具有改良生長(zhǎng)特性的植物及其制備方法

專利名稱：：具有改良生長(zhǎng)特性的植物及其制備方法具有改良生長(zhǎng)特性的植物及其制備方法本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并且涉及改良植物生長(zhǎng)特性的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)調(diào)節(jié)編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)的植改良植物生長(zhǎng)特性的方法，所述CDK蛋白質(zhì)包含不同的基序或所述CDK核酸編碼這類蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及具有植物CDK核酸受調(diào)節(jié)的表達(dá)和/或植物CDK蛋白質(zhì)受調(diào)節(jié)的活性的植物，所述CDK蛋白質(zhì)包含不同的序列基序或所述核酸編碼這類蛋白質(zhì)，并且該植物相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物具有改良的生長(zhǎng)特性。本發(fā)明還涉及特定核酸序列、含有所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和植物，所述核酸序列編碼具有上述植物生長(zhǎng)改良活性的上述蛋白質(zhì)。不斷增加的世界人口和逐漸減少的農(nóng)用耕地供應(yīng)迫使人們朝著提高農(nóng)業(yè)效率的方向進(jìn)行研究。傳統(tǒng)的作物和園藝學(xué)改良方法利用選育技術(shù)來(lái)鑒定具有期望性狀的植物。然而，此類選育技術(shù)有一些缺陷，即這些纟支術(shù)一般為勞動(dòng)密集型的，而且產(chǎn)生的植物通常包含異質(zhì)的遺傳組分，當(dāng)這些異質(zhì)的遺傳組分從親本植物傳遞時(shí)不一定總是產(chǎn)生期望的性狀。分子生物學(xué)的i^艮已經(jīng)允許人類修飾動(dòng)物和植物的種質(zhì)。植物基因工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(一般以DNA或RNA的形式)以及隨后將遺傳物質(zhì)引入植物。這類^L術(shù)能夠產(chǎn)生具有多種改良的經(jīng)濟(jì)、農(nóng)業(yè)或園藝性狀的作物或植物。一種具有特殊經(jīng)濟(jì)利益的性狀是產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物可測(cè)量產(chǎn)出。這可以以數(shù)量和/或質(zhì)量的方式進(jìn)行定義。作物產(chǎn)量受到植物或作物所經(jīng)受的特定脅迫的影響。這些脅迫包括環(huán)境(非生物)脅迫(例如反常的高溫或低溫引起的溫度脅迫；營(yíng)養(yǎng)缺陷引起的脅迫；缺水(干旱)引起的脅迫)和生物脅迫(其可由其他植物(種子)、害蟲(chóng)和病原體引起)。不僅可以通過(guò)抗擊作物或植物所經(jīng)受的一種或多種脅迫增加作物產(chǎn)量，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)植物固有生長(zhǎng)機(jī)制來(lái)增加作物產(chǎn)量。植物生物量為飼料作物如苜蓿、青貯谷物和干草的產(chǎn)量。在谷物作物中使用產(chǎn)量的許多替代參數(shù)。其中首要的是估算植物大小。根據(jù)物種以及發(fā)育階段的不同，可以通過(guò)許多方法測(cè)量植物大小，但是包括植物總干重、地上干重、地上鮮重、葉面積、莖體積、植物高度、蓮座植物直徑、葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根生物量、分蘗數(shù)和葉數(shù)。許多物種在給定的發(fā)育階段維持植物不同部分大小間的保守比。利用這些異速生長(zhǎng)關(guān)系而對(duì)這些有關(guān)大小的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行由此及彼的外推(如Tittonell等2005AgricEcosys&Environ105:213)。早期發(fā)育階段的植物大小通常將與晚期發(fā)育階段的植物大小有關(guān)。具有更大葉面積的較大植物通常能夠比較小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在同期增重更多(Fasoula&Tollenaar2005Maydica50:39)。除了植物所具有的最初達(dá)到較大大小的微環(huán)境或遺傳優(yōu)勢(shì)的潛在延續(xù)，此為其附加效應(yīng)。植物大小和生長(zhǎng)速率存在著強(qiáng)遺傳組件(如terSteege等2005PlantPhysiology139:1078)，且迄今為止，種種多樣化基因型植物在一種環(huán)境條件下的大小很可能與另一種環(huán)境條件下的大小有關(guān)(Hittalmani等2003TheoreticalAppliedGenetics107:679)。以這種方式，的替代^*。J,、收獲指數(shù)為種子產(chǎn)量與地上干重的比值，其在許多環(huán)境條件下相對(duì)穩(wěn)定，因此在植物大小和谷物產(chǎn)量之間通常能夠獲得比較穩(wěn)固的相關(guān)性(如Rebetzke等2002CropScience42:739)。這些方法固有地聯(lián)系在一起，因?yàn)榇蠖鄶?shù)谷物生物量取決于植物葉和莖當(dāng)前或貯存的光合作用生產(chǎn)力(Gardener等1985PhysiologyofCropPlants.IowaStateUniversityPress,pp68-73)。因此，對(duì)植物大小的選擇，甚至是在發(fā)育早期階段的選擇，已經(jīng)用作為未來(lái)潛在產(chǎn)量的指標(biāo)(如Tittonell等2005AgricEcosys&Environ105:213)。當(dāng)測(cè)試遺傳差異對(duì)脅迫耐受性的影響時(shí)，溫室或植物培養(yǎng)室與田地相比具有固有的優(yōu)勢(shì)即能夠使土壤性能、溫度、水和營(yíng)養(yǎng)的可用性以及光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。不過(guò)，因缺乏風(fēng)力或昆蟲(chóng)導(dǎo)致不良授粉，或9由于空間不足以讓成熟根或冠層生長(zhǎng)等等，對(duì)產(chǎn)量造成的這些人工局限性會(huì)限制這些控制環(huán)境在測(cè)試產(chǎn)量差異中的應(yīng)用。因此，在培養(yǎng)室或溫室標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)量早期發(fā)育階段的植物大小，是提供潛在遺傳產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)方法。植物的固有生長(zhǎng)機(jī)制以高度有序的事件順序存在，總稱為"細(xì)胞周期"。影響植物細(xì)胞周期(使用重組DNA技術(shù)或使用非重組手段)并且由此調(diào)節(jié)植物的多種生長(zhǎng)特性的能力將在例如增強(qiáng)作物、植物育種、產(chǎn)生觀賞植物、樹(shù)木培植、園藝學(xué)、林學(xué)、藻類或植物的產(chǎn)生領(lǐng)域中具有多種應(yīng)用(例如用作產(chǎn)生例如藥物、抗體或疫苗物質(zhì)的生物反應(yīng)器，或用于有機(jī)廢物的生物轉(zhuǎn)化的生物反應(yīng)器或在高產(chǎn)量藻類和植物情況下用作燃料)。至關(guān)重要。細(xì)胞周期的主要組件在酵母、哺乳動(dòng)物和植物中高度保守。細(xì)胞周期通常被劃分為下列順序的時(shí)期G0-G1-S-G2-M。DNA復(fù)制或合成通常發(fā)生在S期("S"指DNA合成)，在M期發(fā)生染色體的有絲分離("M，，指有絲分裂)，以及介于其間的間期G1(DNA復(fù)制之前，此期間內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng))和G2(DNA復(fù)制之后的時(shí)期，此期間內(nèi)細(xì)胞為分裂做準(zhǔn)備)。在M期的最后步驟為胞質(zhì)分裂之后完成細(xì)胞分裂。已經(jīng)退出細(xì)胞周期并且成為休眠的細(xì)胞稱為處于GO期。可以刺激這一期間的細(xì)胞重返細(xì)胞周期處于Gl期。在G1、G2和G0中的"G"代表"間期"。細(xì)胞周期進(jìn)程的完成使每個(gè)子細(xì)胞在細(xì)胞分裂期間接受親本基因組的完整拷貝。細(xì)胞分裂由兩個(gè)主要的細(xì)胞周期事件控制，即DNA合成的起始和有絲分裂的起始。這些關(guān)鍵事件的每一轉(zhuǎn)換是由特定蛋白質(zhì)復(fù)合物(涉及DNA復(fù)制和分裂)所代表的限制點(diǎn)控制。在Gl/S邊界DNA合成需要的基因的表達(dá)由哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞中E2F家族轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)(WO96/25494;Muller等人，GenesandDevelopment15，267-285，2001;DeVeylder等人，EMBOJ.21，13602-1368，2002)。通過(guò)E2F/Rb復(fù)合體整合信號(hào)并激活細(xì)胞周期基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)/引發(fā)it^細(xì)胞周期。由不同的異源二聚體絲氨酸此的細(xì)胞周期進(jìn)程，通常稱上述異源二聚體絲氨^/蘇氨酸蛋白激酶為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)。激活這些激酶的先決條件是與特定細(xì)胞周期蛋白的物理締合，激活時(shí)棚艮大程度上依賴于細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)。細(xì)胞周期蛋白結(jié)合引起所結(jié)合的CDK的N-末端葉片(lobe)的構(gòu)象改變并促使復(fù)合體的定位和底物特異性。當(dāng)與細(xì)胞周期蛋白締合時(shí)，單體CDK被激活并由此具有激酶活性。細(xì)胞周期蛋白水平在細(xì)胞周期中波動(dòng)而因此代表確定CDK激活時(shí)機(jī)的主要因子。在細(xì)胞周期中含有細(xì)胞周期蛋白和CDK的這些復(fù)合體的周期性激活介導(dǎo)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換(限制點(diǎn))的時(shí)間性調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)CDK活性的其他因子包括CDK抑制劑(CKI或ICK、KIP、CIP、INK)、CDK激活激酶(CAK)、CDK磷酸酶(Cdc25)和CDK亞基(CKS)(Mironov等人，PlantCell11，509-522,1999;Reed,S.I.ProgressinCellCycleResearch2，5-27，1996)。在植物中，目前已經(jīng)研究的兩種主要類型的CDK被稱為A型和B型CDK。A型CDK調(diào)節(jié)Gl-至-S和G2-至-M的轉(zhuǎn)換，而B(niǎo)型CDK似乎僅控制G2-至-M限制點(diǎn)(Hemerly等人，1995;Magyar等人，1997;Porceddu等人，2001)。此外，已報(bào)道存在C型CDK和CDK激活激酶(CAK)(Magyar等人，1997;Umeda等人，1998;Joub6s等人，2001)，同樣存在D型、E型和F型CDK(Vandepoele等人，PlantCell14，903-916，2002)。已知A型CDK具有保守的三級(jí)結(jié)構(gòu)(Goldsmith和Cobb,Curr.Opin.Struct.Biol.4，833-840)，包括與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合有關(guān)的高度保守的PSTAIRE基序。CDK的催化核心包括N端葉片和C端葉片。C端葉片包含一個(gè)催化裂(負(fù)責(zé)ATP和底物結(jié)合)并且還包括在許多激酶家族中保守的蘇氨酸殘基之后命名的，所謂的T環(huán)。在人CDK2中，這一蘇氨酸殘基在位置161，而在釀酒酵母(^iccAfl/wwj;cMcerev&/fle)cdc28中以及在粟酒裂殖酵母(iSc/r/z仍acc/tiwwMj;ces/w/M6e)cde2中，其分另'J位于位置169和167。據(jù)報(bào)道，該蘇氨酸殘基的磷酸化引起T環(huán)中結(jié)構(gòu)構(gòu)象改變，其為激酶轉(zhuǎn)換為活性狀態(tài)所必需的(Gu等人，EMBOJ.11，3995-4005)。許多研究描述了T環(huán)中保守蘇氨酸的突變(Ducommun等人，EMBOJ.10，3311-3319，1991;Gould等人，EMBOJ.10，3297-3309;Marcote等人，Mol.Cell.Biol.13，5122-5131，1993;Ducommun等人，MolCell.Biol.11，6177-6184，1991;Col函n等人，J.Biol.Chem.272，18869-18874，1997;Martinez等人，EMBOJ.16，343-354，1997;Gould等人，Mol.Gen.Genet,259，437-448，1998;Booher等人，Mol.Cell.Biol.6，3523-3530，1986;Solomon等人，Mol.Biol.Cell3，13-27，1992;Lim等人，Mol.Cell.Biol.16，4573-4583，1996),所有檢測(cè)的突變顯示出對(duì)配體的結(jié)合(例如細(xì)胞周期蛋白或Sucl/ICK)和/或激酶活性具有嚴(yán)重影響，在酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生缺陷或致死表型。盡管T169E突變(才艮據(jù)酵母cdc28的編號(hào))及其相似物T169D突變模擬磷酸化，已證明帶有這類突變的CDK都不能完全補(bǔ)償酵母。在A型CDK蛋白質(zhì)活性中具有重要作用的其他殘基是位置14的蘇氨酸和位置15的酪氨酸。一旦磷酸化這些氨基酸的至少一個(gè)，CDK失去活性。WO99/54489描述了使用分別由丙氨酸和苯丙氨酸取代蘇氨酸14和酪氨酸15的CDK以增加植物對(duì)鹽脅迫的耐受性。WO00/52171描述了調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞周期蛋白介導(dǎo)的形態(tài)、生化和生理特性或特征的方法，其包括在植物中表達(dá)Cdc25磷蛋白磷酸酶。上述CDK是參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)，所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)確保細(xì)胞分裂中基因組的完整。作為有絲分裂中檢驗(yàn)點(diǎn)的CDK由細(xì)胞周期蛋白A或細(xì)胞周期蛋白B調(diào)節(jié)。CDK僅在它們各自的細(xì)胞周期蛋白相關(guān)的細(xì)胞周期中有活性。雖然它們基本的有絲分裂作用是清楚的，然而這些蛋白激S^ft用在活細(xì)胞中的分子機(jī)制必須闡明。具體地，不同CDK同種型和CDK-亞基的功能仍然不清楚。多種生物體中的遺傳和生物化學(xué)分析已表明高度保守的CDK是進(jìn)入有絲分裂及其存在需要的。結(jié)構(gòu)研究和生物化學(xué)研究預(yù)示CDK調(diào)整特異性底物的識(shí)別，但是目前CDK的直接下游效應(yīng)物是未知的。由于大多數(shù)CDK以不同的同種型存在，每個(gè)幾乎功能不同，甚至其位置也很不相同。這意味著需要進(jìn)一步的生物化學(xué)研究來(lái)闡明CDK作用的分子途徑。因此很需要參與植物分化的CDK的新的和更合適的編碼基因。有利地，所述新基因應(yīng)當(dāng)盡可能多的具有以下特征參與細(xì)胞周期和/或細(xì)胞分裂；參與器官發(fā)生；參與形態(tài)發(fā)生；影響植物的解剖結(jié)構(gòu)(anatomy);增加代謝活性；增加植物不同器官的大小，所述器官優(yōu)選種子或籽粒；和/或在不同器官和/或細(xì)胞區(qū)室中更廣泛的活性。因此，本發(fā)明的目的是提供其他CDK基因，其適合在植物中增加產(chǎn)量。該目的通過(guò)本發(fā)明用于制備式I化合物的方法實(shí)現(xiàn)。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，改良植物生長(zhǎng)特性的方法，其包括調(diào)節(jié)植物中CDK基因的活性，優(yōu)選調(diào)節(jié)A型CDK基因的活性，和/或調(diào)節(jié)此類CDK(優(yōu)選A型CDK)的編碼核酸的表達(dá)，并任選選擇具有改良的生長(zhǎng)特性的植物。有利地，實(shí)施本發(fā)明的方法得到了相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物具有多種改良的生長(zhǎng)特性的植物，并且該改良的生長(zhǎng)特性至少包括相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物增加的產(chǎn)量。本文所定義的術(shù)語(yǔ)"增加的產(chǎn)量"意指分別相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物，如下^f壬一項(xiàng)或多項(xiàng)中的增加(i)植物的一個(gè)或多個(gè)部分增加的生物量(重量)，特別是地上(可收獲)部分、增加的根生物量或任何其他可收獲部分增加的生物量；(ii)增加的種子總產(chǎn)量，其包括種子生物量(種子重量)的增加而其可以是每,物或單個(gè)種子基礎(chǔ)上種子重量的增加；(iii)每個(gè)圓錐花序增加的花("小花")數(shù)量；(iv)增加的(飽滿)種子數(shù)；(v)增加的種子大小，其也可能影響種子的組成；(vi)增加的種子體積，其也可能影響種子的組成(包括油、蛋白質(zhì)和糖類總含量和組成)；(vii)增加的單個(gè)種子面積；(viii)增加的單個(gè)種子長(zhǎng)度和/或?qū)挾龋?ix)增加的收獲指數(shù),其表示為可收獲部分如種子的產(chǎn)量與總生物量的比例；以及(x)增加的千粒重(TKW)，其從所計(jì)的飽滿種子數(shù)和它們的總重量推導(dǎo)出來(lái)。增加的TKW可產(chǎn)生自增加的種子大小和/或種子重量。增加的TKW可產(chǎn)生自胚胎大小和/或胚乳大小的增加。以谷類為例，產(chǎn)量增加可以表現(xiàn)為下列一種或多種每公項(xiàng)或英畝植物數(shù)量增加、每M物穗數(shù)量的增加、畦數(shù)、每畦種子數(shù)、粒重、TKW、穗的長(zhǎng);l/直徑的增加等。以稻為例，產(chǎn)量增加可以表現(xiàn)為下列一種或多種的增加每公項(xiàng)或英畝植物數(shù)量、每林植物的圓錐花序數(shù)量、每個(gè)圓錐花序的小穗數(shù)量、每個(gè)圓錐花序花的數(shù)量，種子飽滿率的增加((以％)表示為飽滿種子數(shù)對(duì)小花數(shù)(種子總數(shù))的比例)、TKW的增加等。產(chǎn)量增加還可產(chǎn)生改變的構(gòu)造或可以作為改變構(gòu)造的結(jié)果發(fā)生。根據(jù)優(yōu)選的特征，實(shí)施本發(fā)明的方法使植物具有增加的產(chǎn)量，更具體地，具有增加的生物量和/或增加的種子產(chǎn)量。優(yōu)選地，增加的種子產(chǎn)量包括分別相對(duì)于對(duì)照植物在下列一種或多種中的增加(飽滿)種子數(shù)、種子總重量、種子大小、種子體積、千粒重和收獲指數(shù)。因此，本發(fā)明提供了相對(duì)于相應(yīng)的對(duì)照植物增加植物產(chǎn)量的方法，該方法包括調(diào)節(jié)CDK或其同源物在植物中的活性，所述CDK或其同源物具有本文提及的基序之一，和/或調(diào)節(jié)編碼這類CDK或其同源物的核酸的表達(dá)。由于本發(fā)明的改良植物具有增加的產(chǎn)量，因此，相對(duì)于在其生命周期對(duì)應(yīng)階段的相應(yīng)野生型植物的生長(zhǎng)速度，這些植物很可能表現(xiàn)出增加的生長(zhǎng)速度(至少在其部分的生命周期中)。生長(zhǎng)速度增加可以是對(duì)植物的一個(gè)或多個(gè)部分或植物的細(xì)胞類型(包括種子)特異的，或者可以基本遍布整林植物。具有增加的生長(zhǎng)速度的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期意指從干的成熟種子生長(zhǎng)到植物產(chǎn)生干的成熟種子(類似于起始物質(zhì))14的階段所需的時(shí)間。此生命周期可以受到如早期活力、生長(zhǎng)速度、開(kāi)花時(shí)間和種子成熟速度等因素的影響。生長(zhǎng)速度的增加可以發(fā)生在植物生命周期的一個(gè)或多個(gè)階段或者基本遍布整個(gè)植物生命周期期間。在植物生命周期的早期階段增加的生長(zhǎng)速i良映了增強(qiáng)的活力。生長(zhǎng)速度的增加可以改變植物的收獲周期，這使得植物可以比可能的情形更晚播種和/或更早收獲。如果生長(zhǎng)速度充分增加，可以允許播種相同植物物種的更多種子(例如在播種和收獲稻植物后，接著播種和收獲更多的稻植物，所有這些都在一個(gè)常規(guī)生長(zhǎng)期內(nèi))。類似的，如果生長(zhǎng)速度充分增加，可以允許播種不同植物物種的更多種子(例如在播種和收獲稻植物后，例如接著播種和任選收獲大豆、馬鈴薯或任何其他適當(dāng)?shù)闹参?。在一些植物的情形下，從同一根狀莖收獲更多次也是可能的。改變植物的收獲周期可以使得每英畝每年生物量的產(chǎn)出增加(由于任何特定植物可以生長(zhǎng)和收獲次數(shù)(指在一年中)的增加)。生長(zhǎng)速度的增加還使得轉(zhuǎn)基因植物可以比它們的野生型對(duì)應(yīng)物在更廣的地域栽培，這是因?yàn)樯L(zhǎng)作物的區(qū)域性限制通常決定于種植時(shí)(早季)或收獲時(shí)(晚季)的不利環(huán)境條件。如果收獲周期縮短，那么可以避免此類不利條件。可以通過(guò)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)繪生長(zhǎng)曲線，得到多個(gè)參數(shù)來(lái)確定生長(zhǎng)速度，此類參數(shù)可以是T-Mid(植物達(dá)到其最大大小的S0。/。所用的時(shí)間)以及T-900直物達(dá)到其最大大小的卯％所用的時(shí)間)等。本發(fā)明方法的實(shí)施提供了具有增加的生長(zhǎng)速度的植物。因此，本發(fā)明提供了增加植物生長(zhǎng)速度的方法，該方法包括在植物中調(diào)節(jié)CDK、其同種型或同源物的活性，所述CDK或同源物具有(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE基序和本文提及的其他基序，和/或調(diào)節(jié)這類CDKA或其同源物的編碼核酸的表達(dá)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"同種型"意指具有一些小的區(qū)別的蛋白質(zhì)的不同形式(version),如果蛋白質(zhì)是酶，這也稱為同工酶。同種型通常通過(guò)電泳或一些其他分離技術(shù)分離。這些技術(shù)基于多種機(jī)理不同的基于座、多個(gè)等位片段(也稱為等位基因、等位基因酶或同種異型酶)、不同亞勤目互作用、不同剪接形式或不同的翻譯后修飾。與對(duì)照植物相比，無(wú)論植物是否在無(wú)脅迫條件下或植物是否接觸多種脅迫，發(fā)生產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)速度的增加。植物一般通過(guò)生長(zhǎng)更加緩慢來(lái)應(yīng)答所接觸的脅迫。在嚴(yán)重脅迫條件下，植物甚至完全停止生長(zhǎng)。另一方面，本文將中等脅迫定義為植物所接觸的不引起植物完全停止生長(zhǎng)且沒(méi)有能力恢復(fù)生長(zhǎng)的任何脅迫。根據(jù)農(nóng)業(yè)實(shí)踐(灌溉、施肥、殺蟲(chóng)劑處理)的發(fā)展，在栽培的作物植物中通常不會(huì)遇到嚴(yán)重脅迫。因而，中等脅迫誘導(dǎo)的受損生長(zhǎng)通常是農(nóng)業(yè)所不希望的特征。中等脅迫是植物所接觸的典型脅迫。這些脅迫可以是植物所接觸的日常生物和/或非生物(環(huán)境)脅迫。典型的非生物或環(huán)境脅迫包括由反常的熱或寒冷/凍結(jié)溫度引起的溫度脅迫；鹽脅迫；水脅迫(干旱或過(guò)量的水)。非生物脅迫還可以由化學(xué)品引起。生物脅迫通常是那些由病原體，如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲(chóng)引起的脅迫。本文所用的術(shù)語(yǔ)"無(wú)脅迫條件"是不明顯超出植物可能遇到的每日氣候和其他非生物條件的那些環(huán)境條件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明白指定地域的正常土壤條件和氣候條件。