用于提高作物植物中的氮利用效率的基因的制作方法

專利名稱：：用于提高作物植物中的氮利用效率的基因的制作方法
技術領域：
：本發明一般地涉及分子生物學領域。
背景技術：
：許多植物的馴化與產量的極大提高相關。自然群體中存在的大多數表型變異是持續的并且受到多基因影響的作用。負責馴化的植物中產量的極大差異的特定基因的鑒定已經成為農業研究的重要焦點。影響產量的基因的一個群是氮利用效率(NUE)基因。這些基因用于提高作物植物，尤其是玉蜀黍中的氮的利用。所述基因可以用于改變植物的遺傳組成，使得它們以目前的施肥標準可以更多產，或者以顯著減少的肥料輸入維持它們的生產率。提高的氮應用效率可以起因于氮肥的增強的攝取和同化和/或積聚的氮儲備的后來的再流通和再利用。因此包含這些基因的植物可以用于提高產量。在氮肥的獲得受限的發展中國家中和在氮利用的水平維持較高的發達國家中，提高玉米中的氮利用效率將提高每個單位的輸入氮肥的玉米可收獲的產量。氮利用的提高還允許降低農場上的輸入成本(on-farminputcosts)、降4氐對氮肥生產所需的不可再生能源的利用和依賴、以及降低氮肥制造和農業應用對環境的影響。
發明內容本發明提供了當前NUE序列的多核苷酸、相關多肽和所有保守修飾的變體。本發明提供了NUE基因的序列。本發明介紹了改變作物植物，尤其是玉蜀黍的遺傳組成的方法，以便這樣的作物可以以目前的施肥更多產和/或以顯著減少的肥料輸入同樣多產。因而本發明的這類應用不僅產量提高，而且肥料成本降低，相應的對環境的影響減小。過去還未由科學家實現任何商業可行意義上的為了提高氮利用效率的作物植物的內在遺傳的遺傳增強。這個發明獨特地利用已經在氮利用方面顯示出不同的高度選擇的玉蜀黍植物組。隨后對所述植物進行mRNA性狀(profiling)方面的試驗和數據分析以產生用于作物植物(尤其是玉蜀黍)的修飾以提高氮利用效率的成組基因。因此，在一個方面，本發明涉及包含編碼NUE基因的分離的多核苷酸序列的分離的核酸。本發明的一個實施方式是包含選自由以下構成的組的核苷酸序列的分離的多核苷酸(a)包含SEQIDNO:l、3、5、7、9、"1、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、,55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、,81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311或313的核苷酸序列；(b)編碼包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、.28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、畫、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、訓、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312或314的氨基酸序列的核苷酸序列；以及(c)包<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、,34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、.60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、；S2、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、〗04、106、108、110、112、114、U6、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、68、170、172、174、176、178、180、182、84、186、188、l卯、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312或314具有至少70%的序列同一性的氨基酸序列，其中所迷多肽具有提高的氮利用效率活性。在另一方面，本發明涉及包含所述的核酸的重組表達盒。另外，本發明涉及包含所述重組表達盒的載體。此外，包含所述重組表達盒的所述載體可以促進宿主細胞中所述核酸的轉錄和翻譯。本發明還涉及能夠表達本發明的多核苷酸的宿主細胞。可以使用許多宿主細胞，例如但不限于，微生物、哺乳動物、植物、或昆蟲。在另一實施方式中，本發明針對轉基因植物或植物細胞，包含本發明的核酸。包含本發明的多核苷酸的優選的植物包括而不限于玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉(cariola)、小麥、苜蓿、棉花、稻米、大麥、番茄、及黍(millet)。在另一實施方式中，所述轉基因植物是玉蜀黍植物或植物細胞。另一實施方式是來自可操作地連接到驅動在植物中的表達的啟動子的本發明的轉基因NUE多肽的轉基因種子。本發明的植物可以具有與對照植物相比改變的NUE。在一些植物中，NUE在營養組織、再生組織、或者營養組織和再生組織中是改變的。本發明的植物可以具有下列表型的至少一個，所述表型包括而不限于提高的根質量、提高的根長度、提高的葉子大小、提高的耳穗(ear)大小、提高的種子大小、提高的胚乳大小、導致種子中的蛋白質、油、和/或淀粉的相對水平變化的胚胎和胚乳的相對大小的改變、雄穗(tassd)的缺乏、功能性花粉負載(pollenbearing)雄穗的缺乏、或提高的植物大小。本發明的另一實施方式將是在基因組基因座處被遺傳修飾的植物，其中所述基因組基因座編碼本發明的NUE多肽。提供了用于提高植物中NUE多肽的活性的方法。所述方法可以包括將本發明的NUE多核苷酸引入植物中。提供了用于減少或消除植物中NUE多肽的水平的方法。所迷多肽的水平或活性還可以在特定組織中被減少或消除，造成植物生長速率的改變。減少NUE多肽的水平和/或活性可以導致植物的較小的高度(stature)或較f曼的生長。具體實施例方式除非另外定義，本文所用的所有技術和科學術語具有本發明所迷領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。除非另外提及，本文所用的或預期的技術是本領域普通技術人員熟知的標準方法。材料、方法和實施例僅是示意性的而非限制性的。下文以示意的方式呈現而不試圖限制本發明的范圍。本發明現在將參照附圖在下文中更充分的描述，其中示出了本發明的一些，但不是全部的實施方式。實際上，這些發明可以以許多不同的了這些實施方式以便這個披露將滿足可應用的法律要求。全文相同的數字指的是相同的元件。利用前面描述和相關附圖的教導，這些發明所述領域的技術人員將想到本文陳述的本發明的許多修改和其他實施方式。因此，可以理解本所附權利要求的范圍內。^雖然^文采用特定的術語但是^們僅以一般和描述性的意義使用，并不為了限制。除非另外表明，本發明的實施將采用植物學、微生物學、組織培養、分子生物學、化學、生物化學和重組DNA技術的常規技術，其在本發明的技術范圍內。這樣的技術在文獻中被充分地解釋。參見，例如，LangenheimandThimann,(1982)5幽"少尸/cmfS,Wogy"wd/AyWe/a"ow//訓cmj,^,JohnWiley;Ce〃CWfweSo脂〃cCe〃Ge"e"'"尸/"船，vol.1,Vasil,ed.(1984);Stanier,"a/.,(1986)7TzeM/c油'"/5ed.，Prentice-Hall;DhringraandSinclair,(1985)5as,c尸/a"/尸"Ao/ogyA/W/20^y，CRCPress;Maniatis,"/.，(1982)A/o/ecw/<2rC7owz'"g..^Z/"60n3ror少A/awwa/;C/om'g,vols.IandII，Glover,ed.(1985);0//gowwc/eo/油5y"/te/51，Gait，ed.(1984);AWe/c外Z)r/tfcWo",HamesandHiggins,eds.(1984);及theseriesMeAoA5"，歸/ogy,ColowickandKaplan,eds，AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA。單位、前綴、和符號可以以它們的SI認可的形式表示。除非另外說明，分別地，核酸從左到右以5，到3，方向書寫；氨基酸序列從左到右以氨基到羧基方向書寫。數字范圍包括限定范圍的數字。