶液或校準標準物的體積(jiL)對照人血漿的體積(jiL)10,0B5024505.00校準10.02502502.00校準10.01004001.00校準10.0504500.500校準5.00504500.200校準2.00504500.100校準1.00504500.050校準0.500504502.制備血漿質量控制(QC)試樣使用適當的移液管，如表2中所示制備濃度為0.100、2.00和8.00[iM的4-竭基苯胺的質量控制試樣。通過渦旋小瓶中的內含物使其充分混合并且將等份(約300足夠用于兩次分析)的每種試樣分配到塑料Sarstedt管(2.0mL)中。在冷凍裝置中在-2(TC或更低的溫度下儲藏管。表2制備質量控制試樣質量控制試樣的濃度(,儲備溶液或質量控制試樣儲備溶液或質量控制試樣的體積(fiL)混合的人血漿體積(jiL)8.00B16098402.00(C8.00250075000.100GC2.005009500試,為、浙1.1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R-(4-硝基苯基氨基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基-P-丙氨酸曱酯在血漿中培養依照要求將混合的對照人血漿、質量控制試樣和試驗試樣解凍。將1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R-(4-硝基苯基氨基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基-(3-丙氨酸曱酯(2)iL,溶液D)加到在2mL螺旋瓶蓋凝:型管中的試驗血漿試樣(200pL)中，然后在渦旋混合器上混合。將管在搖動的水浴中在37。C培養60分鐘。在步驟3試驗試樣在培養60分鐘的過程中，如表1所詳述在血漿中制備校準試樣。將試樣在渦旋混合器上混合。使用適當的移液管將等份(IOOjiL)的每種血漿試樣手動分配到96深孔2mL板單獨的孔中。(注意在試驗試樣在步驟3的培養結束IO分鐘前，開始從校準試樣、質量控制試樣和空白試樣中移液。)使用Tecan將內標的曱醇(300inL)溶液分配到每孔中。用聚苯乙烯蓋將板覆蓋。在室溫以3000rpm離心分離5分鐘。使用Tecan將等份(IOOpL)的試樣上清液轉移到96深孔2mL板單獨的孔中。使用Tecan將水(100jiL)和每種試樣在96深孔聚丙烯板中混合。用預裂(pre-spilt)的96孔封條將板覆蓋。經LC/MS分析10pL等分試樣。/,斜備^錄參迷/力丄c緒為V,1.裝置-61<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>PUMHP1100脫氣器HP1100自動采樣器HP1100A/S恒溫器HPllOO柱HPllOOMS:ScieXAPI150eX2.試驗試樣的HPLC條件柱帶有Luna的Luna苯基-己基HPLC柱(5pm，50x2.0mm)苯基-丙基HPLC安全保護柱預柱(4.0x2.0mm)溶劑A:0.01%氨水溶劑B:組成J流速J柱溫4運行時間10分鐘注射體積IOjiL注射針頭洗涂25%乙腈/水，洗滌3秒表3HPLC梯度條件在1至4分鐘之間將HPLC洗脫液導入質譜儀中。對于剩余部分，將其廢棄。3.MS采集將HPLC柱流出物經負模式操作的噴霧器接口導入質譜儀中。使用[M-Hr離子的單離子監測，以分別為m/z137和143的質荷比來沖企測4-硝基苯胺和["C]6-4-硝基苯胺。溫度425°C噴霧器氣體ll(任選刻度)屏障氣體IO(任選刻度)輔助性氣體約1L/min〗亭留時間500ms分辨率約1amu采集時間5.0min處理軟件PEScieX'Analyst'vl.1可將孔和環電壓選擇為必需的以使靈敏度最大化。應該按以下順序來分析試樣a)調節試樣(10)iMx4)b)校準試樣(IO.O，2.00,0.500,0.100jiM)c)質量控制試樣(O.Ol,2.00,8.00|iM)d)空白試樣e)試驗試樣f)質量控制試樣(0.01,2.00,8.00|iiM)g)空白試樣h)才交準試樣(5.00，1.00,0.200，0.050(iM)確定每種試樣中分析物和內標的峰響應(預期的保留時間約8min)。在分析軟件中將合適的曲線擬合應用于來自校準試樣的數據，以便使每種試樣中存在的4-硝基苯胺的濃度定量化。乂/f炎/產的標涼模^確定每種試樣中分析物的峰面積并將適當的線性回歸操作應用于來自校準試樣的數據。實驗使用經驗證的蛋白質析出LC-MS方法以12分析批次來分析血漿試樣。分析批次包括試驗試樣、校準試樣和一式兩份質量控制試樣。