從脂肪組織提取內皮細胞的方法

專利名稱：：從脂肪組織提取內皮細胞的方法
技術領域：
：本發明涉及細胞培養和純化領域。特別地，本發明涉及內皮細胞培養和純化。
背景技術：
：對于細胞治療和組織工程中的許多應用，需要從患者組織獲得內皮細胞，用于移植回同一個患者。為了使操作成本降到最小，以及使內皮細胞在培養期間任何可能發生的變化減到最小，在幾小時內迅速分離大量的內皮細胞是有利的。為了使這種內皮細胞實際上有用，通常需要獲得大量的細胞(如，大于1百萬)，并且需要得到相當高純度的分離細胞(如，大于90%的內皮同一性)。此外，期望將分離時間減到最少，這提高細胞存活力并且增加應用便利性。搭橋手術(旁路手術，bypasssurgery)是冠脈疾病和外周血管疾病的常用治療方法，冠脈疾病和外周血管疾病在美國和歐洲都是死亡率的最大原因(1，2)。在2004年，進行了427,000臺冠狀動脈搭橋手術(2)。在搭橋手術中自體靜脈移植物的開放性優于人工移植物(prostheticgraft)的開放性；然而，達30%的患者不具有用于搭橋術的合適靜脈。在這些患者中，使用小直徑的人工移植物，其導致相當高的失敗率。人工移植物和自體靜脈移植物之間開放性的巨大差異可能部分地歸因于人工移植物的腔表面上缺乏防止血栓形成的內皮細胞(EC)(3，4)。因此，開發在人工血管移植物上成功接種EC的策略將最可能提高對這些移植物觀測的開放性。EC接種(ECseeding)可以以單階段或兩階段程序進行(5)。兩階段接種涉及有限的EC在體外的擴增，其可能需要4-5周(6)，因此，它對于緊急患者護理是不合適的。此外，EC的體外擴增需要高成本的GLP設備。單階段接種是分離大量的EC并且隨后立即接種在人工移植物上。幾個研究者已經嘗試開發單階段接種程序(5)。已報道脂肪組織含有豐富的、容易獲得的微血管內皮細胞(MVEC)(7，8)。在動物模型中，帶有脂肪來源的EC的接種的血管移植物具有增強的開放性(9-ll)，然而，在人類中的臨床試驗結果是令人失望的(12，13)。原因可能是人類不同于犬科動物，缺乏自我內皮化(sdf-endotheliazation)能力。此外，分離自脂肪組織的污染的非內皮細胞促進內膜增生(14-17)。因此，找到分離大量高純度EC的快速且穩定的方法，對于小直徑人工移植物植入的成功是至關重要的。—般來說，兩類方法已被用于純化來自不同組織的內皮細胞。陽性選擇涉及偶聯有EC特異性抗體或分子如血小板內皮細胞粘附分子(PCAM/CD31)、CD34、ve-鈣黏著蛋白(CD144)、或荊豆凝集素-1(Ulexeuropaeusagglutinin-1，UEA陽1)的磁珠的應用(18-20);陰性耗減(negtivedepletion)使用抗非內皮細胞的特異性抗體排除細胞如成纖維細胞或單核細胞(21)。使用CD34Dynabeads被陽性選擇的細胞或使用抗成纖維細胞和單核細胞抗體被陰性選擇的細胞分別為約87。/。和71。/c)CD31陽性。然而，應用CD34珠的EC恢復只有約24。/。(19)。此外，通常使用粗制膠原酶分離EC，其顯示實質的批次變化并且每次改變批次時需要確認(22)。本領域一直需要更快和更成功的內皮細胞恢復和接種，例如，用于體內應用。
發明內容本發明的第一個實施方式提供從脂肪組織制備內皮細胞的方法。洗滌得自吸脂術的脂肪組織并且從該組織收集細胞。用純化的膠原酶制備物對細胞進行酶處理。該制備物被耗盡(depdeted)胃蛋白酶、胰蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶。在一個實施方式中，制備物包括純化的中性蛋白酶(分散酶)。通過與包含第一抗體的磁珠接觸來分選處理細胞，所述第一抗體對選自CD31、CD34、CD144和CD146的第一組的抗原或選自CD14、CD45和F19的第二組的抗原具有特異性。如果抗體對于第一組中的抗原具有特異性，則收集結合到所述磁珠的細胞，如果抗體對于第二組中的抗原具有特異性，則收集未結合到所述磁珠的細胞。本發明的第二個實施方式是分析內皮細胞制備物對于接種在血管移植物中的適宜性的方法。內皮細胞制備物被接種在適合內皮細胞的培養基中3天或更短的時間。培養基處于具有包被了細胞外基質蛋白的表面的容器(vessel)中。確定制備物中粘附到表面的細胞的量。本發明的另一實施方式是分離自脂肪組織的內皮細胞群。該細胞群具有下述特征細胞群中大于80%的細胞是存活的；細胞群中大于80%的細胞是內皮細胞；細胞群中大于50%的細胞在接種在基底(substrate)上的24小時內粘附到基底上。本發明的又一實施方式是包含接種到其內腔上的內皮細胞的人工血管移植物。內皮細胞以大于50,000個細胞/平方厘米的密度粘附到內腔。在閱讀詳細描述之后，本發明的這些實施方式和其它實施方式對于本領域普通技術人員將是顯而易見的。圖h用不同的酶孵育不同時間的細胞產量。圖2:用不同的酶孵育不同時間的細胞存活。圖3:消化后內皮細胞的百分率。圖4:應用FACS分析，表征CD31純化的內皮細胞。圖5:純化的內皮細胞在培養中顯示鵝卵石形態。圖6A:純化的內皮細胞在培養中為vWF染色陽性。圖6B顯示細胞的核染色。圖7:(圖7A)未處理的工程化血管移植物的表面，平滑的膠原表面，沒有內皮細胞存在。