專利名稱：：綠膿桿菌的外膜蛋白pa0427的制作方法
技術領域：
：本發明涉及衍生自綠膿桿菌外膜蛋白PA0427的蛋白質抗原或肽抗原和針對該抗原的抗體。本發明也涉及包含該抗原的疫苗組合物。本發明還涉及包含所述抗體的藥物組合物、用于綠膿桿菌感染的診斷劑和用于檢測綠膿桿菌的試劑盒。
背景技術：
：綠膿桿菌(銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeruginosa))是廣泛分布于自然環境例如土壤和水中的革蘭氏陰性桿菌，引起抵抗治療的嚴重致命感染。綠膿桿菌的主要感染對象是通常稱作易感染性宿主的、宿主防御功能減弱的易感患者，包括燒傷、器官移植和癌癥患者。綠膿桿菌是院內感染的主要病原菌。此外，由這種細菌引起的肺部感染對嚢性纖維化患者是致命的。對這些患者主要施用具有抗綠膿桿菌活性的抗菌劑，而眾多病例則因綠膿桿菌耐藥性而未能獲得充分的治療效果。另外，也已經長時間地研究針對綠膿桿菌的疫苗或抗體。然而，直接使用該細菌滅活形式的方法具有缺點，即必須根據綠膿桿菌的不同血清型制備不同類型的疫苗或抗體。在這種情況下，期待利用具有綠膿桿菌菌林間共同氨基酸序列的綠膿桿菌蛋白的被動免疫或主動免疫來預防或治療綠膿桿菌感染。例如，已知其中外膜蛋白OprF和Oprl的部分相互融合的重組蛋白(日本特開第245699/1996號公報)和IV型菌毛蛋白(WO2004/099250)作為此種綠膿桿菌蛋白應用于疫苗的情形。另外，已經報道抗IV型菌毛蛋白抗體(W02004/099250)、抗PA1706(或PcrV)抗體(美國專利號6309561和6827935)等作為靶向綠膿桿菌蛋白的抗體藥物。然而，在顯示多樣血清型的綠膿桿菌臨床分離林間共同擁有的細菌蛋白可以作為"綠膿桿菌共同抗原，，應用于預防、診斷或治療綠膿桿菌感染，并且因此一直是需要的。已經報道由PA0427(或oprM)基因編碼的PA0427(也稱作OprM)蛋白是構成作為綠膿桿菌細胞密度感受的信號分子的高絲氨酸內酯的分泌裝置的外膜蛋白，并且作為構成用于排出四環素、氯霉素、喹諾酮(quinolone)和P-內酰胺抗生素的多組分生物異源物質排出泵的外膜蛋白，還直接參與針對這些抗生素的耐藥性(JournalofBacteriology,1998,180，5443-5447和AntimicrobialAgentsandChemotherapy,1995，39，1948-1953)。此外，已經對該蛋白質的三維結構實施了X射線晶體結構分析，顯示具有四個跨外膜區的三維結構(JournalofBiologicalChemistry,2004，279，52816-52819)。另一方面，也已經報道在動物實驗中與野生菌抹相比，在編碼含有該蛋白質的生物異源物質排出泵的mexA-mexB-oprM操縱子缺損的綠膿桿菌中病原性顯著降低，而在僅PA0427基因缺損的變體中病原性不降低(JournalofExperimentalMedicine,2002，196，109-118)。還報道(FEMSMicrobiologyLetters,1994，122,267-274)。然而，靶向PA0427蛋白的抗綠膿桿菌藥物是未知的。另外，使用該蛋白質作為疫苗組分和使用由其產生的抗體組合物作為用于綠膿桿菌感染的治療劑或診斷劑是未知的。發明簡述本發明人已經嘗試從綠膿桿菌外膜蛋白中鑒定新的和有用的"綠膿桿菌共同抗原"。在多次研究后，本發明人已經通過基因芯片分析發現編碼存在于綠膿桿菌外膜中的PA0427(也稱作OprM)蛋白的基因穩定地表達，無論人血清存在或不存在(實施例1)。另外，本發明人也已經通過對95林綠膿桿菌臨床分離林的基因分析發現PA0427蛋白的2個推定胞外區不存在可檢測的氨基酸突變并且完全是保守的(實施例2)。此外，本發明人還已經證實用含有PA0427重組蛋白或推定胞外區的肽免疫獲得的抗血清或抗體與PA0427蛋白結合(實施例7和8),該抗體具有調理作用(實施例9)以及該抗體在綠膿桿菌感染的模型小鼠上顯示強效的抗感染保護作用(實施例11-13)。本發明基于這些發現。本發明的目的是提供具有實質的預防或治療綠膿桿菌感染的能力并且可以對源自綠膿桿菌感染患者的多種臨床分離林反應的、能用作疫苗組合物的蛋白質抗原或肽抗原，或是提供針對所述抗原的抗體。根據本發明，提供了包含可誘導產生抗綠膿桿菌PA0427蛋白抗體的蛋白質抗原或肽抗原的抗原組合物。根椐本發明，提供了選自下列的蛋白質(本文中此后稱作"本發明的蛋白質")(i)包含序列編號4的氨基酸序列的蛋白質；(ii)蛋白質，包含序列編號4中缺失、替換、插入或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質功能等同；(iii)蛋白質，由在嚴格條件下與編碼序列編號4的氨基酸序列的多核普酸雜交的多核苷酸編碼，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質功能等同；和(iv)蛋白質，包含與序列編號4的氨基酸序列具有70%或更大同一性的氨基^列，并且與由序列編號4的氨基^列組成的蛋白質功能等同。根據本發明，提供了包含序列編號5的氨基酸序列或序列編號5的含有一個至數個保守性替換的氨基酸序列的肽(本文中此后稱作"本發明第一實施方案的肽")。根椐本發明，提供了包含序列編號6的氨基酸序列或序列編號6的含有一個至數個保守性替換的氨基酸序列的肽(本文中此后稱作"本發明第二實施方案的肽，，)(本文中此后有時將本發明笫一實施方案的肽和本發明第二實施方案的肽統稱為"本發明的肽")。根據本發明，提供了包含本發明的蛋白質或本發明肽的抗原組合物(本文中此后將這種抗原組合物和包含可誘導產生抗綠膿桿菌PA0427蛋白抗體的蛋白質抗原或肽抗原的抗原組合物統稱為"本發明的抗原組合物")。根據本發明，提供了用于預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病的疫苗組合物，包含本發明的抗原組合物和任選地一種或多種可藥用的載體、稀釋劑和/或佐劑。根據本發明，提供了針對綠膿桿菌PA0427蛋白或其部分的抗體，或其功能性片段(本文中此后稱作"本發明的抗體")。根據本發明，提供了在保藏號FERMBP-10782下保藏的雜交瘤。根據本發明，提供了用于預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病的藥物組合物，包含本發明的抗體和任選地一種或多種可藥用的栽體和/或稀釋劑。根據本發明，提供了用于綠膿桿菌感染的診斷劑，包含本發明的抗體。根據本發明，提供了用于檢測綠膿桿菌的試劑盒，包含本發明的抗體。本發明提供具有實質的預防或治療綠膿桿菌感染的能力并且還對源自綠膿桿菌感染患者的多種臨床分離林反應的疫苗組合物和多克隆抗體或單克隆抗體。它們可以應用于針對綠膿桿菌感染的預防劑或治療劑或針對綠膿桿菌感染的診斷劑。此外，本發明的抗體與在綠膿桿菌外膜中或在綠膿桿菌胞外存在的PA0427蛋白的胞外區結合。此外，據估計這些區域是在菌林間極端高度保守的，與血清型等無關，并且與多種臨床分離株反應。因此，本發明的抗體預期對綠膿桿菌感染具有高的治療效果。附圖簡述圖1顯示pET15b質粒(pET曙PA0427-2)。發明詳述PA0427蛋白PA0427蛋白是衍生自綠膿桿菌的外膜PA0427蛋白。該蛋白質的氨基酸序列和編碼該蛋白質的多核苷酸的核苷酸序列分別在序列編號3和序列編號1中描述。在本上下文中，基于綠膿桿菌PA0427(OprM)蛋白(J.Biol.Chem.，2004,279，52816-52819)的二級結構和三維結構信息、有關大腸桿菌(E.coli)TolC蛋白的三維結構信息(Nature，2000，405，914-919)，估計在作為核苷酸序列序列編號1的氨基酸編碼區的1458個核苦酸中第340位至1017位核苷酸的核苷酸序列編碼PA0427蛋白的細胞表面暴露部分(序列編號2)。