術(shù)語(yǔ)"增加，，"改進(jìn)，，或"提高，，可互換，且在本申請(qǐng)意義上應(yīng)理解為與本文所定義的野生型植物相比(例如，這意味著和沒(méi)有引入本發(fā)明的CDK編碼核酸序列的植物相比)，生長(zhǎng)多出至少10%、20%、30%、40%或50%，優(yōu)選至少60%、70%、80%、卯％或100%，更優(yōu)選150%、200%、300%、400%或500%。與對(duì)照、參照或野生型相比，就多肽在細(xì)胞、組織、細(xì)胞器、器官或生物或其部分中生物活性而言的增加優(yōu)選至少多出5%，優(yōu)選至少20%或至少50%，特別優(yōu)選至少70%、80%、90%或以上，及其尤其優(yōu)選至少200%、300%或400%，最優(yōu)選至少500%或以上。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)活性"將意味著本發(fā)明核酸序列表達(dá)或該核酸序列編碼的蛋白質(zhì)的任何改變，這導(dǎo)致植物生長(zhǎng)的增加?？梢栽谌魏沃参镏杏欣馗牧忌鲜錾L(zhǎng)特性。本文所用的術(shù)語(yǔ)"植物"包括整林植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括種子、枝條、莖干、葉、根(包括塊莖)、果實(shí)、柄、幼苗、塊莖、花，以及組織和器官，其中前述的每種包含目的基因/核酸，或在目的基因/核酸中的特異性修飾。術(shù)語(yǔ)"植物，，還包括植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚胎、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣的，其中前述的每種包含目的基因/核酸。"參照"、"對(duì)照"、或"野生型，，尤其是細(xì)胞、組織、器官、生物體或其部分，它們未按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)。從而，術(shù)語(yǔ)"野生型"、"對(duì)照"或"參照"可互換，并且可以是細(xì)胞或植物的部分，如細(xì)胞器、組織或植物，它們未按照本文所述的本發(fā)明方法修飾或處理。從而，用作為野生型、對(duì)照或參照的細(xì)胞或植物部分(如細(xì)胞器或植物)，盡可能地對(duì)應(yīng)于(本發(fā)明的)細(xì)胞、植物或植物部分，而且除了本發(fā)明方法所致結(jié)果以外的任何其他特性都與本發(fā)明的主題對(duì)象(subject)盡可能地相同。因而，對(duì)野生型、對(duì)照或參照進(jìn)行相同的處理，或者盡可能地進(jìn)行相同處理，即條件或特性僅僅是可能有差異，但并不影響所測(cè)特性的品質(zhì)。換言之，這意味著野生型代表(l)攜帶不變形式的基因或等位基因的植物，或者(2)由之獲得本發(fā)明方法生產(chǎn)的植物的起始材料/植物。優(yōu)選在類似條件下對(duì)野生型植物和本發(fā)明方法生產(chǎn)的植物進(jìn)行任何比較。術(shù)語(yǔ)"類似條件"是指在待比較的實(shí)驗(yàn)之間，所有的條件都保持相同例如培養(yǎng)或生長(zhǎng)條件、測(cè)定條件(如緩沖液組成、溫度、底物、病原林、濃度等等)。術(shù)語(yǔ)"參照"、"對(duì)照，，或"野生型"優(yōu)選為(比較)對(duì)象，如細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、植物，其未按照本文所述方法修飾或處理，并且任何其他特性都與本發(fā)明的主題對(duì)象盡可能地相似。參照、對(duì)照或野生型在其基因組、轉(zhuǎn)錄物組(transcriptome)、蛋白質(zhì)組或代謝物組(metabolome)方面與本發(fā)明的主題對(duì)象盡可能地相似。優(yōu)選術(shù)語(yǔ)"參照-"、"對(duì)照-"或"野生型-"-細(xì)胞器、-細(xì)胞、-組織或植物與細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或植物相關(guān)，所述細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或植物與本發(fā)明的細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或植物、或其部分在遺傳上幾乎相同，優(yōu)選95%相同，更優(yōu)選98%相同，甚至更優(yōu)選99，00%相同，特別是99,10%、99,30%、99,50%、99,70%、99,90%、99,99%、99，999%相同或更高(百分比)相同。最優(yōu)選"參照"、"對(duì)照"或"野生型"為比較對(duì)象，如細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、植物，其與使用本發(fā)明方法所對(duì)應(yīng)的植物、細(xì)胞器在遺傳上相同，根據(jù)本發(fā)明方法核酸分子或由其編碼的基因產(chǎn)物經(jīng)改變或修飾除外。在不能提供與本發(fā)明主題對(duì)象的差異僅在于不是本發(fā)明方法的主題對(duì)象的對(duì)照、參照或野生型的情況下，對(duì)照、參照或野生型可以是這樣的生物體，其中導(dǎo)致本文所M細(xì)化學(xué)品增加的活性調(diào)節(jié)原因已逆轉(zhuǎn)或消除，例如通過(guò)負(fù)責(zé)減少基因產(chǎn)物的互補(bǔ)作用，例如通過(guò)穩(wěn)定或瞬時(shí)(過(guò)量)表達(dá)、通過(guò)活化激動(dòng)物或激動(dòng)劑、通過(guò)滅活抑制劑或拮抗劑、通過(guò)加入活性化合物，如激素、通過(guò)轉(zhuǎn)入增強(qiáng)子等。尤其可用于本發(fā)明方法或過(guò)程中的植物包括藻類、蕨類植物以及屬于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括選自如下物種的飼料或飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、喬木或灌木秋葵屬物種(^6e/附仍c/irMSspp.)、槭樹(shù)屬物種(J"rspp.)、獼猴桃屬物種04c,/mV/zVispp.)、冰草屬物種04gro/y;iwispp.)、蔥芹屬物種(y4///w/wspp.)、莧屬物種(Jwam",/f"sspp.)、鳳梨(^4"fl"oyo附仍附)、番篇枝屬物種(/lw/iowflspp.)、芹菜(J/7/w附gr"v/e附)、擬南芥(Jr"6iV/o/7^s^a//""")、落花生屬物種(Jrffc/r/sspp.)、木波羅屬物種(y4rtoc"r/;附spp，)'石刁柏(Jspflnig"soj^">m//s)、燕麥(Jvew"sflftv")、陽(yáng)杉&(Jve/r/^"cflr"附Zw/fl)、冬瓜(必^wVicosflZr/s/;iV/fl)、巴西栗(5^^(//^紐^vcefeea),甜菜(B""vw/g"一、蕓苫屬物種CB醋s/caspp.)、CW由/"nVi歸、大葉茶(Cflme///asiViews/s)、美人葉、(CWiwfl/wd/cfl)、辣椒屬物種(CVi/7w'c"附spp,)、番木瓜拜/7，)、大果假虎刺(CaW柳附ac度a/yfl)、紅花(0iWAff附附ft'""w/附)、山核書(shū)&屬物種(Cflo;flspp.)、栗屬物種(OiWflwe"spp.)、苦首(Oc/^Wwwew^/i'v/fl)、掉屬物種(OViw"附o附w附sp/,)、西瓜(01///附/做ar附)、柑橘屬物種(C^"sspp.)、椰子屬物種(Oc仍spp.)、咖啡屬物種(Oj^spp.)、Co/aspp.、芋(G/o面/"escw/ew似)、榛屬物種(C07/"sspp.)、山楂屬物種(O"似egwsspp.)、香瓜屬物種(Cmcww/sspp.)、南瓜屬物種(C"cw6/似spp.)、菜薊屬物種(Q;mimspp.)、胡蘿卜18(DtiMcwscarW")、山馬蟥屬物種(Des7Mod/wiwspp.)、龍目艮(DiVwoawyMS/。Mg朋)、薯蕷屬物種(Z)/osc附flspp.)、柿樹(shù)屬物種(D/o柳r仍spp.)、稗屬物種(五c/f/腳c/r/o"spp.)、糝子(五/e附/"ecwflcawa)、批把(^Wo^r"乂a/ww/ai)、紅^f子果(JE"wgew/"M",yZom)、蕎麥屬物種CFago/^rw附spp.)、山毛櫸屬物種CF"gwsspp.)、無(wú)花果(F/c附c肌'cfl)、金桔屬物種(/^""6//"卿.)、草莓屬物種(F/Yig"Wflspp.)、銀杏(G/"一緒Ma)、大豆屬物種((7(v""espp.)、陸地才帛(G^ss^/7/"m/hV^M^i附)、向日葵屬物種(/Te/,Vwi^wsspp.)、木槿屬物種(/T船譜spp.)、大麥屬物種(^nfe鵬spp.)、甘薯(7po附oea6tf似似s」、核桃屬物種(/wg/朋sspp.)、萵苣(X""WC"SflftVtf)、山黧豆屬物種spp.)、浮萍屬物種s/;/7.)、兵豆ci///wfl/is)、亞麻(丄/ww附"s/to^w/附w附)、茶斗支(丄/fcA/c/^Vfew^s)、百樂(lè)M艮屬物種(丄W"sSpp.)、棱角絲瓜(丄"j^""CM似Mg"/fl)、羽扇豆屬物種(丄w/;/w附spp.)、石更皮豆屬物種(iWacro^/o附"spp.)、西印度櫻桃(Ma/尸Zg/h"e/fmrg/""to)、蘋(píng)果屬物種(Ma/wsspp.)、曼密蘋(píng)果(Ma柳附e""附en.awia)、芒果(Af""^/^"/"d,c^)、木薯屬物種(M"m7^fspp.)、人心果(Maw/汰amza/wto)、紫苜蓿(M^Z/cagos""v")、草木樨屬物種(Afe/i'/C附spp.)、薄荷屬物種(Mew幼aspp.)、苦瓜屬物種(Mo附o/^/c"spp.)、黑桑(Mw"sw/gr")、芭蕉屬物種(M附flspp.)、煙草屬物種(iV/coftVmflspp.)、木犀欖屬物種(0/e"spp.)、仙人掌屬物種(0^wiftVispp.)、Om/幼o(hù)/;"sspp.、稻屬物種(Oijwspp.)、稷(尸"附c"附附/"acew附)、雞蛋果(尸"M!y/oniWw//s)、歐防風(fēng)、鱘梨屬物種(尸eraeflspp.)、香芹(戶C仍Ww"附cWs/7mw)、菜豆屬物種(尸A"wo/附spp.)、刺葵屬物種(iV^ewixspp.)、酸漿屬物種(尸/^^/^spp.)、；忪屬物種(戶/wMsspp.)、阿月渾子(尸/sto"Viwm)、豌豆屬物種(尸&wwspp.)、早熟禾屬物種(尸oflspp.)、楊屬物種(jPo/;"/"sspp.)、牧豆樹(shù)屬物種(iV仍o/7&spp.)、李屬物種(尸r"WMsspp.)、番石榴屬物種(i^,VZ/w附spp.)、石榴(尸mw/c"gnm"似附)、西洋梨(i^rwsco附/w"m&)、櫟屬物種(6齢面spp.)、蘿卜(及fl/7/i""附saftV附)、波葉大黃(及/^麵W"6flr^w"附)、茶簾子屬物種(i/6"spp.)、懸鉤子屬物種(及"6"sspp.)、甘蔗屬物種(5Vic(^"fM附spp.)、接骨木屬物種(S"附6"cwsspp.)、黑麥(Smi/emr"/e)、iSesa附w附spp.、癡屬物種(5W"fiM附spp.)、兩色蜀黍(5"wg/r"附A/co/w)、菠菜屬物種(iS/wVifl"Vispp.)、蒲杉匕屬物種(iSyzj^/w附spp.)、酸豆(71a附flW"flfws'W/ai)、可可樹(shù)(r/^6/y附flozcao)、車(chē)軸草屬物種(7>《/6//"附spp.)、7Wft'cosecfl/eW附/mw,'、小麥屬物種(7Wft'cm附spp.)、越桔屬物種(K"cdw/wwspp.)、野豌豆屬物種(FiW"spp.)、紅豆屬物種(F/g"ffs/，/.)、葡萄屬物種(K/似spp.)、玉蜀黍(Zm附"j，s)、北美洲野生稻(Zl'Z朋/fl/7"/"51/,/51)、奉屬物種(Z/Z—WS1Spp.)等。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特征，植物是包含大豆、向日葵、蕓苜、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯或煙草的作物植物。更優(yōu)選本發(fā)明的植物是單子葉植物，如甘蔗，最優(yōu)選谷類，如稻、玉米、小麥、粟、大麥、黑麥、燕麥或高粱。更優(yōu)選的植物選自下組菊科(Asteraceae)如向日葵屬(/TW"w狄"s)、萬(wàn)壽菊屬(rflgetes)，例如物種向日葵(/^/,Vm汰附、香葉萬(wàn)壽菊(7Vigetes/w"V/fl)、萬(wàn)壽菊(T(ag"es)或細(xì)葉萬(wàn)壽菊(！Ttfge,esteiyb//");十字花科(5mssicflce"e)如蕓苫屬(必ra^/cfl)、擬南芥屬(^m^wto/w/s),例i口物種歐洲蕓苜(5nws/ai、甘藍(lán)型油菜物種(5/msiaim戸邵.)(蕓繭、油菜籽油菜、蕪菁)或擬南芥；豆科(F"k"fle)如大豆屬(Gfy"Vie)，例如物種大豆(G7戸Vie附ax)、黃豆(Wa/r/s//flffl)或大豆(Wa附flpc)5亞麻科(丄iVi"ceflfe)3口亞麻屬(Ziwfi附)，眾'J:i口物種亞麻(IiwM附M5ito^s5i附w附)；禾本科(尸oflccfle)如大麥屬(J^(9n/e謂)、黑麥屬(i^ai/e)、燕麥屬(Jvemi)、高粱屬(SwgA"附)、稻屬(Orj;z")、玉蜀黍(Zm)、小麥屬(7Wft'cw附)，例如物種大麥(vM/gff/T)、黑麥(iS^cfl/ecemi/e)、燕麥(jvewflsaftVa)、野燕麥(ve麗/fl,wa)、紅燕麥(zawft'"fl)、野燕麥(」ve麗/"她iw.swAVa)、Jve"fl/^6尸論[燕麥]、高粱或粟(5^g/ri/附6/cotor)、稻(saftVa)，闊葉稻(Ozyz")、玉米或玉蜀泰(Zea附"")、小麥(7hY/c"附fles^/v"附)、硬粒小麥(7W,i'cm附flfMrW/ll)、圓雄'J、麥(7Wft'CM/Mrtl/^lV/M附)、7Wft'CM/M/^^Crt"附、馬卡,J、麥(7h7/cw附附"cZ^)、面包小麥(7WftCM附s"ftV"附)或普通小麥(7WftVw附vn/gare);癡科(5^/"w"ce"e)如癡屬(5W"w扁)、番癡屬()，命'J:i口物種馬鈴薯(So/"ww附似6erosw附)、番癡(Z^co/;cs/cow&scfi/ei^w/m、Z^co/^尸sicow(vco/7w.cw附、Z^co/em.c卵/^ri/b簡(jiǎn)e、紅癡(5W做m附/贈(zèng)"/<//"附)、iSW/"聽(tīng)附/yc印emV"附)?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)CDKA蛋白質(zhì)的水平來(lái)調(diào)節(jié)CDKA蛋白質(zhì)的活性?？蛇x的，當(dāng)CDKA蛋白質(zhì)水平?jīng)]有變化時(shí)，也可以調(diào)節(jié)其活性，這可以在例如通過(guò)產(chǎn)生突變體改變多肽固有特性時(shí)發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特征，引入CDKA蛋白質(zhì)改變的活性和/或此CDKA編碼核酸改變的表達(dá)，和/或CDKA蛋白質(zhì)活性增加和/或此CDKA編碼核^^達(dá)增加。本文所定義的術(shù)語(yǔ)"A型CDK"或"CDKA"可交換地使用并且包括具有細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶活性的任何氨基,列，而且當(dāng)該序列(如優(yōu)選由序列表(sequenceprotocol)中SEQIDNO:45、47、49、51、53和/或SEQIDNO:55所示)用于CDK進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建時(shí)，在A型CDK而非任何其他CDK類群周?chē)垲?，且其氨基酸序列?yōu)選包含(P/N/AXS/L/M/FXT/S/R)(T/S/A)(L/I)RE^J^酸序列。本領(lǐng)域熟練的4支術(shù)人員使用制備這樣進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)的已知技術(shù)和軟件，如GCG、EBI或CLUSTAL包，使用默認(rèn)參數(shù)，可以容易地確定研究的任何氨基酸序列是否落入"A型CDK，，的定義內(nèi)(見(jiàn)例如Vandepoele等人，！2002)。一旦構(gòu)建這樣的進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)，在A型CDK類群聚類的序列被認(rèn)為落入"A型CDK"或"CDKA"定義之內(nèi)，并將因此用于實(shí)施本發(fā)明的方法。優(yōu)選CDK還包含與SEQIDNO:2所示的氮基酸具有一定的全序列同一性，所述全序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?5%、80%、85%、卯％、95%、％%、97%、98%、99%或更多。因此基于前述算法的程序是優(yōu)選的。有利地，可使用程序PileUp(J.Mol.Evolution"25，351-360，1987，Higgins等人，CABIOS，51989:151-153)或優(yōu)選使用程序Gap和BestFit(所述程序分別基于Needleman和Wunsch算法[J.Mol.Biol.48;443-453(1970)]以及Smith和Waterman[Adv.Appl.Math.2;482-489(1981)]的算法)進(jìn)行序列的比較。兩個(gè)程序都是GCG軟件包[GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991);Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.25:"89及以下列j的一部分。因此優(yōu)選使用程序Gap在全序列范圍上進(jìn)行確定序列同源性的百分?jǐn)?shù)的計(jì)算。使用核^列比較的下列標(biāo)準(zhǔn)校正空位權(quán)重50、長(zhǎng)度權(quán)重3、平均匹配10.000、平均錯(cuò)配0.000。兩個(gè)多肽之間的同源性應(yīng)理解為指每種情況下在整個(gè)序列長(zhǎng)度上的氨基酸序列的同一性，其借助于使用如下參數(shù)設(shè)置的GAP算法程序(WisconsinPackage版本10.0，Wisconsin大學(xué)，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison,美國(guó))通過(guò)比較而計(jì)算得出空位權(quán)重8長(zhǎng)度權(quán)重2平均匹配2,912平均錯(cuò)配-2,003.在兩種情況下(核酸序列或氨基酸序列比較)，涉及的所示參數(shù)平均匹配和平均錯(cuò)配的數(shù)值是計(jì)算的結(jié)果。CDKA蛋白質(zhì)中多個(gè)結(jié)構(gòu)域是眾所周知的(DeBondt等人，Nature363，595-602，1993)，并且可以使用專門(mén)的數(shù)據(jù)庫(kù)鑒別，如SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864;Letuni等人(2002)NucleicAcidsRes30，242-244;http:〃smart.embl-heidelberg.de/)、InterPro(Mulder等人，(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318;http:〃www.ebi.ac.uk/interpro/)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，Ageneralizedprofilesyntaxforbiomolecularsequencesmotifsanditsfunctioninautomaticsequenceinterpretation.(In)ISMB-94;Proceedings2ndInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology.AltmanR.、BrutlagD.、KarpP.、LathropR.、SearlsD.編輯，53-61頁(yè)，AAAI出版，MenloPark;Hulo等人，Nucl.Acids.Res.32:D134-D137，(2004)，http:〃www.expasy,org/prosite/)或Pfam(Bateman等人，NucleicAcidsResearch30(l):276-280(2002)，http:〃www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)。22CDK的激酶結(jié)構(gòu)域是S_TKc型(SMART登錄號(hào)SM00220,Interpro登錄號(hào)IPR002290),并且具有Ser/Thr激酶活性。預(yù)測(cè)的活性位點(diǎn)(VLHRDLKPQNLLI，其中D是預(yù)測(cè)的催化殘基)對(duì)應(yīng)著PROSITE標(biāo)簽PS00108?；钚晕恢玫牡?位可能存在苯丙氨酸對(duì)纈氨酸的取代。在第6位可能發(fā)生亮氨酸甲硫氨酸的取代，并且在第9位Gln可能被取代為Asn。ATP結(jié)合位點(diǎn)(IGEGTYGWYRARDKVTNETIALK)對(duì)應(yīng)著PROSITE標(biāo)簽PS00107。在ATP結(jié)合位點(diǎn)中可能發(fā)生其他突變。它們是第11位Arg—Lys;第12位Ala今Gly、第13位Arg—Leu、第15位Lys》Arg和第16位Val》Leu、Ala、Ser、Thr或Asn。搜索和鑒定A型CDK同源物的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉了解的。此類方法包括使用本領(lǐng)域熟知的序列比對(duì)或比較的算法，如GAP(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48;443-453(1970》、BESTFIT(使用Smith和Waterman(AdvancesinAppliedMathematics2;482-489(1981))的局部同源性算法)、BLAST(AItschul，S.F.、Gish，W.、Miller,W.、Myers，E.W.和Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215:403-410(1990))、FASTA和TFASTA(W.R.Pearson和D.J.LipmanProc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-2448(1988))，將計(jì)算機(jī)可讀形式的SEQIDNO1或2或由GenBank登錄號(hào)CAA42922代表的序列與在公共數(shù)據(jù)庫(kù)如MIPS(http:〃mips.gsf.de/)、GenBank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)或EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www.ebi.ac.uk/embl/index.html)中獲得的序列進(jìn)行比較。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)公開(kāi)獲得。下面提到的同源物是使用BLAST默認(rèn)參數(shù)(BLOSUM62矩陣，空位開(kāi)放罰分為11且空位延伸罰分為l)鑒定出的，且優(yōu)選使用全長(zhǎng)序列用于分析。這些比對(duì)方法也能夠容易地鑒定對(duì)應(yīng)于人CDC2或稻CDKA;1(SEQIDNO:8)中蘇氨酸161的保守蘇氨酸。應(yīng)該理解術(shù)語(yǔ)"CDK，或優(yōu)選A型CDK，或其同源物"不限于序列表中所示的序列，而是符合具有細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶活性、有且與序列表中公開(kāi)的序列(優(yōu)選為序列SEQIDNO:45、47、49、51、53和/或SEQIDNO:55)具有至少80%、85%或90%,優(yōu)選91%、92%、93%、94%或95%，最優(yōu)選96%、97%、98%、99%或100%序列同一性標(biāo)準(zhǔn)的任何多肽，可以適用于本發(fā)明的方法，只要該CDK具有產(chǎn)量增加特性。為了確定A型CDK的激酶活性，一些測(cè)定是可用的并且在本領(lǐng)域中眾所周知(例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,1和2巻，Ausubd等人(1994)，CurrentProtocols;或者是在線的，例如http:〃www.protocol-online.org)。簡(jiǎn)言之，激酶測(cè)定通常包括(l)使激酶蛋白質(zhì)接觸含有待磷酸化的耙位點(diǎn)的底物多肽；(2)在適當(dāng)?shù)腲Ht下，在適當(dāng)?shù)募っ妇彌_液中進(jìn)行乾位點(diǎn)的磷酸化；(3)在恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)期后將磷酸化的產(chǎn)物從未磷酸化的底物中分離出來(lái)。激酶活性的存在或缺乏是通過(guò)磷酸化的靶標(biāo)的存在或缺乏來(lái)確定的。另夕卜，可以進(jìn)行定量測(cè)量。純化的CDK蛋白質(zhì)，或者含有或富含CDK蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物可以用作激酶蛋白質(zhì)的來(lái)源。組蛋白HI或小肽尤其適合作為底物。肽在磷酸化位點(diǎn)基序中必須含有一個(gè)或多個(gè)絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基。可以在BiochimicaetBiophysicaActa1314，191-225，(1996)中找到磷酸化位點(diǎn)的匯編。