(圖7B)在16小時內粘附到纖連蛋白包被的工程化血管移植物的CD31微珠純化的EC。移植物是從組織工程化動脈的去細胞化(decellularization)產生的。這些純化的EC細胞非常迅速地粘附到纖連蛋白包被的工程化血管移植物上。在約16小時內，約50M的表面區域已覆蓋有純化的EC。此實例中的大致細胞密度為110,000個細胞/平方厘米。圖8:來自脂肪的脂肪衍生內皮細胞，其在工程化血管移植物上被接種16小時。細胞接種明顯密集。此外，移植物表面上的細胞伸展由箭頭標出，其為牢固粘附的指示。圖9A-9D:CD31+細胞在第4天在DMEM/10%FBS/MVGS中培養。這些細胞分離自A:LB1、B:LB2、C:LB3、D:粗制I型膠原酶消化；圖9A:LB1、圖9B:粗制I型膠原酶、圖9C:LB2、圖9D:LB3。具體實施例方式我們描述了應用純化的i型膠原酶和n型膠原酶，結合純化的中性蛋白酶，以使酶變異和細胞損傷在分離期間減到最少的細胞分離方法。這種純化的酶配制物有助于通過此方法分離的細胞的高存活和高鋪板效率。我們使用CD31微珠富集脂肪來源的EC細胞。可以獲得如84。/。高的CD144陽性EC。我們發現，CD31選擇后的EC純度與選擇前的EC百分比有關。純化的EC表達EC特異性標記物，如CD31、CD34、CD144和CD146,并且它們對CD105、CD133、CD117和CD141的表達呈陰性或表達弱。這些來自脂肪的純化的EC群體顯示出非常高的存活和快速的粘附速率。與己經報道的其它方法——其或是產生低的純度或是低的存活/鋪板效率——相反，存活和鋪板這兩種特性與高純度相結合使這種分離方法真正可應用到臨床。分離自脂肪的EC細胞可以不具有與分離自脈管系統的EC—樣的全部相同特征。[22]內皮細胞以微血管內皮和大血管內皮的形式存在于身體所有組織中。為了從各種組織分離細胞，典型的是崩解組織，并且隨后從也存在于該組織內的其它細胞中選擇內皮細胞。本發明涉及從組織獲得內皮細胞的方法，其涉及崩解步驟、內皮細胞選擇步驟。在本發明的一些實施方式中，在崩解之前或崩解之后可以利用離心或其它的分離步驟以幫助獲得內皮細胞。為崩解組織，可以采用幾種技術。在一個實施方式中，可以使用機械攪拌和/或物理切碎以打碎組織結構。扭壓組織或促使其通過濾網也可以崩解大的組織。也可以使用劇烈攪拌。可選地(或此外)，可以使用蛋白酶如細菌膠原酶、彈性蛋白酶、或中性蛋白酶破碎包含組織細胞的細胞外基質。可以使用純化的膠原酶，尤其是耗盡了胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或嗜熱菌蛋白酶的那些酶。可以使用離子螯合劑如EDTA，其結合介導細胞與基質粘附的二價陽離子，從而將細胞從其周圍蛋白質中釋放出來。所有這些技術可以在室溫或高于室溫的溫度如37i:下進行，這可以使各種蛋白酶的活性最大化。可以改變孵育溶液的pH以增加組織的崩解，典型的pH值的范圍為4.0-10.0。這些處理的應用時間可以從1分鐘至長如24小時變化，這取決于組織密度和細胞外基質的強度。在一些實施方式中，在崩解步驟后，可以利用離心步驟作為收集細胞的方法。離心可以發生在任何類型的標準緩沖液中，或可以發生在專門的離心梯度溶液如Ficoll梯度中。離心步驟對于其中周圍組織具有與內皮細胞不同的物理密度的組織尤其有利。例如，可以通過離心來改進從脂肪組織或從骨髓——兩者都包含高密度的脂肪細胞——的內皮分離。離心可以將低密度的脂肪細胞從較高密度的內皮細胞中分離。然而，一般地，單獨的離心對于從組織中選擇分離內皮是不夠的。這是因為其它的細胞類型如成纖維細胞和周細胞可以具有與內皮細胞相似的密度。因此，即使使用離心，為獲得高的內皮純度如大于80%、85%、90%或95%，隨后的純化步驟通常是必要的。可以在任何適合細胞的緩沖液(一種或多種)中洗滌組織和細胞，所述緩沖液例如，包括磷酸鹽緩沖液。也可以使用細胞培養基。可以將洗過的組織和/或細胞在沉淀或離心后輕輕倒出，以分離遷移到不同相中的細胞類型和細胞碎片。作為內皮細胞分離中的額外步驟，使用細胞選擇。選擇可以是"陽性的"，其中利用內皮細胞特性或標記物來選擇細胞，或者選擇可以是"陰性的"，其中可以利用組織或離心球內的其它細胞類型的特性將這些其它細胞類型從內皮細胞中排除或除去。與本發明相容的分選方法的類型包括磁珠分離(MACS)、熒光激活細胞分選(FACS)以及淘析。可被用于選擇的內皮細胞特異性標記物的例子包括血管內皮生長因子(VEGF)的表面受體、血管內皮鈣黏著蛋白(VE-Cadherin)、血小板內皮細胞粘附分子(PECAM或CD-31)、CD34(CD62(L-選擇素)的配體)、表面凝集素(其被UEA-I所結合)、馮威勒布蘭特因子(vonWillebrandfactor)、P-選擇素、E-選擇素、血管內皮細胞粘附分子(VCAM-1)、CD144(鈣黏著蛋白-5，VE-鈣黏著蛋白)、CD146(MCAM、MUC18、S-endo)、和細胞間粘附分子(ICAM-1)。在這些中，對本發明最有利的那些可以包括在未活化內皮細胞的表面表達的那些，并且將包括CD-31、VE-鈣黏著蛋白、VEGF受體以及凝集素。這些列舉僅僅是示例性的并且不是限制性的。陰性選擇性標記物的例子將是組織內其它細胞類型的那些表面標記物，并且將因此而有些組織特異性。