PA0427蛋白的細胞表面暴露部分是選自下列的蛋白質(i)包含序列編號4的氨基酸序列的蛋白質；(ii)蛋白質，包含序列編號4中缺失、替換、插入或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質功能等同；(iii)蛋白質，由在嚴格條件下與編碼序列編號4的氨基酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質功能等同；和(iv)蛋白質，包含與序列編號4的氨基酸序列具有70%或更大同一性的氨基酸序列，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質功能等同。在本說明書中，表述"缺失、替換、插入或添加一個或多個氨基酸"意指已經根據熟知技術方法例如位點定向誘變或通過替換多個氨基酸至天然產生的程度實施了修飾。待修飾氨基酸的數目可以優選地是l-50個、更優選是l-30個，仍更優選是1-10個，仍就更優選是1-5個并且最優選地是1個或2個。PA0427蛋白的修飾的氨基酸序列可以優選地是序列編號4的氨基酸序列中具有一個或多個(優逸地，一個至幾個或1、2、3或4個)保守性替換的氨基酸序列。在本說明書中，術語"保守性替換，，意指一個或多個氨基酸殘基用化學相似的其它氨基酸殘基替換。此類保守性替換的實例包括其中某個疏水性9殘基用另一個疏水性殘基替換的情況，和其中某個極性殘基用帶相同電荷的另一個極性殘基替換的情況。對于每種類型的氨基酸，可以按照如此方式進行替換的功能相似氨基酸是本
技術領域：
已知的。非極性(疏水性)氨基酸的實例包括丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。極性(中性)氨基酸的實例包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸。正電荷(堿性)氨基酸的實例包括精氨酸、組氨酸和賴氨酸。負電荷(酸性)氨基酸的實例包括天冬氨酸和谷氨酸。在本說明書中，術語"在嚴格條件下，，意指其中雜交后的膜洗滌過程在高溫度于具有低鹽濃度的溶液中實施的條件。此類洗滌條件可以例如是在60。C的0.5xSSC(lxSSC:15mM檸檬酸三鈉和150mM氯化鈉)持續15分鐘，并且優選地是在60'C的0.5xSSC，0.1。/。SDS持續15分鐘。可以根據已知方法實施雜交。在使用商業可獲得文庫的情況下，可以根據隨該文庫所包括的說明書中描述的方法實施雜交。在本說明書中，術語"同一性"就核苷酸序列或氨基酸序列而言，意指所比較的序列間在構成該序列的核苷酸殘基或氨基酸殘基方面的一致性程度。在本說明書中所述的這種同一性的數值可以使用本領域技術人員已知的同源性檢索程序進行計算。例如，這種數值如同一性可以容易地使用FASTA或BLAST中的默認(初始設定)參數進行計算。與序列編號4的氨基,列具有70%或更大同一性的氨基酸序列可以是與前述氨基酸序列具有優選80%或更大、更優選85。/。或更大、仍更優選90%或更大、仍就更優選95%或更大、特別優選98%或更大和最優選99%或更大同一性的氨基酸序列。在本發明中，若給出序列編號4的氨基酸序列，則可以容易地確定編碼該氨基酸序列的核苷酸序列。因此，可以選擇編碼序列編號4的氨基酸序列的多種核苷酸序列。因此，編碼包含序列編號4的氨基,列的蛋白質的多核苷酸不僅意指序列編號2所示DNA序列的部分或全部，還意指編碼同一氨基酸的DNA序列，其具有以簡并關系的密碼子作為DNA序列的序列。本發明還包括與這些DNA序列相對應的RNA序列。編碼包含序列編號4的氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸的優逸實例包括包含序列編號2的核普酸序列的多核苷酸。在本說明書中，某種蛋白質是否與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質功能等同可以通過評估生物學現象或功能而確定，其中所迷的生物學現象或功能與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質的表達相關。例如，這可以通過基因重組技術使這種蛋白質表達并隨后評估是否可以制備抗PA0427蛋白的抗體而確定。因為本發明的蛋白質暴露在綠膿桿菌的細胞表面上，因而該蛋白質可以作為用于制備抗綠膿桿菌抗體的抗原(蛋白質抗原)使用。在PA0427蛋白的細胞表面暴露部分中，鑒定了不存在可檢測的氨基酸突變的以下兩個部分(本文中此后稱作推定胞外區)包含序列編號5的氨基酸序列的肽，或包含序列編號5的含有一個至數個保守性替換的氨基酸序列的肽；和包含序列編號6的氨基酸序列的肽，或包含序列編號6的含有一個至數個保守性替換的氨基酸序列的肽。因為本發明的肽暴露在綠膿桿菌的細胞表面上并且在綠膿桿菌中保守，因而該肽可以用作制備抗綠膿桿菌抗體的抗原(肽抗原)。已經證實該肽在眾多的綠膿桿菌臨床分離林中不存在可檢測的氨基酸突變并且因此有利的之處就在于它們用作綠膿桿菌共同抗原。對于本發明的肽而言，可以將封閉基團例如添加至肽的氨基末端或羧基末端以防止因電荷所致的聚集。常分別對氨基末端使用乙酰化和和羧基末端使用酰胺化，但不限于這些。本發明的肽可以例如通過對其添加半胱氨酸殘基而修飾以增強與間隔物的結合。DMS(辛二亞氨酸二曱酯)、DMA(己二亞氨酸二曱酯)、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來酰亞胺基曱基環己烷-l-羧酸酯)、MBS(間-馬來酰亞胺基苯甲酸-N-羥琥珀酰亞胺酯)、磺基-MBS等通常用作間隔物，但不限于此。可以使用起到間隔物作用的化合物。對于本發明的肽，載體蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、或鑰孔血藍蛋白(KLH)可以用作載體，但不限于這些。l抗原組合物J本發明的蛋白質或本發明的肽可以用作蛋白質抗原或肽抗原。因此，根據本發明，提供了包含可誘導產生抗綠膿桿菌外膜PA0427蛋白抗體的蛋白質抗原或肽抗原的抗原組合物。在本上下文中，蛋白質抗原或肽抗原可以優選地通過根據本領域技術人員眾所周知的方法純化本發明的蛋白質或本發明肽而使用。在本說明書中，術語"抗原組合物，，可以是僅由所述蛋白質抗原或肽抗原組成的組合物或包含這種抗原和其它組分的組合物。根據本發明，提供了包含可誘導產生抗綠膿桿菌PA0427蛋白抗體的蛋白質抗原或肽抗原的抗原組合物。[疫苗組合物本發明的抗原組合物可以用作疫苗。因此，根據本發明，提供了包含可誘導產生抗綠膿桿菌外膜PA0427蛋白抗體的抗原組合物的疫苗組合物。根據本發明，可以制備用于預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病的疫苗組合物，包含本發明的抗原組合物和任選地一種或多種可藥用的載體、稀釋劑和/或佐劑。在本發明的疫苗組合物中使用的載體基于施用模式和途徑和實際的標準藥物制劑進行選擇，并且可以例如是載體蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)和匙孔血藍蛋白(KLH))、增溶劑(例如乙醇、聚山梨酸酯、和CremophorELTM)、等滲劑、防腐劑、抗氧化劑、賦形劑(例如乳糖、淀粉、微晶纖維素、甘露醇、麥芽糖、磷酸氫鈣、輕質無水硅酸和碳酸鉤)、粘合劑(例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素和阿拉伯膠)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石和氫化油)和穩定劑(例如乳糖、甘露醇、麥芽糖、聚山梨酸酯、Macrogol和聚氧乙烯氫化蓖麻油)。可以根據需要添加甘油、二甲基乙酰胺、70%乳酸鈉、表面活性劑或堿性物質(例如氫氧化鈉、乙二胺、乙醇胺、碳酸氬鈉、精氨酸、葡甲胺、或三氨基甲烷)等。特別地，本發明的肽可以與作為載體蛋白的已知KLH溶液(Calbiotec公司制，每毫升50%甘油溶液溶解125mg)偶聯，以增強本發明疫苗組合物的抗原性。在本發明疫苗組合物中使用的稀釋劑基于施用模式和途徑和實際的標準藥物制劑而選擇。