此外，肽底物可以有利地具有凈正電荷，利于結(jié)合到磷酸纖維素濾器上(使能夠?qū)⒘姿峄碾膹奈戳姿峄碾闹蟹蛛x出來(lái)并且檢測(cè)磷酸化的肽)。如果不知道磷酸化位點(diǎn)基序，可以使用通用Ser/Thr激酶底物。例如，肽"ADAQHATPPKKKRKVEDPKDF，，(Marshak等人，J.Cell.Biochem，45，391，1991)是A型CDK的特異性底物。為了確定合成肽磷酸化的動(dòng)力參數(shù)，需要肽濃度的范圍。對(duì)于起始反應(yīng)，可以使用0.7-1.5mM的肽濃度。對(duì)于每種激酶，重要的是要確定活性的最佳緩沖液、離子強(qiáng)度和pH。標(biāo)準(zhǔn)5x激酶緩沖液通常含有5mg/mlBSA(防止激酶吸附于測(cè)定管的牛血清白蛋白)、150mMTris-Cl(pH7.5)、100mMMgCl2。必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)為每種蛋白激酶確定二價(jià)陽(yáng)離子的最佳濃度。CDK測(cè)定的合適緩沖液是本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的(例如John等人，Protoplasma161，70-74，1991)。常用的磷酰基(phophoryl)基團(tuán)供體是放射性標(biāo)記的[，"PATP(通常是0.2mM終濃度)。在肽中摻入的32P的量可以通過(guò)在閃爍計(jì)數(shù)器中硝化纖維素干墊上測(cè)量活性來(lái)確定。此外，當(dāng)在稻(O/j加^rivfl)中的莖干特異性啟動(dòng)子控制下表達(dá)這樣的"CDK或其同源物或衍生物"時(shí)，與相應(yīng)的野生型植物相比，其種子產(chǎn)量增加?？梢砸栽S多方式測(cè)量種子產(chǎn)量的增加，例如按照種子總重量的增加、從植物收獲的飽滿種子數(shù)的增加或增加的收獲指數(shù)。才艮據(jù)本發(fā)明的CDK或其同源物的生物和/或功能活性包括具有至少一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶活性或具有如上所述的植物中增加產(chǎn)量的活性。CDK,優(yōu)選A型CDK蛋白質(zhì)的"活性片段"包括CDK蛋白質(zhì)的至少100、110、120、130、140或150個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選160、170、180、190或200個(gè)氨基酸殘基，該連續(xù)的殘基保留了與天然產(chǎn)生蛋白質(zhì)相似的生物活性和/或功能活性。如本文所定義的CDK或其同源物是由CDK核酸分子編碼的。編碼CDK或其同源物的核酸可以是任何天然或合成的核酸。因此本文定義的術(shù)語(yǔ)"CDK核酸分子"或"CDK基因"是如上定義的編碼CDK多肽或其同源物的任何核酸分子(包括作為遺傳密碼簡(jiǎn)并結(jié)果的那些)。CDK核酸分子的實(shí)例包括由序列表所代表的核酸，以及編碼上述同源物的那些核酸。CDK核酸及其功能性變體可適用于進(jìn)行本發(fā)明的方法。這樣的CDK核酸的功能性變體包括CDK核酸分子的部分、等位變體、剪接變體和/或能夠與CDK核酸分子雜交的核酸。在功能性變體的范圍中，術(shù)語(yǔ)"功能性"交序列)。本發(fā)明另一實(shí)施方案為分離的核酸分子，其包含選自以下的核酸分子a)分離的核酸分子，如SEQIDNO:45、47、49、51、53或55所示；b)分離的核酸分子，其編碼如SEQIDNO:46、48、50、52、54或56所示的M^f列；c)分離的核酸分子，作為遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，其序列能夠根據(jù)如SEQIDNO:46、48、50、52、54或56所示的多狀序列推導(dǎo)出來(lái)；d)分離的核酸分子，其編碼的多肽與(a)至(c)的核酸分子所編碼的多肽的氨基酸序列具有至少80。/。的同一性；e)分離的核酸分子，編碼如SEQIDNO:46、48、50、52、54或56所示的M酸分子的同源物、衍生物或活性片段，所述同源物、衍生物或活性片段為植物來(lái)源，且有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/1)基序；f)編碼蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，所述蛋白質(zhì)包含選自以下的氨基酸序列aa)(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE;ac)(I/L)(G/N)(E/R)G(T/A)YG(V/I)V(Y/C)(R/K/S)(A/G/S)(R/L/T/I)(畫(huà))(K/R/E)(V/K/A/S/T/N)T(N/S/G)(E/K/Q)(T/L/I/K)(I/V)A(L/V/I)KK;ad)LK(I/L)(C/A)DFGL(A/S)R;ae)WYRAPE(L/I)L(L/F)(C/G);af)GCI(F/M)AE(I/L/M);以及ag)DLL(Q/N/S/R)(K/Q/R)(L/M)(L/F)(I/T/I/C)(F/Y/L)DP(T/E/D/R/S)(K/Q)RI;g)分離的核酸分子或其互補(bǔ)物，其能夠與上述(a)至(c)的核酸雜交，(T/S/A)(L/I)基序的植物CDK蛋白質(zhì)；基于所述核酸分子，植物具有生長(zhǎng)增加的活性。本發(fā)明還提供選自以下的分離的核酸分子(=核#列)a)分離的核酸分子，如SEQIDNO:45、47、49、51、53或55所示；b)分離的核酸分子，其編碼如SEQIDNO:46、48、50、52、54或56所示的M,列；c)分離的核酸分子，作為遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，其序列能夠根據(jù)如26SEQIDNO:46、48、50、52、54或56所示的多肽序列推導(dǎo)出來(lái)；d)分離的核酸分子，其編碼的多肽與(a)至(c)的核酸分子所編碼的多肽的氨基酸序列具有至少80%的同一性；e)分離的核酸分子，編碼如SEQIDNO:46、48、50、52、54或56所示的氨基酸分子的同源物、衍生物或活性片段，所述同源物、衍生物或活性片段為植物來(lái)源，且有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE基序；f)編碼蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，所述蛋白質(zhì)包含選自以下的氨基酸序列i)(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE，優(yōu)選為PSTAIRE;為HRDXKXXNXL;iii)(I/L)(G/N)(E/R)G(T/A)YG(V/I)V(Y/C)(R/K/S)(A/G/S)(R/L/T/I)(D/N)(K/R/E)(V/K/A/S/T/N)T(N/S/G)(E/K/Q)(T/L/I/K)(I/V)A(L歷)KK;優(yōu)選為GXVXXXXXXXTXXXXAXKK;iv)LK(I/L)(C/A)DFGL(A/S)R，優(yōu)選為L(zhǎng)KXXDFGLXR;v)WYRAPE(L/I)L(L/F)(C/G)，優(yōu)選為WYRAPE;vi)GCI(F/M)AE(I/L/M)，優(yōu)選為GCIXAEX;以及vii)DLL(Q/N/S/R)(K/Q/R)(L/M)(L/F)(I/T/I/C)(FA7L)DP(T/E/D/R/S)(K/Q)RI，優(yōu)選為DLLXXXXXXDPXXRI。g)分離的核酸分子或其互補(bǔ)物，其能夠與上述(a)至(c)的核酸雜交，其中所述雜交序列或其互補(bǔ)物編碼有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE基序的植物CDK蛋白質(zhì)；h)才艮據(jù)以上(a)至(d)中任一項(xiàng)核酸的等位變體，該等位變體編碼植物CDK;和i)根據(jù)(a)至(d)中任一項(xiàng)核酸的備選剪接變體，該備選剪接變體編碼有利地包含(P/N/A)(S/L層F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE基序的植物CDK蛋白質(zhì)；其中變量x代表任意氨基酸，以及編碼的蛋白質(zhì)由此賦予產(chǎn)量增加。關(guān)于核酸構(gòu)建體(其包含本文所述核酸序列)或生物體(=轉(zhuǎn)基因生物體，其轉(zhuǎn)化了所述核酸序列或所述核酸構(gòu)建體)的核酸序列，"轉(zhuǎn)基因"意指通過(guò)遺傳操作方法制備的那些構(gòu)建體，優(yōu)選其中a)表IA和/或IB，申請(qǐng)?zhí)?，第5和7列所示的核酸序列，或其f汴生物，或b)遺傳調(diào)控元件，例如啟動(dòng)子，其功能性連接到表IA和/或IB,申請(qǐng)?zhí)?，第5和7列所示的核酸序列，或其衍生物，或c)(a)和(b)，不存在于其天然遺傳環(huán)境中，或者已通過(guò)重組方法修飾，有可能修飾采取的形式為例如一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、添加、缺失、倒位或插入。"天然遺傳環(huán)境"意指來(lái)源植物中的天然染色體座位或者存在于基因組文庫(kù)之中。在基因組文庫(kù)的情況下，優(yōu)選至少是部分地維持核酸序列的天然遺傳環(huán)境。至少在核酸序列一側(cè)側(cè)接的環(huán)境序列長(zhǎng)度至少為50bp、優(yōu)選至少500bp、特別優(yōu)選至少1000bp、最優(yōu)選至少5000bp。除非另行指出，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"核酸"及"核酸分子"在本文互換使用。除非另行指出，術(shù)語(yǔ)"肽"、"多肽"及"蛋白質(zhì)"在本文中互換使用。術(shù)語(yǔ)"序列，，可能涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白質(zhì)，取決于4吏用術(shù)語(yǔ)"序列"的上下文。術(shù)語(yǔ)"一個(gè)或多個(gè)基因"、"多核苷酸"、"核酸序列""核苷酸序列"或"一個(gè)或多個(gè)核酸分子"在本文用于指任何長(zhǎng)度的多聚體形式的核苷酸，或者為核糖核苷酸或者為脫氧核糖核苷酸。這些術(shù)語(yǔ)僅M分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，如本文所用的術(shù)語(yǔ)"一個(gè)或多個(gè)基因"、"多核苷酸"、"核酸序列，，"核苷酸序列"或"一個(gè)或多個(gè)核酸分子"包括雙鏈和單鏈DNA及RNA。它們還包括已知類型的修飾，例如甲基化、"加帽"、用類似物取代一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸。優(yōu)選本發(fā)明的DNA或RNA序列包含編28碼本文定義的多肽的編碼序列。"編碼序列"為核苷酸序列，當(dāng)將其置于合適的調(diào)控序列的控制之下時(shí)，轉(zhuǎn)錄為mRNA和/或翻譯為多肽。編碼序列的邊界確定為5，-末端的翻譯起始密碼子和3，-末端的翻譯終止密碼子。編碼序列可以包括但不局限于mRNA、cDNA、重組核苷酸序列或基因組DNA,而且在一定的情形下也可以存在內(nèi)含子。"分離的"多核苷酸或核酸分子與存在于所述核酸分子天然來(lái)源中的其他多核苷酸或核酸分子分離開(kāi)。分離的核酸分子可以是幾kb的染色體片段，或者優(yōu)選為僅包含基因編碼區(qū)的分子。從而，本發(fā)明分離的核酸分子可以包含染色體區(qū)域，其為鄰近的5，和3，或其他鄰近的染色體區(qū)域，但是優(yōu)選不含在所述核酸分子來(lái)源生物體的基因組或染色體環(huán)境中天然側(cè)接此核酸分子序列的序列(例如，鄰近編碼核酸分子5，-UTR和3，-UTR區(qū)域的序列)。在多種實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法中所使用的分離的核酸分子可以例如包含少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或O.lkb所述核酸分子來(lái)源細(xì)胞的基因組DNA中天然側(cè)接此核酸分子的核苷酸序列。包含本發(fā)明方法中所用核酸分子例如本發(fā)明多核苷酸的完整序列或其部分的核酸分子，可以利用基于所用序列或其部分的寡核苷酸引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行分離。例如，包含所述完整序列或其部分的核酸分子可以利用基于此序列所產(chǎn)生的寡核苷酸引物通過(guò)聚合酴隨式反應(yīng)進(jìn)行分離。例如，可以從細(xì)胞中分離mRNA(例如通過(guò)Chirgwin等(l979)Biochemistry18:5294-5299的異硫氰酸lfl^取法)，并且可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶(例如莫洛尼(Moloney)MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，可購(gòu)自Gibco/BRL，Bethesda,MD;或AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，可獲自SeikagakuAmerica,Inc.,St.Petersburg，F(xiàn)L)產(chǎn)生cDNA。對(duì)根據(jù)本發(fā)明的方法有利的核酸分子可基于其與本文公開(kāi)的核酸分子的同源性，利用所述序列或其部分作為雜交探針，在嚴(yán)格雜交條件下按照標(biāo)準(zhǔn)雜交^t支術(shù)進(jìn)行分離。就此而言，有可能使用，例如，具有至少l5、20、25、30、35、40、50、60或更多個(gè)核苷酸、優(yōu)選長(zhǎng)度至少為15、20或25個(gè)核苷酸的分離的核酸分子，其在嚴(yán)格條件下與上述核酸分子雜交，特別是與那些包含這樣的核苷酸序列的核酸分子雜交，所述核苷酸序列為本發(fā)明方法中所用的核酸分子、編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)、或者為本發(fā)明的核酸分子。也可以^使用具有30、50、100、250個(gè)或更多個(gè)核苷酸的核酸分子。本發(fā)明方法中所用的核酸序列，如序列表中特別是SEQIDNO:45、47、49、51、53或55所示，最好引入核酸構(gòu)建體，優(yōu)選表達(dá)盒中，這使得所述核酸分子在植物中的表達(dá)成為可能。從而，本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，優(yōu)選表達(dá)載體，含有本發(fā)明的核酸分子，功能性連接于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控元件或信號(hào)。如本文所述，核酸構(gòu)建體也可以含有其他欲引入生物體或細(xì)胞的基因。有可能并且最好在宿主生物體中引入并表達(dá)調(diào)控基因，如誘導(dǎo)物、抑制物或酶的基因，它們通過(guò)其除&活性參與調(diào)控生物合成通路中的一個(gè)或多個(gè)基因。這些基因可以是異源或同源來(lái)源。而且，最好可能存在其他生物合成基因，或者這些基因可以位于一個(gè)或多個(gè)其他核酸構(gòu)建體中。最好采用這樣的基因，其影響植物的生長(zhǎng)，例如調(diào)控序列或因子。通過(guò)使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，可以有利地在轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生調(diào)控元件的增強(qiáng)作用。不過(guò)，此外，也有可能利用翻譯增強(qiáng)作用，例如通過(guò)增加mRNA穩(wěn)定性或通過(guò)插入翻譯增強(qiáng)子序列。原則上，核酸構(gòu)建體可以含有本文所述的調(diào)控序列以及與所包含基因的表i^目關(guān)的其他序列。從而，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可用作為表達(dá)盒，從而可用于直接引入到植物中，或者將其引入到載體中。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體為表達(dá)盒，包含微生物啟動(dòng)子或孩史生物終止子或兩者兼而有之。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)盒包括植物啟動(dòng)子或植物終止子或兩者兼而有之。為將核酸分子引入到核酸構(gòu)建體中，例如，作為表達(dá)盒的一部分，最好以技術(shù)人員已知的方式對(duì)符號(hào)性(codogenic)基因區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增和連接反應(yīng)。優(yōu)選按照類似于PfuDNA聚合酶或Pfu/TaqDNA聚合酶混合物方案的方法。根據(jù)待擴(kuò)增的序列選擇引物。應(yīng)當(dāng)有利地選擇引物，從而擴(kuò)增物包含從起始到終止密碼子的符號(hào)性序列。擴(kuò)增之后，最好分析擴(kuò)增物。例如，所述分析可以考慮質(zhì)量和數(shù)量，并在凝膠電泳分離之后進(jìn)行。其后，可以按照標(biāo)準(zhǔn)方案(例如Qiagen)純化擴(kuò)增物。然后可利用小份純化的擴(kuò)增物進(jìn)行隨后的克隆步驟。技術(shù)人員通常知曉合適的克隆載體。它們尤其包括能夠在易于操作的克隆系統(tǒng)像基于細(xì)菌、酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞(如桿狀病毒表達(dá))的系統(tǒng)中復(fù)制的栽體，也即特別是確保在大腸桿菌(Ec^/Z)中有效克隆的栽體，其使得有可能穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物。必需要提及的載體為多種雙元和共合體載體系統(tǒng)，它們適用于T-DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。通常此類栽體系統(tǒng)的特征在于，它們至少含有vir基因和T-DNA邊界序列，其中vir基因式農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化所必需的。通常，載體系統(tǒng)優(yōu)選還包含其他順式調(diào)控區(qū)域，如啟動(dòng)子和終止子和/或選擇標(biāo)記，借助于它們能夠鑒定適當(dāng)轉(zhuǎn)化的生物體。在共合體載體系統(tǒng)的情況下，vir基因和T-DNA序列位于同一載體上，而雙元系統(tǒng)基于至少兩個(gè)載體，其中一個(gè)攜帶vir基因而非T-DNA，而第二個(gè)攜帶T-DNA而非vir基因。因?yàn)檫@個(gè)事實(shí)，后述的載體相對(duì)較小，易于操作，并能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中復(fù)制。這些雙元載體包括來(lái)自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的載體。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選使用的雙元載體有Bin19、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA。有關(guān)雙元載體及其用途的綜述由Hellens等，TrendsinPlantScience(2000)5，446~451提供。所述載體優(yōu)選以這樣的方式修飾，從而它們已經(jīng)含有編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸，并且本發(fā)明的核酸，優(yōu)選編碼表II，申請(qǐng)?zhí)杔，5和7列所示的多肽的核酸，能夠M，端(prime)克隆為轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列(產(chǎn)生功能性特征)，其由質(zhì)體指導(dǎo)并意味著成熟蛋白質(zhì)發(fā)揮其生物學(xué)活性。在重組表達(dá)載體中，"有效連接"表示目的核酸分子以這樣的方式連接于調(diào)控信號(hào)，從而使所述所述核酸分子的表達(dá)成為可能它們以這樣的方式彼此連接，從而兩種序列均實(shí)現(xiàn)歸屬于序列的預(yù)測(cè)功能(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或者如果載體被51入宿主細(xì)胞則在宿主細(xì)胞中)。如本文所定義的術(shù)語(yǔ)部分是指編碼CDK的DNA片段，其包含至少300、400、450或500個(gè)核苷酸，優(yōu)選550、600、650或700個(gè)核苷酸，并且該部分編碼具有細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶活性的多肽，具有(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE基序并具有下列序列VLHRDLKPQNLLI的活性位點(diǎn)，其中D是預(yù)測(cè)的催化殘基，并且其中可發(fā)生所述序列的以下修飾第l位Val分Phe;第6位Leu—Met;第9位Gln今Asn。另外，所述CDK序列可有利地具有下列ATP結(jié)合位點(diǎn)IGEGTYGWYRARDKVTNETIALK。在該ATP結(jié)合位點(diǎn)中也可發(fā)生一些突變。它們是下列突變第11位Arg—Lys;第12位Ala今Gly;第13位Arg》Leu;第15位Lys^Arg和第16位Val^Leu、Ala、Ser、Thr或Asn。例如，可以通過(guò)對(duì)CDK核酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)缺失來(lái)制備部分。部分可以以分離的形式使用，或者可將其與其他編碼(或非編碼)序列融合，以便，例如，生產(chǎn)組合了若干活性(其中一種是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶活性)的蛋白質(zhì)。當(dāng)與其他編碼序列融合時(shí)，經(jīng)翻譯后所產(chǎn)生的多肽可能比預(yù)測(cè)的CDK片段要大。優(yōu)選功能性部分是CDK核酸的部分，更優(yōu)選是SEQIDNO:45、47、49、51、53或55所示核酸分子的部分。術(shù)語(yǔ)"片段"、"序列片段"或"序列的一部分"、"部分"或"其部分"是指所參照原始序列的截短序列。截短序列(核酸或蛋白質(zhì)序列)長(zhǎng)度可變；最低長(zhǎng)度為這樣的序列，其大小足以提供具有與所參照原始序列相當(dāng)?shù)墓δ芎?或活性的序列，或者在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的或本發(fā)明方法所用的核酸分子雜交，而最高長(zhǎng)度并不重要。在有些應(yīng)用中，最高長(zhǎng)度通常并不比提供期望的原始序列活性和/或功能所需的大小長(zhǎng)多少。通常，截短的氨基酸序列長(zhǎng)度為約5至約310個(gè)氣基酸。然而更經(jīng)常的，該序列的長(zhǎng)度最大為約250個(gè)氛基酸，優(yōu)選最大為約200個(gè)氨基酸或約100個(gè)氛基酸。通常期望選擇大約IO、12或15個(gè)氨基酸的序列，最多最大為約20或25個(gè)氨基酸的序列。另一CDK核酸分子的變體是能夠在降低的嚴(yán)格條件下，優(yōu)選在嚴(yán)格條件下能夠與前述定義的CDK核酸分子雜交的核酸分子，其中雜交序列編碼包含上述基序的CDK多肽。優(yōu)選地，雜交序列是能夠與核酸分子SEQIDNO:45、47、49、51、53或55雜交的序列，或者是與編碼上述同源物之一的核酸雜交的序列，或者是與任意前述序列的部分雜交的序列。最優(yōu)選地，雜交序列是能夠與核酸分子SEQIDNO:45、47、49、51、53或55雜交的序列。本文所定義的術(shù)語(yǔ)"雜交"是其中基本同源的互補(bǔ)核苷^列彼此退火的過(guò)程。雜交過(guò)程可以完全發(fā)生在溶液中，即兩條互補(bǔ)核酸都在溶液中。雜交過(guò)程還可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定于基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖珠子或任何其他樹(shù)脂上。此外雜交過(guò)程可還可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定于固相支持物如硝化纖維素膜或尼龍膜上，或通過(guò)例如照相或稱之為核酸芯片)。為了使得雜交發(fā)生，通常使核酸分二子熱變:或化學(xué)變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈和/或從單鏈核酸中除去發(fā)夾或其他二級(jí)結(jié)構(gòu)。雜交的嚴(yán)格性受諸如溫度、鹽濃度、離子強(qiáng)度和雜交緩沖液組成M的影響。在諸如Southern雜交和Northern雜交的核酸雜交實(shí)驗(yàn)中，"嚴(yán)格雜交條件，，和"嚴(yán)格雜交洗滌條件，，是由序列決定的，并且隨環(huán)境參數(shù)而不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到在雜交和洗滌中可以改變多種參數(shù)，而該參數(shù)將保持或改變嚴(yán)格條件。