氨基酸可以以它們通常已知的三字母符號或由IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission推薦的一-字母符號在本文中提及。同樣地，核苷酸可以以它們通常認可的單字母密碼提及。下面定義的術語參照說明書作為整體更充分地定義。在描述本發明中，下面的術語將被采用，并意圖如下所示被定義。"微生物體(microbe)"是指任何微生物(包括真核和原核微生物)，如真菌、酵母、細菌、放線菌、藻類和原生動物、以及其它單細胞結構。"擴增，，指的是核酸序列的多個拷貝或互補于所述核酸序列的多個拷貝的構建，其利用所述核酸序列的至少一個作為模板。擴增系統包括聚合酶鏈反應(PCR)系統、連接酶鏈反應(LCR)系統、基于核酸序列的擴增(NASBA,Cangene，Mississauga,Ontario)、Q-Seto復制酶系統、基于轉錄的擴增系統(TAS)、以及鏈置換擴增(SDA)。參見，例如，DZagwoWcM/ecw/arMcro6/'o/ogy:尸n'"c/p/esam/々/3//c""0眠Persing,Weds.，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC(1993)。擴增產物被稱為擴增子。術語"保守修飾的變體"應用于氨基酸和核酸序列。關于特定的核酸序列，保守修飾的變體指的是編碼相同或保守修飾的變體的氨基酸序列的那些核酸。因為遺傳密碼的簡并性，許多功能相同的核酸編碼任何給定蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU均編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密碼子表示的每一位置，所述密碼子可以被改變為所述相應密碼子的任何一個，而不改變編碼的多肽。這樣的核酸變異為"沉默變異"，并代表一種保守修飾的變異。本文編碼多肽的每個核酸序列也描述了所述核酸的每個可能的沉默變異。普通技術人員將認識到核酸中的每個密碼子(除了AUG,其通常是蛋氨酸的唯一密碼子；一個例外是M/crococc^n^era,對于其GTG是蛋氨酸密碼子(Ishizuka,e/a/.,(1993)/.M/cro6/0/.139:425-32)可以被修飾以產生功能相同的分子。因此，核酸的每個沉默變異，其編碼本發明的多肽，在每個描述的多肽序列中是隱含的，并且以引用方式并入本文。至于氨基酸序列，技術人員將認識到改變、添加或缺失編碼的序列中的單一氨基酸或小百分比的氨基酸的核酸、肽、多肽、或蛋白質序列的單獨的替換、缺失或添加在改變導致氨基酸被化學相似的氨基酸替換時是"保守修飾的變體"。因此，選自由1到15組成的整數的組的任何數量的氨基酸殘基可以被這樣改變。因此，例如，可以進行1、2、3、4、5、7或10個改變。保守修飾的變體通常提供與它們來源的未修飾的多肽序列相似的生物學活性。例如，底物特異性、酶活性、或配體/受體結合通常為天然蛋白對其天然底物的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，優選60-90%。提供功能相似的氨基酸的保守替換表在本領域是熟知的。下面的六個組，每個包含對于另一個是保守的替換的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、纈氨酸(V);以及6)笨丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。還參見，Creighton,尸/Y^e,朋，W.H.FreemanandCo.(1984)。如本文所用的，"基本上由...組成"指的是包括除了目標多核苷酸交到與所述多核苷酸相同的cDNA,并且其中所述雜交條件、包括在65°C在0.IXSSC和0.1%十二烷基硫酸鈉中的沖洗步驟。關于指定核酸的"編碼"或"編碼的"指的是包含用于翻譯成指定蛋白質的信息。編碼蛋白質的核酸可以包含核酸的翻譯區內的非翻譯序列(例如，內含子)，或者可以缺乏這樣的插入非翻譯序列(例如，如在cDNA中)。蛋白質被編碼的信息通過利用密碼子表示。通常，利用"通用"遺傳密碼由核酸編碼氨基酸序列。然而，遺傳密碼的變體，如在一些植物、動物、及真菌線粒體、細菌A^co//"sw(3capn'co/wm(Yamao,"a/.,(1985)/Voc^V",/.」c^/.aSL482:2306-9)、或者纖毛蟲A勤cTO"wc/e^中存在的，在核酸利用這些有機體被表達時，可以使用。當核酸被合成地制備或改變時，可以利用核酸要被表達的預定宿主的已知密碼子偏好。例如，雖然本發明的核酸序列可以在單子葉植物和雙子葉植物物種中表達，序列可以被修飾以說明單子葉植物或雙子葉植物的特殊密碼子偏好和GC含量偏好，因為這些偏好已經顯示出不同(Murray,e,a/.,(1989)A^c/e,'c爿c/AW化17:477-98,以引用方式并入本文中)。因此，用于特定氨基酸的玉蜀黍偏好的密碼子可以源自來自玉蜀黍的已知基因序列。來自玉蜀黍植物的28個基因的玉蜀黍密碼子選擇在Ji面Murray,Wa/.的^4中歹'j出。如本文所用的，關于核酸的"異源的"是起源于外來物種的核酸，或者如果起源于相同的物種，是通過故意的人類干預在組成和/或基因組基因座上從其天然形式實質上(substantially)被修飾的核酸。例如，可操作地連接到異源結構基因的啟動子是來自與結構基因來源的物種不同的物種，或者，如果來自相同的物種，一個或兩個均實質上從它們的起源形式被修飾。異源蛋白質可以起源于外來物種，或者，如果來自相同物種，通過故意的人類干預從其起源形式實質上被修飾。"宿主細胞"是指這樣的細胞，其包括本發明的異源核酸序列，其包含載體并支持所述表達載體的復制和/或表達。宿主細胞可以為原核細月包，如Kco仏或者真核細胞，如酵母、昆蟲、植物、兩棲動物、或哺乳動物細胞。優選地，宿主細胞為單子葉或雙子葉植物細胞，包括而不限于玉蜀黍、高粱、向曰葵、大豆、小麥、苜蓿、稻米、棉花、卡諾拉、大麥、黍、及番茄。特別優選的單子葉宿主細胞是玉蜀黍宿主細胞。術語"雜交復合物"包括涉及由選擇性相互雜交的兩條單鏈核酸序列形成的雙鏈核酸結構。在將核酸插入細胞內的上下文中術語"引入"指的是"轉染"或"轉化"或"轉導"并且包括涉及核酸并入真核或原核細胞，其中所述核酸可以被并入細胞的基因組中(例如，染色體、質粒、質體或線粒體DNA),轉換入自主復制子，或者被瞬時表達(例如，轉染的mRNA)。術語"分離的"涉及材料，如核酸或蛋白質，其實質上或基本上不含有在其天然存在的環境中發現時通常伴隨其的成分或者與其相互作用的成分。分離的材料可選地包含在其天然環境中沒有伴隨所述材料發現的材料。核酸，其是"分離的"，如本文所定義的，還被稱為"異源"核酸。除非另外陳述，術語"NUE核酸"指的是包含編碼全長或部分長度的NUE多肽的多核苷酸("NUE多核苷酸")的核酸。如本文所用的，"核酸"包括單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核香酸聚合物，并且除非另外限制，包括具有天然核苷酸的基本性質的已知類似物，因為它們以類似于天然存在的核苷酸的方式雜交到單鏈核酸(例如，肽核酸)。"核酸文庫"指的是分離的DNA或RNA分子的集合，其包括并基本上代表指定的有機體的基因組的整個轉錄的部分。示例性核酸文庫的構建，如基因組和cDNA文庫，在標準分子生物學參考文獻中教導，如BergerandKimmel,(1987)Gw/deM/ecw/arC7om'"gTec/m一e51,fromtheseriesA/"/zoc/yfi""z，o/ogy,vol.152,AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA;Sambrook，"/.,(1989)iWb/ecw/arC7ow/wg:爿Z^6o/y^o^yA^awwa/,2nded.,vols.1-3;及Cw/re/^尸rofocoAsz'wA/o/ecw/arAusubel，""/.，eds,CurrentProtocols,ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates,Inc.andJohnWiley&Sons,Inc.(1994Supplement)。如本文所用的，"可操作地連接的"包括涉及第一序列(如啟動子)和第二序列之間的功能性連接，其中所述啟動子序列起始并介導相應于第二序列的DNA的轉錄。通常，可操作地連接的指的是被連接的核酸序列是鄰近的，并且其中必需結合兩個蛋白編碼區，臨近的，并且在相同的閱讀框中。如本文所用的，術語"植物"包括涉及全植物、植物器官(例如，葉子、莖、根等)、種子及植物細胞及其子代。