稀釋劑的實例包括水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖生理鹽水和碳酸氫鹽溶液。在本發明疫苗組合物中使用的佐劑基于施用模式和途徑和實際的標準藥物制劑而選擇。佐劑的實例包括霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)、脂質體和免疫刺激性復合體(ISCOM)。施用途徑可以根據具有綠膿桿菌感染風險的受者的年齡、體重、性別和總體健康而不同，但是施用可以通過經口施用和腸胃外施用(例如靜脈內注射、動脈內注射和局部施用)的任一途徑而實施。在它們當中，優選腸胃外施用。用于經口施用和腸胃外施用的劑型及其制備方法是本領域技術人員眾所周知的。用于經口施用和腸胃外施用的劑型可以通過常規方法，例如通過將本發明的抗原組合物與例如前述可藥用的載體混合而制備。用于經口施用的劑型實例包括固體和液體劑型如溶液劑、片劑、顆粒劑、散劑或膠嚢劑。用于腸胃外施用的劑型實例包括溶液劑、混懸劑、軟骨劑、乳骨劑、栓劑、眼藥劑、滴鼻劑和滴耳劑。若需要本發明制劑的持續釋放，則可以添加生物可降解聚合物(例如聚-D，L-丙交酯共乙交酯或聚乙交酯)作為增容基質(見例如美國專利號5,417,986、4,675,381和4,450,150)。13在經口施用的情況下，也可以添加香味劑和著色劑。合適的藥物載體和稀釋劑等以及為了使用它們所需的物質在Remington'sPharmaceuticalSciences中描述。本發明疫苗組合物的劑量由本發明人基于疫苗抗原的類型、本發明的抗原是否與佐劑組合施用、與本發明抗原共同施用的佐劑的類型、施用模式和頻率以及希望的效果(例如預防或治療效果)而確定，并且通常可以是每個成人ljig/劑量-100mg/劑量。當本發明疫苗與佐劑一起施用時，劑量可以通常是每個成人lng/劑量-lmg/劑量。這種劑量可以根據本發明人的決定按照需要施用數次。例如，可以實施初始接種和間隔1周時間的后續3次加強接種。另外，加強注射和第二次加強注射可以使用相同制劑距離初次免疫第8至第12周以及第16至第20周分別實施。[抗體本發明的抗體可以識別綠膿桿菌外膜PA0427蛋白或其部分，并且與綠膿桿菌結合。根據本發明，提供了本發明的抗體或其功能性片段，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的部分是綠膿桿菌PA0427蛋白的細胞表面暴露部分。根據本發明，提供了本發明的抗體(本文中此后稱作"本發明第一實施方案的抗體")，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的部分是本發明的蛋白質。根據本發明，提供了本發明的抗體(本文中此后稱作"本發明第二實施方案的抗體")，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的部分是本發明第一實施方案的肽。根據本發明，提供了本發明的抗體(本文中此后稱作"本發明第三實施方案的抗體")，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的部分是本發明第二實施方案的肽。此種抗體包括識別本發明的蛋白質并與綠膿桿菌結合的抗體。該抗體還包括識別本發明肽的抗體。本發明的抗體優選地通過用包含純化的本發明蛋白質抗原或肽抗原的抗原組合物免疫實驗動物而獲得，其中所述的抗原組合物以可以誘導抗體的量施用。這種抗體可以通過從心臟或動脈收集血液、從中分離抗血清并純化獲得的抗血清而作為純抗體使用。本發明的抗體包括使用PA0427蛋白或肽作為抗原并用所述抗原來免疫哺乳動物例如小鼠而獲得的多克隆抗體或單克隆抗體(其包括由產生本發明單克隆抗體的雜交瘤所產生的單克隆抗體)；由基因重組技術制備的嵌合抗體和人源化抗體；和使用產生人抗體的轉基因動物等制備的人抗體。當本發明的抗體作為藥物施用至人時，人抗體因副作用降低而優選地使用。"人抗體，，意指其中全部區域衍生自人的抗體。本發明的人抗體可以使用本領域4支術人員眾所周知的方法制備(見例如Intern.Rev.Immunol,1995，13，65-93;丄Mol.Biol，1991，222，581-597;日本特開第146194/1998號公報；日本特開第155492/1998號公報；日本專利號2938569;日本特開第206387/1999號公報；日本特表第509612/1996號公報；和日本特表第505107/1999號^^才艮)。"人源化抗體，，是通過僅植入小鼠抗體的抗原結合位點(CDR;互補決定區)的基因序列至人抗體基因(CDR移植)而制備的抗體。本發明的人源化抗體可以使用本領域技術人員眾所周知的方法(見例如EP239400和WO90/07861)制備。"嵌合抗體"是這樣的抗體，其通過連接某種抗體的可變區至不同物種抗體的恒定區而制備。具體地，小鼠用抗原免疫，并且與該抗原結合的抗體可變區(V區)從小鼠單克隆抗體的基因中被切下。隨后使如此獲得的V區連接至衍生自人骨髓的抗體恒定區(c區)基因，以制備嵌合抗體。本發明的嵌合抗體可以使用本領域技術人員眾所周知的方法(見例如日本特開第280387/1996號公報和美國專利號4816397、4816567和5807715)制備。本發明單克隆的抗體可以使用本領域技術人員眾所周知的方法制備(見例如抗體實驗手冊(Antibodies:ALaboratoryManual)，編者Harlow和DavidLane，冷泉港實驗室(ColdSpringHarborLaboratory)(1988);單克隆抗體實驗手冊(ExperimentalManualforMonoclonalAntibody)，SakujiToyama等編輯，Kodansha(1987);和單克隆抗體雜交瘤和EL1SA(MonoclonalAntibody:HybridomaandELISA),TatsuoIwasaki等編輯,Kodansha(1987))。本發明的多克隆抗體可以使用本領域技術人員眾所周知的方法制備。"功能性片段"根據本發明意指抗體的部分(部分片段)，其特異性地識別本發明的蛋白質。這種功能性片段的具體實例包括Fab、Fab，、F(ab，)2、可變區片段(Fv)、二硫鍵連接的Fv和單鏈抗體(scFv)及它們的聚合物。本發明第一實施方案的抗體的優選實例包括針對這樣的蛋白質的抗體和其功能性片段，其中所述的蛋白質包含序列編號4的氨基酸序列或包含了含有一個至數個保守性替換的序列編號4的氨基酸序列。本發明第二實施方案的抗體的優選實例包括針對這樣的肽的抗體及其功能性片段，其中所述的蛋白質包含序列編號5的氨基酸序列或包含序列編號5的含有一個至數個保守性替換的氨基酸序列。本發明第三實施方案的抗體的優選實例包括通過在FERMBP-10782下保藏的雜交瘤產生的單克隆抗體。因此，根據本發明，提供了于2007年2月8日保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心—305-8566，日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中夬笫6)的保藏號為FERMBP-10782的雜交瘤(0427-L2-l)。本發明的抗體優選是單克隆抗體。根據本發明，提供了這樣的單克隆抗體，其與由本發明雜交瘤產生的單克隆抗體所針對的同一抗原發生交叉反應。根據本發明，提供了可以與綠膿桿菌結合的抗體，其由動物自身的免疫系統應答本發明的抗原組合物而產生。[抗體的用途和藥物組合物l與綠膿桿菌相關的疾病綠膿桿菌是因宿主抵抗力降低而造成致命后果的機會感染病原體。另16外，綠膿桿菌耐受抗生素并且因此是醫院內感染的主要病原菌。如稍后在實施例中顯示，證實本發明的第三實施方案的抗體具有調理作用(實施例9)。還證實本發明的抗血清在巨噬細胞功能因施用粘蛋白而降低的綠膿桿菌易感性小鼠模型上確實具有抗感染保護作用(實施例11)，并且在嗜中性粒細胞水平因施用一水合環磷酰胺而降低的綠膿桿菌易感性小鼠模型上確實具有抗感染保護作用(實施例12)。還證實本發明的第三實施方案的抗體在多藥耐藥性綠膿桿菌易感性小鼠模型上確實具有抗感染保護作用(實施例13)。