Tm是在限定的離子強(qiáng)度和pH下，50%的靶標(biāo)序列雜交至完全匹配的探針時(shí)的溫度。Tm依賴于溶液條件、堿基組成以及探針的長(zhǎng)度。例如，較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異雜交。最大雜交速率是在低于！\大約16匸至32。C下得到。雜交溶液中一價(jià)陽(yáng)離子的存在降低了兩條核酸鏈之間的靜電排斥，從而促進(jìn)雜交分子的形成；對(duì)于高達(dá)0.4M的鈉濃度，這個(gè)作用是明顯的。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度，每百分?jǐn)?shù)甲酰胺降低0.6至0.7X:，而加入50%的甲酰胺雖然使雜交速率降低，但使雜交在30至45"C進(jìn)行。^對(duì)錯(cuò)配降低雜交速率和雙鏈體的熱穩(wěn)定性。平均而言，對(duì)于大探針，每％#錯(cuò)配使Tm降低大約lX:。由雜交分子的類型決定，可以使用下列公式計(jì)算T一DNA畫(huà)DNA雜交分子(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem"138:267-284，1984):Tm=81.5。C+16.6xlogNa+a+0.41x%[G/Cb-500x[L"T1—0.61x%甲酰胺DNA-RNA或RNA-RNA雜交分子Tm=79.8+18.5(log10[Na+a)+0.58(%G/Cb)+11.8(%G/Cb)2-820/Lc寡-DNA或寡-RNAd雜交分子對(duì)于<20個(gè)核苷酸Tm=2(/)對(duì)于20-35個(gè)核苷酸Tm=22+1.46(/n)fl或?qū)τ谄渌粌r(jià)陽(yáng)離子，但是僅僅在0.01-0.4M范圍內(nèi)精確。6僅對(duì)于在30。/o至75。/o范圍的。/。GC精確。cL=雙鏈體中堿基對(duì)的長(zhǎng)度。"寡，寡核苷酸；/n，引物的有效長(zhǎng)度=2><(0/<:數(shù))+(~1數(shù))。注對(duì)于每1%甲酰胺，Tm降低大約0.6至0.7X:,而6M尿素的存在降低Tm大約30。C。雜交的特異性通常是雜交后洗滌的作用。為了除去非特異性雜交產(chǎn)生的背景，用稀釋的鹽溶液洗滌樣品。此類洗滌的關(guān)鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度鹽濃度越低且洗滌溫度越高，洗滌的嚴(yán)格性越高。洗滌條件通常在雜交嚴(yán)格性或低于雜交嚴(yán)格性下進(jìn)行?？傮w上，如上所述設(shè)置核酸雜交測(cè)定或基因擴(kuò)增檢測(cè)操作的合適的嚴(yán)格條件。也可以選擇相差不多的嚴(yán)格M。通常，選擇的低嚴(yán)格M大約比在限定的離子強(qiáng)度和pH下特異性序列的熱解鏈溫度(TJ低50'C。中等嚴(yán)格M是低于Tm20r的溫度，而高嚴(yán)格條件是低于TmIO'C的溫度。例如，嚴(yán)格條件是那些至少與例如條件A-L—樣嚴(yán)格的條件；而簡(jiǎn)化的嚴(yán)M件是至少與例如條件M-R—樣嚴(yán)格的條件?？梢允褂枚喾N已知技術(shù)中的任意一種，例如用^^有蛋白質(zhì)的溶液將膜封閉，添加異源RNA、DNA和SDS至雜交緩沖液中，以及用RNA酶處理，來(lái)控制非特異性的結(jié)合。雜交和洗滌條件的實(shí)例在表l中列出表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>*"雜交分子長(zhǎng)度"是雜交核酸的預(yù)期長(zhǎng)度。當(dāng)已知序列的核酸雜交時(shí)，可以通過(guò)比對(duì)序列和鑒定本文所述的保守區(qū)確定雜交分子長(zhǎng)度。t在雜交和洗滌緩沖液中，SSPE(1xSSPE是0.15MNaCl、10mMNaH2P04和1.25mMEDTA，pH7.4)可以代替SSC(1xSSC是0.15MNaCI和15mM檸檬酸鈉)；在雜交完成后洗滌15分4K雜交和洗滌可以另外地包括5xDenhardt試劑、0.5-1.0%SDS、100照/ml變性的片段化的鮭精DNA、0.5%焦磷酸鈉和高達(dá)50%曱酰胺。*Tb-Tr:對(duì)于預(yù)期長(zhǎng)度少于50個(gè)威基對(duì)的雜交分子，雜交溫度應(yīng)該比雜交分子的解鏈溫度Tm低5-10'C,根據(jù)上述公式確定Tm。士本發(fā)明還包括用PNA或修飾的核酸取代任意一個(gè)或多個(gè)DNA或RNA雜交配偶體。為了定義嚴(yán)格性水平，可以方便地參考Sambrook等人(2001)MolecularCloning:alaboratorymanual,第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,CSH，NewYorkortoCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)。在雜交和洗滌后，由探針標(biāo)記的類型決定，可以通過(guò)放射自顯影(當(dāng)使用放射性標(biāo)記探針時(shí))或者通過(guò)化學(xué)發(fā)光、免疫檢測(cè)、通過(guò)熒光或顯色檢測(cè)來(lái)檢測(cè)雙鏈體?；蛘撸梢赃M(jìn)行核糖核酸酶保護(hù)測(cè)定來(lái)檢測(cè)RNA:RNA雜交分子。CDK核酸分子或其變體可以來(lái)自任何植物或人工來(lái)源?？梢酝ㄟ^(guò)精細(xì)的人工操作在組成和/或基因組環(huán)境方面對(duì)核酸的天然形式進(jìn)行修飾。核酸優(yōu)選植物來(lái)源的，可以是來(lái)自相同的植物物種(例如來(lái)自其待引入的植物物種)或來(lái)自不同的植物物種。核酸可以分離自單子葉物種，優(yōu)選分離自禾本科(Poaceae),更優(yōu)選分離自稻或或玉蜀黍。更優(yōu)選地，分離自稻的CDK是SEQIDNO:45,或分離自玉蜀黍的CDK是SEQIDNO:53。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，核酸可分離自雙子葉物種，優(yōu)選分離自十字花科、槭樹(shù)科(Aceraceae)、亞麻科或菊科，更優(yōu)選分離自歐洲蕓苔、大豆、亞麻或向日葵(Helianthusaimuus)。更優(yōu)選地，分離自歐洲蕓苔的CDK是SEQIDNO:47、分離自大豆的CDK是SEQIDNO:49、分離自亞麻的CDK是SEQIDNO:51或分離自向日葵的CDK是SEQIDNO:55?？梢酝ㄟ^(guò)引入遺傳修飾(優(yōu)選在CDK基因的基因座)調(diào)節(jié)CDK多肽或其同源物的活性和/或這類CDK編碼核酸的表達(dá)。如本文所定義的基因的基因座意指包括目的基因以及編碼區(qū)的上游或下游10kb的區(qū)域。例如，可以通過(guò)以下的任何一種(或多種)方法引入遺傳修飾TILLING、定點(diǎn)誘變、定向進(jìn)化和同源重組或者通過(guò)在植物中引入和表達(dá)編碼CDK的多肽或其同源物的核酸，該CDK或同源物含有如上所述的基序。在引入遺傳修飾后，接下來(lái)的步驟是選擇表達(dá)增加的核酸(該核酸編碼含有如上所述的基序的CDK多肽)和/或選擇活性增加的所述CDK多肽，這種表達(dá)和/或活性的增加使植物具有改良的生長(zhǎng)特性。也可以使用TILLING技術(shù)(耙向誘導(dǎo)基因組局部損害技術(shù))，把遺傳修飾引入到CDK基因的基因座中。這是一種誘變技術(shù)，用于產(chǎn)生和/或鑒定，并最終分離核酸分子的誘變變體，所述核酸分子編碼具有如上所述的序列，能夠呈現(xiàn)依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶活性的CDK。TILLING還使能夠選擇攜帶這類突變變體的植物。TILLNG將高密度誘變與高通量篩選方法結(jié)合起來(lái)。TILLING—般遵循的步驟是(a)EMS誘變(Redei和Koncz(1992)，In:CKoncz，N-HChua，JSchell編輯,MethodsinArabidopsisResearch.WorldScientific,Singapore,16-82頁(yè)；Feldmann等人，(1994)In:EMMeyerowitz，CRSomerville編輯，Arabidopsis.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,137-172頁(yè)；Lightner和Caspar(1998)，In:JMartinez-Zapater，JSalinas編輯，MethodsonMolecularBiology,82巻，HumanaPress,Totowa，NJ，91-104頁(yè))；(b)DNA制備和個(gè)體合并；(c)目標(biāo)區(qū)域的PCR擴(kuò)增；(d)變性和退火使能夠形成異源雙鏈體；(e)DHPLC,其中集合體中異源雙鏈體的存在檢測(cè)為色譜圖中額外的峰值；(f)鑒定突變個(gè)體；和(g)突變體PCR產(chǎn)物的測(cè)序。TILLING的方法是本領(lǐng)域熟知的(McCallumNatureBiotechnol.18，455-457，2000，StempleNatureRev.Genet.5,145-150，2004)。37可以使用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生保留了活性(例如依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶活性)的CZ)《核酸或其部分的變體。多種方法可用來(lái)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變，最常用的是基于PCR的方法(見(jiàn)例如Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley編輯,http:〃www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.htni1)。也可以^使用定向進(jìn)化產(chǎn)生CDK核酸的變體。定向進(jìn)化由重復(fù)的DNA改組組成，繼之以適當(dāng)?shù)暮Y選和/或選擇產(chǎn)生CDK核酸或其部分的變體，其部分(Castle等人，(2004)Science304(5674):1151-4;US5,811,238和US6,395,547)。TILLING,定點(diǎn)誘變和定向進(jìn)化是能夠產(chǎn)生新的CDK等位基因和變體的技術(shù)實(shí)例，所述CDK等位基因和變體保留了CDK功能因而可用于本發(fā)明的方法中。同源重組能夠在基因組中限定的選擇位置引入選定的核酸。同源重組是生物學(xué)中通常使用的常規(guī)技術(shù)，用于較低等的生物體如酵母或苔蘚i>/^ow>e//"。在植物中進(jìn)行同源重組的方法不僅已在模式植物中有描述(Offringa等人(1990)EMBOJ.9，3077-3084)，而且在作物植物，例如稻中也有描述(Terada等人，(2002)NatureBiotechnol.20，1030-1034;或Iida和Terada(2004)Curr.Opin.Biotechnol.15，132-138)。待耙向的核酸(其可以是如上文所定義的a)/r核酸分子或其功能性變體)不需要靶向到cd/t基因的基因座中，而可以被引入到例如高表達(dá)的區(qū)域。待靶向的核酸可以是用于替換內(nèi)源基因的改良的等位基因，或在內(nèi)源基因之外額外引入。引入遺傳修飾(在這一情況中不需要在CDK基因的基因座中)的優(yōu)選方法是在植物中引入和表達(dá)編碼CDK多肽或其同源物的核酸。以上提到的且適用于本發(fā)明梯:作的CDK多肽或其同源物具有依賴細(xì)胞周期蛋白的激酵活性，其與SEQIDNO:46、48、50、52、54或56所代表的氨基斷列具有一定的序列同一性，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?5%、80%、85%、卯％、95%、96%、97%、98%、99%或更多，且該CDK多肽包含本文所述的基序。引入植物的核酸可以是如以上定義的部分或雜交序列。蛋白質(zhì)的"同源物"涵蓋相對(duì)于所討論的未修飾蛋白質(zhì)具有^酸取代、缺失和/或插入，且與其所衍生自的未修飾蛋白質(zhì)具有相似的生物學(xué)活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。這意味著它們具有共同的祖先。術(shù)語(yǔ)"同源物，，涵蓋兩種特殊形式的同源性，即直系同源序列和旁系同源序列，它們涉及用于描述基因遺傳關(guān)系的進(jìn)化概念。優(yōu)選地，用于本搜索中與SEQIDNO:46、48、50、52、54或56具有最高相似性。術(shù)語(yǔ)"旁系同源"涉及由物種基因組內(nèi)一個(gè)或多個(gè)基因復(fù)制產(chǎn)生的同源基因。CDK的旁系同源物可以容易地通過(guò)對(duì)來(lái)自與查詢序列相同物種的一組序列進(jìn)行BLAST分析來(lái)鑒定。術(shù)語(yǔ)"直系同源，，涉及在不同生物中由于這些基因的祖先關(guān)系形成的同源基因。例如，通過(guò)實(shí)施所謂的交互blast搜索可以容易地找到單子葉或雙子葉植物物種中的直系同源物。這可以通過(guò)在任何序列數(shù)據(jù)庫(kù)，如可在http:〃www.ncbi,nlm.nih.gov中找到的公眾可獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)所討論的序列(例如，來(lái)自單子葉物種稻或玉蜀黍，或雙子葉物種歐洲蕓苔、大豆、亞麻或向日葵的SEQIDN045、47、49、51、53或55)進(jìn)行第一次blast。當(dāng)起始于核苷酸時(shí)可以使用BLASTn或tBLASTX,或者當(dāng)起始于蛋白質(zhì)時(shí)可以使用BLASTP或TBLASTN,并使用標(biāo)準(zhǔn)缺省值。可以過(guò)濾blast結(jié)果。之后將過(guò)濾結(jié)果或未過(guò)濾結(jié)果的全長(zhǎng)序列與所討論的序列的來(lái)源生物(例如稻、玉蜀黍、歐洲蕓苔、大豆、亞麻或向日葵)的序列進(jìn)行反向blast(笫二次blast)。然后對(duì)第一次和第二次blast的結(jié)果進(jìn)行比較。如果第二次blast的最高相似性來(lái)自與查詢序列所源自的相同物種時(shí)，就找到了旁系同源物；如果最高相似性并非來(lái)自與查詢序列所源自的相同物種時(shí)，那么就找到了直系同源物。只要這一同源物含有絲氨l蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域并且含有(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE基序，這樣的直系同源物或旁系同源物也可"^人為是CDK的同源物。在大家族的情況下，可以使用ClustalW,接著通過(guò)構(gòu)建相鄰連接樹(shù)以幫助觀察相關(guān)基因的聚類(clustering)并且鑒定直系同源物和旁系同源物。同源物可以是蛋白質(zhì)"取代變體"的形式，即其中^J^^列中的至少一個(gè)殘基已經(jīng)4皮除去，并且在其位置上插入不同的殘基。M酸取代一般是單個(gè)殘基的，但是取決于對(duì)多肽的功能限制可以是成串的；插入片段通常是大約l、2、3、4或5個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選6、7、8、9到10個(gè)M酸殘基。優(yōu)選的，M酸取代包括保守性M酸取代(表2)。為了產(chǎn)生此類同源物，蛋白質(zhì)的氨基酸可以^^具有相似性質(zhì)(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞a-螺旋結(jié)構(gòu)或P-折疊結(jié)構(gòu)的特性)的其他氨基酸所置換。保守性替換表是本領(lǐng)域所熟知的(見(jiàn)例如Creighton(1984)Proteins.W.H.FreemanandCompany),用于本發(fā)明方法中的取代變體是CDK多肽的取代變體并含有(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE基序和上述其他基序。表2:保守性M酸取代的實(shí)例殘基保守性取代殘基保守性取代AlaSerLeulie;ValArgl_ysl_ysArg;GinAsnGin;HisMetLeu;HeAspGluPheMet;Leu;TyrGinAsnSerThr;GlyCysSerThrSer;ValGluAspTrpTyrGlyProTyrTrp;PheHisAsn;GinVallie;LeulieLeu，Val在上述氨基酸性質(zhì)不是很關(guān)鍵的情況下，可以產(chǎn)生保守性較低的取代。同源物還可以是蛋白質(zhì)的"插入變體，，的形式，即將其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基引入到蛋白質(zhì)中的預(yù)定位點(diǎn)。插入可包括氨基端和/或羧基端融合，以及單個(gè)或多個(gè)M酸的序列內(nèi)插入。通常，M,列內(nèi)的插入將小于氨基或氛基端的融合，約為1到IO個(gè)殘基的數(shù)量。氨基或氛基端融合蛋白質(zhì)或肽的實(shí)例包括如用于酵母雙雜交系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸v標(biāo)簽、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、A蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag.l00表位、c-myc表位、FLAG⑧表位、lacZ、CMP(釣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位?？捎糜诒景l(fā)明的方法的插入變體是CDK多肽的插入變體并且含有本文所述的基序。蛋白質(zhì)"缺失變體"形式的同源物的特征在于從蛋白質(zhì)除去一個(gè)或多個(gè)M酸，并且包含活性片段。使用本領(lǐng)域熟知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成等等，或通過(guò)重組DNA操作，可以容易的制備蛋白質(zhì)的氨基酸變體。對(duì)DNA序列進(jìn)行操作以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的取代、插入或缺失變體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，在DNA的預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生突變的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括M13誘變、T7腸Gen體外誘變(USB，Cleveland,OH)、快速變換的定點(diǎn)資變(Stratagene，SanDiego，CA)、PCR-介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變或其他定點(diǎn)誘變方案。帶有(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE基序的CDK多肽或其同源物也可以是，衍生物。"^t生物，，包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，相對(duì)于蛋白質(zhì)天然存在形式的M酸序列(例如，如序列46、48、50、52或56所示)，其可以包括天然和非天然存在的氨基酸殘基的取代、缺失或添加。蛋白質(zhì)的"f汙生物"包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，相對(duì)于多肽天然存在形式的氨基酸序列，其可以包括天然發(fā)生改變的、糖基化的、?；陌被釟埢蚍翘烊淮嬖诘陌被釟埢Ｏ鄬?duì)于其所衍生自的M^列，衍生物還可包含一個(gè)或多個(gè)非M酸取代基，例如與氨基酸序列共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的報(bào)道分子或其他配體，如結(jié)合以便于檢測(cè)的報(bào)道分子，以及相對(duì)于天然存在蛋白質(zhì)的M酸序列而言非天然存在的氨基酸殘基?？?1用于本發(fā)明方法的衍生物是具有CDK生物活性以及本文所述基序的CDK多肽衍生物。植物中的CDK型激酶具有模塊結(jié)構(gòu)，其由N葉片和C葉片組成，含有一個(gè)催化裂和T環(huán)(DeBondt等人，1993)。因此可期望以保留或改變CDK蛋白質(zhì)活性的方式進(jìn)行激酶結(jié)構(gòu)域的基因工程可以產(chǎn)生可用于操作本發(fā)明方法的CDK突變體。只要產(chǎn)生的CDK含有(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE、ATP結(jié)合和活性部位基序，首選的變體類型包括由結(jié)構(gòu)域缺失、堆積或改組產(chǎn)生的那些變體(見(jiàn)例如He等人，Science288，2360-2363，2000;或US專利5，811，238和6,395,547)。CDK多肽或其同源物可以由CDK核酸分子或基因的備選的剪接變體編碼。本文所用的術(shù)語(yǔ)"備選的剪接變體"包括核酸序列的變體，其中選擇的內(nèi)含子和/或外顯子被切除、替換或添加。這樣的變體可以是編碼包含突變的多肽并且其中保留了該蛋白質(zhì)的生物活性，其可以通過(guò)選擇地保留該蛋白質(zhì)的功能區(qū)段獲得。這樣的剪接變體可以在自然中發(fā)現(xiàn)或可以人工制備制備這樣的剪接變體的方法是本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)熟知的。首選的剪接變體來(lái)自由SEQIDN045、47、49、51、53或55代表的核酸。另外首選的是其編碼的多肽保留了依賴細(xì)胞周期蛋白激酶活性且含有本文所述基序。所述同源物還可以由編碼CDK多肽或其同源物的核酸的等位變體編碼，優(yōu)選由SEQIDN045、47、49、51、53或55代表的核酸的等位變體，只要由等位變體編碼的多肽具有依賴細(xì)胞周期的蛋白激酶活性且含有本文所述基序。天然存在且包括在本發(fā)明方法中的等位變體使用這些天然的等位基因。等位變體包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)，以及小的插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多數(shù)生物天然存在的多態(tài)性株系中SNP和INDEL形成了最大類的序列變體。根據(jù)本發(fā)明首選的方面，希望增強(qiáng)或增加本發(fā)明的C2WT核酸分子或其變體的表達(dá)。得到基因或基因產(chǎn)物表達(dá)增強(qiáng)或增加的方法在本領(lǐng)域中有詳細(xì)記載并且包括例如用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)量表達(dá)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子的使用?？梢詫⒂米鲉?dòng)子或增強(qiáng)子元件的分離的核酸引入至多核苷酸非異源形式的適當(dāng)位置上(一般為上游)，從而上調(diào)本發(fā)明的CDK核酸或其變體的表達(dá)。例如，可以通過(guò)突變、缺失和/或取代來(lái)體內(nèi)改變內(nèi)源啟動(dòng)子(參見(jiàn)Kmiec，美國(guó)專利5，565，350號(hào)；Zarling等人，PCT/US93/03868),或者可以將分離的啟動(dòng)子以與本發(fā)明基因適當(dāng)?shù)姆较蚝途嚯x引入植物細(xì)胞中，從而調(diào)控基因的表達(dá)。如果希望多^達(dá)，通常需要在多核苷酸編碼區(qū)的3，-端包括多聚腺苷酸化作用區(qū)域。多聚腺苷酸化作用區(qū)域可以來(lái)自天然基因、來(lái)自多種其他植物基因或來(lái)自T-DNA。待添加的3，端序列可以來(lái)自例如胭脂氨酸合酶或章魚(yú)堿合酶基因，或可選的來(lái)自其他植物基因，或次優(yōu)選的來(lái)自任何其他真核基因。還可以將內(nèi)含子序列添加到5，非翻譯區(qū)或部分編碼序列的編碼序列以增加在胞質(zhì)中聚集的成熟信使的量。已經(jīng)表明在植物和動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單位中包含可剪接的內(nèi)含子能在mRNA和蛋白質(zhì)水平上^^因表達(dá)增加高達(dá)1000倍(Buchman和Berg，Mol.CellBiol.8，4395-4405(1988);Callis等人，GenesDev.1，1183-1200(1987))。當(dāng)將內(nèi)含子置于轉(zhuǎn)錄單位的5，端附近時(shí)，此類內(nèi)含子的基因表達(dá)的增強(qiáng)通常是最大的。玉米內(nèi)含子Adhl-S內(nèi)含子l、2和6,Bronze-l內(nèi)含子的使用是本領(lǐng)域^^的?？傮w參見(jiàn)TheMaizeHandbook,116章，F(xiàn)reeling和Walbot編輯，Springer,N.Y.(1994)。本發(fā)明還提供了遺傳構(gòu)建體和載體，以便于引入和/或表達(dá)可用于本發(fā)明方法中的核苷i^亭列。因此，本發(fā)明提供了基因構(gòu)建體，其包含(i)CDK核酸分子或其功能性變體，該核酸或變體編碼含有(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE、ATP結(jié)合和活性部位基序的CDK;(ii)能驅(qū)動(dòng)(i)的核酸序列在植物中表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列；和可選的(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建可用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體?？