所有的12個批次都是可接受的，然而由于不正確的試樣準備，其中一個結果是不接受的。用不同濃度的酵母聚糖(0、50、300、600、900和1200^g/mL)刺激全血試樣。將由受刺激的全血試樣獲得的血漿試樣與底物l-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R-(4-硝基苯基氨基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基-f3-丙氨酸曱酯在濃度為lOiiM的血漿中混合，然后將試樣在37。C培養60分鐘。將等份的(IOOlaL)人血漿與含有['"C]6-4-硝基苯胺作為內標的曱醇(300pL)63混合，使蛋白質析出，將試樣離心分離，然后將上清液(100pL)與水(100iaL)混合。將萃取物10|liL直接注射在PhenomeneXLuna笨基-己基柱(50x2.0mm,5]Lim)上，并用由0.01%氨水/曱醇組成的梯度的流動相對化合物進行洗脫。將4-硝基苯胺從內源性血漿組分中分解，然后將HPLC流出物經負模式操作的加熱的噴霧器接口導入質譜儀中。使用[M-H]-離子的單離子監測，以分別為m/z137和143的質荷比來4企測4-硝基苯胺和[。C]6-4-硝基苯胺。所述方法描述在上文中。基于對lOOpL血漿試樣的分析，經0.0500至10.0|iM范圍的4-硝基苯胺對所述方法進行了驗證。包括了濃度為0.100、2.00和8.00pM的質量控制試樣4-硝基苯胺，以確定每個分析批次的可接受性。對于100jiL等份的血漿而言，所述方法的定量極限(limitofquantification,LOQ)為0.0500pM4-硝基苯胺。結果均值和標準偏差數據在全文中表示為3位有效數字。1.試^驗試樣用于確定來自訪問3和4的健康志愿受試者的4-硝基苯胺的個體濃度以及附圖1中闡明的平均值分別表示于表4和表5中。對于訪問3平均值為0.121|iM/0pg酵母聚糖至3.59|liM/1200pg酵母聚糖，而對于訪問4平均值為0.131嗎酵母聚糖至3.39|ig酵母聚糖。表4.由訪問3中健康志愿受試者獲得的4-硝基苯胺濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>AR二分析是不接受的用于確定來自訪問3和4的吸煙者的4-硝基苯胺的個體濃度以及附圖2中闡明的平均值分別表示于表6和表7中。對于訪問3平均值為0.149|iM/0叫酵母聚糖至4.47pM/1200嗎酵母聚糖，而對于訪問4平均值為0.142|aM/0|Lig酵母聚糖至4.41pM/1200(ig酵母聚糖。表6.由訪問3中吸煙者獲得的4-硝基苯胺濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>表7.由訪問4中吸煙者獲得的4-硝基苯胺濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>用于確定來自訪問3和4的COPD患者的4-硝基苯胺的個體濃度以及附圖3中闡明的平均值分別表示于表8和表9中。對于訪問3平均值為0.128iiM/0(ig酵母聚糖至4.47|iM/900|ig酵母聚糖，而對于訪問4平均值為0.141|iM/0[ig酵母聚糖至4.54jjM/1200嗎酵母聚糖。表8.由訪問3中COPD患者獲得的4-硝基苯胺濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>3140.1151.554.395.536.165.923150.06472,013.914,144.504.153160.2432.716.387.738.398.933170.08510.9272.012.923.073.023180.05270.2811.171.821,821.953190.1180.9692.523,463.953.883200.1651.002.413,453.834.14均值0.1281.583.564.334.774.68SD0.04530.6821.351,421.591.63表9.