因此，本發明用于預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病。與綠膿桿菌相關的疾病的實例包括由綠膿桿菌感染包括多藥耐藥性綠膿桿菌感染引起的全身感性疾病，例如敗血癥、腦膜炎和心內膜炎。與綠膿桿菌相關的疾病的其它實例包括耳鼻喉學領域的中耳炎和鼻竇炎；肺臟學領域的肺炎、慢性呼吸道感染和氣管感染；外科領域的術后腹膜炎和膽管術后感染等；眼科領域的眼瞼膿肺、淚嚢炎、結膜炎、角膜潰瘍、角膜膿肺、全眼球炎和眼眶感染；和泌尿外科學領域的泌尿道感染(包括復雜的泌尿道感染)、導管感染和肛周膿腫。其它實例包括燒傷(包括重度燒傷和呼吸道燒傷)、褥瘡感染和嚢性纖維化。本發明第三實施方案的抗體是特別有用的，因為預期它有效地預防或治療難以治療的多藥耐藥性綠膿桿菌感染。還證實本發明第一實施方案的抗體與本發明笫二實施方案的肽結合(實施例7和8)。因此，本發明第一實施方案的抗體可以預期具有相同的作用。根據本發明，提供了本發明抗體的用途，用于產生針對與綠膿桿菌相關的疾病的預防劑或治療劑。根據本發明，提供了用于預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病的方法，包括施用預防性或治療性有效量的本發明抗體至哺乳動物(包括人)的步驟。用于綠膿桿菌感染的診斷劑如稍后在實施例中所示，證實本發明第一實施方案的抗體分別與本發明的蛋白質、本發明第一實施方案的肽、本發明第二實施方案的肽結合(實施例7)。也證實本發明的第二實施方案的抗體與本發明的蛋白質及本發明第一實施方案的肽結合(實施例7)。還證實本發明的第三實施方案的抗體與本發明的蛋白質及本發明第二實施方案的肽結合(實施例7)。另外，證實本發明的第一至第三實施方案的抗體與暴露在綠膿桿菌細胞表面上的PA0427蛋白的胞外區結合(實施例8)。這些結果表明本發明的抗體可以用來檢測綠膿桿菌的存在。因此，本發明的抗體用于診斷綠膿桿菌感染。根據本發明，提供了使用本發明抗體用于診斷綠膿桿菌感染的方法。本發明的i會斷方法可以通過如此方式實施，即收集生物樣本，例如來自哺乳動物(包括具有綠膿桿菌感染風險的人)的痰、肺洗出液、膿、淚、血液或尿，隨后將收集的樣品與本發明的抗體接觸，以及確定是否發生抗原-抗體反應。用于綠膿桿菌感染的診斷藥試劑盒根據本發明，提供了用于檢測綠膿桿菌存在的試劑盒，其至少包含本發明的抗體。本發明的抗體可以;故標記。該檢測試劑盒通過檢測抗原-抗體反應而檢測綠膿桿菌的存在。因此，本發明的檢測試劑盒還可以含有多種類型的用于實施抗原-抗體反應的試劑、所用的二次抗體(例如在ELISA中)、生色試劑、緩沖液、，說明書和/或根據需要的儀器。藥物組合物本發明的藥物組合物或藥劑可以組合物的形式使用，其中所述的組合物包含本發明的抗體作為活性成分，優選地含有純化的抗體和任選地含有其它成分，例如生理鹽水、葡萄糖水溶液或磷酸鹽緩沖液。本發明的藥物組合物可以根據需要配制成液體或冷凍干燥的形式。此種藥物組合物可以任選地含有可藥用的載體，例如穩定劑、防腐劑和等滲劑。可藥用載體的實例可以包括用于冷凍干燥制劑的甘露醇、乳糖、蔗糖和人白蛋白；和用于液體制劑的生理鹽水、注射用水、磷酸鹽緩沖液和氫氧化鋁，但不限于這些實例。施用途徑可以根據受者的年齡、體重、性別和總體健康而不同，但是施用可以通過經口施用和腸胃外施用(例如靜脈內注射、動脈內注射和局部施用)途徑而實施。在它們當中，優選腸胃外施用。藥物組合物的劑量根據患者的年齡、體重、性別和總體健康、綠膿桿菌感染的嚴重性和待施用的抗體組合物的成分而不同。本發明抗體組合物的日劑量對于靜脈內注射通常是0.1-1000mg/kg每個成人體重、優選地1-100mg/kg每個成人體重。優選本發明的藥物組合物應當事先施用至具有綠膿桿菌感染風險的患者。當藥物組合物制備為診斷劑時，這種診斷劑可以通過采用適合此目的的任意手段以任意劑型獲得。例如對腹水、含有目的抗體的培養液或經純化抗體測量抗體滴度并且以PBS(含有生理鹽水的磷酸緩沖液)等適度地稀釋，并且隨后對其添加防腐劑例如0.1。/。疊氮鈉。另外，還對吸附至乳膠等的本發明抗體測定抗體滴度并且適度地稀釋，并對其添加防腐劑以便使用。這種與乳膠粒子結合的本發明抗體是作為診斷劑的優選劑型之一。在這種情況下，適宜的樹脂材料例如聚苯乙烯、聚曱基苯乙烯或聚丁二烯是作為乳膠而適用的。實施例本文中此后，本發明將參考用于促進理解本發明的實施例而描述。然而，本發明將不限于這些實施例。實施例1:基因芯片W分析使用基因芯片表達分析系統(Affymetrix，基因芯片綠膿桿菌基因組陣19列)作為用于鑒定在補充了人血清的培養基中所表達基因的方法。使用綠膿桿菌PAOl林(ATCCBAA-47)在3種不同培養條件即在補充0%、20%和50%人血清的Luria-Bertani(LB)培養基(NacalaiTesque)(LB培養基的最終組成在它們之間相同)中在37。C實施振蕩培養直至吸光度在595nm處達到1.0。使用RNeasyProtectBacteriaMini試劑盒(QIAGENGmbH)，總RNA根椐在該試劑盒所包括的文件中描述的方法提取并使用2100生物分析儀(AgilentTechnologies)定量。隨后，實驗根據隨基因芯片包括的文件中所述的方法進行。使用MicroarraySuite5.0(Affymetrix)分析基因表達數據，并且計算信號及檢測。在此時，實施校正，使來自全部探針組的信號的平均值是IOOO。實施了兩個獨立的實驗。作為結果，在全部培養條件下，無論添加的血清存在或不存在，將顯示檢測到轉錄產物確定為作為持家蛋白的PA4761蛋白(DnaK或HSP70)是"存在"的，并且因此證實該基因表達。另外，確定作為與PAS158(OprM)和PA2019(MexX)蛋白結合以構成藥物排出泵的內膜跨越蛋白并受到核糖體抑制劑例如四環素或氨基糖苷類抗生素誘導的PA2018蛋白(MexY)(J.Bacteriology,2005，187，5341-5346)在沒有前述那些藥物的這些條件下是"不存在，，的，并且因此證實該基因不表達。相反，在全部培養條件下，無論添加的血清存在或不存在，確定PA0427基因是"存在"的。因此，PA0427基因必定表達，并且提出這樣的可能，即PA0427基因產物PA0427蛋白在細菌表面上恒定存在。這提示綠膿桿菌PA0427蛋白可用作疫苗成分。實施例2:分析臨床分離抹中的PA0427基因所用的細菌菌林是95林綠膿桿菌菌抹(保管于橫濱研究所，MeijiSeikaKaisha)，分離自日本各地臨床機構的多種類型臨床材料并進行測試。這些菌林源自血液、尿、痰、膿、咽粘液等，并且基于根據日本綠膿桿菌協會(1975)所贊助的血清分型委員會決定，進行血清學分類法，它們的血清型包括A、B、E、F、G、I、M等組。(1)基因組DNA的制備95林綠膿桿菌臨床分離林的每一林在37。C在Mueller，Hinton培養基(BectonDickinson)中培養過夜并通過低速離心加以收集。使用DNeasy組織試劑盒(QIAGENGmbH)，根據隨該試劑盒所包括的文件中描述的方法，從獲得的細菌細胞中制備基因組DNA。(2)通過PCR方法擴增DNA片段使用制備的基因組DNA作為模板，通過PCR擴增了含有PA0427基因的區域。具體而言，用于特異性擴增每一基因的引物組(序列編號7和序列編號8)基于綠膿桿菌PAOl菌林基因組的序列(NCBI登錄號NCJ)02516)設計。使用GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems)，使用TakaraExT叫(TakaraBio)根據其中所包括的說明書實施PCR。如此由PCR擴增的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳證實具有目的大小(1628bp)。(3)使用DNA測序儀分析多核苷^列PCR產物使用MultiScreenPCR板(MilliporeCorporation)純化并且隨后進行測序反應。能夠對每種PCR產物測序的引物(序列編號9至序列編號13)基于PAOl菌林的基因組序列(NC—002516)設計。