梢詫⒒驑?gòu)建體插入載體中，該載體是可商購(gòu)的、適于轉(zhuǎn)化到植物中并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因。使用包含目的序列(即根據(jù)本發(fā)明的CDK核酸或其變體)的載體轉(zhuǎn)化植物。將目的序列有效連接于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列(至少連接于啟動(dòng)子)。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)元件"、"一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列"、"調(diào)控序列"和"啟動(dòng)子"在本文都可以互換使用，且應(yīng)當(dāng)取其廣義，指能影響與它們連接的序列表達(dá)的調(diào)節(jié)核酸序列。上述術(shù)語(yǔ)包括來(lái)源于經(jīng)典真核生物基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(包括精確轉(zhuǎn)錄起始所需的TATA框，含有或不含CCAAT框序列)以及應(yīng)答發(fā)育和/或外界刺激，或以組織特異性方式改變基因表達(dá)的另外的調(diào)節(jié)元件(即上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)。該術(shù)語(yǔ)還包括經(jīng)典原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，在這種情況下它可以包括-35框序列和/或-10框轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)元件"也包括合成的融合分子或衍生物，其賦予、激活或增強(qiáng)核酸分子在細(xì)胞、組織或器官中的表達(dá)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"有效連接，，指啟動(dòng)子序列與目的基因之間的功能性連接，4吏得啟動(dòng)子序列能起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。調(diào)節(jié)序列可與內(nèi)源性或轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)的編碼序列有效連接，并控制其轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，或編碼mRNA或表達(dá)的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或衰變(decay)。為了修飾和控制編碼序列的表達(dá)，可以改變、增加或改動(dòng)其調(diào)節(jié)元件，例如啟動(dòng)子、UTR、剪接位點(diǎn)、加工信號(hào)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、終止子、增強(qiáng)子、誘導(dǎo)物、阻抑物、轉(zhuǎn)錄后或翻譯后修飾位點(diǎn)。調(diào)節(jié)序列尤其包括如本文公開(kāi)的啟動(dòng)子和終止子的植物序列。例如，Hayashi等人，1992(Science258:1350-1353)或Weigel等人，2000(PlantPhysiol.122，1003-1013)及其中引用的其他文獻(xiàn)已描述了通過(guò)隨機(jī)整合增強(qiáng)子元件來(lái)活化植物基因。例如，可以通過(guò)以更強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子取代內(nèi)源啟動(dòng)子，或者以不改變編碼區(qū)而提供更高的穩(wěn)定性的3'UTR替換內(nèi)源3，UTR來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。另外，可以通過(guò)轉(zhuǎn)入實(shí)施例中所述的人工轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)控。備選的啟動(dòng)子、終止子和UTR描述如下。調(diào)節(jié)序列旨在能夠特異性表達(dá)基因和特異性的蛋白質(zhì)表達(dá)。例如，基于宿主植物，這意P未著基因僅在誘導(dǎo)后表達(dá)和/或過(guò)量表達(dá)，或者組成型表達(dá)和/或過(guò)量表達(dá)。這些調(diào)節(jié)序列例如是結(jié)合誘導(dǎo)物或阻抑物的序列，由此調(diào)控核酸的表達(dá)。除了這些新的調(diào)節(jié)序列或取代這些序列的是，這些序列的天然調(diào)節(jié)仍然存在于真正的結(jié)構(gòu)基于之前，如果合適，這些序列的天然調(diào)節(jié)可被遺傳修飾，由此該天然調(diào)節(jié)被關(guān)閉或基因表達(dá)增加。作為規(guī)則，所述調(diào)節(jié)序列位于待表達(dá)的核酸序列的編碼序列的上游(5')、其中和/或下游(3')。但是，本發(fā)明方法中所使用的以及本文描述的核酸構(gòu)建體(=表達(dá)盒、表i^J建體或基因構(gòu)建體)也可以更簡(jiǎn)單的構(gòu)建，這就是說(shuō)在核*列或其衍生物之前沒(méi)有插入其他調(diào)節(jié)信號(hào)，且天然啟動(dòng)子及其調(diào)節(jié)(序列)沒(méi)有被移動(dòng)?；蛘?，天然調(diào)控序列以調(diào)控不再發(fā)生和/或基因表達(dá)增加的方式突變。這些修飾的啟動(dòng)子也可以被引入它們自己的位置，所述位置在部分序列形式(=啟動(dòng)子和部分本發(fā)明的核酸序列)的天然基因之前以增加活性。此外，基因構(gòu)建體有利地還包含一個(gè)或多個(gè)已知的增強(qiáng)子序列(和啟動(dòng)子有效連接)，這能夠增加核酸序列的表達(dá)。同時(shí)，可能在DNA序列的3，末端插入其他有利的序列(例如其他調(diào)節(jié)元件或終止子)。調(diào)節(jié)序列包括轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列或信號(hào)，例如位于上游(5，)的序列，其尤其涉及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或翻譯的起始，例如啟動(dòng)子或起始密碼子，以及位于下游(3，)的序列，其尤其涉及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或翻譯的終止和轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性，例如聚腺苷酸化信號(hào)或終止密碼子。調(diào)節(jié)序列可位于轉(zhuǎn)錄的編碼區(qū)以及轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)，例如內(nèi)含子，如例如剪接位點(diǎn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞中本發(fā)明核酸分子表達(dá)的啟動(dòng)子，原則上可以使用能夠刺激目的基因在植物中轉(zhuǎn)錄的所有調(diào)節(jié)序列均可以使用。"編碼序列，，是當(dāng)在適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的控制下轉(zhuǎn)錄為mRNA和/或翻譯為多肽的核苷酸序列。編碼序列的邊界由5，-末端的翻譯起始密碼子和3，-末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列包括但不限于mRNA、cDNA、重組核苷酸序列或基因組DNA,同時(shí)在某些情況下可以存在內(nèi)含子。如上所述，調(diào)節(jié)序列或因子對(duì)所導(dǎo)入的基因的表達(dá)具有正效應(yīng)，因此增加所導(dǎo)入的基因的表達(dá)。因此，通過(guò)使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)，例如強(qiáng)啟動(dòng)子和/或強(qiáng)增強(qiáng)子可以在轉(zhuǎn)錄水平上有利地發(fā)生表達(dá)的增加。另外，在翻譯水平上增加表達(dá)也是可能的，例如通過(guò)轉(zhuǎn)入翻譯增強(qiáng)子序列，例如￡1增強(qiáng)子(例如增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄物的核糖體結(jié)合)，或者通過(guò)增加mRNA的穩(wěn)定性，例如通過(guò)已知賦予轉(zhuǎn)錄物高穩(wěn)定性的3'UTR編碼區(qū)取代3'UTR編碼區(qū)，或者通過(guò)消除轉(zhuǎn)錄物的不穩(wěn)定性來(lái)穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物，這樣mRNA分子比野生型更經(jīng)常被翻譯。例如植物中AU-豐富元件(ARE)和DST(下游)元件使轉(zhuǎn)錄物不穩(wěn)定。誘變研究已證明在兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(ATAGAT和GTA區(qū))之間的殘基對(duì)于不穩(wěn)定功能是必須的。因此除去或誘變此類元件顯然將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物更加穩(wěn)定、更高的轉(zhuǎn)錄速度和更高的蛋白質(zhì)活性。翻譯增強(qiáng)子也是"超驅(qū)動(dòng)序列"，其包含煙草花葉病毒5，-非翻譯前導(dǎo)序列，其增加蛋白質(zhì)/RNA比率(Gallie等人，1987，Nucl.AcidsResearch15:8693-8711)。增強(qiáng)子一般定義為順式作用元件(cisactiveelements)，其可不依賴于位置和方向刺激基因轉(zhuǎn)錄。已在植物中鑒定了不同的增強(qiáng)子，其可以組成型刺激轉(zhuǎn)錄，或組織或刺激特異性刺激轉(zhuǎn)錄。組成型增強(qiáng)子的公知實(shí)例是來(lái)自35S啟動(dòng)子的增強(qiáng)子(Odell等人，1985，Nature313:810-812)或ocs增強(qiáng)子(Fromm等人，1989，PlantCell1:977:984)。其他例子是G-Box基序四聚體，其在雙子葉和單子葉植物中賦予高水平的組成型表達(dá)(Ishige等人，1999，PlantJournal,18，443-448)，或petE(A/T-豐富序列)，其在轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯植物中作為基因表達(dá)的定量增強(qiáng)子(Sandhii等人，1998;PlantMolBiol.37(5):885-96)。除此之外，已描述了大量有助于特異性表達(dá)模式的順式作用元件，所述特異性表g式例如器官特異性表達(dá)，或響應(yīng)生物或非生物脅迫的誘導(dǎo)性表達(dá)。該元件的例子是提供病原體或損傷誘導(dǎo)表達(dá)的元件(Rushton，2002，PlantCell,14,749-762)，或保衛(wèi)細(xì)胞特異性表達(dá)(Plesch，2001，PlantJournal28，455-464)。有利地，可以使用任何類型的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)核酸序列的表達(dá)。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，即應(yīng)答發(fā)育、化學(xué)、環(huán)境或物理刺激具有誘導(dǎo)的或增加的轉(zhuǎn)錄起始。另外的或可選的啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子，即在植物的至少一種組織或器官中顯著表達(dá)，且在植物的任何生命階段顯著性表達(dá)的啟動(dòng)子。另外的或可選的，啟動(dòng)子可以是組織偏好的或細(xì)胞偏好的啟動(dòng)子，即其能夠在某些組織如葉、根、種子組織等，或甚至在特定細(xì)胞中優(yōu)選地起始轉(zhuǎn)錄。能夠僅在某些組織或細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子在本文中分別稱其為"組織特異性"和"細(xì)胞特異性"。在這些植物中有功能的合適啟動(dòng)子通常是已知的。它們可以采取組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的形式。合適的啟動(dòng)子能夠在多細(xì)胞真核生物中進(jìn)行發(fā)育和/或組織特異性表達(dá)；從而可以有利地在植物中使用葉、根、花、種子、氣孔、塊莖或果實(shí)特異性啟動(dòng)子。例如，在植物中可用的不同植物啟動(dòng)子為諸如USP、LegB4-、DC3啟動(dòng)子或來(lái)自歐芽的泛素啟動(dòng)子等啟動(dòng)子。"植物"啟動(dòng)子包含調(diào)節(jié)元件，其介導(dǎo)編碼序列區(qū)段在植物細(xì)胞中的表達(dá)。從而，植物啟動(dòng)子無(wú)需為植物來(lái)源的，而是可以來(lái)源于病毒或#:生物，例如，特別是來(lái)源于攻擊植物細(xì)胞的病毒。"植物，，啟動(dòng)子也可以來(lái)源于植物細(xì)胞，例如，來(lái)源于經(jīng)本文所述的欲在本發(fā)明方法中表達(dá)的核酸序列轉(zhuǎn)化的植物。這對(duì)于其他"植物"調(diào)控信號(hào)同樣適用，例如"植物"終止子的情況。為在植物中表達(dá)，核酸分子必須如上文所述的那樣，有效連接于或者包含合適的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子在合適的地點(diǎn)適時(shí)地以細(xì)胞或組織特異性方式表達(dá)該基因?？捎玫膯?dòng)子有組成型啟動(dòng)子(Benfey等，EMBOJ.8(1989)2195-2202)，如來(lái)源于植物病毒的那些啟動(dòng)子，如35SCAMV(Franck等，Cell21(1980)285-294)、19SCaMV(還參見(jiàn)US5352605和WO84/02913)、34SFMV(Sanger等，Plant.Mol.Biol"14，1990:433-443)、歐芽泛素啟動(dòng)子，或植物啟動(dòng)子如US4，962，028中所述的核酮糖二磷酸縮化酶/加氧酶(Rubisco)小亞基啟動(dòng)子或植物啟動(dòng)子PRPl[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)1、SSU、PGELl、OCS[Leisner(1988)ProcNatlAcadSciUSA85(5):2553-2557、lib4、usp、masComai(1990)PlantMolBiol15(3):373-381]、STLS1、ScBV(Schenk(1999)PlantMolBiol39(6):1221-1230)、B33、SAD1或SAD2(亞麻啟動(dòng)子，Jain等，CropScience,39(6)，1999:1696-1701)或nos[Shaw等(1984)NucleicAcidsRes.12(20):7831-7846。其他組成型植物啟動(dòng)子的實(shí)例為甜菜V-ATPase啟動(dòng)子(WO01/14572)。合成組成型啟動(dòng)子的實(shí)例有超級(jí)啟動(dòng)子(Superpromoter)(WO95/14098)和來(lái)源于G-box的啟動(dòng)子(WO94/12015)。此外，適當(dāng)?shù)那闆r下還可以使用化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，對(duì)照EP-A388186、EP-A335528、WO97/06268。在植物中穩(wěn)定組成型表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)是有利的。然而，如果收獲前的晚期表達(dá)有利的話，最好誘導(dǎo)型表達(dá)本發(fā)明的多肽，因?yàn)榇x操作很可能會(huì)導(dǎo)致植物生產(chǎn)延遲。也能夠通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子促進(jìn)植物基因的表達(dá)(有關(guān)綜述，參見(jiàn)Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol"48:89-108)。當(dāng)期望以時(shí)間特異性方式表達(dá)基因時(shí)，化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子尤其適用。此類啟動(dòng)子的實(shí)例有水楊酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO95/19443)、脫落酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(EP335528)、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gatz等(1992)PlantJ.2，397-404)、環(huán)己醇或乙醇+秀導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO93/21334)，或者本文所述的其他啟動(dòng)子。其他合適的啟動(dòng)子是那些針對(duì)生物或非生物脅迫M應(yīng)的啟動(dòng)子，例如病原誘導(dǎo)的PRPl基因啟動(dòng)子(Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)361-366)、番茄熱誘導(dǎo)型hsp80啟動(dòng)子(US5,187,267)、馬鈴薯冷誘導(dǎo)型a-淀粉酶啟動(dòng)子(WO96/12814)或創(chuàng)傷誘導(dǎo)型pinlI啟動(dòng)子(EP-A-03"091)，或者本文所述的其他啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子尤其是那些導(dǎo)致基因在組織和器官、在種子細(xì)胞如胚乳細(xì)胞以及發(fā)育中的胚細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子有油菜籽油菜napin基因啟動(dòng)子(US5,608,152)、蠶豆(Viciafaba)USP啟動(dòng)子(Baeumlein等，MolGenGenet,1991，225(3):459-67)、擬南芥油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(WO98/45461)、菜豆(Phaseolusvulgaris)菜豆蛋白啟動(dòng)子(US5，504，200)、蕓苔Bce4啟動(dòng)子(WO91/13980)、豆arc5啟動(dòng)子、胡蘿卜DcG3啟動(dòng)子或豆球蛋白B4啟動(dòng)子(LeB4;Baeumlein等，1992，PlantJournal,2(2):233-9)，以及在單子葉植物中帶來(lái)種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，如玉米、大麥、小麥、黑麥、48稻等。有利的種子特異性啟動(dòng)子有蔗糖結(jié)合蛋白啟動(dòng)子(WO00/26388)、菜豆蛋白啟動(dòng)子和napin啟動(dòng)子。必須考慮的合適的啟動(dòng)子有大麥lpt2或lptl基因啟動(dòng)子(WO95/15389和WO95/23230)，以及WO99/16890中所述的啟動(dòng)子(來(lái)自大麥大麥醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻oryzin基因、稻醇溶谷蛋白基因、小麥醇溶蛋白基因、小麥谷蛋白基因、玉米玉米醇溶蛋白基因、燕麥谷蛋白基因、高粱kasirin基因、黑麥黑麥堿基因的啟動(dòng)子)。其他合適的啟動(dòng)子為Amy32b、Amy6-6和Aleurain[US5,677,474]、Bce4(油菜籽油菜)[US5,530,149]、大豆球蛋白(大豆)[EP571741、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(大豆)JP06/62870、ADR12-2(大豆)[WO98/08962，異檸檬酸裂合酶(油菜籽油菜)[US5，689，040或01-淀粉酶(大麥)[EP781849]?？捎糜谠谥参镏斜磉_(dá)基因的其他啟動(dòng)子有葉特異性啟動(dòng)子，如DE-A19644478中所述的那些；或者光調(diào)控的啟動(dòng)子，如豌豆petE啟動(dòng)子。其他合適的植物啟動(dòng)子有胞質(zhì)FBPase啟動(dòng)子或馬鈴薯ST-LSI啟動(dòng)子(Stockhaus等，EMBOJ.8,1989，2445)、大豆磷酸核糖焦磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子(GenBank登錄號(hào)U87999)或EP-A-0249676中描述的瘤特異性啟動(dòng)子(node-specificpromoter)。優(yōu)選地，本發(fā)明的CDK核酸或其變體有效連接到莖干特異性啟動(dòng)子。本文所定義的術(shù)語(yǔ)"莖干特異性"指的是在莖干中顯著性表達(dá)，并在植物的任何生命階段顯著性表達(dá)的啟動(dòng)子。本文所用術(shù)語(yǔ)"莖干"包括植物的全部地上部分，包括莖和枝條、葉、芽、生殖器官，包括莖干衍生的結(jié)構(gòu)，例如匍匐莖、球莖、根莖或塊莖。優(yōu)選地，能夠在整個(gè)莖干中偏好地表達(dá)核酸的莖干特異性啟動(dòng)子是弱啟動(dòng)子?？梢岳缤ㄟ^(guò)將啟動(dòng)子連接于報(bào)告基因并測(cè)定報(bào)告基因在多種植物組織中的表達(dá)來(lái)分析啟動(dòng)子的強(qiáng)度和/或表達(dá)方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一個(gè)合適的報(bào)告基因是P-葡糖醛酸糖苷酶。接著可以將啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或表達(dá)方式與充分表征的莖干特異性參考啟動(dòng)子，例如Cab27啟動(dòng)子(弱表達(dá)，GenBankAP004700)或推定的原葉綠素酸酯還原酶啟動(dòng)子(強(qiáng)表達(dá)，GenBankAL606456)相比較。關(guān)于"弱啟動(dòng)子"指驅(qū)動(dòng)編碼序列以j氐水平表達(dá)的啟動(dòng)子，即在每個(gè)細(xì)胞中約1/10,000轉(zhuǎn)錄物至約1/100,000轉(zhuǎn)錄物，至約1/500,000轉(zhuǎn)錄物的水平。相反地，"強(qiáng)啟動(dòng)子"驅(qū)動(dòng)編碼序列以高水平表達(dá)，或在每個(gè)細(xì)胞中約1/10轉(zhuǎn)錄物至約1/100轉(zhuǎn)錄物，至約1/1000轉(zhuǎn)錄物。最優(yōu)選地，能夠在整個(gè)植物中偏好地表達(dá)核酸的啟動(dòng)子是來(lái)自稻的金屬硫蛋白啟動(dòng)子。應(yīng)該清楚的是本發(fā)明的應(yīng)用不限于序列表中描述的CDK核酸，尤其不限于由SEQIDNO:45、47、49、51、53或55所示的CDK核酸。任選的，還可在引入植物的構(gòu)建體中使用一個(gè)或多個(gè)終止子序列。術(shù)語(yǔ)"終止子"包括調(diào)控序列，其為位于轉(zhuǎn)錄單位末端的DNA序列，標(biāo)志初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的3'加工(在終止密碼子后)和多聚腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄的終止?？捎糜诒景l(fā)明方法中的終止子例如是OCSl終止子、nos3終止子或35S終止子。有啟動(dòng)子的情況下，各基因使用不同的終止子序列。微生物中有用的終止子例如是fimA終止子、txn終止子或trp終止子。此類終止子可以是rho-依賴性的或rho-非依賴性的。其他調(diào)節(jié)元件可以包括轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子以及翻譯增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉適合用于實(shí)施本發(fā)明的終止子和增強(qiáng)子序列。此類序列是已知的，或本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易的獲得。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包括在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制所需的復(fù)制序列的起點(diǎn)。一個(gè)實(shí)例是需要遺傳構(gòu)建體在細(xì)菌細(xì)胞中作為附加型遺傳元件(如質(zhì)?