由訪問4中COPD患者獲得的4-硝基苯胺濃度受試者編4-硝基苯胺的濃度(pM)酵母聚糖的濃度0tg)05030060090012003010.1391.182.793.013,593.623020.0844.483.353.794.184.223030.1791.483.183.674.183.793040.09511.252.953.493,703.853050.1381.883.954.755.054.853060.2431.843.774.635.264.913070.1102.113.614.454.584.433080.2171.342.632.993.303.473090.1252.163.714.234,424.873100.1151.583.744.584.905.223110.1431,203.013.554.064.063120.1251.674.124.624.945.423130.1341.184.145,285.135.503140.1851.444.775.906.156.493150.09841.874.034.835.145333160.2192.335.866.527.337.403170.1102.150.7892.763.183.393180.09720.6751.952.622.913.493190.1090.5891.562.182.993.163200.1570.8912.272.823.143.42均值0,1411.513.314.034.414.54SD0.04540.4931.14U5U3U3來自所有3組的結果顯示4-硝基苯胺的濃度隨酵母聚糖濃度的增加而增加。這種增加在0和600ng酵母聚4唐之間較大，而在600和1200)ag酵母聚糖之間逐漸平緩。與健康志愿受試者相比，4-硝基苯胺的平均濃度通常在吸煙者和COPD患者中更高，而在吸煙者和COPD患者之間沒有明顯的差別。672.校準試樣和質量控制試樣由對質量控制試樣進行分析所確定的4-硝基笨胺的結果在表10中給出。均值偏差為-3%/0.100至2%/8.00。精度為3.2%/8.00(iM至10.6%/0.100HM。由反向計算(backcalculated)校準曲線確定的4-硝基苯胺濃度在表11中給出。均值偏差為-3%/0.200至3%/10.0。精度為2.6%/2.00pM至6.0%/0.100|LlM.4-硝基苯胺校準曲線回歸參數表示于表12中。結果顯示平均斜率值為0.289,精度為3.7%。R-平方值的范圍為0.9914-0.9995。表10.對于質量控制試樣所確定的人血漿中4-硝基苯胺的濃度曲線編號低(O.IOO^M)中(2.00pM)高(8.00,10.1011.857.610.1001,977.8620.09421.958.30#0.08361.998.3130.08511.887.650.09921.937.7940.1041.988,10#0.1172.038.1950.09771,978.200.1001.997.8960.1072.018.100.1072.028.1770.1082.218.210,09312.058.2680.09152.008.47#0.08172,048.609#0.07962.008.010.09131.988.25100.1032.108.340,1122.158.56110.09742.078.240.08922.088.49120.1022.068.28湘.07902.048.14均值0.09682,018.17S.D.0.01030,07820.261精度10.63.93.2%偏差-312n24242468<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>,g潛使用經驗證的LC-MS分析方法對人血漿試樣的4-硝基苯胺進行分析。由分析的質量控制試樣和試驗試樣獲得的數據在可接受的限度內并對在研究中產生的數據中給出置信度。來自所有3組的結果顯示4-硝基苯胺的濃度隨酵母聚糖濃度的增加而增加。這種增加在0和600pg酵母聚糖之間較大，而在600和1200jig酵母聚糖之間逐漸平緩。與健康志愿受試者相比，4-硝基苯胺的平均濃度通常在吸煙者和COPD患者中更高，而在吸煙者和COPD患者之間沒有明顯的差別。實滋斧A-滑濕尹蛋^癉的活^滑液(SF)是從類風濕性關節炎患者(7位受試者)和系統性紅斑狼瘡(SLE)患者(l位受試者)中獲得的。試袢斜備為了得到對預期的活性范圍的估計，用市售ELISA試劑盒對試樣的總MMP蛋白質含量進行確定。MMP1水平為3.5-10nM,MMP9為0.05-0.81nM。總蛋白質水平為30-56mg/ml(BioradDC蛋白質確定試劑盒，試劑A、B和S)。調整每種試樣的量以便將約4mg總蛋白質用于確定(表13)。用緩沖液將試樣的體積補充為18(Hd,所述緩沖液組成如下50mMpH為7.5的兩性離子緩沖劑(Tricine)、200mMNaCl、10mMCaCl2、20)iMZnCl2和0.05%Brij-35。MM尸活#確定向試樣中加入20pl底物l-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基一a-R-(4-硝基苯基氨基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酸甲酯(實施例1.2)溶液(10mM的曱醇溶液)。