在測序反應中使用BigDyeTerminatorvl.l循環測序試劑盒(AppliedBiosystems)。使用GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems)根據其中所包括的說明書實施測序反應。使用事先以水溶脹的SephadexG-50FineDNAGrade(AmershamBiosciencesAB)所填充的MultiScreen畫HV板(MilliporeCorporation)純化測序反應產物。隨后，使用AppliedBiosystems3730DNA分析儀(AppliedBiosystems)分析多核苷,列。將臨床分離林中通過所述分析而測定的多核苷酸序列轉換成多肽序列，并且這些多肽序列與來自PAOl菌林的多肽序列進行比較。作為結果，在PA0427蛋白的全長序列中觀察到3處突變(表1)。不過，獨自地推測的推定胞外區(序列編號5和序列編號6)證實不存在可檢測的氨基酸突變，其中所述的推定胞外區由本發明人基于有關綠膿桿菌PA0427蛋白的二級結構和三維結構信息(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)以及有關大腸桿菌TolC蛋白的三維結構信息(Nature，2000，405，914-919)而預測。這提示綠膿桿菌PA0427蛋白可用作"綠膿桿菌共同抗原"。[表l<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>-"代表與PAOl菌林中氨基酸相同的氨基酸。實施例3:PA0427基因DNA片段的克隆使用載體pIVEX2.4d(RocheDiagonstics)來克隆在作為綠膿桿菌PA0427基因(序列編號l)的氨基酸編碼區的1458個核苷酸中第340位至1017位核苷酸的DNA片段(序列編號2)并且通過以下方法整合入表達載體pET15b(Novagen)。基于有關與PA0427蛋白同源的大腸桿菌TolC蛋白的結構分析信息(Nature,2000，405，914-919)，估計所述氨基酸編碼區中第1至第339位核普酸和第1018至笫1458位核苷酸的核苦酸序列編碼細胞表面非暴露區域，因此，將這些核苷酸序列從克隆對象中排除。待克隆的DNA片段從綠膿桿菌PAOl菌林的基因組DNA中通過PCR(DNAThermalCycler480;Perkin-Elmer)擴增。使用Pyrobest(TakaraShuzo)作為DNA聚合酶。反應溶液補充以5%二曱基亞砜。含有用于添加限制性位點Ncol(CCATGG)和Pstl(CTGCAG)及終止子的核香酸的引物(序列編號14和序列編號15)用作PCR引物。PCR溫度條件包括在94i:加熱2分鐘，隨后是由94°C30秒、60°C1分鐘和72"C2分鐘構成的30次循環。PCR產物使用GenElutePCRDNA純化試劑盒(Sigma)加以純化，并且純化產物用NcoI和PstI(均來自NewEnglandBiolabs)消化。PIVEX2.4d用Ncol和Pstl消化。這些DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳，并且使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取和純化。使用T4DNA連接酶(Invitrogen)連接如此以Ncol-Pstl消化的PCR產物和pIVEX2.4d，并且大腸桿菌DH5a菌林(高感受態DH5a，Toyobo)以連接產物轉化。使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(Qiagen)純化其中已經摻入PA0427基因片段的pIVEX2.4d質粒(pIVEX-PA0427-l)，并且使用BigDyeTerminatorvl.l循環測序試劑盒(AppliedBiosystems),通過循環測序反應而證實插入物的核苷酸序列(3730DNA分析儀，AppliedBiosystems/HITCHI)。接下來，pET15b用NdeI(NewEnglandBiolabs)和BamHI(Toyobo)消化。另外，使用pIVEX-PA0427-l作為模板，使用與位于插入物上游的區域配對的PCR引物(序列編號16)和含有用于添加限制性位點BglII(AGATCT)和終止密碼子的核苷酸的PCR引物(序列編號17)擴增插入片段，并將PCR產物用緊鄰NcoI位點上游的NdeI以及用BglII(Toyobo)消化。用BamHI及用BglII消化后的突出末端是彼此互補的。因此，將這些消化的DNA片段連接，用連接產物轉化大腸桿菌，以獲得其中已經摻入PA0427基因片段的pET15b質粒(pET-PA0427-2)(圖1)。實施例4:PA0427重組蛋白的表達和純化在重組蛋白的表達中使用其中已經并入T7RNA聚合酶基因的大腸桿菌BL21(DE3)菌林和具有T7啟動子的pET載體表達系統(Novagen)。大腸桿菌表達載體pET-PA0427-2是編碼在T7啟動子下游融合有His標簽(6個連續組氨酸)的PA0427部分蛋白的質粒(見實施例3)。BL21(DE3)菌林用氯化4丐處理(見分子克隆(MolecularCloning),第二版，Sambrook等(1989))并以pET-PA0427-2轉化。轉化體在含有50|ug/ml氨芐青霉素的23LB培養基中培養過夜，并將它們懸浮(稀釋200倍)于新鮮培養基內并且在37C培養4小時。隨后，通過添加終濃度0.5mM的IPTG而誘導表達，并繼續培養額外3小時。通過離心收集細胞并將其冷凍在-20。C。將細胞溶解于B-PER細菌蛋白提取試劑(Pierce)中，并且將含有已表達蛋白質的不溶性部分收集并以終濃度100|ag/ml的溶菌酶(卵清溶菌酶，SeikagakuCorporation)處理，隨后用補充以l%TritonX-100的Dulbecco's磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)洗滌。在蛋白質純化中使用了利用His-標簽的Ni螯合層析。如此表達和制備的的不溶性蛋白質用溶解緩沖液(補充有8M尿素、5mM咪唑、200mMNaCl和0.05%NP-40的PBS)增溶。溶解的蛋白質結合至Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)并用40體積的溶解緩沖液洗滌。蛋白質進一步用40體積的洗滌緩沖液(除NP-40外，具有如溶解緩沖液那樣的相同組成)洗滌。隨后，His-標簽-融合蛋白用洗脫緩沖液(補充有8M尿素、300mM咪唑和200mMNaCl的PBS)洗脫，隨后收集。作為結果，最終從115ml大腸桿菌培養物中獲得2.0mg蛋白質。實施例5:用抗原免疫和制備抗血清綠膿桿菌PA103菌林(ATCC29260)在37。C在Mueller-Hinton瓊脂培養基上培養過夜。將幾個菌落在LB培養基中懸浮并且隨后在37。C振蕩培養過夜，并將它們用PBS洗滌，隨后重懸。隨后，通過添加1%福爾馬林進行滅活處理24小時或更長時間，并且使用如此滅活的菌林(本文此后有時稱作"福爾馬林滅活的PA103菌林")。為在免疫中使用，將PA0427重組蛋白溶解在8M尿素溶液中，產生lOO^g/ml的濃度。PA0427蛋白中胞外區的氨基酸序列由本發明人基于有關綠膿桿菌PA0427蛋白的二級結構和三維結構信息(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)以及有關大腸桿菌TolC蛋白的三維結構信息(Nature，2000，405，914-919)而推測。含有所推測的氨基酸序列(序列編號5和序列編號6)的肽通過使用Fmoc的固相合成法合成。由序列編號5的氨基酸序列組成的肽(本文此后有時稱作"0427L1，，)作為含有序列編號5的氨基酸序列的合成肽而合成。其中半胱氨酸殘基添加至序列編號6的氨基酸序列羧基末端的肽(本文此后有時稱作"0427L2Q")作為含有序列編號6的氨基酸序列的合成肽(序列編號18)。