植物細胞，如本文所用的，包括而不限于，種子、懸浮培養物、胚胎、分生組織區、愈傷組織(callustissue)、葉子、根、枝條、配子體、孢子體、花粉、及小孢子。植物的類別，其可以用在本發明的方法中，通常與服從轉化技術的高等植物的類別一樣廣泛，包括單子葉和雙子葉植物，包括來自以下屬的物種Cwcw6""、Wto、，/wgAms、Fr"g"n'a、Z^幽s,她WcagcKOwc^/jd"7>//&//讓、7Wgowe〃^F/gwa、C"簡、Zj力應、iS7"fl/7,'iS1、力/ro/7"、C"戸'cw7w、Z)"/wm、//少cwc少鐘船》Lycc^erj/cow、yV/co"aw"、iSo/awwm,尸e/w"z'a,D/g/^a/z^,iWi3y'0尸awa、CVa/zc^v'wm、Z^o//t//wCV_yz"、」vewa,//ordewwnSeca/e、y4〃/wm,及7W"cwm。特別優選的植物是Zeamfl^。如本文所用的，"產量"可以包括涉及收獲的谷類作物的每英畝的蒲式耳，其是谷粒濕度調整過的(例如，對于玉蜀黍，通常15%)，以及產生的生物量的體積(用于飼料作物，如苜蓿，以及用于復種作物的植物根大小)。谷粒濕度在收獲的谷粒中被測量。谷粒的調整的測試重量被確定為每蒲式耳的磅重，對于收獲的谷粒濕度水平是調整過的。生物量被測量為產生的可收獲的植物材料的重量。如本文所用的，"多核苷酸"包括涉及脫氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸、或其類似物，其具有天然核糖核苷酸的基本性質，在于它們在列和/或允許翻譯為與天然存在的核苷酸相同的氨基酸。多核苷酸可以為天然或異源的結構基因或調節基因的全長或亞序列(subs叫uence)。除非另外指明，所述術語包括涉及指定的序列以及其互補序列。因此，具有為了穩定性或為了其它原因修飾的主鏈的DNA或RNA是那個術語在本文中意指的"多核苷酸，，。此外，包含不尋常的堿基，如肌苷，或修飾的堿基，如三苯甲基化(tritylated)的堿基(僅指出兩個實例)的DNA或RNA,是本文所用術語的多核苷酸。將認識到已經對DNA和RNA進行了大量修飾，其滿足本領域技術人員已知的許多有用目的。本文所用的術語多核苷酸包括多核苷酸的這樣的化學、酶、或代謝修飾的形式，以及病毒和細胞(包括其中，簡單和復雜細月包)的DNA和RNA特征的化學形式。術語"多肽"、"肽"、及"蛋白質"在本文中可交換地使用，指的是氨基酸殘基的聚合物。所述術語應用于其中一個或多個氨基酸殘基為相應的天然存在的氨基酸的人工化學類似物的氨基酸聚合物、以及天然存在的氨基酸聚合物。本文所用的"啟動子"包括涉及從轉錄的起始的DNA上游區，并且涉及RNA聚合酶和其它蛋白質的識別和結合以引起轉錄。"植物啟動子"是能夠引起植物細胞中的轉錄的啟動子。示例性的植物啟動子包括，而不限于，那些從植物、植物病毒、及細菌(其包括在植物細胞中表達的基因，如爿gro^c"n'ww或AA/zo6/ww)獲得的啟動子。實例是優先引起在一些組織，如葉子、根、種子、須根、木質部導管(xylemvessels)、管胞、或者厚壁組織中的轉錄的啟動子。這樣的啟動子被稱為"組織優先的，，。"細胞類型，，特異性啟動子主要驅動在一個或多個器官中的一些細胞類型中的表達，例如，在根或葉子中的維管細胞。"可誘導的，，或"可調節的，，啟動子是在環境控制下的啟動子。可以影響通過可誘導的啟動子的轉錄的環境條件的實例包括厭氧條件或光的存在。另一類型的啟動子是發育調節的啟動子，例如，驅動在花粉發育期間的表達的啟動子。組織優先的、細胞類型特異性的、發育調節的、以及可誘導的啟動子組成"非組成性"啟動子的類別。"組成性"啟動子是在大多數環境條件下有活性的啟動子。術語"NUE多肽，，指的是一個或多個氨基酸序列。所述術語還包括其片段、變體、同系物、等位基因或前體(例如，前原蛋白(preproproteins)或前蛋白(proproteins))。"NUE蛋白"包括NUE多肽。除非另外說明，術語"NUE核酸"意味著包含編碼NUE多肽的多核苦酸("NUE多核苷酸")的核酸。本文所用的"重組體"包括涉及細胞或栽體，其已經通過引入異源核酸而被^^飾或者所述細胞源自這樣修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達在細胞的天然(非重組體)形式內未發現以相同形式存在的基因或者由于故意地人類干預而被另外異常地表達、低表達或全然未表達的天然基因；或者可以具有天然基因的減少的或消除的表達。本文所用的術語"重組體"不包括通過天然存在的事件(例如，自發突變、天然轉化/轉導/轉座)的細胞或栽體的改變，如沒有故意地人類干預的存在的那些。如本文所用的，"重組表達盒"是核酸構建體，重組地或合成地產生，具有一系列指定的核酸元件，其允許特定的核酸在扭細胞內的轉錄。所述重組表達盒可以被并入質粒、染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒、或核酸片段中。典型地，表達栽體的重組表達盒部分包括，在其它序列中，要被轉錄的核酸、及啟動子。術語"殘基"或"氨基酸殘基"或"氨基酸"在本文中被可交換地用于指被并入蛋白質、多肽、或肽(共同地"蛋白質")中的氨基酸。所述氨基酸可以為天然存在的核酸并且，除非另外限制，可以包括可以以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的天然氨基酸的已知類似物。術語"選擇性地雜交"包括涉及在嚴格的雜交條件下核酸序列雜交到指定的核酸靶序列到比其雜交到非靶核酸序列和基本上排除的非耙核酸的可檢測地更大程度(例如，至少為背景的2倍)。選擇性地雜交序列通常具有互相約至少40%的序列同一性、優選60-90%的序列同一性、及最優選100%的序列同一性(即，互補的)。術語"嚴格的條件"或"嚴格的雜交條件"包括涉及這樣的條件，序列(例如，至少2倍于背景、)。嚴格的條件P是序列依賴性的并且在不同的情況下將是不同的。通過控制雜交和/或沖洗條件的嚴格性，可以一直到100%互補于所述探針的靶序列可以被鑒定(同源探測)。可替換地，可以調整嚴格性條件以允許序列中的一些錯配，以便檢測較低程度的相似性(異源探測)。可選地，探針為約500個核苷酸的長度，但是長度可以極大地變化，從少于500個核苷酸到等于靶序列的整個長度。典型地，嚴格的條件將是那些條件，其中鹽濃度少于約1.5MNa離子，通常約0.01-1.0MNa離子濃度(或其它鹽類)，pH為7.0-8.3，對于短探針(例如，10到50個核苷酸)，溫度為至少約30。C,對于長探針(例如，大于50個核苷酸)，溫度為至少約6(TC。嚴格地條件還可以通過加入去穩定劑如甲酰胺或Denhardt's來實現。示例性的低嚴格性條件包括用30-35%的甲酰胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基疏酸鈉)的緩沖溶液在37。C雜交，以及在50-55。C的1X-2XSSC(20XSSC=3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中沖洗。示例性的中等嚴格性條件包括在40-45%曱酰胺、l.OMNaCl、1%SDS中在37。C雜交，并且在55-60。C的0.5X-1XSSC中沖洗。示例性的高度嚴格性條件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中在37。C雜交，并且在60-65。C在0.IXSSC中沖洗。特異性通常為雜交后沖洗的功能，關鍵因素為最終沖洗溶液的離子強度和溫度。對于DNA-DNA雜交體，Tm可以為接近來自于MeinkothandWahl(1984)^""/.Aoc/^肌138:267-84的等式Tm=81.5°C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.6U°/o形(form))-500/L;其中M為單價陽離子的摩爾濃度，。/oGC為DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％形為雜交溶液中甲酰胺的百分比，以及L為堿基對中雜交體的長度。Tm為(在限定的離子強度和pH下)50%的互補靶序列雜交到完全匹配的探針的溫度。對于每個1%的錯配，丁m降低約rc;因此，可以調整Tm、雜交和/或沖洗條件以雜交到希望的同一性的序列。例如，如果尋求具有^90%同一性的序列，Tm可以降低l(TC。通常，在限定的離子強度和pH時，對于特異性序列及其互補體，選擇的嚴格的條件比熱熔點(Tm)低約5。C。然而，極其嚴格的條件可以利用比熱熔點(Tm)低l、2、3或4。