許多CD標記物與本發明相容，尤其是識別組織中污染細胞類型如成纖維細胞的那些標記物。作為具體例子，成纖維細胞、周細胞和平滑肌細胞表達血小板衍生生長因子的表面受體(PDGF受體)，并且這種標記物可以被用于選擇細胞，以便從內皮細胞群中排除或除去。可以作為陰性選擇標記物被靶向的具體抗原包括CD14、CD45和F19。如果FACS或磁珠細胞分選被用于細胞選擇，那么上述類型的陽性或陰性標記物中的一種或一些組合將被用于實現選擇。一般地，細胞特異性標記物的特異性抗體或其它結合分子將被結合到熒光團以進行FACS，或者將被結合到磁珠以通過MACS進行細胞分離。可以利用陽性選擇或陰性選擇，或者，在一些實施方式中，可以利用陽性選擇和陰性選擇的組合。可選地，可以利用以幾種標記物、陽性和/或陰ii性地進行選擇。可選地，淘選可被用作選擇方法；這種方法依賴于組織中的內皮細胞和其它細胞的具體尺寸和密度特征。內皮尺寸和密度的具體范圍—其可以與組織中其它細胞類型的尺寸和密度僅僅略微不同——可以被用于從組織中保留的細胞類型中選擇內皮細胞。此外，預見到一個特定的選擇方法不排除使用額外的方法。也就是說，在本發明的范圍內可以同時或順序使用幾種內皮細胞選擇方法。也可以重復某些步驟以獲得更好的純化或產量。引人注目地，本發明的內皮細胞制備物高度并快速粘附到適當的基底上。因此，我們已觀測到，與基底的粘附以高比率和高密度并且在短的時間段內發生。粘附可以被評價，例如，在接種后12小時、18小時、24小時、36小時、48小時、和/或72小時。在如這些時間一樣短的時間時，我們已經觀測到顯著的粘附率。可以在容器如載片或培養容器表面，或在血管移植物上評價粘附。快速粘附到基底("粘附性")和高存活以及內皮純度包含在本發明的細胞群的標志性特征(signatureproperties)中。合適的基底典型地包被有細胞外基質蛋白質。這些蛋白質可以包括膠原蛋白、纖連蛋白和明膠。本發明的細胞群在接種后12小時、18小時、24小時、36小時、48小日寸、和/或72小時達到至少50%的粘附。根據本發明的內皮細胞群是高存活的。不被任何理論或機制所束縛，據認為，現有技術的崩解方法如此粗糙以致于存活和粘附性受到不利影響。本發明的細胞群的至少50%、60%、70%、80%、或甚至90%是存活的。根據本發明的內皮細胞群是高純度的。采用評價內皮細胞同一性的現代標準，即采用如上所述的適當抗原標記物，本細胞群是至少約50%、60%、70%、80%、或甚至90%的內皮細胞。這種內皮細胞標記物包括CD31+、CD34+、CD144+、CD146+、CD133-、CD45-、CD117-、和/或CD14F。而且，內皮細胞可以通過它們在培養中分泌tPA和前列環素的能力來表征。所有這些標記物可能不在內皮細胞制備物中被同樣地充分表達。此外，不意圖被任何理論所束縛，假定現有技術的細胞群由于真實內皮細胞的比率禾n/或低存活而相對于它們意圖的目的是不成功的。高內皮細胞純度、高存活和高粘附的組合結果使待取自患者的吸脂樣品能夠接收血管移植物，快速處理所述樣品以使所獲得的細胞能被用于定位在血管移植物的內腔，并且在同一天或兩天或三天內將所述血管移植物植入到同一患者內。而且，這些特征使內腔的內皮細胞以大于50,000個細胞/平方厘米、大于75,000個細胞/平方厘米、大于85,000個細胞/平方厘米、大于95,000個細胞/平方厘米、大于105,000個細胞/平方厘米、大于110,000個細胞/平方厘米的密度的群集。這樣高的細胞密度將增加開放性并減少血管移植物的失敗。實施例1皮下脂肪組織獲自吸脂術或其它手術程序。切碎脂肪組織并且隨后用細菌膠原酶作用以實現崩解。隨后離心崩解的組織以便將脂肪細胞從其它細胞類型(包括內皮細胞)中分離，其它細胞存在于離心球(離心沉淀物，centriftigedpellet)中。重懸離心球，之后進行針對內皮特異性標記物的基于抗體的選擇。采用針對內皮表面分子VE-鈣黏著蛋白的熒光激活的細胞分選。在這些條件下，崩解后，在離心球中，每克脂肪組織產生一百萬至一百二十萬個細胞。針對VE-鈣黏著蛋白的細胞分選導致內皮細胞選擇。我們已經發現，在離心細胞球中的內皮細胞含量為約15-20%。這轉變為每克脂肪中大約200,000個內皮細胞。內皮細胞的細胞存活一般為85-90%，如通過7AAD染色所評定的。因此，如果從指定的患者獲得10克皮下脂肪(相應于2茶匙)，則獲得大約二百萬活的內皮細胞，該數量足以排列于血管移植物的內部，如可能被用于搭橋手術。分離的內皮細胞的純度為大約90%，如通過重復熒光激活的細胞分選所評定的。實施例2我們檢測了消化吸脂組織并釋放內皮細胞(EC)的LiberaseBlendzymes(RocheDiagnostics,Indianapolis,Indiana)。LiberaseBlendzymes由純化的膠原酶和其它蛋白酶組成，而且不同的批次具有相同的酶活性。因此，可以避免由酶批次而產生的變化。細胞產量(細胞數目/克脂肪)和細胞存活(采用7-AAD通過FACS測量)被顯示在圖1和圖2中。具有相同孵育時間(30分鐘)的LB1和LB3之間的平均細胞產量相似，為每克脂肪中大約5"05個細胞。應用LB3時，更長孵育時間(40分鐘)幾乎使細胞產量加倍(1><106)而具有相當的細胞存活。