；蝠ち７肿?維持的情況。首選的復(fù)制起點(diǎn)包括但不限于fl-ori和colEl。成功轉(zhuǎn)移，最好使用標(biāo)記基因(—艮道基因)。這些標(biāo)記基因能夠通過(guò)一系列不同的原理鑒定核酸分子的成功轉(zhuǎn)移，例如通過(guò)視覺(jué)鑒定，借助于熒光、發(fā)光或者人眼不可見(jiàn)的光波波長(zhǎng)范圍，通過(guò)除草劑或抗生素抗性，通過(guò)稱為營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記(營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記)或抗?fàn)I養(yǎng)標(biāo)記(antimitritivemarker),通過(guò)酶測(cè)定或通過(guò)植物激素。可提及的此類標(biāo)記的實(shí)例有GFP(-綠色熒光蛋白)；熒光素/熒光素酶系統(tǒng)；p-半乳糖苷酶及其著色底物，例如X-Gal;針對(duì)例如咪唑啉酮、草甘磷、膦絲菌素或磺胺脲的除草劑抗性；針對(duì)例如博來(lái)霉素、潮霉素、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、氨千青霉素、慶大霉素、遺傳霉素(G418)、壯觀霉素或殺稻痘菌素等等的抗生素抗性；營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記如甘露糖或木糖的利用；或抗?fàn)I養(yǎng)標(biāo)記如對(duì)2-脫氧葡萄糖的抗性。這僅僅是一小部分可能的標(biāo)記的名單。技術(shù)人員對(duì)這類標(biāo)記極為熟悉。優(yōu)選根據(jù)不同生物體和選擇方法來(lái)使用不同的標(biāo)記。因此遺傳構(gòu)建體可以任選地包括可選擇的標(biāo)記基因。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"可選擇的標(biāo)記或可選擇的標(biāo)記基因"包括賦予細(xì)胞表型的任何基因，該基因在細(xì)胞中表達(dá)，有利于鑒定和/或選擇經(jīng)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記基因的實(shí)例包括其編碼的蛋白質(zhì)能賦予抗生素抗性的基因(如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptll，或磷酸化潮霉素的hpt)、其編碼的蛋白質(zhì)賦予除草劑抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar;提供草甘膦抗性的aroA或gox)，或提供陳代謝性狀的基因(如允許植物利用甘露糖作為唯一碳源的附""^)。編碼可視標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因?qū)е滦纬深伾?例如P國(guó)葡糖醛酸糖苷酶，GUS)、螢光(如螢光素酶)或熒光(綠色熒光蛋白，GFP,及其衍生物)。已知核酸穩(wěn)定或瞬時(shí)整合進(jìn)植物細(xì)胞，僅少數(shù)細(xì)胞攝入外來(lái)DNA，并整合進(jìn)其基因組(如果期望的話)，這取決于所用的表達(dá)載體和所用的轉(zhuǎn)染技術(shù)。為鑒定并選擇這些整合體，通常將編碼可選擇標(biāo)記(如上文所屬，例如抗生素抗性)的基因與目的基因一起引入宿主細(xì)胞中。植物中優(yōu)選的可選擇標(biāo)記包括那些賦予除草劑如草甘膦或草丁膦抗性的標(biāo)記。其他合適的標(biāo)記為例如編碼參與例如糖或氨基酸生物合成通路基因的標(biāo)記，如P-半乳糖苷酶、ura3或ilv2。編碼基因如熒光素酶、gfp或其他熒光基因的標(biāo)記同樣適用。這些標(biāo)記和前述標(biāo)記可在突變體中^f吏用，所述突變體中原有的這些基因沒(méi)有功能，例如由于常規(guī)方法而缺失。此外，編碼可選擇標(biāo)記的核酸分子與編碼本發(fā)明多肽的核酸分子可以在同一個(gè)載體中引入宿主細(xì)胞或用于本發(fā)明的方法，或者在單獨(dú)的載體中。由所引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以例如通過(guò)選擇(例如，整合有可選擇標(biāo)記的細(xì)胞存活而其他細(xì)胞死去)予以鑒定。一旦成功引入核酸，將不再需要或不期望轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中存在標(biāo)記基因，通常特別是抗生素和除草劑抗性基因，所以根據(jù)本發(fā)明引入核酸的方法有利地采用能夠除去或切除這些標(biāo)記基因的技術(shù)。一種這樣的方法是稱為共轉(zhuǎn)化的方法。共轉(zhuǎn)化法采用兩個(gè)載體同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，一個(gè)載體攜帶根據(jù)本發(fā)明的核酸，而第二個(gè)攜帶標(biāo)記基因。較大比例的轉(zhuǎn)化體接收或者對(duì)于植物而言含有(高達(dá)40%或以上的轉(zhuǎn)化體)兩個(gè)栽體。對(duì)于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化體通常只接收載體的一部分，即為T(mén)-DNA所側(cè)接的序列，其通常指表達(dá)盒。隨后可通過(guò)雜交從轉(zhuǎn)化植物中除去標(biāo)記基因。在另一種方法中，利用整合進(jìn)轉(zhuǎn)座子的標(biāo)記基因與期望的核酸一起進(jìn)行轉(zhuǎn)化(稱為Ac/Ds技術(shù))。轉(zhuǎn)化體可與轉(zhuǎn)座酶來(lái)源雜交，或者用賦予轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的核酸瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體。在有些情況下(約10%)，一旦成功進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)座子跳出宿主細(xì)胞基因組并丟失。在其他一些情況下，轉(zhuǎn)座子跳至不同的位置。在這些情況下，必須通過(guò)雜交消除標(biāo)記基因。在微生物學(xué)領(lǐng)域，研發(fā)了有可能或便于檢測(cè)此類事件的技術(shù)。另一有利的方法有賴于稱為重組系統(tǒng)的方法，其優(yōu)勢(shì)在于可以免除雜交消除步驟。最著名的這類系統(tǒng)稱為Cre/lox系統(tǒng)。Crel為重組酶，且切除位于loxP序列之間的序列。如果標(biāo)記基因整合在loxP序列之間，一旦成功進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，由于該重組酶的表達(dá)，其得以切除。其他重組系統(tǒng)有HIN/HIX、FLP/FRT及REP/STB系統(tǒng)(Tribble等，J.Biol.Chem"275，2000:22255-22267;Velmurugan等，J.CellBiol"149，2000:553-566)。才艮據(jù)本發(fā)明的核酸有可能位點(diǎn)特異性地整合進(jìn)植物基因組。這些方法自然也可以應(yīng)用于^:生物如酵母、真菌或細(xì)菌。本發(fā)明還包括可由本發(fā)明方法獲得的植物或植物細(xì)胞。本發(fā)明因此提供可由本發(fā)明方法獲得的植物或植物細(xì)胞，所述植物或植物細(xì)胞中引入了CDK核酸或其變體，所述CDK核酸或其變體編碼本文公開(kāi)的包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE、ATP結(jié)合和活性部位基序的CDK。本發(fā)明還提供用于生產(chǎn)具有改良生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括在植物中引入和表達(dá)CDK核酸或其變體，所述CDK核酸或其變體編碼本文公開(kāi)的包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE、ATP結(jié)合和活性部位基序的CDK。52更具體地，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改良的生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括(i)向植物或植物細(xì)胞中引入編碼CDK或其同源物的核酸；和(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。可以將核酸直接^j入植物細(xì)胞或植物本身(包括引入到植物的組織、器官或任何其他部分)。根據(jù)本發(fā)明首選的特征，優(yōu)選通過(guò)轉(zhuǎn)化將核酸引入植物。本文所涉及的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"或"導(dǎo)入"包括將外源多核苷酸轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞，而不管轉(zhuǎn)移所用的方法如何。無(wú)論通過(guò)器官發(fā)生還是胚胎發(fā)生能夠隨后克隆繁殖的植物組織，可以用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，并且從其再生出整林植物。選擇的特定組織將根據(jù)可用且最適于所轉(zhuǎn)化特定物種的克隆繁殖系統(tǒng)而改變。示例性的靶標(biāo)組織包括葉盤(pán)、花粉、胚胎、子葉、下胚軸、雌配子、胼胝體組織、存在的分生組織(例如，頂端分生組織，腋生的芽和根分生組織)以及誘導(dǎo)的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)?？梢运矔r(shí)或穩(wěn)定的將多核苷酸引入宿主細(xì)胞中，且可保持非整合狀態(tài)，例如，作為質(zhì)粒?？蛇x擇的，可以將其整合到宿主基因組中。接著可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，使用所得的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物。外來(lái)基因轉(zhuǎn)移^植物基因組中稱為轉(zhuǎn)化。為實(shí)施轉(zhuǎn)化，利用轉(zhuǎn)化方法以及由植物組織或植物細(xì)胞再生植物的方法來(lái)進(jìn)行瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。有利的轉(zhuǎn)化法是植物原位(inplanta)轉(zhuǎn)化。為此，有可能例如使農(nóng)桿菌作用于植物種子，或用農(nóng)桿菌接種植物分生組織。根據(jù)本發(fā)明，證明使轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌懸液作用于完整植林或至少花原基尤為有利。隨后培養(yǎng)植物，直至獲得所處理植物的種子(Clough和Bent，PlantJ.(1998)16,735-743)。為選擇轉(zhuǎn)化的植物，通常將在轉(zhuǎn)化過(guò)程中獲得的植物材料置于選擇性條件中，從而可將轉(zhuǎn)化植物與非轉(zhuǎn)化植物區(qū)分開(kāi)來(lái)。例如，可以種植以上述方式獲得的種子，并在最初的生長(zhǎng)周期之后，通過(guò)噴霧對(duì)其進(jìn)行選擇。另一可能性包括使用合適的選擇劑，將種子，適用的情況下是在授粉之后，種植在瓊脂板上，從而僅轉(zhuǎn)化的種子能夠長(zhǎng)成植物。其他有利的轉(zhuǎn)化方法、特別是植物轉(zhuǎn)化方法，為技術(shù)人員所公知，并在下文描述。植物物種的轉(zhuǎn)化目前是相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。有利的，可以使用任意的一些轉(zhuǎn)化方法將目的基因引入到合適的祖代細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、增加游離DNA攝入的化學(xué)品、直接注射DNA到植物中、基因槍轟擊、使用病毒或花粉轉(zhuǎn)化以及顯微注射。方法可選自用于原生質(zhì)體的釣/聚乙二醇方法(Krens等人，(1982)Nature296，72-74;Negrutiu等人(1987)PlantMol.Biol.8，363-373);原生質(zhì)體的電穿孔(Shillito等人，(1985)Bio/Technol3，1099-1102);顯微注射到植物材料中(Crossway等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202，179-185);DNA或RNA包被顆粒轟擊(Klein等人，(1987)Nature327，70);用(非整合型)病毒感染等等。優(yōu)選使用任何用于諸如蕓苜屬、大豆、谷物或稻轉(zhuǎn)化的熟知方法，通過(guò)農(nóng)桿菌(JgnM"er/"/w)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生表達(dá)本發(fā)明的CDK的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)化的方法例如在以下任何文獻(xiàn)中描述的方法/^開(kāi)的歐洲專利申請(qǐng)EPU98卵5Al，Aldemita和Hodges(Planta,199，612-617，1996);Chan等人(PlantMol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(PlantJ.6，271-282，1994)，公開(kāi)內(nèi)容以其全文在此引用作為參考。在谷物轉(zhuǎn)化情形下，首選方法如在Ishida等人(NatureBiotechnol.14，745-50，1996)或Frame等人(PlantPhysiol.129，13-22，2002)所述，公開(kāi)內(nèi)容以其全文在此引用作為參考。作為舉例，所述方法由B.Jenes等,TechniquesforGeneTransfer,在TransgenicPlants,巻l,EngineeringandUtilization,S.D.Kung和R.Wu編輯，AcademicPress(1993)128-143以及PotrykusAnnu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)205-225)中進(jìn)一步描述。優(yōu)選將待表達(dá)的核酸或構(gòu)建體克隆到載體中，所述載體適用于轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌04gn^flcteW"附似附e/"c/e附)，例如pBinl9(Bevan等，Nucl.AcidsRes.12(1984)8711)。然后以已知的方式利用由這樣的載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌來(lái)轉(zhuǎn)化植物，特別是作物植物，例如作為舉例的煙草植物，例如通過(guò)在農(nóng)桿菌溶液中水^傷的葉子或剁碎的葉子，然后在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)之。例如，通過(guò)根瘤農(nóng)桿菌的植物轉(zhuǎn)化由H6fgen和Willmitzer在Nucl.AcidRes.(1988)16，9877中描述，或者尤其是由于F.F.White,VectorsforGeneTransferinHigherPlants在TransgenicPlants,巻1，EngineeringandUtilization,編輯S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress,1993，第15-38頁(yè)而為人所知。通常在轉(zhuǎn)化以后，選擇存在與目的基因共轉(zhuǎn)移的由植物可表達(dá)基因編碼的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的植物細(xì)胞或細(xì)胞群，接著將轉(zhuǎn)化的材料再生成整林植物。如所提到的那樣，用本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌也可以以其自身已知的方法來(lái)轉(zhuǎn)化植物，如實(shí)驗(yàn)植物，像擬南芥或作物植物，例如像谷類、玉米、燕麥、黑麥、大麥、小麥、大豆、稻、棉花、甜菜、蕓苔、向曰葵、亞麻、大麻、馬鈴薯、煙草、番茄、胡蘿卜、甜椒、油菜籽油菜、木薯淀粉、木薯、竹芋、萬(wàn)壽菊、苜蓿、生菜和多種樹(shù)木、堅(jiān)果和葡萄藤物種，特別是含油作物植物，如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、玉米、棉花、亞麻、油菜籽油菜、椰子、油椰、紅花(Car幼"附wsri"cton'M力、可可豆，例如通過(guò)在農(nóng)桿菌溶液中水浴劃破的葉子或葉節(jié)，隨后在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)之。除了轉(zhuǎn)化體細(xì)胞、然后再生為完整植林以外，還有可能轉(zhuǎn)化植物分生組織的細(xì)胞，特別是良育成配子的那些細(xì)胞。在這種情況下，轉(zhuǎn)化的配子循著天然植物的發(fā)育而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。因此，例如，用農(nóng)桿菌處理擬南芥的種子，并從發(fā)育中的植物獲得種子，其中一定比例經(jīng)轉(zhuǎn)化因而是轉(zhuǎn)基因的(Feldman，KA和MarksMD(1987).MolGenGenet208:274-289;FeldmaimK(1992).在CKoncz，N畫(huà)HChua和JShdl編輯MethodsinArabidopsisResearch.WordScientific,Singapore,第274-289頁(yè))?？蛇x方法基于熒光的反復(fù)去除以及蓮座葉中心切除部位與轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌一起進(jìn)行的孵育，由此在隨后的時(shí)間點(diǎn)同樣能夠獲得轉(zhuǎn)化的種子(Chang(l994》PlantJ.5:551-558;Katavic(1994).MolGenGenet,245:363-370)。然而，特別有效的方法是真空滲透法，及其改良法如"浸花法"(floraldip)。對(duì)于擬南芥的真空滲透，用農(nóng)桿菌懸液減壓處理完整植林(Bechthold,N(l993).CR55AcadSciParisLifeSci，316:1194-1199)，而對(duì)于"浸花法"，將發(fā)育中的花組織與表面活性劑處理的農(nóng)桿菌懸液一起短暫孵育(Cloiigh，SJimdBent,AF(1998).ThePlantJ.16,735-743)。在兩種情況下均收獲一定比例的轉(zhuǎn)基因種子，且可通過(guò)在上述選擇性條件下培養(yǎng)而將這些種子與非轉(zhuǎn)基因種子區(qū)分開(kāi)來(lái)。另外，質(zhì)體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化是有利的，因?yàn)橘|(zhì)體在多數(shù)作物中母系遺傳，降低或消除了轉(zhuǎn)基因通過(guò)花粉流失的風(fēng)險(xiǎn)。葉綠體基因組的轉(zhuǎn)化通常通過(guò)Klaus等，2004(NatureBiotechnology22(2)，225-229)系統(tǒng)展示的方法實(shí)現(xiàn)。簡(jiǎn)言之，將待轉(zhuǎn)化的序列與可選擇的標(biāo)記基因一起克隆到同源于葉綠體基因組的側(cè)翼序列之間。這些同源側(cè)翼序列指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)特異性整合到質(zhì)體中。質(zhì)體轉(zhuǎn)化已在許多不同的植物物種中描述，且綜述可摘自Bock(2001)Transgenicplastidsinbasicresearchandplantbiotechnology.JMolBiol.2001Sep21;312(3):425畫(huà)38或Maliga，P(2003)Progresstowardscommercializationofplastidtransformationtechnology.TrendsBiotechnol.21,20-28。其他生物技術(shù)方法最近被報(bào)道為不含標(biāo)記的質(zhì)體轉(zhuǎn)化體的形式，這可以通過(guò)瞬時(shí)共合體標(biāo)記基因產(chǎn)生(Klaus等，2004，NatureBiotechnology22(2)，225-229)。遺傳修飾的植物細(xì)胞能夠通過(guò)技術(shù)人員熟悉的所有方法再生。合適的方法可見(jiàn)于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者H6fgen和Willmitzer的出版物。DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，可例如使用Southern分析評(píng)價(jià)推定的轉(zhuǎn)化植物中目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組組成。可選的或另外的，可使用Northern和/或Western分析監(jiān)控新引入DNA的表達(dá)水平，兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的?？赏ㄟ^(guò)多種方法繁殖產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物，如通過(guò)克隆繁殖或經(jīng)典育種沖支術(shù)。例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化植物可以自交產(chǎn)生純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，并且T2植物可通過(guò)傳統(tǒng)的育種技術(shù)進(jìn)一步繁殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物可以是多種形式的。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆的轉(zhuǎn)化體(例如，所有被轉(zhuǎn)化以含有表達(dá)盒的細(xì)胞)；轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化組織的嫁接體(例如，在植物中，嫁接到未轉(zhuǎn)化的接穗中的轉(zhuǎn)化的根莖)。本發(fā)明顯然延及由本文描述的任何方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖體。本發(fā)明還延及包括由任何上述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、組織、器官或整^^物的后代，唯一的要求是本發(fā)明還包括含有分離的植物CDK核酸或其變體的宿主細(xì)胞，所述核酸或其變體編碼包含本文所公開(kāi)的特征的CDK。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。本發(fā)明還g本發(fā)明植物的可收獲部分，例如但不限于種子、葉、果實(shí)、花、莖、根莖、塊莖和鱗莖。本發(fā)明另外涉及來(lái)源于，優(yōu)選直接來(lái)源于此類植物的可收獲部分的產(chǎn)物，如干的顆?；蚍?、油、脂肪和脂肪酸、淀粉和蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括在CDK基因和其編碼的蛋白質(zhì)對(duì)于改良植物生長(zhǎng)特性的用途，這類改良的生長(zhǎng)特性如以上所定義。本發(fā)明還包括CDK核酸或其變體的用途，以及CDK多肽或其同源物的用途，該CDK或同源物包含本文公開(kāi)的(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE、ATP結(jié)合和活性部位基序，或該CDK核酸或變體編碼這類蛋白質(zhì)。此類的用途之一涉及改良植物的生長(zhǎng)特性，具體而言改良產(chǎn)量，特別是種子產(chǎn)量。種子產(chǎn)量可以包括下列一種或多種增加的種子總數(shù)、增加的飽滿種子數(shù)、增加的種子重量、增加的收獲指數(shù)等。CDK核酸或其變體，或CDK多肽或其同源物可以用在育種方案中，其中鑒定了與CDK基因或其變體遺傳連鎖的DNA標(biāo)記。CDK或其變體，或CDK或其同源物可以用來(lái)定義分子標(biāo)記。隨后可以將此DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記用在育種方案中以選擇具有改良的生長(zhǎng)特性的植物。CDK基因或其變體可以是，例如由序列表中所示的核酸，優(yōu)選SEQIDNO:45、47、49、51、53或55所示的核酸，或編碼任意本文所定義的同源物的核酸。還發(fā)現(xiàn)CDK的等位變體可以用于標(biāo)記輔助的育種方案中。此類育種方案有時(shí)需要通過(guò)植物的誘變處理，例如使用EMS誘變引入等位變異；可選的，該方案可以從收集無(wú)意產(chǎn)生的所謂"天然"來(lái)源的等位變體開(kāi)始。之后通過(guò)例如PCR進(jìn)行等位變體的鑒定。接著是選擇步驟，用于選擇所討論序列的優(yōu)良等位變體，其在植物中產(chǎn)生改良的生長(zhǎng)特性。