通過質譜在由序列編號5的氨基酸序列組成的合成肽0427L1中觀察到[M+lm/z1592.94(計算值m/z1591.77)，并且由HPLC分析對這種合成肽給出在13.199分鐘保留時間處具有面積比71.1%的峰。另外，通過質語在含有序列編號6的氨基酸序列的合成肽0427L2Q中觀察到[M+1m/z1615.51(計算值m/z1613.84)，并且由HPLC分析對這種合成肽給出在16.75分鐘保留時間處具有面積比74.7%的峰。每種合成肽通過間隔物與鑰孔血藍蛋白(KLH)偶聯，以制備KLH綴合的肽，并且這些KLH綴合的肽分別命名為0427L1-KLH和0427L2Q-KLH。使用DMS(辛二亞氨酸二甲酯.2HC1，Pierce，目錄號20700)或磺基畫MBS(間-馬來酰亞胺基苯甲酸畫N畫羥基磺基琥珀酰亞胺酉旨，Pierce，目錄號22312)作為間隔物。委托ThermoELECTRON進行肽的合成。對每只動物分別免疫與佐劑聯合的20|ig的福爾馬林滅活PA103菌株、PA0427重組蛋白和KLH綴合肽。在對動物的施用方法中，雄性BN大鼠(從日本CharlesRiver實驗室購買)以總計6次注射進行皮下或肌內免疫，首次注射聯合^f吏用弗氏完全佐劑并且后續注射聯合使用不完全佐劑，間隔時間2周。最后一次免疫l周后，從腹主動脈收集全血，并且全血在室溫下擱置1小時并隨后在1500G離心20分鐘，以獲得具有約5ml/大鼠的血清的上清液。實施例6:從抗血清中純化IgG級分根據例如McCauleyR&Racker,E;MolecularandCellularBiochemistry1，73-81(1973)的方法從大鼠抗血清中純化IgG級分。添加冰冷的飽和硫酸銨溶液(pH8)以制備43(v/v)。/。混懸液，并且獲得的混懸液在室溫攪拌15分鐘。沉淀物通過在lO，OOOxg離心20分鐘而收集并且在補充有10%甘油的10mM磷酸鉀緩沖液(pH8)中溶解。隨后，沉淀物通過添加水冷的飽和硫酸銨溶液(pH8)以制備50(v/v)。/o溶液而再次沉積，從而完成2次洗滌。沉淀物在補充有10%甘油的10mM磷酸鉀緩沖液(pH8)中溶解，并且隨后對該緩沖液透析過夜。將透析液離心并且隨后進行陰離子交換層析(DEAE-Toyopearl650M(Tosoh))。將流過的體積通過測定在280nm的紫外吸收而作為IgG級分收集。收集的級分使用AmiconUltra-15(Millipore)予以濃縮，并且緩沖液最終與PBS(-)溶液交換，以獲得最終樣品。通過純化而從5ml的PA0427重組蛋白免疫的大鼠抗血清中收集14,5mg蛋白質作為IgG級分，并且該級分命名為抗PA0427IgG。蛋白質才艮據基于Lowry法的DC蛋白質測定法(Bio-Rad)定量，并且通過SDS-PAGE評估IgG純度。例如，使用Harlow和Lane等人于抗體實驗手冊(Antibodies,ALaboratoryManual),冷泉港(ColdSpringHarbor)(1988)第8章288-318的方法作為簡單的備選方法。向其中已經通過在lO，OOOxg離心20分鐘而除去不溶物質的大鼠抗血清的上清液添加2體積的60mM乙酸鈉(pH4.0)，并且pH隨后以IN鹽酸調節至4.8。在室溫逐步添加相對于該抗血清的0.06體積辛酸，并將混合物攪拌30分鐘，以產生不溶物質。通過在13，000xg離心10分鐘，然后將所獲得的溶液通過0.45|im濾器。所獲得的樣品使用AmiconUltra-15(Millipore)濃縮，并將緩沖液最終與PBS(-)溶液交換，以獲得最終樣品。根據這種方法，通過純化而從KLH綴合肽(即0427L1-KLH或0427L2Q-KLH)免疫的大鼠血清各30ml中分別收集68mg和27mg蛋白質作為IgG級分，并且這些級分分別命名為抗0427L1IgG和抗0427L2QIgG。蛋白質根據基于Lowry法的DC蛋白質測定法(Bio-Rad)定量，并且通過SDS-PAGE評估IgG純度。實施例7:ELISA試驗為了通過ELISA方法檢測與PA0427重組蛋白或每一合成肽0427L1和0427L2Q結合的抗體，將PA0427重組蛋白溶解在補充有8M尿素的PBS中，并且合成肽0427L1和0427L2Q各自溶解在碳酸鹽緩沖液(0.15%Na2C03，0.3%NaHC03)中。所述蛋白質或肽置于96孑LELISA板(MaxiSorpType,NUNC)內。該板置于4'C過夜，以引起固定。板隨后用PBS洗滌并以補充有0.5%BSA的PBS封閉。隨后，將實施例6中獲得的每種純化的IgG級分作為樣品添加至孔內并且允許在室溫反應。該板用含有0.05%吐溫20的PBS洗滌。隨后向該板添加二次抗體(過氧化物酶標記的山羊抗大鼠IgG抗體，10000倍稀釋，Sigma)添加并且允許其在室溫與該板反應，并且隨后洗涂該板。酶反應通過添加顯色底物(TMB微孔過氧化物酶底物系統，KPL公司制)而實施，并且隨后用1M磷酸溶液終止酶反應。測定在450nm處的吸光度。作為結果，當PA0427重組蛋白凈皮固定時，抗PA0427IgG級分的吸光度是0.961。相反，作為陰性對照的假大鼠IgG級分的吸光度是0.080。這表明在抗PA0427IgG級分中含有與作為免疫原的PA0427重組蛋白相結合的抗體(IgG)。另外，抗PA0427L1IgG級分和抗PA0427L2QIgG級分的吸光度分別是0.353和0.751。備選地，當合成肽0427L1被固定時，抗PA0427IgG級分的吸光度是0.750。相反，作為陰性對照的假大鼠IgG級分的吸光度是0.015。這表明在抗PA0427IgG級分中含有與由推定胞外區之一的氨基酸序列(序列編號5)組成的合成肽0427L1相結合的抗體(IgG)。抗PA0427L1IgG級分的吸光度是0.117，并且這表明在該級分中也含有與合成肽0427L1相結合的抗體(IgG)。相反，抗PA0427L2QIgG級分的吸光度是0.034，并且這表明在該級分中不含與合成肽0427L1相結合的抗體(IgG)。另外，當合成肽0427L2Q被固定時，抗PA0427IgG級分的吸光度是0.569。相反，作為陰性對照的假大鼠IgG級分的吸光度是0.063。這表明在抗PA0427IgG級分中含有與包含推定胞外區之一的氨基酸序列(序列編號6)的合成肽0427L2Q相結合的抗體(IgG)。抗PA0427L2QIgG級分的吸光度是0.361，并且這表明在該級分中也含有與合成肽0427L2Q相結合的抗體(IgG)。相反，抗PA0427L1IgG級分的吸光度是0.101,并且這表明在該級分中不含與合成肽0427L2Q相結合的抗體(IgG)。實施例8:完整細胞ELISA(wholecellELISA)試驗對于完整細胞ELISA，在LB培養基中過夜培養的PA103菌株的細菌溶液以濃度100|aL/孔分配至96孔ELISA板(MaxiSorpType,NUNC),隨后在4°C固定1小時。該板隨后用洗滌緩沖液(含有0.05%吐溫20的TBS)洗滌并以封閉緩沖液(含有2。/。牛血清白蛋白的TBS)封閉。此后，將實施例6中獲得的每種純化的IgG級分添加至孔內并且允許其在37。C反應1小時。洗滌后，向其添加二次抗體(過氧化物酶標記的山羊抗大鼠IgG抗體，5000倍稀釋，Sigma)添加并且允許在室溫與其反應30分鐘，并且隨后洗滌該板。酶反應通過添加顯色底物(TMB微孔過氧化物酶底物系統，KPL公司制)而實施，并且隨后用1M磷酸溶液終止酶反應。測定在450nm處的吸光度。作為結果，抗PA0427IgG級分的吸光度是0.713，而作為陰性對照的假大鼠IgG級分的吸光度是0.240。這表明在抗PA0427IgG中含有識別暴露在綠膿桿菌細胞表面上的PA0427蛋白胞外區的抗體(IgG)。另外，抗PA0427L1IgG級分和抗PA0427L2QIgG級分的吸光度分別是0.555和0.596。這表明在這些樣品中也含有識別暴露在綠膿桿菌細胞表面的PA0427蛋白胞外區的抗體(IgG)。