采用不同的LiberaseBlendzyme酶和消化時間，作為從脂肪組織釋放的全部非脂肪細胞的一部分的EC的百分率是相似的，如所示(圖3)。這些細胞在酶消化后沒有通過任何方式純化，而只是通過針對內皮特異性標記物進行FACS分選而進行表征。這些數據顯示，在酶消化之后，非脂肪細胞群是混合的，具有與其它細胞類型混合的內皮細胞部分。不純化這種由酶消化產生的混合細胞群，則該混合群對于接種到血管移植物上而言不是最佳的，因為污染的成纖維細胞和其它細胞類型會促進內膜增生和移植失敗。應用利用CD31微珠的陽性選擇純化來源于酶消化后的混合細胞群。純化的EC表達CD31、CD34、CD144和CD146;并且它們為CD105和CD141陰性(圖4)。如通過對內皮高度特異的標記物——CD144(VE-鈣黏著蛋白)表達所評定的，該群體的內皮純度為80%以上。純化的EC在培養中生長，顯示出典型的EC鵝卵石形態(圖5)，并且免疫細胞化學染色顯示馮威勒布蘭特因子(vWF)陽性(圖6)。馮威勒布蘭特因子(vWF)是高度分化內皮的標記物，說明用該技術分離的EC的高的功能性。純化的EC細胞在約IO小時內粘附到纖連蛋白包被的、工程化的血管移植物上。移植物由組織工程化動脈的去細胞化產生。去細胞化的移植物內腔表面沒有內皮，光滑并且是蛋白質的(圖7A)。純化的EC細胞非常快速地粘附到纖連蛋白包被的工程化血管移植物上。在大約16小時中，約50。/。的表面區域已經被純化的EC所覆蓋。本實施例中的近似細胞密度為110,000個細胞/平方厘米(圖7B)。[39]已經檢測了應用抗-CD31微珠的陽性選擇的EC富集。表達EC特異性標記物CD144的細胞的百分數被用于測定EC的純度。CD31富集后的EC純度與富集之前EC的百分數直接相關(表l)。用本方法所觀測到的最高EC純度為大約87%。這反映了純化前個體間關于EC百分數的顯著不同。表1.富集后的EC純度取決于富集前的EC%。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>從LB1消化釋放的細胞在EBM-A培養基中培養IO小時后具有最高的鋪板效率(表2，圖9A-9D)。來自LB1消化的鋪板效率為至少58%。這顯著高于用LB2和LB3觀察到的鋪板效率。重要的是，鋪板效率比應用其他人使用的粗制膠原酶的鋪板效率更高。本發明的一個關鍵方面是來自脂肪組織的高部分的純化EC的快速鋪板(在這種情況下，在10小時或更短的時間內)。使用LB1釋放并隨后純化的細胞具有這樣高的鋪板效率的潛在原因可能是中性蛋白酶(在LB1中)是比嗜熱菌蛋白酶(在LB3中)更溫和的酶，并且用LB1消化的細胞可能因此保留細胞粘附所需的受體。此外，非純化的膠原酶也可能損傷細胞，并且導致比高度純化形式的酶低的鋪板效率。表2.在EBM-A中培養10小時后的鋪板效率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>'EC恢復(％)=(起始細胞數目x純化前的EC%)/(CD31陽性收集物x純化后的EC。/。)xl00實施例3-材料與方法1.材料l丄組織脂肪組織樣品從吸脂抽吸(liposuctionaspirates)或切開的皮下脂肪組織獲得。1.2.試劑1.2丄無鈣鎂的磷酸鹽緩沖液(PBSlx)或無鈣鎂的Hanks'平衡鹽緩沖液(HBSSlx)(Gibco)1.2.2.M199培養基(Gibco)1.2.3.EBM-2培養基(Clonetics)1.2.4.)RPMI(Gibco)1.2.5.牛血清白蛋白(BSA)(MiltenyiBiotech)1.2.6.LiberaseBlendzyme1禾口LiberateBlendzyme3(Roche)1.2.7.I型膠原酶(Sigma)1.2.8.L-谷氨酰胺(Invitrogen)1.2.9.氫化可的松(Sigma)1.2.10.聯丁酰基環AMP(Sigma)1.2.11.青霉素-鏈霉素溶液(lOO，Signal)1.2.13.胰蛋白酶-EDTA(0.25毫克/毫升)(Invitrogen)1.2.14.乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)(Sigma)1.2.15.胎牛血清(FBS)，認證的，熱失活的(US)(Gibco)1.2.16.CD31微珠(MiltenyiBiotech)1.2.17.FcR封閉劑(blockingreagent)(MiltenyiBiotech)1.2.18.CD31-Fitc(BD)1.2.19.CD45-APC(BD)1.2.20.CD105Fitc(Chemicon)1.2.21.CD117APC(BD)1.2.22.CD133PE(BD)1.2.23.凝血調節蛋白(CD141-PE,BD)1.2.24.Ve-轉黏著蛋白-PE(CD144-PE,eBiosciences)1.2.25.CD146-PE(BD)1.2.26.Uea-l-fitc(Biomeda)1.2.27.7-AAD(BD)1.2.28.vWF(馮威勒布蘭特因子)抗體(Dako)1.2.29.4。/。多聚甲醛(USB)1.2.30.曲拉通(Triton)X-100(Sigma)1.2.31.吐溫-20(Sigma)1.2.32.4，,6-二脒基-2-苯基吲哚，二鹽酸化物(DAPI)(MolecularProbes)1.3.