C的雜交和/或沖洗；中等嚴格的條件可以利用比熱熔點(Tm)低6、7、8、9或1(TC的雜交和/或沖洗；低嚴格性條件可以利用比熱熔點(Tm)低11、12、13、14、15或2(TC的雜交和/或沖洗。利用所述等式、雜交和沖洗組分、及希望的Tm，普通技術人員將理解雜交和/或沖洗溶液的嚴格性中的變化被內在的描述。如果希望的錯配程度導致TVf氐于45。C(水溶液)或32°C(甲酰胺溶液)，最好是提高SSC濃度以便可以利用更高的溫度。對于核酸的雜交的廣泛的指導存在于Tijssen,丄"60m/0/7AWe,c」c/c//Vo6ey,partI,chapter2,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,"Elsevier，NewYork(1993);及Cw^re",尸ro,oco/sz'wA/o/ecw/"rS/o/ogy,chapter2,Ausubd,"a/"eds,GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork(1995)。除非另外說明，在本申請中，高度嚴格性被限定為在4XSSC、5XDenhardt，s(500ml的水中5gFicoll、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.1mg/ml煮沸的鮭魚精子DNA、及25mM磷酸鈉中在65。C雜交，以及在0.1XSSC、0.1。/oSDS中在65。C沖洗。如本文所用的，"轉基因植物"包括涉及植物，其包括在其基因組中的異源多核苷酸。通常，所述異源多核苷酸被穩定的整合入基因組內以便所述多核苷酸被傳遞到連續世代。所述異源多核苷酸可以單獨地被整合入基因組中或者作為重組表達盒的一部分被整合。"轉基因"在本文中被用于包括任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，其基因型已經通過異源核酸的存在而被改變，所述異源核酸包括如此改變的起始轉基因的那些以及通過有性雜交(sexualcrosses)或無性繁殖從起始轉基因形成的那些。本文所用的術語"轉基因"不包括通過常規植物育種方法或通過天然存在的事件(如隨機異抹受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座、或自發突變)的基因組(染色體或染色體外)的改變。如本文所用的，"載體"包括涉及在宿主細胞的轉染中所用的核酸，多核苷酸可以被插入其中。載體通常為復制子。表達載體允許被插入其中的核酸的轉錄。下面的術語用于描迷兩個或更多個核酸或多核苷酸或多肽之間的序列關系:(a)"參考序列"，(b)"比較窗，，,(c)"序列同一性"，(d)"序列同一性的百分比"，以及(e)"實質的(substantial)同一性，，。如本文所用的，"參考序列，，是用作序列比較的基礎的限定的序列。參考序列可以為特定的序列的亞組或全部；例如，作為全長cDNA或基因序列的節段，或者完全的cDNA或基因序列。如本文所用的，"比較窗，，指的是包括涉及多核苷酸序列的相鄰和指定節段，其中所述多核苷酸序列可以與參考序列比較并且其中所述比較窗中的多核苷酸的部分可以包括相較于參考序列(其不包括添加或缺失)的添加或缺失(即，間隙)，用于所述兩個序列的最佳對準。通常，比較窗為至少20個相鄰核苷酸的長度，可選地可以為30、40、50、100個的長度或更長。本領域的技術人員理解為了避免由于多核苷酸序列中包含間隙導致與參考序列的高度相似性，通常引入間隙罰分并且從匹配的數量^皮減去。用于比較的核苷酸和氨基酸序列的對準方法在本領域是熟知的。SmithandWaterman,(1981)爿dv.M",/z2:482的局部同源性算法(BESTFIT)可以進行用于比較的序列的最佳對準；通過NeedlemanandWunsch，(1970)丄嵐腸/.48:443-53的同源性對準算法(GAP);通過PearsonandLipman,(1988)尸廠oc.Ato/,Jcad85:2444的檢索相似性方法(TfastaandFasta);通過這些算法的計算機化的實施，包括，而不卩艮于'WisconsinGeneticsSoftwarePackage，Version8中通過Intelligenetics,MountainView,California,GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA,和TFASTA的PC/Gene程序中的CLUSTAL(可以從GeneticsComputerGroup(GCG⑧程序(Accelrys,Inc.,SanDiego，CA)獲得)。CLUSTAL程序由HigginsandSharp,(1988)73:237-44;HigginsandSharp,(1989)C4膨S5:151-3;Corpet，""/.,(1988)A^c/e/cJc油to.16:10881-90;Huang,a/.,(1992)Co/wpwrer^4/7/7//co〃o"515/c^c/e"c^8:155-65,及Pearson，Wa/.,(1994)A/e仇Mo/.5/o/.24:307-31充分描述。用于多個序列的最佳全局對準的優選程序為PileUp(FengandDoolittle,(1987)J.嵐￡W.，25:351-60,其類似于HigginsandSharp,(1989)5:151-53描述的方法，以引用方式并入本文中)。可以用于數據庫相似性檢索的程序的BLAST家族包括用于針對核苷酸數據庫序列的核苷酸查詢序列的BLASTN;用于針對蛋白質數據庫序列的核苷酸查詢序列的BLASTX;用于針對蛋白質數據庫序列的蛋白質查詢序列的BLASTP;用于針對核苷酸數據庫序列的蛋白質查詢序列的TBLASTN;以及用于針對核苷酸數據庫序列的核苷酸查詢序列的TBLASTX。參見，Cw/rewf/VofocoAyz力A/o/ecw/arChapter19，Ausubel"a/"eds.,GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork(1995)。GAP利用上文NeedlemanandWunsch的算法，以發現最大化匹配的數量和最小化間隙的數量的兩個完全序列的對準。GAP考慮所有可能的對準和間隙位置并形成具有最大數量的匹配堿基和最少的間隙的對GAP必須利用對于它插入^每個二隙的匹:的間隙形成罰;數量。'如果所選的間隙擴展罰分大于零，那么GAP必須，另外，利用插入的每個間隙的間隙長度乘以間隙擴展罰分。WisconsinGeneticsSoftwarePackage的Version10中缺省間隙形成罰分值和間隙擴展罰分值分別為8和2。間隙形成和間隙擴展罰分可以被表達為選自由,人0到100組成的整數的組的整數。因此，例如，間隙形成和間隙擴展罰分可以為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。GAP表示最佳配準的家族的一個成員。可以存在這個家族的許多成員，但是沒有其他成員具有更好的質量。GAP顯示四個用于配準的品質因數質量、比率、同一性、及相似性。質量是為了對準序列最大化的量度。比率是質量除以較短節段中的堿基數量。百分比同一性是實際上匹配的符號的百分比。百分比相似性是相似的符號的百分比。從間隙穿過的符號被忽略。當對于成對符號的計分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值)時，相似性被計分。WisconsinGeneticsSoftwarePackage的Version10中所用的計分矩陣是BLOSUM62(參見，HenikoffandHenikoff,(1989)尸wc.iY"〃.JcW.5"c/'.WS^89:10915)。除非另外說明，本文所提供的序列同一性/相似性值指的是利用程序的BLAST2.0組利用缺省參數獲得的值(Altschul，"a/.,(1997)M/c/e/c爿c油to.25:3389-402)。如本領域的那些普通技術人員將理解的，BLAST檢索假定蛋白質可以^皮模型化為隨機序列。然而，許多真實的蛋白質包括非隨機序列區，其可以為均聚物域(tract)、短周期重復、或一個或多個氨基酸富集的區。這樣的低復雜性區可以在不相關的蛋白質之間對準(aligned),即使所述蛋白質的其他區是完全不同的。大量低復雜性過濾程序可以用于減少這樣的低復雜性對準。例如，SEG(WootenandFederhen,(1993)Cow/w,.C/ze肌17:149-63)和XNU(ClaverieandStates,(1993)Cow;w.C/zew.17:191-201)低復雜性過濾可以單獨或結合使用。