在37。C培養3h后，用5pl200mM的EDTA,使反應停止。將試樣經過用lml水和lml90。/。乙醇洗脫的前置柱(WatersOASISHLBIcc,零件編號94225，先后用lml乙醇和lml水進行預調節)過濾。將70試樣在氮氣流下蒸發至干，再溶于200|^150%乙醇中，然后用渦旋混合器劇烈混合并離心分離(1000g,2min)。使用HPLC(如實施例3中進行^r測或在380nM用UV進行檢測)對等份上清液中的報道分子4-硝基苯胺進行分析。標準曲線獲自摻入有定量報道分子(4NA)的試樣，然后用與分析性試樣相同的方式進行處理。471滑濕哞MM尸的活'/主受試者MMP1(nM)MMP9(nM)蛋白(mg/ml)Sample(W)4NA(nmol/mlSF)RA2385.80.3744.292.326.4RA24010.40.0748.684.016.5RA2477.50.0756.572.220.6RA2486.90.0730.013612.0RA2493.50.8150.680.694.4RA2503.50.4648.684.017.4RA254.50.5439.8102.515.9SLE5244.70.3144.990.923.9類似地，使用來自表13中所有受試者的滑液的匯集試樣，遵循相同的操作使用1-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-S-(聯苯-4-基曱氧基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酸曱酯(實施例1.3),但對報道分子4-聯苯曱醇進行分析。在該底物中，釋放值為33.2nmol/mlSF。在本申請中引入上述說明書中提及的所有出版物，作為參考。在不背離本發明的范圍和精神的情況下，對本發明的多種修改和改變對本領域技但是應該理解的是，所要求保護的發明不應過度地限制于所述的具體實施方案。7權利要求1.用于確定試樣中蛋白酶活性的方法，所述方法包括以下步驟(i)將所述試樣與底物混合，其中底物具有式(1a)其中R1為烴基R2為第一肽部分R3為第二肽部分，以及X選自O、S和NH；Y1為適當的取代基；Y2為適當的取代基；以及(ii)通過檢測具有式H-X-R1的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性，其中X選自O、S和NH；以及R1為烴基。2.用于確定蛋白酶調節劑的功效的方法，所述方法包括以下步驟使蛋白酶與所述蛋白酶調節劑接觸，并通過權利要求l的方法確定所述蛋白酶的活性。3.權利要求2的方法，其中所述蛋白酶調節劑為蛋白酶抑制劑。4.權利要求2的方法，其中所述蛋白酶調節劑為蛋白酶活化劑。5.權利要求4的方法，其中所述蛋白酶活化劑為酵母聚糖。6.用于確定候選蛋白酶調節劑的功效的方法，所述方法包括以下步驟使蛋白酶與所述候選蛋白酶調節劑接觸，并通過權利要求1的方法確定所述蛋白酶的活性。7.權利要求6的方法，其中所述候選蛋白酶調節劑為候選蛋白酶抑制劑。8.權利要求6的方法，其中所述候選蛋白酶調節劑為候選蛋白酶活化劑。9.權利要求1至8任一項的方法，其中所述試樣選自尿、全血、血漿、血清、滑液、唾液、痰、支氣管肺泡液、腦脊液、鼻灌洗液、肺襯液、淚液和皮膚水泡液。10.權利要求1至8任一項的方法，其中所述試樣選自細胞培養物、組織、組織切片和勻漿組織。11.權利要求1至IO任一項的方法，其中所述蛋白酶為基質金屬蛋白酶(MMP)EC3.4.24-。12.權利要求11的方法，其中所述基質金屬蛋白酶選自MMP8(EC3.4.24.34)、MMP9(EC3.4.24.35)、MMP12(EC3.4.24'65)詳口MMP13(EC3.4.24.-)。13.權利要求12的方法，其中所述基質金屬蛋白酶為MMP9(EC3.4.24.35)。14.權利要求1至13任一項的方法，其中所述烴基R!選自芳基、雜芳基、芳基氧基芳基、聯芳基、烷基、環烷基、雜環烷基以及它們的衍生基團。15.權利要求14的方法，其中R選自芳基、雜芳基、芳基氧基芳基、聯芳基以及它們的衍生基團。16.權利要求15的方法，其中R,選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中X表示式(la)底物的其余部分和/或具有式H-X-R,的報道分子的其余部分。17.權利要求1至16任一項的方法，其中所述底物為l-乙酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-a-R-(4-硝基苯基氨基)-甘氨酰基-L-亮氨酰基-卩-丙氨酸甲酯。