通常通過(guò)監(jiān)控含有所討論序列的不同等位變體(例如SEQIDNO:45、47、49、51、53或55的不同等位變體，或編碼任意上述同源物的核酸的不同等位變體)的植物的生長(zhǎng)特性來(lái)進(jìn)行選擇。監(jiān)控生長(zhǎng)特性可以在溫室或野外進(jìn)行。此外可選的步驟包括使其中已鑒定優(yōu)良等位變體的植物與另一植物雜交。例如，這可用于產(chǎn)生目標(biāo)表型特征的組合。還可使用本發(fā)明的CDK核酸或其變體作為探針對(duì)其為部分的基因進(jìn)行遺傳和物理作圖，以及作為那些基因有關(guān)性狀的標(biāo)志。此類信息可用于植物育種，以開(kāi)發(fā)具有期望表型的林系。CDK核酸或其變體的此類用途僅需要長(zhǎng)度至少為15個(gè)核苷酸的核酸序列。CDK核酸或其變體可用作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記。可使用CDK核酸或其變體探測(cè)限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡。然后可以使用計(jì)算機(jī)程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics1:174-181)對(duì)所得的帶型進(jìn)行遺傳分析，以構(gòu)建遺傳圖譜。此外，該核酸可用于探測(cè)含有限制性核酸內(nèi)切酶處理的基因組DNA的Southern印跡，所述基因組DNA來(lái)自代表親本和確定的遺傳雜交后代的一組個(gè)體。記錄DNA多態(tài)性的分離，并用來(lái)計(jì)算CDK核酸或其變體在先前使用該群體獲得的遺傳圖譜中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。在遺傳作圖中植物基因來(lái)源的探針的生產(chǎn)和用途在Bernatzky和Tanksley(Geneticsll2，幼7-898，l卵0中有描述。眾多出版物描述了使用上述方法或其變通形式對(duì)特定的cDNA克隆進(jìn)行遺傳作圖。例如，可使用F2雜交群體、回交群體、隨機(jī)交配群體、近等基因系及其他的個(gè)體組作圖。這類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。核酸探41"也可用于物理作圖(即將序列置于物理圖上；參見(jiàn)Hoheisel等人，在Non-mammalianGenomicAnalysis:APracticalGuide,Academicpress1996，第319-346頁(yè)，以及其中引用的參考文獻(xiàn))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針可用于直接熒光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154)。雖然現(xiàn)在的FISH作圖方法偏向于使用大的克隆(幾kb到幾百kb;參見(jiàn)Laan等人(1995)GenomeRes.5:13-20)，但是靈敏度的提高允許使用較短的探針進(jìn)行FISH作圖?？梢允褂煤怂徇M(jìn)行多種基于核酸擴(kuò)增方法的遺傳和物理作圖。實(shí)例包括等位基因特異性擴(kuò)增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR擴(kuò)增片段的多態(tài)性(CAPS;Sheffield等人(1993)Genomics16，325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等人(1988)Science241:1077-1080)、核苷酸延伸反應(yīng)(Sokolov(1990)NucleicAcidRes.18:3671)、放射雜交作圖(Walter等人(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作圖(Dear和Cook(1989)NucleicAcidRes.17:6795-6807)。為實(shí)施這些方法，使用核酸序列設(shè)計(jì)和生產(chǎn)引物對(duì)用于擴(kuò)增反應(yīng)或引物延伸反應(yīng)。此類引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在使用基于PCR的遺傳作圖方法中，需要鑒定在對(duì)應(yīng)于此核酸序列的區(qū)域之上作圖的親代之間的DNA序列差異。但是這對(duì)作圖方法通常不是必要的。可以以此方式產(chǎn)生、鑒定和/或分離具有改變的依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶活性、呈現(xiàn)改良的生長(zhǎng)特性的改良植物。本發(fā)明的CDK核酸或其變體，或CDK多肽或其同源物還可以用作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。由于已經(jīng)表明這些分子可用于改良植物的生長(zhǎng)特性，它們也是有用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，如除草劑或生長(zhǎng)刺激物。本發(fā)明因此提供了用作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組合物，其包含CDK或其變體，或CDK多肽或其同源物，連同合適的載體、稀釋劑或賦形劑，所述CDK或同源物包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE、ATP結(jié)合和活性部位基序，或該CDK或變體編碼這樣的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生如上所述的具有改良生長(zhǎng)特性的植物。這些有利的生長(zhǎng)特性也可與其他經(jīng)濟(jì)學(xué)上有利的性狀組合，如進(jìn)一步增加產(chǎn)量的性狀、對(duì)各種脅迫的耐受性、修飾各種結(jié)構(gòu)特征和/或生化和/或生理學(xué)特征的性狀。本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下附圖進(jìn)行描述，其中圖l顯示了載體EG073qcz，其也描述于序列表中的SEQIDNO:57。圖2顯示了載體EG065qcz，其也描述于序列表中的SEQIDNO:58。圖3顯示了載體pMME0607，其也描述于序列表中的SEQIDNO:59。圖4顯示了栽體序列EG073qcz、EG065qcz和pMME0607，其也描述于序列表中的SEQIDNO:57至59。實(shí)施例現(xiàn)在將參考以下實(shí)施例描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅意在說(shuō)明。DNA操作除非另外說(shuō)明，重組DNA技術(shù)按照(Sambrook(2001)MolecularCloning:alaboratorymanual,第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,CSH,NewYork)或Ausubd等人(1994)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols的巻1和2(http:〃www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。植物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法描述于R.D.DCroy的PlantMolecularBiologyLabfax(1993)，由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications(UK)出版。實(shí)施例l:基因克隆SEQIDNO:45可4吏用已知的成熟方法，克隆入質(zhì)粒pBR322(Sutcliffe，J.G.(1979)Proc.NatlAcad.Sci.美國(guó)，75:3737-3741)、pACYC177(Change&Cohen(1978)J.Bacteriol.134:1141-1156)、pBS系列的質(zhì)粒(pBSSK+,pBSSK-等；Stratagene，LaJolla,美國(guó))，或黏粒，^口SuperCosl(Stratagene，LaJolla，美國(guó))或Lorist6(Gibson,T.J.60Rosenthal,A.和Waterson，R.H.(1987)Gene53:283-286)，以在大腸桿菌中表達(dá)(參見(jiàn)，例如Sambrook，J.等人(1989)"MolecularCloning:ALaboratoryManual".ColdSpringHarborLaboratoryPress,或Ausubel，F(xiàn).M.等人(1994)"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley&Sons)。實(shí)施例2:DNA測(cè)序以及計(jì)算機(jī)化功能分析通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，特別是鏈測(cè)定方法，使用ABI377測(cè)序儀測(cè)序DNA(參見(jiàn)，例如Fleischman，R.D.等人(1995)"Whole-genomeRandomSequencingandAssemblyofHaemophilusInfluenzaeRd.，Science269;496-512)"。實(shí)施例3:不同微生物(例如大腸桿菌(Escherichiacoli)和根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens))間DNA轉(zhuǎn)移本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到允許核#列在不同微生物之間轉(zhuǎn)移的穿梭載體，例如pYE22m、pPAC畫(huà)ResQ、pClasper、pAUR224、pAMH10、pAML10、pAMT10、pAMU10、pGMH10、pGML10、pGMT10、pGMU10、pPGALl、pPADHl、pTADHl、pTAex3、pNGA142、pHT3101及其衍生物。SoniR.和MurrayJ.A.H.[NucleicAcidResearch,第20巻，第21期，1992:5852]公開(kāi)了分離此類穿梭載體的簡(jiǎn)單方法如果需要，此類穿梭載體可以使用用于大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)載體(Sambrook，J.等人，(1989)，"MolecularCloning:ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratoryPress，或Ausubel,F.M.等人(1994)"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley&Sons)和/或前述載體構(gòu)建，所述載體具有用于大腸桿菌或根瘤農(nóng)桿菌的復(fù)制起點(diǎn)，以及加入的來(lái)自大腸桿菌或根瘤農(nóng)桿菌的合適標(biāo)記。此類復(fù)制起點(diǎn)優(yōu)選來(lái)自內(nèi)源性質(zhì)粒，所述內(nèi)源性質(zhì)粒分離自用于制備本發(fā)明中所用的植物的物種。用于這些物種作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記的具體基因是卡那霉素抗性基因(例如來(lái)自Tn5或Tn力03轉(zhuǎn)座子的那些)或氯霉素抗性基因(Winnacker，E丄.(1987)"FromGenestoClones-IntroductiontoGeneTechnology,VCH，Weinheim)，或其他抗生素抗性基因，例如G418抗性、慶大霉素抗性、新霉素抗性、潮霉素抗性或四環(huán)素抗性。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，可以將目的基因克隆進(jìn)入上述穿梭載體之一。并將此類雜交載體導(dǎo)入本發(fā)明方法所用的微生物菌抹中。實(shí)施例4:測(cè)定突變/轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)的表達(dá)基于突變或轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)以類似的方式和量表達(dá)的事實(shí)，進(jìn)行突變或轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的活性觀察。通過(guò)Northern印記進(jìn)行測(cè)定突變基因或轉(zhuǎn)基因(可用于基因產(chǎn)物的翻譯的mRNA量的標(biāo)記)轉(zhuǎn)化的量的合適方法(參見(jiàn)，例如，Ausubd等人，(1988)CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley:NewYork)，其中引物以這種方式設(shè)計(jì)，所述方式是引物與提供了可檢測(cè)標(biāo)記(通常是放射性標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記)的目的基因結(jié)合，這樣當(dāng)提取生物培養(yǎng)物的總RNA、在凝膠上分離、應(yīng)用到穩(wěn)定的基質(zhì)和用該探針溫育時(shí)，探針的結(jié)合和結(jié)合的量指示該基因mRNA的存在及其量。另一方法是定量PCR。該信息檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄的程度。細(xì)胞總RNA可例如從酵母或大腸桿菌中通過(guò)多種方法分離，所述方法是本領(lǐng)域已知的，例如根據(jù)制造商的指示使用Ambion試劑盒或如Edgington等人,PromegaNotesMagazineNumber41，1993，第14頁(yè)中所述。使用諸如Western印記的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定從該mRNA翻譯的蛋白質(zhì)的存在或相對(duì)量(參見(jiàn)，例如，Ausubel等人(1988)"CurrentProtocolsinMolecularBiology",Wiley,NewYork)。在該方法中，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)、通過(guò)凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)移到如硝酸纖維素的基質(zhì)上，以及與和目的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的探針(例如抗體)溫育。該探針通常直接或間接提供易檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或顯色(colorimetric)標(biāo)記。標(biāo)記的存在和觀察到的量指示細(xì)胞中尋找的突變蛋白質(zhì)的存在和量。但是其他方法也是已知的。實(shí)施例5:遺傳修飾微生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件諸如大腸桿菌的遺傳修飾微生物可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合成或天然生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。諸如大腸桿菌的孩i生物用的大量不同生長(zhǎng)培養(yǎng)基是眾所周知、方便可及的。實(shí)施例6:轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌使用熱休克或電穿孔方案可將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入根瘤農(nóng)桿菌(GV3101pMP90;Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204:383-396)。轉(zhuǎn)化的菌落可在YEP培養(yǎng)基上以28。C生長(zhǎng)2天，并用相應(yīng)的抗生素(Rif/Gent/Km)選擇。這些農(nóng)桿菌培養(yǎng)物用于植物轉(zhuǎn)化。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化擬南芥Bechtold1993(Bechtold,N.，Ellis,J.，Pelletier,G.1993.InplantaAgrobacteriummediatedgenetransferbyinfiltrationofArabidopsisthalianaplantsC.R.Acad.Sci.Paris.316:1194-1199);Bent等人，1994(Bent,A"Kunkel，B.N"Dahlbeck，D.，Brown,K丄.，Schmidt,R.，Giraudat,J"Leung,J.和Staskawicz，B.J.1994;PPCS2ofArabidopsisthaliana:Aleucin-richrepeatclassofplantdiseaseresistantgenesScience265:1856-1860)。轉(zhuǎn)基因擬南芥植物可在York生長(zhǎng)室中分別培養(yǎng)于罐中，所述罐含有4:1(v/v)混合的土和石英砂。標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)M是16小時(shí)明8小時(shí)暗的光周期、20°C、60%相對(duì)濕度和150pE的光通量密度。為了誘導(dǎo)萌發(fā)，播種的種子黑暗中至于4。C3天。植物每天澆水直至它們大約3周齡，此時(shí)通過(guò)限制7JC施于干旱。同時(shí)，相對(duì)濕度以隔天10%的增量降低至20%。在所述條件下檢測(cè)植物改良的生長(zhǎng)。通常將所述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次連續(xù)的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)是有益的。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，待檢測(cè)的每個(gè)基因播種10林獨(dú)立的T2林系。確定未顯示可見(jiàn)的損傷癥狀的植物的百分?jǐn)?shù)。然后在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中以相同的實(shí)驗(yàn)方法確認(rèn)陽(yáng)性林系。之后在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中重復(fù)確i/^現(xiàn)出改良的生長(zhǎng)的最佳林系的至少7個(gè)重復(fù)。在另一實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于各主要林系，再次測(cè)定得自不同的轉(zhuǎn)化事件但是含有相同基因構(gòu)建體的其他林系?？偨Y(jié)并分析所有結(jié)果。實(shí)施例6:栽體構(gòu)建和稻轉(zhuǎn)化在稻中表達(dá)諸如在圖1-4中所示的，含有表達(dá)盒SEQIDNO:60的載體是有益的。序列表中所示的SEQIDNO:1可轉(zhuǎn)入所述載體。所述載體可轉(zhuǎn)化iiX農(nóng)桿菌菌林LBA4404，隨后轉(zhuǎn)化i^稻植林。使轉(zhuǎn)化的稻植林生長(zhǎng)，然后檢測(cè)實(shí)施例7中描述的參數(shù)。實(shí)施例7:轉(zhuǎn)化體的評(píng)估生長(zhǎng)測(cè)量一般產(chǎn)生大約15到20個(gè)獨(dú)立的TO轉(zhuǎn)化體。將初級(jí)轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移到溫室中生長(zhǎng)，并收獲T1種子。4個(gè)事件得以保留，其中T1后代發(fā)生3:1的轉(zhuǎn)基因存在/缺乏分離。對(duì)于這些事件中的每一個(gè)，通過(guò)可視標(biāo)記篩選10個(gè)包含轉(zhuǎn)基因的Tl幼苗(雜合子和純合子)，以及10個(gè)缺乏轉(zhuǎn)基因的Tl幼苗(失效合子)。將選擇的Tl植物轉(zhuǎn)移到溫室中。每個(gè)植物具有一個(gè)唯一的條形碼標(biāo)簽以將表型數(shù)據(jù)與對(duì)應(yīng)植物明確聯(lián)系起來(lái)。所選擇的Tl植物在10cm直徑花盆的土壤中在下列環(huán)境狀態(tài)下生長(zhǎng)光周期=11.5小時(shí)、日光強(qiáng)度-30,000勒克斯或更多、日間溫度-28'C或更高、夜間溫度-22。C、相對(duì)濕度=60-70%。轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)的失效合子在隨機(jī)位置上并排生長(zhǎng)。從播種期到成熟期，使植物幾次通過(guò)數(shù)字成像箱。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上從至少6個(gè)不同的角度取得每a物的數(shù)字圖像(加48xl536像素，一千六百萬(wàn)色)。收獲成熟的初級(jí)圓錐花序、裝袋并貼上條碼標(biāo)簽，然后在37t:烤箱中干燥三天。隨后將圓錐花序脫粒并且收集所有的種子。使用鼓風(fēng)裝置將飽滿外殼和空外殼分開(kāi)。在分離后，使用可商購(gòu)的計(jì)數(shù)器對(duì)兩批種子進(jìn)行計(jì)數(shù)。棄去空外殼。在分析天平上稱重飽滿的外殼并且使用數(shù)字成像測(cè)量種子的截面積。此方法得到下述一組種子相關(guān)參數(shù)。這些*是4吏用圖像分析軟件以自動(dòng)方式從數(shù)字圖像中得到，并且進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。雙因素ANOVA(方差分析)修正不平衡設(shè)計(jì)并用作統(tǒng)計(jì)模型用于植物表型特征的全面評(píng)估。對(duì)用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的所有植林全部事件的所有測(cè)量M進(jìn)行F測(cè)驗(yàn)。進(jìn)行F檢驗(yàn)以檢查基因?qū)λ修D(zhuǎn)化事件的效應(yīng)，并檢驗(yàn)基因的總效應(yīng)，亦稱之為整體基因效應(yīng)。如果F檢驗(yàn)的值顯示數(shù)據(jù)具有顯著性，則結(jié)論是有"基因"效應(yīng)，意味著不僅基因的存在或定位引起了效應(yīng)。真實(shí)整體基因效應(yīng)的顯著性閾值設(shè)置為F測(cè)驗(yàn)的5°/。概率水平。為了檢查基因在事件中的效應(yīng)，即抹系特異性效應(yīng)，在每一事件中使用來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)無(wú)效植物的數(shù)據(jù)組進(jìn)行t檢驗(yàn)。"無(wú)效植物，，或"無(wú)效分離子"或"無(wú)效合子"是與轉(zhuǎn)基因植物以相同方式處理，但是轉(zhuǎn)基因已經(jīng)與其分離的植物。也可以將無(wú)效植物描述為純合的陰性轉(zhuǎn)化植物。將t^r驗(yàn)顯著性的閾值設(shè)定為10%概率水平。一些事件的結(jié)果可以高于此閾值或低于此閾值。這;L^于這種假設(shè)，即基因可以僅在基因組中的某些位置中具有效應(yīng)，并且這一位置依賴性效應(yīng)的發(fā)生并非罕見(jiàn)。本文中此類基因效應(yīng)也稱為"基因的林系效應(yīng)"。通過(guò)比較t值和t分布得到p值，或者備選的，通過(guò)比較F值和F分布得到p值。p值給出了無(wú)效假設(shè)(即沒(méi)有轉(zhuǎn)基因效應(yīng))為正確的概率。將在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中得到的數(shù)據(jù)使用T2植物在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)。選擇3個(gè)林系進(jìn)一步分析。通過(guò)監(jiān)控標(biāo)記基因表達(dá)來(lái)篩選Tl中來(lái)自陽(yáng)性植物(雜合子和純合子)的一批種子。對(duì)于每一個(gè)選擇的事件，隨后保存幾批雜合種子用于T2評(píng)估。在每批種子中，在溫室中種植等量的陽(yáng)性和陰性植物用于評(píng)估。在T2代中評(píng)估總數(shù)為120個(gè)的轉(zhuǎn)化植物，即每個(gè)事件有40個(gè)植物，其中有20個(gè)為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性且20個(gè)為陰性。由于進(jìn)行了具有重疊事件的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行組合分析。這可用于檢查兩個(gè)實(shí)驗(yàn)效應(yīng)的一致性，并且如果在這種情形下，可用于從兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中收集證據(jù)從而增加結(jié)論的可信性。使用的方法是考慮到數(shù)據(jù)的多級(jí)結(jié)構(gòu)(即實(shí)驗(yàn)_事件_分離子)的混合模型方法。通過(guò)比較卡方分布的似然比測(cè)定得到p值。