如本文所用的，在兩個核酸或多肽序列的上下文中的"序列同一性"或"同一性"包括涉及兩個序列中的殘基，其當在指定的比較窗上對準用于最大的相應性時是相同的。當使用的序列同一性的百分比涉及蛋白時，認識到不相同的殘基位置通常通過保守的氨基酸替換而不同，其中氨基酸殘基被另外的具有類似化學性質(例如，電荷或疏水性)的氨基酸殘基替換，并因此不改變所述分子的功能性質。當序列在保守的替換方面不同時，百分比序列同一性可以被向上調整以校正替換的保守性質。通過這樣的保守替換而不同的序列被稱為具有"序列相似性，，或"相似性，，。用于進行這樣的調整的方式對于本領域的技術人員是熟知的。典型地，這涉及將保守替換作為部分而不是全部錯配計分，由此提高百分比序列同一性。因此。例如，當相同的氨基酸被給予1的得分時，非保守的替換被給予0的得分，保守的替換被給予0和1之間的得分。例如在程序PC/GENE(Intelligenetics,MountainView,California,USA)中實施時，例如才艮才居MeyersandMiller,(1988)Cowpw/erA'o/.<SW.4:11-17的算法，計算保守替換的計分。如本文所用的，"序列同一性的百分比，，指的是通過在比較窗上比較兩個最佳對準的序列確定的值，其中比較窗內多核苷酸序列的部分與參考序列相比(其不包括添加或缺失)可以包括添加或缺失(即，間隙)，用于兩個序列的最佳對準。百分比通過如下計算確定兩個序列中存在的相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數量以產生匹配的位置的數量、匹配的位置的數量除以比較窗中位置的總數、結果乘以100,以產生序列同一性的百分比。術語多核普酸序列的"實質的同一性"意味著多核普酸包含這樣的序列，其利用所述的對準程序之一，利用標準參數，與參考序列相比，具有50-100%之間的序列同一性，優選至少50%的序列同一性，優選至少60%的序列同一性，優選至少70%、更優選至少80%、更優選至少90%、最優選至少95%。技術人員將認識到這些值可以被適當地調整以通過考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等，確定由兩個核苷酸序列編碼的蛋白質的相應的同一性。用于這些目的的氨基酸序列的實質的同一性通常意味著55-100%之間的序列同一性，優選至少55%,優選至少60%，更優選至少70%、80%、90%，最優選至少95%。核普酸序列是實質地同一的另一指征是兩個分子在嚴格的條件下是否相互雜交。遺傳密碼子的簡并性允許導致編碼相同的氨基酸的核苷酸序列中的多樣性的許多氨基酸的替換，因此DNA序列可以編碼相同的多肽但是在嚴格的條件下不會相互雜交是可能的。例如，在核酸的拷貝是利用由遺傳密碼允許的最大密碼子簡并性形成時，這可以發生。兩個核酸序列是實質地同一的一個指征是第一核酸編碼的多肽是與由第二核酸編碼的多肽免疫學交叉反應的。在肽的上下文中的術語"實質的同一性"表明肽包含這樣的序列，其在指定的比較窗上與參考序列具有55-100%之間的序列同一性，優選與參考序列至少55。/。的序列同一性，優選60%,優選70%、更優選80。/0、最優選至少90%或95%的序列同一性。優選的，最佳對準利用上文NeedlemanandWunsch的同源性對準算法進行。兩個肽序列是實質地同一的指征是一個肽與針對第二肽產生的抗體是免疫反應性的。因此，肽是與笫二肽實質地同一的，例如，在兩個肽僅由于保守的替換而不同時。此外，肽可以與第二肽在它們因非保守變化而不同時，如果抗體識別的表位是實質地同一的，那么它們是實質地同一的。"實質上相似的"肽分享如上所迷的序列，除了不同的殘基位置可以因保守的氨基酸變化而不同。本發明披露了NUE多核苷酸和多肽。本發明的新型核苷酸和蛋白質具有這樣的表達模式，其表明它們提高了氮利用，并且因此在植物發育中扮演重要角色。所述多核苷酸在各種植物組織中表達。所述多核苷酸和多肽因此提供了操作植物發育以改變組織發育、定時(timing)或組成的機會。這可以用于在有限的氮供應下形成具有提高的產量的植物。核酸本發明提供了，其中，RNA、DNA、及其類似物和/或嵌合體的分離的核酸，包括NUE多核苷酸。本發明還包括用于在不同的有機體中表達的最優化的多核苷酸。例如，為了多核苷酸在玉蜀黍植物中的表達，所述序列可以被改變以解釋特定的密碼子偏好并根據上文Murray,""/改變GC含量。用于來自玉蜀黍植物的28個基因的玉蜀黍密碼子選擇在上文Murray,的表4中列出。本發明的NUE核酸包括分離的NUE多核苷酸，其包括(a)編碼NUE多肽和其保守修飾的和多形的變體的多核苷酸；(b)與(a)或(b)的多核苷酸具有至少70%的序列同一性的多核苷酸；(c)(a)或(b)的多核苷酸的互補序列。核酸的構建本發明的分離的核酸可以利用(a)標準重組方法，(b)合成技術，或其組合制備。在一些實施方式中，本發明的多核苷酸可以從真菌或細菌克隆、擴增、或以其他方式構建。所述核酸可以方便地包含除了本發明的多核苷酸之外的序列。例如，包含一個或多個內切核酸酶限制性位點的多個-克隆位點可以被插入所述核酸以幫助分離多核苷酸。并且，可翻譯的序列可以被插入以幫助本發明的翻譯的多核苷酸的分離。例如，六-組氨酸標記物序列提供了方便的方式以純化本發明的蛋白質。本發明的核酸-排除所述多核苷酸序列，可選地為用于本發明的多核苷酸的克隆和/或表達的載體、適配子(adapter)、或連接子。另外的序列可以被加入到這樣的克隆和/或表達序列以最優化它們在克隆和/或表達中的功能、幫助多核苷酸的分離、或者提高所述多核苷酸導入細胞。典型地，本發明的核酸的長度少于本發明的其多核苷酸的長度，少于20千堿基對，通常少于15kb,常常少于10kb。克隆載體、表達載體、適配子、及連接子的應用在本領域是熟知的。示例性的核酸包括這樣的載體如M13、lambdaZAPExpress、lambdaZAPII、lambdagt10、lambdagtll、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescriptII、lambdaDASHII、lambdaEMBL3、lambdaEMBL4、pWE15、SuperCosl、SurfZap、Uni-ZAP、pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pSPUTK、p3'SS、pGEM、pSK+/-、pGEX、pSPORTI和II、pOPRSVICAT、pOPI3CAT、pXTl、pSG5、pPbac、pMbac、pMClneo、pOG44、pOG45、pFRT(3GAL、pNEO(3GAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、lambdaMOSSlox、及lambdaMOSElox。用于本發明的最佳載體包括而不限于lambdaZAPII,和pGEX。多種核酸的描述參見例如StratageneCloningSystems,Catalogs1995,19%,1997(LaJolla,CA);以及,AmershamLifeSciences,Inc,Catalog，97(ArlingtonHeights,IL)。用于構建核酸的合成方法
技術領域：