供應品1.3.1.500ml塑料離心瓶(Corning)1.3.2.0.2(im濾器單元(Nalgene)1.3.3.50ml圓錐形管(Coming)1.3.4.15圓錐形管(Coming)1.3.5.5ml聚苯乙烯管(BD)1.4設備1.4.1.AutoMACSSeparator是臺式自動化的磁性細胞分選器(MiltenyiBiotech)1.4.2.BDFACSCalibur系統(BD)1.4.3.滴定板振動器(TiterPlateShaker)(Lab-LineInstruments)1.4.3.離心機(Beckman)1.4.4.生物安全超凈臺(BiosafetyHood)1.4.5.C02培養箱(NUAIR)1.4.6.倒置顯微鏡——帶有Epi-熒光附件(滎燈照明器型號名稱(MercuryLampIlluminatormodelname):C-SHG)(NikonInstrumentsIncorporation,Melville,NY)并且配備有照相機光度冷拍(cameraphotometriccool-snap)(Nikon)的NikonEclipseTSIOO。1.5.培養基儲存液所有的培養基溶液通過0.2過濾器單元過濾并且在50毫升管中于-2(TC冷凍。1.5.1.EBM-A培養基EBM-2基礎培養基(CLOTECH)20%FBSL-谷氨酰胺(0.292毫克/毫升)氫化可的松(1微克/毫升)19DicAMP(0.25毫克/毫升)1%青霉素-鏈霉素抗生素溶液1.5.2.基于DMEM的培養基DMEM(Invitrogen)腦FBS1xMVGS(CascadeBiologies)青霉素-鏈霉素2.方法在運送到實驗室之后，立即處理吸脂樣品以分離MVEC。如果不能立即處理樣品，將其保存在室溫下并且在24小時內處理。進行實驗之前，將水浴升溫至37'C。下列所有的操作在生物安全超凈臺中進行。2丄分離2丄1.升溫500或更多的具有0.1。/。葡萄糖的PBS或HBSS緩沖液。用一次性工作臺(bench)保護器覆蓋生物安全超凈臺的表面。2丄2.制備消化溶液(0.75單位/毫升LiberaseBlendzymel(LBl)或LiberaseBlendzyme3(LB3)或4毫克/毫升I型膠原酶，在含有4毫克/毫升BSA和0.1%葡萄糖的PBS或HBSS中)并使其在37。C水浴中保溫。2丄3.將M199和EC培養基在37。C水浴中保溫。2.1.4.制備RPMI/1%FBS/2mMEDTA并保持在4°C。2丄5.為了保持最佳的無菌條件，在生物安全工作臺下打開用于吸脂程序的手術容器。將200毫升脂肪組織分散在500毫升離心瓶(Coming)中。加入等體積的溫熱PBS或HBSS。攪拌洗滌組織，然后進行相分離3-5分鐘。吸出下漂浮(infranatant)溶液(較低的液相)。重復洗漆幾次直到獲得清澈的下漂浮溶液(通常3-4次)。2丄6.最后一次洗滌后以1500-2000轉/分鐘將細胞離心5-15分鐘。吸出下漂浮溶液。測量脂肪組織并且每1克脂肪加入大約1毫升溫的LB1或LB3、或I型膠原酶溶液。蓋緊蓋子并將它們放置在37"C培養箱中的振蕩器上，輕輕振蕩30-40分鐘。每10分鐘手動混和組織。2丄7.加入150毫升溫的M199培養基并且以1200轉每分鐘離心細胞5分鐘。2丄8.旋轉之后，EC以及其它細胞將在瓶或管的底部形成球(團)(這通常將包括暗紅色細胞層)。小心地除去油和脂肪的頂層、主要脂肪細胞(黃色的懸浮細胞層)和消化溶液的下層。留下小量的膠原酶溶液在球的上面，以使細胞不被弄亂。2丄9.將細胞懸浮在10毫升溫的M199培養基中并且用70微米的細胞濾網過濾細胞。在室溫下，在合適的離心機中以1200轉/分鐘將細胞離心5分鐘。2丄10.吸出剩余的培養基。在吸出時，吸液管的尖端應該從頂部吸以盡可能徹底地除去油。細胞球應該在管的底部。2.1.11.在每一個管中，用10毫升的冷RPMI/1%FBS/2mMEDTA培養基重懸細胞。在一個50毫升圓錐形管中匯集細胞。通過70微米的濾網過濾細胞。2丄12.移出150微升細胞懸液并使用Sysmex計數細胞。2.2.用CD31微珠富集EC2.2丄將25xl0、50xl(^個細胞轉移到15毫升的圓錐形管并以1200轉/分鐘在室溫下離心5分鐘。2.2.2.吸出上清并且懸浮細胞，至每60微升RPMI/1%FBS/2mMEDTA培養基1(^106個細胞的最大濃度。每1(^106個細胞加入20微升FcR封閉劑。簡單混和，并且隨后每10xl(^個細胞加入20微升CD31-微珠。在4'C孵育細胞15分鐘。2.2.3.孵育后，用RPMI/1%FBS/2mMEDTA培養基漂洗細胞并且以300g離心細胞IO分鐘。2.2.4.在2毫升RPMI/1%FBS/2mMEDTA培養基中懸浮細胞球。2.2.5.將細胞加載在autoMACS上并且使用POSSELD程序分離。2.2.6.收集CD31陽性細胞和CD31陰性細胞。2.2.7.將150微升CD31陽性細胞或CD31陰性細胞轉移到微量離心管并且應用Sysmex計數細胞。2.2.8.應用熒光激活的細胞分選(FACS)在CD31分離之前和之后表征細胞。通過用7-AAD對細胞染色，使用FACS測定存活。