18.權利要求17的方法，其中所述報道分子為4-硝基苯胺。19.如前述權利要求中任一項所定義的具有式(la)的底物。20.在羰基和-NH-CH(X-R,)-基團之間的肽鍵處能夠被蛋白酶斷裂的底物；其中R,為烴基，以及x選自o、s和麗。21.具有式H-X-R,的報道分子，其中R,為烴基，以及X選自O、S和NH;以及其中所述報道分子是從如權利要求1至20中任一項所定義的式(la)的底物得到的；但其中所述報道分子不是2-(4-異丁基-苯基)-丙酸。22.權利要求21的報道分子，其中所述烴基R,選自芳基、雜芳基、芳基氧基芳基、聯芳基、烷基、環烷基、雜環烷基以及它們的衍生基團。23.權利要求22的報道分子，其中R,選自芳基、雜芳基、芳基氧基芳基、聯芳基以及它們的衍生基團。24.權利要求23的報道分子，其中R,選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中x表示報道分子的其余部分。25.用于確定試樣中蛋白酶活性的試劑盒，所述試劑盒包括(i)如前述權利要求中任一項所定義的底物；以及(ii)用于檢測試樣中如前述權利要求中任一項所定義的報道分子的工具。26.如前述權利要求中任一項所定義的底物在檢測試樣中蛋白酶活性中的用途。27.如前述權利要求中任一項所定義的報道分子在檢測試樣中蛋白酶活性中的用途。28.用于診斷受試者中疾病或障礙的方法，所述方法包括以下步驟從所述受試者中獲得試樣，并通過權利要求1至18任一項的方法確定所述試樣中蛋白酶的活性。29.如前述權利要求中任一項所定義的底物，其用于診斷受試者中的疾病或障礙。30.如前述權利要求任一項所定義的報道分子，其用于診斷受試者中的疾病或障礙。31.權利要求28的方法、權利要求29的底物或權利要求30的報道分子，其中所述疾病為慢性阻塞性肺病(COPD)。32.確定蛋白酶調節劑的功效的方法，其中所述方法包括以下步驟(i)將所述蛋白酶調節劑連同蛋白酶與如前述權利要求中任一項所定義的具有式(la)的底物混合；(ii)通過;f企測如前述權利要求中任一項所定義的具有式H-X-R,的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性。33.用于確定候選蛋白酶調節劑的功效的方法，其中所述方法包括以下步驟(i)將所述候選蛋白酶調節劑連同蛋白酶與如前述權利要求中任一項所定義的具有式(la)的底物混合；以及(ii)通過檢測如前述權利要求中任一項所定義的具有式H-X-R,的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性。34.用于鑒別蛋白酶調節劑的方法，其中所述方法包括以下步驟(i)將候選蛋白酶調節劑連同蛋白酶與如前述權利要求中任一項所定義的具有式(la)的底物混合；以及(ii)通過檢測如前述權利要求中任一項所定義的具有式H-X-R，的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性。35.—種方法，所述方法包括以下步驟鑒別蛋白酶調節劑、制備更多的經鑒別的蛋白酶調節劑和/或然后配制更多的經鑒別的蛋白酶調節劑；其中所述的鑒別部分包括以下步驟(i)將候選蛋白酶調節劑連同蛋白酶與如前述權利要求中任一項所定義的具有式(la)的底物混合；以及(ii)通過檢測如前述權利要求中任一項所定義的具有式H-X-R,的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性。36.基本上如本申請所描述并參照權利要求1的方法。全文摘要本發明提供了確定試樣中蛋白酶活性的方法。所述方法包括(i)將所述試樣與底物混合，其中所述底物具有式(1a)的結構，其中R<sub>1</sub>為烴基；R<sub>2</sub>為第一肽部分；R<sub>3</sub>為第二肽部分，并且X選自O、S和NH；Y<sub>1</sub>為適當的取代基；Y<sub>2</sub>為適當的取代基；以及(ii)通過檢測具有式H-X-R<sub>1</sub>的報道分子的存在來確定所述蛋白酶的活性；其中X選自O、S和NH；R<sub>1</sub>為烴基。所述底物和報道分子用于確定蛋白酶調節劑和候選蛋白酶調節劑的功效，以及用于診斷受試者中的疾病或障礙。文檔編號C12Q1/37GK101466846SQ200780022050公開日2009年6月24日申請日期2007年4月11日優先權日2006年4月12日發明者卡林·范瓦琴費爾特,基思·喬利,安德斯·埃里克森,安德斯·布洛姆格倫,托馬斯·漢森,馬蒂·勒皮斯托申請人:阿斯利康(瑞典)有限公司