：本發明的分離的核酸還可以通過以下方法通過直接化學合成制備，所述方法例如Narang,"(1979)A/e仇^:"^ymo/.68:90-9的磷酸三酯方法；Brown,""/.,(1979)她汰68:109-51的磷酸二酯方法;Beaucage，""/.，(1981)TWr".22(20):859-62的二乙基亞磷酰胺(diethyiphosphoramidite)方法；上文Beaucage,e/1"/.描述的固相亞石岸酰胺三酯(phosphoramiditetriester)方法，例如，利用自動合成儀，例如Needham-VanDevanter,"a/.，(1984)M/c/e/c"饑12:6159-68中描述的；以及美國專利No.4,458,066的固相支持(solidsupport)方法。化學合成通常產生單鏈寡核苷酸。通過與互補序列的雜交或通過利用單鏈作為模板借助DNA聚合酶的聚合，這可以被轉變為雙鏈DNA。技術人員將認識到雖然DNA的化學合成限于約100個堿基的序列，但是較長的序列可以通過較短序列的聯接獲得。UTR和密碼子偏好通常，翻譯效率已經發現由RNA的5，非編碼或非翻譯區(5，UTR)中的特定序列元件調節。正性序列基序包括翻譯起始共有序列(Kozak,(1987)淑'/e/c爿c油U5:8125)和5<G〉7曱基GpppGRNA帽結構(Drummond,e/a/.,(1985)M/c/e/c爿c,'A7仏13:7375)。負性元件包括穩定的分子內5，UTR莖-環結構(Muesmg,"a/"(1987)0〃48:691)和5，UTR中的AUG序列或前面有合適的AUG的短開放閱讀框(Kozak,w戶ra,Rao,""/.,(1988)Mo/.WCW/.脂.8:284)。因此，本發明提供了用于調節異源編碼序列的翻譯的5'和/或3'UTR區。此外，本發明的多核苷酸的多肽編碼節段可以被修飾以改變密碼子選擇。改變的密碼子選擇可以用于改變翻譯效率和/或最優化用于在希望的宿主中表達的編碼序列或最優化用于在玉蜀黍中表達的異源序列中的密碼子選擇。本發明的多核苷酸的編碼區中的密碼子選擇可以利用商業上可獲4尋的凈欠件包，i口可以乂人UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup獲得的"CodonPreference"統計分析。參見，Devereaux,e/1"/.,(1984)iVwc/"'c^c^版12:387-395);或MacVector4.1(EastmanKodakCo.,NewHaven,Corm.)。因此，本發明提供了本發明的多核苷酸的至少一個的編碼區的密碼子選擇頻率特征。可以用于確定密碼子選擇頻率的多核苷酸的數量(每個氨基酸3個核苷酸)可以為從3到本文所提供的本發明的多核苷酸的數量的任何整數。可選地，所述多核苷酸將為全長序列。用于統計分析的序列的示例性數目可以為至少1、5、10、20、50或100。序歹'j改組(SequenceShuffling)本發明提供了利用本發明的多核苷酸的用于序列改組的方法，以及由此獲得的組分。序列改組在PCT公開No.96/19256中描述。還參見，Zhang,"a/.,(1997)」c"t/.94:4504-9;和Zhao,""/.,(1998)16:258-61。通常，序列改組提供了用于產生具有希望的特征的多核苷酸的文庫的方式，其可以被選擇或篩選。重組多核苷酸的文庫從相關序列多核苷酸群產生，其包括序列區，其具有實質的序列同一性并可以在體外或體內同源重組。序列重組的多核苷酸群包括具有希望的或有利的特征并且可以通過合適的選擇或篩選方法選擇的多核苦酸的亞群。所述特征可以為能夠在篩選系統中被選擇或檢測的任何性質或屬性，并且可以包括以下性質編碼的蛋白質、轉錄元件、調控基因或轉基因的轉錄、RNA加工、RNA穩定性、染色質構象、翻譯、或其它表達性質的序列、復制元件、蛋白結合元件、或類似物、如賦予可選擇的或可檢測的性質的任何特征。在一些實施方式中，所選擇的特征可以為如本文提供的超過野生型蛋白質的改變的Km和/或Kcat。在另一些實施方式中，從序列改組產生的蛋白質或多核苷酸將具有大于非改組的野生型多核普酸的配體結合親和力。在另一些實施方式中，從序列改組產生的蛋白質或多核苷酸將具有與非改組的野生型多核苷酸相比的改變的pH最佳值。這樣的性質的提高可以為野生型值的至少110%、120%、130%、140%或大于150%。重組表達盒本發明進一步提供了包含本發明的核酸的重組表達盒。編碼本發明的希望的多核苷酸的核酸序列，例如編碼足夠長的多肽以編碼本發明的活性蛋白質的cDNA或基因組序列，可以用于構建可以被引入希望的宿主細胞的重組表達盒。重組表達盒將通常包括可操作地連接到引導多核苷酸在預期的宿主細胞(如轉化的植物的組織)中的轉錄的轉錄起始調節序列的本發明的多核苷酸。例如，植物表達載體可以包括(1)在5，和3，調節序列的轉錄調控下的克隆的植物基因和(2)顯性可選擇的標記物。這樣的植物表達載體還可以包含，如果希望，啟動子調節區(例如，提供可誘導的或組成性的、環境或發育調節的、或細胞或組織特異性/選擇性表達的一個調節區)、轉錄引發起始位點、核糖體結合位點、RNA加工信號、轉錄終止位點、和/或多聚腺苷酸(polyadenylation)信號。可以使用植物啟動子片段，其可以引導本發明的多核苷酸在再生植物的所有組織中的表達。這樣的啟動子在本文中被稱為"組成性"啟動子并在大多數環境條件和發育或細胞分化的狀態下是活性的。組成性啟動子的實例包括源自爿gAY)6""en'WTUwwe/flc/e"s的T-DNA的l，-或2，-啟動子、Smas啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子(美國專利No.5,683,439)、Was啟動子、rubisco啟動子、GRP1-8啟動子、來自花椰菜花葉病毒(cauliflowermosaicvirus(CaMV))的35S啟動子，其在Odell,"a/.,(1985)淑臟313:810-2中描述;稻米肌動蛋白(McElroy,""/.,(1990)尸/贈Ce〃163-171);泛蛋白(ubiquitin)(Christensen,W(〗992)尸WA/o/.S,o/.12:619-632和Christensen,""/.,(1992)尸/"",A^/.5,》/.18:675-89);pEMU(Last,Wa/.，(1991)rW.智/.81:581-8);MAS(Velten,W"/.,(1984)EtWSOJ.3:2723-30);及玉蜀黍H3組蛋白(Lepetit,"a/.,(1992)Mo/.Gew".231:276-85;和Atanassvoa,"a/.,(1992)尸/朋〃owr"a/2(3):291-300);ALS啟動子，如PCT申請No.WO96/30530中描述的；以及技術人員已知的來自各種植物基因的其它轉錄起始區。對于本發明，泛蛋白是用于在單子葉植物中表達的優選的啟動子。可替換地，植物啟動子可以引導本發明的多核苷酸在特定組織中的表達或者可以另外的在更精確的環境或發育控制下的表達。這樣的啟動子這里被稱為"可誘導的"啟動子。可以通過可誘導的啟動子影響轉錄的環境條件包括病原體攻擊、厭氧條件、或者光的存在。可誘導的啟動子的實例為Adhl啟動子，其可由缺氧或冷應激誘導，Hsp70啟動子，其可以由熱應激誘導，及PPDK啟動子，其可以由光譯導。在發育調控下的啟動子的實例包括僅，或優先地，在一些組織中，如葉子、根、果實、種子、或花中引發轉錄的啟動子。啟動子的操作還可以依賴其在基因組中的位置而變化。因此，可誘導的啟動子可以在一些位置中變得完全或部分組成性。如果多肽表達是希望的，通常希望包括多核苷酸編碼區的3，-端的多聚腺苷酸區。多聚腺苷酸區可以源自多種植物基因，或源自T-DNA。要添加的3，端序列可以源自，例如，胭脂堿合酶(nopalinesynthase)或章魚堿合酶(octopinesynthase)基因，或可選地源自另一植物基因，或較少優選地源自任何其它真核基因。這樣的調節性元件的實例包括，而不P艮于，3，末端和/或多聚腺普酸區，如爿g"o6""er/wwfwwe/acz'e"s月因脂》咸合酶(nos)基因的那些(Bevan,""/.，(1983)M/c/ez'cv4c/&i^s.12:369-85);馬鈴薯蛋白酶抑制劑II(PINII)基因(Keil，""/.,(1986)A^c/e/c爿"A尺"14:5641-50;及An,""/.,(1989)尸/a"fCe〃1:115-22);以及CaMV19S基因(Mogen,"a/.,(1990)尸/awCe〃2:1261畫72)。內含子序列可以被加入到部分編碼序列的5'非翻譯區或編碼序列以提高聚集在胞質溶液中的成熟信使的數量。植物和動物表達構建體中的轉錄單位中包含可剪接的內含子已經顯示在mRNA和蛋白質水平提高基因表達一直到1000倍(BuchmanandBerg,(1988)嵐Ce〃脅/.8:4395-4405;Callis,"a/.,(1987)Ge歸Dev.1:1183-200)。這樣的內含子的基因表達提高通常在位于轉錄單位的5'端附近時最大。玉蜀黍內含子Adhl-S內含子1、2和6,Bronze-l內含子的應用在本領域是已知的。一般地參見，71/^A^/'ze//""必ooA，Chapter116,FreelingandWalbot,eds"Springer,NewYork(1994)。植物信號序列，包括，而不限于，靶向蛋白質到植物細胞的細胞外基質的編碼信號肽的DNA/RNA序列(Dratewka-Kos,"/.,(1989)丄5z'o/.C7e肌264:4896-900),如iV/co"朋"擴張基因(DeLoose,""/.,(1991)99:95-100);靶向蛋白質到液泡的信號肽，如甘薯儲藏蛋白(sporamin)基因(Matsuka,",(1991)/Voc.A^/.J^^/.