實施例9:調理作用證實試驗使用小鼠嗜中性粒細胞對綠膿桿菌的吞噬作用作為指標，研究實施例6中從0427L2Q-KLH免疫的大鼠血清獲得的純化IgG級分(抗0427L2QIgG)的調理作用腹膜內施用8%酪蛋白溶液至雄性BALB/c小鼠(從日本CharlesRiver實驗室購買)。6小時后，收集腹腔細胞。腹腔細胞通過離心進行洗滌并隨后以濃度2x1(^個細胞/mL懸浮在RPMI-1640培養基(Gibco)中。將該細胞和經4。/。多聚甲醛處理的熒光標記的綠膿桿菌PA103菌株以25:1的比例在大鼠補體(ICNBiomedicals)和抗0427L2QIgG存在下或從僅施用佐劑而獲得的對照大鼠血清中純化的IgG存在下混合培養1.5小時。在如此培養后，用流式細胞儀(EpicsLXII，Coulter)測量吞噬的綠膿桿菌。嗜中性粒細胞區域是門控的，并且測定10，000個細胞的熒光強度。使用平均熒光強度作為調理作用的指標。作為結果，在100jUg/mL和200iag/mL抗0427L2QIgG存在下，與綠膿桿菌一起培養的嗜中性粒細胞的平均熒光強度分別是0.39和0.52,而在100jug/mL和200Mg/mL對照IgG存在下，與綠膿桿菌一起培養的嗜中性粒細月包的平均熒光強度分別是0.36和0.41,因而證實抗0427L2QIgG的調理作用。實施例10:單克隆抗體(MAb)的制備在實施例5中用含有推定胞外區(SEQIDNO:6)的KLH綴合肽0427L2Q-KLH初次免疫后1周，聯合不完全佐劑進行加強免疫，其中所述的推定胞外區由本發明人基于有關綠膿桿菌PA0427蛋白的二級結構和三維結構信息(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)以及有關大腸桿菌TolC蛋白的三維結構信息(Nature，2000，405，914-919)而預測。三日后，在麻醉下無菌地取出膝下淋巴結。獲得的淋巴結用RPMI-1640培養基(Gibco)洗滌，并將它們隨后夾入載玻片的磨砂部分之間并壓碎，以便獲得作為微小片的淋巴結細胞樣品。獲得的淋巴結細胞通過使用RPMI-1640培養基于1000轉/分鐘離心5分鐘而洗滌。另一方面，骨髓瘤細胞(P3X63Ag8Ul細胞)在5%C02、相對濕度100%和37。C下在含有10%FCS(胎牛血清)的RPMI-1640培養基中預培養，并且如此培養的在對數生長期間的骨髓瘤細胞通過使用RPMI-1640培養基離心而洗滌并且與前述淋巴結細胞混合，以至于使淋巴結細胞數對骨髓瘤細胞數的比例變成約4:1。混合的細胞在1000轉/分鐘離心5分鐘。棄去上清液并充分地使細胞疏+〉。對含有細胞的離心管，溫和地添加1mL由2g聚乙二醇(分子量1000，29WakoPureChemicalIndustries),2mLRPMI-1640培養基和0.2mLDMSO(NacalaiTesque)組成的溶液。細胞通過緩慢地旋轉離心管而混合。l分鐘后，緩慢地旋轉離心管，同時15mLRPMI-1640培養基經3分鐘添加至該離心管。細胞在1000轉/分鐘離心5分鐘。隨后，棄去上清液并充分地使細胞疏松。此后，將細胞懸浮在50mL的HT培養基(Gibco)中并培養過夜。此后，細胞通過在1000轉/分鐘離心10分鐘而收集并懸浮在10mL的RPMI培養基中，并且細胞溶液隨后添加至含有90mL曱基纖維素HAT選擇培養基(StemCellTechnologies公司制)的瓶中并充分地混合。在這種甲基纖維素培養基中的混合細胞以濃度IOmL/皿接種至9cm培養皿中。細胞在5%C02、相對濕度100%和37。C下培養。在10-14日后，觀察到在甲基纖維素培養基上培育的雜交瘤集落。挑出這些集落并在96孔微量培養板中進一步培養幾曰。(1)篩選目的抗體與PA0427重組蛋白或含有推定胞外區(序列編號6)的合成肽(序列編號18)結合的抗體通過實施例7中描述的ELISA而檢測。另外，與綠膿桿菌細胞表面結合的抗體通過實施例8中描述的完整細胞ELISA而檢測。(2)克隆產生目的抗體的細胞使用舍有5°/。BM-CondimedHI雜交瘤克隆補充物(RocheDiagnostics)的10%FCS/HT(Gibco)培養基將通過篩選確定產生目的抗體的雜交瘤調整至1個雜交瘤/0.2mL，并以濃度0.2mL/孔分配至96孔板的孔內，隨后培養。l至2周后，克隆通過在"篩選"項目中所述的方法分析，以選出產生目的抗體的單克隆。作為結果，獲得保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心的保藏號為FERMBP-10782的雜交瘤。(3)細胞的體外培養和MAb的產生在96孔微量板中充分增殖的目的克隆在24-孔板、50-mL燒瓶和250-mL燒瓶逐階段》文大并在10%FCS-RPMI培養基中培養。對如此所獲細胞的培養上清中產生的MAb由實施例7中描述的ELISA檢測。在用于檢測與其上未吸附肽、吸附合成肽0427L1(序列編號5)或合成肽0427L2Q(SEQIDNO:18)的孔相結合的這種ELISA中，以保藏號FERMBP-10782保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心的雜交瘤的培養上清的吸光度分別是0.049、0.049和0.610，這證實產生了與合成肽0427L2Q(序列編號18)特異性結合的MAb。(4)在體內細胞的腹水化和MAb的產生向BALB/c-nu/nu小鼠(從日本CharlesRiver實驗室購買)以濃度1x107個雜交瘤/小鼠腹膜內施用以保藏號FERMBP-10782保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心的雜交瘤。1至2周后，收集腹水。在腹水中含有的MAb通過實施例6中所述的方法純化，并將獲得的純化IgG級分命名為抗0427L2Q(48-5)IgG。使用單克隆抗體同種型分型試劑盒(RMT1，DainipponPharmaceutical),確定這種大鼠MAb的IgG亞類對于重鏈和輕鏈分別是IgG2a和k。與PA0427重組蛋白或合成肽(序列編號18)結合的抗體通過實施例7中所述的ELISA方法檢測。作為結果，在用于檢測與其上已經吸附PA0427重組蛋白的孔相結合的這種ELISA中，抗0427L2Q(48-5)的吸光度是0.906,而作為陰性對照的假大鼠IgG的吸光度是0.080，證實產生了與該蛋白質結合的MAb。另外，在用于檢測與其上已經吸附合成肽0427L2Q(序列編號18)的孔相結合的ELISA中，抗0427L2Q(48-5)的吸光度是0.585，而作為陰性對照的假大鼠IgG的吸光度是0.063，證實產生了與該肽結合的MAb。實施例11:PA0427重組蛋白免疫的大鼠血清在正常小鼠中防御PA103菌林全身感染的能力在用正常小鼠全身感染模型的評估中，將懸浮在500nl含有5%粘蛋白的生理鹽水中的PA103菌林以劑量7.0x104cfu/小鼠(14LDso)腹膜內施用至4周齡雄性CD-1小鼠(從日本CharlesRiver實驗室購買)。此后立即，按照劑量10ml/kg從尾靜脈施用以生理鹽水稀釋5倍的血清樣品。7天后，基于存活而確定抗感染的保護性活性。作為結杲，在作為陰性對照的僅施用佐劑而獲得的假大鼠血清的組中7只小鼠有5只死亡，并且剩余的2只小鼠存活。相反，在已經施用了實施例5獲得的福爾馬林滅活的PA103菌林免疫血清的組中全部小鼠存活，因此證實經福爾馬林滅活的PA103菌林免疫的大鼠血清具有抗感染的保護性活性。在這種條件下，在已經施用了實施例5獲得的PA0427重組蛋白免疫的大鼠血清的組中7只小鼠有6只存活，因此證實PA0427重組蛋白免疫的大鼠血清具有抗感染的保護性活性。實施例12:PA0427重組蛋白免疫的大鼠血清和純化IgG級分在中性白細胞減少的小鼠中防御PA103菌林全身感染的能力在用中性白細胞減少的小鼠的全身感染模型進行的評估中，制備12.5mg/mL(生理鹽水)環磷酰胺(本文此后稱作CY,Sigma-Aldrich)并將其以mg/kg劑量在第-5、-2和0日(總計3次投藥)腹膜內施用至4周齡雄性CD-1小鼠，以降低外周血中的嗜中性粒細胞水平。