2.3鋪板效率2.3丄以2-5xl0V平方厘米的密度，將CD31純化的EC接種在ECM如纖連蛋白、明膠、膠原蛋白I包被的，含有EC培養基如EBM-A或MEM/10%FBS/MVGS的培養板中并在5%C02、37°C的培養箱中培養。2.3.2.第二天，輕微搖動平板并且將含有未粘附的細胞的培養基收集在管中。用PBS漂洗細胞并且將細胞收集在同一個管中。向培養板加入新鮮培養基并放回到培養箱中。2.3.3.以1500轉/分鐘離心收集的培養基5分鐘。2.3.4.吸取培養基并且將細胞懸浮在200到500微升的PBS中。劇烈吸吹細胞并且使用Sysmem計數細胞。2.3.5.鋪板效率=(全部接種細胞的數目-漂浮細胞的數目)/全部接種細胞)。4.細胞表征收集CD31微珠分離之前和之后以及培養48小時的細胞并且通過FACS分析CD31、CD34、CD45、CD141和CD144、CD146的表達而進行表征。用4%多聚甲醛固定來自96孔板的一些細胞并且對vWF、eNOS或CD31染色。2.5.在人工移植物上接種EC在37。C，在6孔板中用人粘連蛋白(100微克慮升)對0.5x0.5厘米的HumacyteTM工程化移植物片包被^小時。然后將CD31微珠選擇的EC(lxl0、5xl0"加入到孔中并在培養箱中孵育10-16小時。所述移植物在福爾馬林中固定并且用掃描電子顯微鏡(SEM)對這些移植物進行掃描。參考文獻1.AmericanHeartAssociation-HeartDiseaseandStrokeStatistics.2006Update.http:〃www.americanheart.Org/downloadable/heart/1166711577754HS—StatsInsideText.pdf2.PomposelliFBJr,AroraS,GibbonsGW,FrykbergR，SmakowskiP,CampbellDR,FreemanDV3LoGerfoFW.Lowerextremityarterialreconstructionintheveryelderly:successfuloutcomepreservesnotonlythelimbbutalsoresidentialstatusandambulatoryfunction.JVaseSurg.1998;28(2):215-25.3.VeithFJ,MossCM，SprayregenS，MontefUscoC.Preoperativesaphenousvenographyinarterialreconstructivesurgeryofthelowerextremity.Surgery.1979;85(3):253-6.4.VeithFJ,GuptaSK，AscerE，White-FloresS,SamsonRH，ScherLA,TowneJB,BernhardVM，BonierP，FlinnWR,etal.Six-yearprospectivemulticenterrandomizedcomparisonofautologoussaphenousveinandexpandedpolytetmfluoroethylenegraftsininfrainguinalarterialreconstructions.JVaseSurg.1986;3(1):104-14.5.TiwariA,SalacinskiHJ,HamiltonG,SeifalianAM.Tissueengineeringofvascularbypassgrafts:roleofendothelialcellextraction.EurJVaseEndovascSurg.2001;21(3):193-201.Review.6.ZillaP,FasolR,DudeckU,SiedlerS,PreissP，FischleinT,Muller-GlauserW,BaitellaG,SananD,OdellJ，etal.Insitucannulation，microgridfollow-upandlow-densityplatingprovidefirstpassageendothelialcellmassculturesforinvitrolining.JVaseSurg.1990;12(2):180-9.7.JarrellBE,WilliamsSK，StokesG，HubbardFA,CarabasiRA，KoolpeE,GreenerD，PrattK，MoritzMJ,RadomskiJ，etal.Useoffreshlyisolatedcapillaryendothelialcellsfortheimmediateestablishmentofamonolayeronavasculargraftatsurgery.Surgery.1986;100(2):392畫9.8.WilliamsSK,JarrellBE，RoseDG,PontellJ,KapelanBA，ParkPK，CarterTL.Humanmicrovesselendothelialcellisolationandvasculargraftsoddingintheoperatingroom.AnnVaseSurg.1989Apr;3(2):146-52.9.PasicM,Muller-GlauserW,vonSegesserL,OdermattB,LachatM,TurinaM.Endothelialcellseedingimprovespatencyofsyntheticvasculargrafts:manualversusautomatizedmethod.EurJCardiothoracSurg.1996;10(5):372-9.10.WilliamsSK,RoseDG,JarrellBE.MicrovascularendothelialcellsoddingofePTFEvasculargrafts:improvedpatencyandstabilityofthecellularlining.JBiomedMaterRes.1994Feb;28(2):203隱12.11.WilliamsSK,JarrellBE，KleinertLB.Endothelialcelltransplantationontopolymericarteriovenousgraftsevaluatedusingacaninemodel.JInvestSurg,1994Nov-Dec;7(6):503畫17.12.ParkPK,JarrellBE,WilliamsSK，CarterTL,RoseDG，Martinez-HernandezA,CarabasiRA3rd.Thrombus-free,humanendothelialsurfaceinthemidregionotaDacronvasculargrattintnesplanchnicvenouscircuit—observationsafterninemonthsofimplantation.JVaseSurg.1990;11(3):468誦75.13.MeerbaumSO.SharpWV,SchmidtSP.Lowerextremityrevascularizationwithpolytetrafluoroethylenegraftsseededwithmicrovscularendothelialcells.In:Zilla，P,Fasol，R.Callow,A.editors.AppliedCardiovascularBiology1990-91.InternationalSocietyForAppliedCardiovascularBiology.2nded.Basel:Karger,1992,ppl07-119etal.2414.SharpWV,SchmidtSP,MeerbaumSO,PippertTR.DerivationofhumanmicrovascularendothelialceIsforprostheticvasculargraftseeding.AnnVaseSurg.1989;3(2):104-7,15.SterpettiAV,HunterWJ,SchultzRD，SugimotoJT3BlairEA,HackerK，ChasanP，ValentineJ.Seedingwithendothelialcellsderivedfromthemicrovesselsoftheomentumandfromthejugularvein:acomparativestudy.JVaseSurg.1988;7(5):677-84.16.ArtsCH，HedemanJoostenPP,BlankensteijnJD，StaalFJ，NgPY,Heijnen-SnyderGJ,SixmaJJ,VerhagenHJ，deGrootPG，EikelboomBC.Contaminantsfromthetransplantcontributetointimalhyperplasiaassociatedwithmicrovascularendothelialcellseeding.EurJVaseEndovascSurg.2002;23(l):29-38.17.ArtsCH,BlankensteijnJD,Heijnen-SnyderGJ，VerhagenHJ，HedemanJoostenPP，SixmaJJ,EikelboomBC3deGrootPG.Reductionofnon-endothelialcellcontaminationofmicrovascularendothelialcellseededgraftsdecreasesthrombogenicityandintimalhyperplasia.EurJVaseEndovascSurg.2002;23(5):404-12.18.HewettPW，MurrayJC.ImmunomagneticpurificationofhumanmicrovesselendothelialcellsusingDynabeadscoatedwithmonoclonalantibodiestoPECAM-I.EurJCellBiol.1993;62(2):451-4.19.ArtsCH,deGrootP，Heijnen-SnyderGJ，BlankensteijnJD，EikelboomBC，Slaper-CortenbachIC.ApplicationofaclinicalgradeCD34-mediatedmethodfortheenrichmentofmicrovascularendothelialcellsfromfattissue.Cytotherapy.2004;6(l):30-42.20.MiebachS,GrauS,HummelV，RieckmannP3TonnJC,GoldbrunnerRH.IsolationandcultureofmicrovascularendothelialcellsfromgliomasofdifferentWHOgrades.JNeurooncol.2006;76(l):39-48.21.ArtsCH，Heijnen-SnyderGJ，JoostenPP，VerhagenHJ,EikelboomBC:SixmaJJ,deGrootPG.Anovelmethodforisolatingpuremicrovascularendothelialcellsfromsubcutaneousfattissueidealfordirectcellseeding.LabInvest.2001;81(10):1461-5.22.WilliamsSK3McKenneyS3JarrellBE.Collagenaselotselectionandpurificationforadiposetissuedigestion.CellTransplant.1995;4(3):281-9.權利要求1.從脂肪組織制備內皮細胞的方法，其包括洗滌從吸脂術患者獲得的脂肪組織；收集來自所述洗滌的脂肪組織的細胞；用純化的膠原酶制備物酶處理所述細胞，其中所述制備物被耗盡胃蛋白酶、胰蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶；通過與包含第一抗體的磁珠接觸來分選所述處理細胞，所述第一抗體對選自CD31、CD34、CD144和CD146的第一組的抗原或選自CD14、CD45和F19的第二組的抗原具有特異性；如果所述抗體對于所述第一組中的抗原具有特異性，則收集結合到所述磁珠的細胞，如果所述抗體對于所述第二組具有特異性，則收集未結合到所述磁珠的細胞。2.:權利要求l所述的方法，其中所述收集的細胞在吸脂術的3天內被接種到血管移植物上。3.權利要求l所述的方法，其中所述收集的細胞在吸脂術的2天內被接種到血管移植物上。4.權利要求1所述的方法，其中所述收集的細胞在吸脂術的1天內被接種到血管移植物上。5.權利要求1所述的方法，其中所述血管移植物被植入到所述吸脂術患者體內。6.權利要求1所述的方法，其中包含一種以上抗體的磁珠與所述處理細胞接觸。7.權利要求1所述的方法，其中所述純化的膠原酶制備物包含中性蛋白酶。8.權利要求1所述的方法，其中所述膠原酶來自溶組織梭菌(C7oiWww/h'加/Wc讀)。9.權利要求7所述的方法，其中所述中性蛋白酶來自多粘芽孢桿菌(5acz7/ws/o/戸f:ca)。10.分析內皮細胞制備物對于接種在血管移植物中的適宜性的方法，其包括在適合內皮細胞的培養基中培養內皮細胞制備物3天或更短的時間，其中所述培養基在具有包被了細胞外基質蛋白的表面的容器中；測定所述制備物中粘附到所述表面的細胞的數量。11.權利要求10所述的方法，其中所述內皮細胞制備物被培養2天或更短的時間。12.權利要求10所述的方法，其中所述內皮細胞制備物被培養1天或更短的時間。13.分離自脂肪組織的內皮細胞群，所述細胞群具有下列特征所述細胞群中大于80%的細胞是存活的；所述細胞群中大于80%的細胞是內皮細胞；所述細胞群中大于50%的細胞在接種在基底上的24小時內粘附到所述基底上。14.權利要求13所述的細胞群，其中所述細胞群中大于50%的細胞在接種到所述基底上的12小時內粘附到所述基底上。15.權利要求13所述的細胞群，其中所述內皮細胞是CD31+。16.權利要求13所述的細胞群，其中所述內皮細胞是CD31+、CD34+、CD144+、CD146+、CD133—、CD117-、禾HCD14F。17.權利要求13所述的細胞群，其中所述內皮細胞得自吸脂樣品。18.權利要求13所述的細胞群，其中所述內皮細胞在培養中分泌tPA和前列環素。19.包括接種到其內腔上的內皮細胞的人工血管移植物，其中所述內皮細胞以大于50,000個細胞/平方厘米的密度粘附到所述內腔。20.權利要求19所述的移植物，其中所述細胞以大于75,000個細胞/平方厘米的密度粘附。21.權利要求19所述的移植物，其中所述細胞以大于85,000個細胞/平方厘米的密度粘附。22.權利要求19所述的移植物，其中所述細胞以大于95,000個細胞/平方厘米的密度粘附。23.權利要求19所述的移植物，其中所述細胞以大于105,000個細胞/平方厘米的密度粘附。24.權利要求19所述的移植物，其中所述細胞以大于110,000個細胞/平方厘米的密度粘附。全文摘要已證明脂肪組織作為適合組織工程的內皮細胞或血管內皮細胞的豐富、易得并且充足的來源。我們描述了使用純化酶和基于抗體的選擇來分離和純化內皮細胞的詳細方法。所述細胞可以從吸脂術獲得并被用在血管移植物中。文檔編號C12N5/02GK101437937SQ200780013885公開日2009年5月20日申請日期2007年3月7日優先權日2006年3月7日發明者L·E·尼克拉松,Y·李申請人:哈瑪賽特公司