園88:834)及大麥凝集素基因(Wilkins,"<(1990)尸/a"rCW/，2:301-13);造成蛋白質被分泌的信號肽,如PRIb的那些(Lind,""/.,(1992)尸/朋fMo/.所o/.18:47-53)或大麥阿爾法淀并分酶(BAA)(Rahmatullah,(1989)尸/""/Mo/.Ao/.12:119,并由此以引用方式并入)，或將蛋白質靶向到質體的信號肽，如油菜籽脂烯酰基Acp還原酶的信號肽(Venvaert,(1994)尸/朋fA^/.腸/.26:189-202),在本發明中是有用的。包含來自本發明的多核苷酸的序列的載體將通常包含標記物基因，其賦予植物細胞可選擇的表型。通常，可選擇的標記物基因將編碼抗生素抗性、合適的基因包括編碼對抗生素壯觀霉素的抗性的基因(例如，aada基因)、編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉移酶(SPT)基因、編碼卡那霉素或遺傳霉素(geneticin)抗性的新霉素磷酸轉移酶(NPTII)基因、編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶(HPT)基因、編碼對除草劑的抗性的基因，其起作用以抑制乙酰乳酸合酶(acetolactatesynthase)(ALS)的作用，尤其是磺酰脲類(sulfonylurea-type)除草劑(例如，包含導致這樣的抗性的突變，尤其是S4和/或Hra突變的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、編碼對起作用以抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草劑(如草丁膦(phosphinothricin)或basta)抗性的基因(例如,6"r基因),或者本領域已知的其它這樣的基因。&r基因編碼對除草劑basta的抗性，ALS基因編碼對除草劑氯磺隆(chlorsulfuron)的抗性。用于基因在高等植物中的表達的典型的載體在本領域是熟知的，并且包括源自Rogers,""/.(1987),她仇￡考歸/.153:253-77描述的v4groZ^c/er/'ww/wwe/t/cz'em的腫瘤誘導(Ti)質粒的載體。這些載體是才直物整合栽體，因為在轉化上，所述載體將載體DNA的部分整合入宿主植物的基因組中。本文所用的示例性A,wme/ac/e似栽體是Schardl,""/.,(1987)61:1-11,和Berger,""/.,(1989)/>oc.Ato/.jc^;86:8402-6的質粒pKYLX6和pKYLX7。本文另一有用的載體是可以從CLONTECHLaboratories,Inc.(PaloAlto,CA)獲得的質粒pBI101.2。蛋白質在宿主細胞中的表達利用本發明的核酸，人們可以在重組工程化的細胞，如細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物、或優選的植物細胞中表達本發明的蛋白質。所述細胞在非天然的條件中(例如，量、組成、位置、和/或時間)產生蛋白質，因為它們已經通過人類干預而遺傳改變以這樣進行。預期本領域的技術人員在用于表達編碼本發明的蛋白質的核酸的可獲得的眾多表達系統方面是博學的。沒有進行嘗試來詳細地描述抑制用于蛋白質在原核生物或真核生物中的表達的多種已知方法。簡而言之，編碼本發明的蛋白質的分離的核酸的表達將通常通過可操作地連接，例如，DNA或cDNA到啟動子(其是組成性或可誘導的)，隨后并入表達載體而實現。所述載體可以適于在原核生物或真核生物中復制和整合。典型的表達載體包含轉錄和翻譯終止子、起始序列、及用于調節編碼本發明的蛋白質的DNA的表達的啟動子。為獲得克隆的基因的高水平表達，希望構建最少包含強啟動子，如泛蛋白，以引導轉錄，用于翻譯起始的核糖體結合位點、以及轉錄/翻譯終止子的表達載體。組成性啟動子被分類為提供一定范圍內的組成性表達。因此，一些為弱的組成性啟動子，另一些為強的組成性啟動子。通常，"弱啟動子"意圖指驅動編碼序列在低水平表達的啟動子。"低水平"意圖指在約1/10,000轉錄物到約1/100,000轉錄物到約1/500,000轉錄物的水平。相反地，"強啟動子"驅動編碼序列在"高水平"，或約1/10轉錄物到約1/100轉錄物到約/1,000轉錄物的表達。技術人員將認識到可以對本發明的蛋白質進行修飾而不降低其生物活性。一些修飾可以被進行以促進靶分子的克隆、表達、或并入融合蛋白內。這樣的修飾對于本領域技術人員是熟知的，并且包括，例如在氨基末端添加的蛋氨酸以提供起始位點，或位于兩個末端的另外的氨基酸(例如，polyHis)以形成方便位置的限制性位點或終止密碼子或純化序列。在原核生物中的表達原核細胞可以用作用于表達的宿主。最常見的原核生物以五.CO/i的各種菌抹為代表；然而，也可以使用其它微生物菌抹。本文中限定的通常使用的原核調控序列包括用于轉錄起始的啟動子、可選地具有操縱基因、與核糖體結合位點序列一起，包括這樣的通常使用的啟動子如j3內酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)啟動子系統(Chang，""/.，(I977)A^wre198.1056)、色氨酸(trp)啟動子系統(Goeddel,W"/"(1980)A^c/"c^c/A/饑8:4057)和lambda來源的PL啟動子和N-基因核糖體結合位點(Shimatake，""/.,(1981)淑群292:128)。在co//中轉染的DNA載體中包含選擇標記物也是有用的。這樣的標記物的實例包括指定對氨節青霉素、四環素、或氯霉素的抗性的基因。選擇栽體以允許感興趣的基因導入合適的宿主細胞。細菌載體通常是質粒或噬菌體起源。合適的細菌細胞被噬菌體栽體顆粒感染或被棵噬菌體栽體DNA轉染。如果使用質粒載體，細菌細胞被質粒載體DNA轉染。用于表達本發明的蛋白質的表達系統可利用萬acz〃usandMw騰〃"(Palva,""/.,(983)G置22:229-35;Mosbach，"(1983)yV"/wre302:543-5)獲得。來自Pharmacia的pGEX-4T-l質粒載體是用于本發明的優選的co/z表達載體。在真核生物中的表達多種真核表達系統如酵母、昆蟲細胞系、植物和哺乳動物細胞，是本領域技術人員已知的。如下面簡要解釋的，本發明可以在這些真核系統中被表達。在一些實施方式中，轉化的/轉染的植物細胞，如下文討論的，被用作用于產生本發明的蛋白質的表達系統。酵母中異源蛋白質的合成是熟知的。Sherman,e"/.,(1982)Mef/zoA/"y^w/G^"e,/'d,ColdSpringHarborLaboratory是4笛述可以用來在酵母中產生蛋白質的各種方法的充分驗證的著作。用于真核蛋白質生產的兩個廣泛利用的酵母是iSflcc/^rowjycescereWs/ae和尸z'c/z/fl/7"W077i。用于在S"CC/2"rOWyCW和尸/c/z/a中表達的載體、菌林、和方案在本領域是已知的并且可以從商業供應者獲得(例如，Invitrogen)。合適的載體通常具有表達調控序列，如啟動子，包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶，及復制起點、希望的終止序列等。本發明的蛋白質，一旦表達，可以通過裂解細胞并將標準蛋白分離技術應用于裂解液或沉淀物(pellet)來從酵母分離。可以利用Western測。編碼本發明的蛋白質的序列還可連接到各種表達栽體，用在轉染例如哺乳動物、昆蟲、或植物起源的細胞培養物中。哺乳動物細胞系統通常將為細胞的單層形式，雖然還可以使用哺乳動物細胞懸浮液。在本領域已經開發了大量能夠表達完整的蛋白質的合適的宿主細胞系，包括HEK293、BHK21、和CHO細胞系。用于這些細胞的表達栽體可以包括表達調控序列，如復制起點、啟動子(例如，CMV啟動子、HSVA啟動子或/7g々(磷酸甘油酸激酶)啟動子)，增強子(Queen,w(1986)/www"o/.Aev.89:49)、以及必要的加工信息位點，如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多聚腺苷酸位點(例如，SV40大TAgpolyA添加位點)、及轉錄終止序列。用于產生本發明的蛋白質的其它動物細胞是可獲4尋的，例如,乂人AmericanTypeCultureCollectionCatalogueofCellLinesandHybridomas(7thed.,1992)獲得。用于在昆蟲細胞中表達本發明的蛋白質的合適的載體通常源自SF9桿狀病毒。