隨后，懸浮在250nl生理鹽水中的PA103菌林以劑量1.0x105cfu/小鼠(74LDso)腹膜內施用至小鼠。此后立即，從尾靜脈以劑量IOml/kg或20ml/kg施用每種樣品(血清樣品用生理鹽水稀釋5倍，并且每種純化的IgG級分用生理鹽水調整至2.5mg/ml)。7天后，基于存活而確定抗感染的^:護性活性。作為結果，當大鼠血清用作樣品時，在已經施用作為陰性對照的通過僅施用佐劑所獲得的假大鼠血清的組中全部小鼠死亡。相反，在已經施用了實施例5中獲得的福爾馬林滅活的PA103菌林免疫的大鼠血清的組中全部小鼠存活，因此證實經福爾馬林滅活的PA103菌林免疫的大鼠血清具有抗感染的保護性活性。在這種條件下，在已經施用在實施例5中獲得的PA0427重組蛋白免疫的大鼠血清的組中7只小鼠有5只存活。因此證實PA0427重組蛋白免疫的大鼠血清具有抗感染的保護性活性。另外，當純化的IgG級分用作樣品(0.5mg/小鼠)時，在施用作為陰性對照的假大鼠IgG的組中7只小鼠中6只死亡，并且剩余的1只小鼠存活。相反，在已經施用抗PA103IgG的組內7只小鼠有5只存活，其中所述的抗PA103IgG從福爾馬林滅活的PA103菌林免疫的大鼠血清獲得。因此證實這種抗PA103IgG具有抗感染的保護性活性。在這種條件下，在已經施用在實施例6中獲得的抗0427L1IgG的組中7只小鼠有5只存活。因此證實抗0427LlIgG具有抗感染的保護性活性。另外，在已經施用在實施例6中獲得的抗0427L2QIgG的組中7只小鼠有4只存活。因此證實抗0427L2QIgG具有抗感染的保護性活性。進一步地，在施用實施例10中獲得的作為大鼠MAb的抗0427L2Q(48-5)IgG的組中7只小鼠有4只存活。因此證實抗0427L2Q(48-5)IgG具有抗感染的保護性活性。實施例13:純化的IgG級分對中性白細胞減少的小鼠防御多藥耐藥性綠膿桿菌全身感染的能力多種類型抗菌劑對多藥耐藥性綠膿桿菌MSC06120菌林的最小生長抑制濃度是亞胺青霉烯(imipenem):32fig/ml，丁胺卡那霉素64嗎/ml，和環丙沙星>256fig/ml。制備12.5mg/ml(生理鹽7JC)的CY并以劑量125mg/kg在笫-5、-2和0天共三次腹膜內施用至4周齡雄性CD-1小鼠，以降低外周血的中性白細胞水平。隨后，懸浮在250jal生理鹽水中的MSC06120菌抹以劑量0.925x105cfu/小鼠(8.3LDso),內接種至所述小鼠。此后，每種純化的IgG樣品立即以劑量20ml/kg(0,5mg/小鼠)從尾靜脈施用。7天后，基于存活而確定抗感染的保護性活性。作為結果，作為陰性對照的7只施用大鼠假IgG的小鼠中有4只死亡，并且剩余的3只小鼠存活。但是，施用抗PA103IgG的組中7只小鼠有6只存活，其中所述的抗PA103IgG從福爾馬林滅活的PA103菌株免疫的大鼠血清中獲得。因此證實抗PA103IgG具有抗感染的保護性活性。在這種條件下，施用實施例6中獲得的抗0427L2QIgG的組中7只小鼠有5只存活。因此證抗0427L2QIgG具有抗感染的保護性活性。3權利要求1.抗原組合物，其包含能夠誘導產生抗綠膿桿菌PA0427蛋白抗體的蛋白質抗原或肽抗原。2.蛋白質，其選自(i)包含序列編號4的氨基,列的蛋白質；(ii)蛋白質，包含序列編號4中缺失、替換、插入或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質功能等同；(iii)蛋白質，由在嚴格條件下與編碼序列編號4的氨基#列的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質功能等同；和(iv)蛋白質，包含與序列編號4的氨基#列具有70%或更大同一性的氨基酸序列，并且與由序列編號4的氨基*列組成的蛋白質功能等同。3.肽，其包含序列編號5的氨基酸序列或序列編號5的含有一個至數個保守性替換的氨基酸序列。4.肽，其包含序列編號6的氨基酸序列或序列編號6的含有一個至數個保守性替換的氨基酸序列。5.抗原組合物，其包含根據權利要求2所述的蛋白質或根據權利要求3或4所述的肽。6.用于預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病的疫苗組合物，其包含根據權利要求1或5所述的抗原組合物，和任選地一種或多種可藥用的載體、稀釋劑和/或佐劑。7.針對綠膿桿菌PA0427蛋白或其部分的抗體或抗體的功能性片段。8.根據權利要求7所述的抗體或抗體的功能性片段，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的部分是綠膿桿菌PA0427蛋白的細胞表面暴露部分。9.根據權利要求8所述的抗體或抗體的功能性片段，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的細胞表面暴露部分選自(i)包含序列編號4的氨基,列的蛋白質；(ii)蛋白質，包含序列編號4中缺失、替換、插入或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質功能等同；(iii)蛋白質，由在嚴格條件下與編碼序列編號4的氨基酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質功能等同；和(iv)蛋白質，包含與序列編號4的氨基酸序列具有70%或更大同一性的氨基^列，并且與由序列編號4的氨基^列組成的蛋白質功能等同。10.根據權利要求8所述的抗體或抗體的功能性片段，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的細胞表面暴露部分是包含序列編號5的氨基酸序列的肽或包含序列編號5的含有一個至數個保守性替換的氨基酸序列的肽。11.根據權利要求8所述的抗體或抗體的功能性片段，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的細胞表面暴露部分是包含序列編號6的氨基酸序列的肽或包含序列編號6的含有一個至數個保守性替換的氨基酸序列的肽。12.根據權利要求ll所述的抗體或抗體的功能性片段，其通過在保藏號FERMBP-10782下保藏的雜交瘤產生。13.根據權利要求7至12任一項中所述的抗體或抗體的功能性片段，其中抗體是單克隆抗體。14.在保藏號FERMBP-10782下保藏的雜交瘤。15，根據權利要求7所述的抗體或抗體的功能性片段，其是與由權利要求14所述雜交瘤產生的單克隆抗體的相同抗原發生交叉反應的單克隆抗體。16.用于預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病的藥物組合物，其包含根據權利要求7至13和15中任一項所述的抗體或抗體的功能性片段，和任選地一種或多種可藥用的栽體和/或稀釋劑。17.根據權利要求6所述的疫苗組合物或根據權利要求16所述的藥物組合物，其中與綠膿桿菌相關的疾病是由綠膿桿菌感染所引起的全身性感染疾病。18.根據權利要求17所述的疫苗組合物或藥物組合物，其中綠膿桿菌感染是多藥耐藥性綠膿桿菌感染。19.綠膿桿菌感染的診斷劑，其包含根據權利要求7至13和15任一項中所述的抗體或抗體的功能性片段。20.用于檢測綠膿桿菌的試劑盒，其包含根據權利要求7至13和15任一項中所述的抗體或抗體的功能性片段。全文摘要本發明的目的旨在提供用于診斷、預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病的蛋白質抗原或肽抗原和抗所述抗原的抗體。根據本發明，提供了衍生自綠膿桿菌外膜蛋白PA0427的蛋白質或肽和針對它們的抗體，用于診斷、預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病。文檔編號C12N15/00GK101454446SQ20078001980公開日2009年6月10日申請日期2007年3月30日優先權日2006年3月30日發明者大塚圭子,大澤福市,奧富隆文,熊谷正志,田中二朗,鈴木貴久,長曾宏申請人:明治制果株式會社