實(shí)施例8:轉(zhuǎn)化體的評(píng)估產(chǎn)量有關(guān)參數(shù)的測(cè)量當(dāng)對(duì)上述種子進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)明人能夠發(fā)現(xiàn)用編碼具有本文所述的基序的CDK的CDK基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物比缺乏CDK轉(zhuǎn)基因的植物具有增加的飽滿種子數(shù)、增加的種子總重量和增加的收獲指數(shù)。在T2代中再次得到在Tl代植物中所得的陽(yáng)性結(jié)果。在與Tl代結(jié)果的組合分析中重新評(píng)估這些T2數(shù)據(jù)，并且得到的p值表明觀察到的效應(yīng)具有顯著性。飽滿種子數(shù)通過(guò)計(jì)算分離步驟后保留的飽滿外殼數(shù)確定飽滿種子數(shù)。通常4個(gè)測(cè)試林系中的3個(gè)顯示飽滿種子數(shù)的顯著增加。種子總產(chǎn)量通過(guò)對(duì)從植物收獲的所有飽滿外殼稱重測(cè)量每林植物的種子總產(chǎn)量(種子總重量)。通常4個(gè)轉(zhuǎn)基因Tl林系中的3個(gè)顯示種子總重量的增加。收獲指數(shù)本發(fā)明中的收獲指數(shù)在本文中定義為種子總產(chǎn)量與地上面積(mm"之間的比率，乘以因子106。所有測(cè)試的林系顯示增加的收獲指數(shù)。此外，有種子總數(shù)增加的總體趨勢(shì)。實(shí)施例9:用于生物分析(bioanalyticalanalyse)的植物培養(yǎng)物為了生物分析轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物如上培養(yǎng)。實(shí)施例10:轉(zhuǎn)化植物的代謝分析根據(jù)本發(fā)明確定的修飾通過(guò)如下方法進(jìn)行測(cè)定。a)勻漿樣品使用球磨機(jī)(Retsch)進(jìn)行樣品的均漿。將10至30顆稻粒移至塑料管(Eppendorf，Safe-Lock,2mL)中，在液氮冷卻條件下，用不銹鋼球進(jìn)行勻漿。b)凍干在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，小心將樣品保持在深度冷凍狀態(tài)(溫度《40X:),或者直到首次與溶劑接觸之前，通過(guò)凍干勻漿材料使之不含水分。將樣品轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的(-40n)冷凍干燥器中。主要干燥階段的初始溫度為-35。C，而壓力為0.120mbar。在干燥階段，按照壓力和溫度程序來(lái)改變參數(shù)。12小時(shí)后的最終溫度為+30。C，而最終壓力為0.001至0.004mbar。在關(guān)閉真空泵和冷卻機(jī)器之后，向系統(tǒng)中沖入空氣(經(jīng)干燥管干燥)或氬。c)萃取在向凍干設(shè)備中充氣后，即刻牢固密封裝有凍干植物材料的管，以保護(hù)材料免受空氣濕度的影響。為進(jìn)行萃取，在玻璃纖維萃取套管中稱重部分(50mg)干燥的勻漿化植物材料，并轉(zhuǎn)移至ASE裝置(快速溶劑萃取儀ASE200,配有溶劑控制器和AutoASE軟件(DIONEX))的5ml萃取柱中。向ASE裝置(快速溶劑萃取儀ASE200，配有溶劑控制器和AutoASE軟件(DIONEX))的24個(gè)樣品點(diǎn)填充植物材料，包括一些測(cè)試質(zhì)量控制的樣口P口o用大約10ml甲醇/水(80/20，v/v)于T=70匸和p=140bar下，以5分鐘的加熱階段，1分鐘的靜態(tài)萃取來(lái)萃ML性物質(zhì)。用大約10ml甲醇/二氯甲烷(40/60，Wv)于T=70匸和p=140bar下，以5分鐘的加熱階段，1分鐘的靜態(tài)萃取來(lái)萃取更為親脂性的物質(zhì)。在相同的玻璃管(離心管，50ml，配有螺帽和可穿透的隔膜，以用于ASE(DIONEX))中萃取兩種溶劑混合物。酸43、精氨酸—(13C)、色氨酸-ds、a-甲基吡喃葡糖苷十九烷酸甲酯、十一烷酸甲酯、十三烷酸甲酯、十五烷酸甲酯和二十九烷酸甲酯處理溶液。將總萃取物與8ml水混合。棄去植物樣品固體殘留物和萃取套管。振蕩萃取物，然后以至少1400g離心5至10分鐘，以加速相分離。取1ml上清甲醇/水相("極性相"，無(wú)色)進(jìn)行進(jìn)一步GC分析，并取1ml進(jìn)行LC分析。棄去剩余的甲醇/水相。取0.75ml有機(jī)相("脂質(zhì)相"，深綠色)進(jìn)行進(jìn)一步的GC分析，并取0.75ml進(jìn)行LC分析。所有移除的級(jí)分經(jīng)IRDancer紅外真空干燥機(jī)(Hettich)蒸發(fā)干燥。蒸發(fā)過(guò)程中最高溫度不超過(guò)40X:。設(shè)備中的壓力為不超過(guò)10mbar。d)處理脂質(zhì)相和極性相以進(jìn)行LC/MS或LC/MS/MS分析將經(jīng)蒸發(fā)干燥的脂質(zhì)萃取物吸收于流動(dòng)相。將經(jīng)蒸發(fā)干燥的極性萃取物吸收于流動(dòng)相。e)LC-MS分析LC部分在可由AgilentTechnologies,美國(guó)商購(gòu)的LCMS系統(tǒng)中進(jìn)行。將10pi極性萃取物以200jil/min的流速注入系統(tǒng)。色譜期間分離柱(反相C18)維持在15"C。對(duì)于脂質(zhì)相萃取物，將5fil以200jil/min的流速注入系統(tǒng)。分離柱(反相C18)維持在30"C。以梯度洗脫進(jìn)行HPLC。質(zhì)傳分析在配有turbo噴霧離子源的AppliedBiosystemsAPI訓(xùn)00三級(jí)四極儀器中進(jìn)行。對(duì)于極性萃取物，儀器以負(fù)離子模式通過(guò)全掃描模式在100-1000amu測(cè)量。對(duì)于脂質(zhì)相萃取物，儀器以正離子模式通過(guò)全掃描模式在100-1000amu測(cè)量。f)衍生脂質(zhì)相以進(jìn)行GC/MS分析為了進(jìn)行曱醇分解轉(zhuǎn)移作用(transmethanolysis)，向蒸發(fā)干燥的萃取物中添加140pi氯仿、37pl鹽酸(以重量計(jì)37%的HC1水溶液)、3加甲醇和20pl甲苯的混合物。牢固密封容器，并于100。C加熱2小時(shí)，同時(shí)振蕩。隨后對(duì)溶液進(jìn)行蒸發(fā)至干。殘留物徹底干燥。通過(guò)與甲氧胺鹽酸鹽(5mg/ml吡啶溶液，100fil于60C進(jìn)行1.5小時(shí))在牢固密封的容器中反應(yīng)來(lái)進(jìn)行羰基的甲氧化作用。加入20^奇數(shù)碳的直鏈脂肪酸溶液(7至25碳原子的脂肪酸各0.3mg/mL而27、29和31碳原子的脂肪酸各0.6mg/mL的3/7(v/v)吡勿甲苯溶液)作為時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)。最后，還是在牢固密封的容器中于60。C用100plN-甲基-N-(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)衍生30分鐘。注入GC之前的終體積為220pl。g)衍生極性相以進(jìn)行GC/MS分析通過(guò)與甲氧胺鹽酸鹽(5mg/ml吡啶溶液，50jtl于60。C進(jìn)行1.5小時(shí))在牢固密封的容器中反應(yīng)來(lái)進(jìn)行羰基的甲氧化作用。加入IOnl奇數(shù)碳的直鏈脂肪酸溶液(7至25碳原子的脂肪酸各0.3mg/mL而27、29和31碳原子的脂肪酸各0.6mg/mL的3/7(v/v)吡力甲苯溶液)作為時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)。最后，還是在牢固密封的容器中于60"C用50plN-甲基-N-(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)衍生30分鐘。注入GC之前的終體積為110pl。h)GC-MS分析GC-MS系統(tǒng)包括與Agilent5973MSD偶聯(lián)的Agilent6890GC。自動(dòng)取樣器為來(lái)自CTC的CompiPal或GCPal。為進(jìn)行分析，根據(jù)待分析的樣品材料和相分離步驟級(jí)分的不同，采用一般市售的毛細(xì)管分離柱(30mx0.25mmx0.25pm)，使用含0%至35%芳香族部分的具有不同聚甲^氧烷的固定相(例如DB-lms、HP畫(huà)5ms、DB-XLB、DB-35ms、AgilentTechnolo-gies)。才艮據(jù)樣品材料和相分離步驟級(jí)分的不同，采用不同的加熱速率，烘箱溫度程序始于70。C終于340'C梯度，以不分流(splitless)模式注射多達(dá)1HL的終體積，以實(shí)現(xiàn)充分的色譜分離以及各分析物峰內(nèi)的多次掃描。使用平常的GC-MS標(biāo)準(zhǔn)條件，例如恒速額定的l至l.7ml/min,并以氦作為流動(dòng)相。通過(guò)在70eV電子撞擊進(jìn)行離子化，m/z掃描范圍為15至600，掃描速率為2.5至3次掃描/秒，標(biāo)準(zhǔn)頻率條件。i)多種植物樣品的分析分別對(duì)20個(gè)植物樣品的獨(dú)立系列進(jìn)行樣品測(cè)量(也稱為順序)。實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)順序含有至少3個(gè)重復(fù)的各轉(zhuǎn)基因林系，外加至少3林相應(yīng)的無(wú)效分離林系作為對(duì)照。各分析物的峰面積調(diào)整為確立的植物干重面積(標(biāo)準(zhǔn)化面積)。通過(guò)相對(duì)于對(duì)照進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)計(jì)算比值。實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)用標(biāo)準(zhǔn)化面積除以同順序中對(duì)照組相應(yīng)數(shù)據(jù)的均值來(lái)計(jì)算比值。所獲得的數(shù)值稱為對(duì)照比(ratio一by_control)。這些數(shù)值在順序間是可比較的，并表明突變體中的分析物濃度與對(duì)照組有多大差異，對(duì)照組為給定順序中相應(yīng)無(wú)效分離林系的植物。合適的對(duì)照在證明載體和轉(zhuǎn)化方法本身對(duì)于植物的代謝組成沒(méi)有顯著的影響之前預(yù)先選定。因此，與對(duì)照組相比記錄的變化無(wú)疑是由突變引起的。不同植物分析的結(jié)果示于下表3:分析含有本文^^開(kāi)的CDK蛋白質(zhì)的編碼基因的稻植物的種子。表3:稻植物中CDK蛋白質(zhì)代謝分析的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>第l欄顯示了所分析的代謝物。第2和3欄顯示了轉(zhuǎn)基因植物與對(duì)照林系比40C現(xiàn)的所分析代謝物的增長(zhǎng)范圍。第4欄顯示了分析方法。權(quán)利要求1.相對(duì)于相應(yīng)的對(duì)照植物，改良植物生長(zhǎng)特性的方法，其包括以下步驟(a)在植物中導(dǎo)入至少一種選擇以下的核酸序列，所述核酸序列編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶i)分離的核酸分子，如SEQIDNO45、47、49、51、53或55所示；ii)分離的核酸分子，其編碼如SEQIDNO46、48、50、52、54或56所示的氨基酸序列；iii)分離的核酸分子，作為遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，其序列能夠根據(jù)如SEQIDNO46、48、50、52、54或56所示的多肽序列推導(dǎo)出來(lái)；iv)分離的核酸分子，其編碼的多肽與(i)至(iii)的核酸分子所編碼的多肽的氨基酸序列具有至少80％的同一性；v)分離的核酸分子，其編碼如SEQIDNO46、48、50、52、54或56所示的氨基酸分子的同源物、衍生物或活性片段，所述同源物、衍生物或活性片段為植物來(lái)源，且有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序；vi)編碼蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，所述蛋白質(zhì)包含選自以下的氨基酸序列aa)(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE；ab)(V/F/I)(L/I)HRD(L/M)K(P/S/T)(Q/N/S/G)N(L/I)L(V/L/I)；ac)(I/L)(G/N)(E/R)G(T/A)YG(V/I)V(Y/C)(R/K/S)(A/G/S)(R/L/T/I)(D/N)(K/R/E)(V/K/A/S/T/N)T(N/S/G)(E/K/Q)(T/L/I/K)(I/V)A(L/V/I)KK；ad)LK(I/L)(C/A)DFGL(A/S)R；ae)WYRAPE(L/I)L(L/F)(C/G)；af)GCI(F/M)AE(I/L/M)；以及ag)DLL(Q/N/S/R)(K/Q/R)(L/M)(L/F)(I/T/I/C)(F/Y/L)DP(T/E/D/R/S)(K/Q)RI；vii)分離的核酸分子或其互補(bǔ)物，其能夠與上述(i)至(iii)的核酸雜交，其中所述雜交序列或其互補(bǔ)物編碼有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序的植物CDK蛋白質(zhì)；viii)根據(jù)以上(i)至(iv)中任一項(xiàng)核酸的等位變體，所述等位變體編碼植物CDK；和ix)根據(jù)(iii)至(iv)中任一項(xiàng)核酸的備選剪接變體，所述備選剪接變體編碼有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序的植物CDK蛋白質(zhì)；(b)選擇相對(duì)于相應(yīng)的對(duì)照植物具有改良的生長(zhǎng)特性的植物。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述活性的調(diào)節(jié)通過(guò)引入植物來(lái)源的編碼CDK的核酸序列實(shí)現(xiàn)。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述編碼CDK的核酸序列來(lái)自單子葉或雙子葉植物。4.權(quán)利要求l-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的核酸序列來(lái)自物種稻、歐洲蕓苔、大豆、亞麻、玉蜀黍或向日葵。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼CDK的核酸序列與調(diào)節(jié)序列有效連接。6.權(quán)利要求l-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述改良的植物生長(zhǎng)特性是相對(duì)于相應(yīng)的對(duì)照植物的增加的產(chǎn)量。7.權(quán)利要求l-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述增加的產(chǎn)量為增加的種子產(chǎn)量。8.權(quán)利要求l-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述增加的種子產(chǎn)量選自下列中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)(i)增加的種子重量；(ii)增加的種子總數(shù)；(iii)增加的飽滿種子數(shù)；(iv)增加的收獲指數(shù)。9.根據(jù)權(quán)利要求l-8中任一項(xiàng)的方法獲得的植物、植物部分或植物細(xì)胞。10.相對(duì)于相應(yīng)的對(duì)照植物，改良植物生長(zhǎng)特性的方法，其包括以下步驟(c)在植物中導(dǎo)入至少一種選擇以下的核酸序列，所述核酸序列編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶—CDK):i)分離的核酸分子，如SEQIDNO:45、47、49、51、53或55所示；ii)分離的核酸分子，其編碼如SEQIDNO:46、48、50、52、54或56所示的M,列；iii)分離的核酸分子，作為遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，其序列能夠根據(jù)如SEQIDNO:46、48、50、52、54或56所示的多肽序列推導(dǎo)出來(lái)；iv)分離的核酸分子，其編碼的多肽與(i)至(iii)的核酸分子所編碼的多肽的氨基酸序列具有至少80%的同一性；v)分離的核酸分子，其編碼如SEQIDNO:46、48、50、52、54或56所示的氨基酸分子的同源物、衍生物或活性片段，所述同源物、衍生物或活性片段為植物來(lái)源，且有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序；vi)編碼蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，所述蛋白質(zhì)包含選自以下的M餅列aa)(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE;ab)(V歴)(L/I)HRD(L/M)K(P/S/T)(Q/N/S/G)N(L/I)L(V/L/I);ac)(I/L)(G/N)(E/R)G(T/A)YG(V/I)V(Y/C)(R/K/S)(A/G/S)(R/L/T/I)(謹(jǐn))(K/R/E)(V/K/A/S/T/N)T(薩/G)(E/K/Q)(T/L/I/K)(I/V)A(L/V/I)KK;ad)LK(I/L)(C/A)DFGL(A/S)R;ae)WYRAPE(L/I)L(L/F)(C/G);af)GCI(F/M)AE(I/L/M);以及ag)DLL(Q/N/S/R)(K/Q/R)(L/M)(L/F)(I/T度)(F/Y/L)DP(T/E/D/R/S)(K/Q)RI;vii)分離的核酸分子或其互補(bǔ)物，其能夠與上述(i)至(iii)的核酸雜交，(T/S/A)(L/I)基序的植物CDK蛋白質(zhì)；viii)根據(jù)以上(i)至(iv)中任一項(xiàng)核酸的等位變體，所述等位變體編碼植物CDK;和ix)根據(jù)(iii)至(iv)中任一項(xiàng)核酸的備選剪接變體，所述備選剪接變蛋白質(zhì)；^(d)選"^相對(duì)于相應(yīng)的對(duì)照植物具有改良的生長(zhǎng)特性的植物；以及(e)在植物能夠生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培養(yǎng)所述植物。11.權(quán)利要求10的方法，其中編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的核#列來(lái)自植物。12.權(quán)利要求10或11的方法，其中所述編碼CDK的核酸序列來(lái)自單子葉或雙子葉植物。13.權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的核酸序列來(lái)自物種稻、歐洲蕓苔、大豆、亞麻、玉蜀黍或向日14.權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼CDK的核酸序列與調(diào)節(jié)序列有效連接。15.權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述改良的植物生長(zhǎng)特性是相對(duì)于相應(yīng)的對(duì)照植物的增加的產(chǎn)量。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述增加的產(chǎn)量為增加的種子產(chǎn)量。17.權(quán)利要求15或16的方法，其中所述增加的種子產(chǎn)量選自下列中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)(i)增加的種子重量；(ii)增加的種子總數(shù)；(iii)增加的飽滿種子數(shù)；(iv)增加的收獲指數(shù)。18.根據(jù)權(quán)利要求10-17中任一項(xiàng)的方法獲得的植物、植物部分或植物細(xì)胞。19，分離的核酸分子，其包含選自以下的核酸分子a)分離的核酸分子，如SEQIDNO:45、47、49、51、53或55所示；b)分離的核酸分子，其編碼如SEQIDNO:46、48、50、52、54或56所示的MM列；c)分離的核酸分子，作為遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，其序列能夠根據(jù)如SEQIDNO:46、48、50、52、54或56所示的多肽序列推導(dǎo)出來(lái)；d)分離的核酸分子，其編碼的多肽與(i)至(iii)的核酸分子所編碼的多肽的氨基^列具有至少80%的同一性；e)分離的核酸分子，其編碼如SEQIDNO:46、48、50、52、54或56所示的氨基酸分子的同源物、衍生物或活性片段，所述同源物、衍生物或活性片段為植物來(lái)源，且有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序；f)編碼蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，所述蛋白質(zhì)包含選自以下的氨基^列aa)(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE;ab)(V/F/I)(L/I)HRD(L夠K(P/S/T)(Q/N/S/G)N(L/I)L(V/L/I);ac)(I/L)(G/N)(E/R)G(T/A)YG(V/I)V(Y/C)(R/K/S)(A/G/S)(R/L/T/I)(D/N)(K/R/E)(V/K/A/S/T琴(腦/G)(E/K/Q)(T/L皿)(I/V)A(L簡(jiǎn))KK;ad)LK(I/L)(C/A)DFGL(A/S)R;ae)WYRAPE(L/I)L(L/F)(C/G);af)GCI(F/M)AE(I/L/M);以及ag)DLL(Q/N/S/R)(K/Q/R)(L/M)(L/F)(I/T/I/C)(F/Y/L)DP(T/E/D/R/S)(K/Q)RI;g)分離的核酸分子或其互補(bǔ)物，其能夠與上述(i)至(iii)的核酸雜交，(T/S/A)(L/I)基序的植物CDK蛋白質(zhì)；憑借所述核酸分子，植物具有增加的生長(zhǎng)活性。20.基因構(gòu)建體，其包含分離的核酸分子，所述分離的核酸分子具有權(quán)利要求19中所要求的核酸序列，其中所述核酸與一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)信號(hào)功能性連接。21.栽體，其包含權(quán)利要求19中所要求的核酸或權(quán)利要求20中所要求的基因構(gòu)建體。22.轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求19中所要求的核酸、權(quán)利要求20中所要求的基因構(gòu)建體或權(quán)利要求21中所要求的載體中的至少一種。23.權(quán)利要求22的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是雙子葉或單子葉植物。24.權(quán)利要求22或23的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自甘蔗、蕓莒/油菜籽油菜、大豆、稻、棉花、馬鈴薯、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥、油椰、甜菜、向日葵或高粱。25.權(quán)利要求19中所要求的核酸分子、權(quán)利要求20中所要求的基因構(gòu)建體或權(quán)利要求21中所要求的栽體在改良植物生長(zhǎng)特性，尤其是提高產(chǎn)量，特別是提高種子產(chǎn)量中的用途。全文摘要本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并且涉及改良植物生長(zhǎng)特性的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)調(diào)節(jié)編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)的植物核酸在植物中的表達(dá)和/或通過(guò)調(diào)節(jié)植物CDK蛋白質(zhì)在植物中的活性來(lái)改良植物生長(zhǎng)特性的方法，所述CDK蛋白質(zhì)包含不同的基序或所述CDK核酸編碼這類蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及具有植物CDK核酸受調(diào)節(jié)的表達(dá)和/或植物CDK蛋白質(zhì)受調(diào)節(jié)的活性的植物，所述CDK蛋白質(zhì)包含不同的序列基序或所述核酸編碼這類蛋白質(zhì)，并且該植物相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物具有改良的生長(zhǎng)特性。本發(fā)明還涉及特定核酸序列、含有所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和植物，所述核酸序列編碼具有上述植物生長(zhǎng)改良活性的上述蛋白質(zhì)。文檔編號(hào)C12N9/12GK101460611SQ200780020589公開(kāi)日2009年6月17日申請(qǐng)日期2007年5月31日優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日發(fā)明者C·達(dá)曼,S·亨克斯申請(qǐng)人:巴斯福植物科學(xué)有限公司