合適的昆蟲細胞系包括蚊幼體、蠶、粘蟲、蛾、及果蠅(Z>oyo//^/a)纟田月包系，^口Schneider纟田月包系(參見，Y列^口，Schneider,(1987)/Ew6A70/.M0/77/w/.27:353-65)。至于酵母，當采用高等動物或植物宿主細胞時，多聚腺苷酸或轉錄終止序列通常被并入載體中。終止序列的實例是來自牛生長素基因的多聚腺苷酸序列。還可以包括用于轉錄物的精確剪接的序列。剪接序列的實例是來自SV40的VP1內含子(Sprague""/.,J.45:773-81(1983))。此外，調控宿主細胞中復制的基因序列可以被并入載體中，如在牛乳頭瘤病毒型-載體中發現的那些序列(Saveria-Campo,"BovinePapillomaVirusDNAaEukaryoticCloningVector,"inC7om力g:^/Vac〃ca//ip/ro"c/2,vol.II,Glover,ed.，IRLPress,Arlington,VA,pp.213-38(1985))。此外，位于合適的植物表達載體中的NUE基因可以用于轉化植物細胞。所述多肽可以隨后從植物愈傷組織分離或者轉化的細胞可以用于再生轉基因植物。可以收獲這樣的轉基因植物，可以對合適的組織(種子或葉子，例如)進行大規模蛋白提取和純化技術。植物轉化方法用于將外源基因引入植物的眾多方法是已知的并且可以用于將NUE多核普酸插入植物宿主，包括生物和物理植物轉化方案。參見，例:i口,Mikief"ProcedureforIntroducingForeignDNAintoPlants,"inA/"/zods尸/贈M)/ecw/w朋c/S/ofec/mo/ogy,GlickandThompson,eds.,CRCPress,Inc.,BocaRaton,pp.67-88(1993)。所選的方法隨著宿主植物而變化，包括化學轉染方法，如磷酸铞、微生物-介導的基因轉移,如土壤桿菌(々ro6a"m'wm)(Horsch"Scie"ce227:1229-31(1985))、電穿孔、顯微注射、及彈道(biolistic)轟擊。用于植物細胞或組織轉化和植物的再生的表達盒和載體及體外培養方法是已知的和可獲得的。參見，例如，Gmber""/,,"VectorsforPlantTransformation,"in她f/zotfo/力尸/贈M>/ecw/ar5,o/ogyS/ofec/mo/ogy,sw/ra,pp.89-119。分離的多核苷酸或多肽可以通過通常用于直接遞送入細胞的一種或多種技術被引入植物中。這樣的方案可以依賴于有機體、細胞、植物或植物細胞的類型而變化，即，單子葉植物或雙子葉植物，靶向用于基因修飾。合適的轉化植物細胞的方法包括顯微注射(Crossway,"/.,(1986)Ao,ec/"/'^^4:320-334;及美國專利6,300，543)、電穿孔(Riggs,a/.,(1986)/>oc.AW/,v4ca6/.V&483:5602-5606,直接基因轉移(Paszkowski""/.,(1984)￡"細<9./.3:2717-2722)、及彈道粒子加速(參見，例如Sanford,""/.,美國專利No.4,945,050;WO91/10725;及McCabe，"a/.,(1988)6:923-926)。還參見，Tomes,""DirectDNATransferintoIntactPlantCellsViaMicroprojectileBombardment"pp.197-213in尸/""/Ce〃，7V^we"w/OgtmCw〃wre,尸w(^w7ew/"/A^e,/zo<^.eds.O.L.Gamborg&G.C.Phillips.Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork,1995;美國專利5,736,369(分生組織)；Weissinger,""/.,(1988)Aev.22:421-477;Sanford，""/.,(1987)尸"W/'cw/a/eScz'e"ce""〃rec/"o/ogy5:27-37(;羊'寬、)；Christou,""/.,(1988)f/""f尸/;as,W.87:671-674(大豆)；Datta,"a/.,(1990)腸/ec/mo/ogy8:736-740(稻米)；Klein,""/.,(1988)TVoc.淑/.爿c^/.,85:4305-4309(玉蜀黍)；Klein,""/.,(1988)胸ec/z油gy6:559-563(玉蜀黍)；WO91/10725(玉蜀黍)；Klein,""/,,(1988)尸/W尸/z戸o/.91:440-444(玉蜀黍)；Fromm,""/.,(1990)腸&由o/ogy8:833-839;及Gordon-Kamm,""/.,(1990)尸/爐CW/2:603-618(玉蜀黍);Hooydaas-VanSlogteren&Hooykaas(1984)淑,(London)311:763-764;Bytebierm,""/"(1987)W"".^c"dS".^7&484:5345-5349(Liliaceae);DeWet,"a/.,(1985)/7TzeEx/en'we幽/M^m一/a〃owo/Ovw/e77^wwes，edG.P.Chapman,"a/.，pp.197-209.Longman,NY(pollen);Kaeppler,(1990)尸/""fCe〃A印o,"9:415-418;及Kaeppler，""/.,(1992)Z7纖Ge威84:560-566(頸須(whisker)-介導的轉化)；美國專利No.5,693,512(聲波降解法)；D，匿uin,"a/"(1992)尸/a"f0〃4:1495-1505(電穿孔);Li,"a/"(1993)尸/a",C"/鄉om12:250-255;及ChristouandFord,(1995)j麵/so/細，75:407-413(稻米)；Osjoda,""/.,(1996)脂,5/o&c/.14:745-750;土壤桿菌介導的玉蜀黍轉化(美國專利5,981,840);碳化硅晶須(siliconcarbidewhisker)方法(Frame,""/.,(1994)尸/""fJ.6:941國948);激光法(Guo,e,a/.,(1995)尸/z戸o/ogi"尸/"廳簡93:19-24);聲波降解法(Bao,W"/.,(1997)6Y/zmowwc//她血z力ecS:腸/ogy23:953-959;FinerandFiner,(2000)丄e"柳/30:406-10;Amoah,"/,,(2001)JEx/5of52:1135-42);聚乙二醇方法(Krens,"a/.,(1982)淑,296:72-77);單子葉植物和雙子葉植物細胞的原生質體可以利用電穿孔(Fromm,Wa/.,(1985)尸,oc7Va〃.Sc/'.82:5824-5828)和顯微注射(Crossway,"a/.,(1986)M>/.Ge".202:179-185)轉化；其全部以引用方式并入本文中。土壤桿菌-介導的轉化用于將表達載體引入植物的最廣泛使用的方法是基于土壤桿菌的天然轉化系統。A化we/^c,e附和AWz/zoge"w是才直物f丈病土i泉細菌，其遺傳專爭4匕才直物纟田月包。Artwze/ac/em和Ar/n'zoge"^的Ti和Ri質并立分別攜帶負責植物的遺傳轉化的基因。參見，例如,Kado，(1991)Ov/.版尸/cmf10:1。用于土壤桿菌-介導的基因轉移的土壤桿菌載體系統和方、法的4葛述提供在Gruber,ersw/na;Miki,""/.,sw/n;andMoloney,""/.,(1989)尸/朋^Ce〃仏/w他8:238中。類似》也，基因可以孚皮4悉入分別源自爿.d/we/ac/e朋或爿./^Z20gew^的Ti或Ri質粒的T-DNA區。因此，表達盒可以利用這些質粒如上構建。許多調控序列是已知的，其在連結到異源編碼序列并轉化入宿主有機體時在基因表達中表現出關于最初的編碼序列的組織/器官特異性的保真度(fidelity)。參見，例如，BenfeyandChua,(1989)Scze"ce244:174-81。用在這些質粒中的特別合適的調控序列是用于多種靶植物中的基因的組成性葉子-特異性表達的啟動子。其它有用的調控序列包括來自胭脂堿合酶基因(NOS)的啟動子和終止子。NOS啟動子和終止子存在于質粒pARC2中，可以從AmericanTypeCultureCollection獲得，指定為ATCC67238。如果這樣的系統被使用，來自Ti或Ri質粒的毒性(Wr)基因也必需存在，或者與T-DNA部分一起，或者經由二元系統，其中基因存在于分開的載體上。這樣的系統、用于其中的載體、及轉化植物細胞的方法描述在以下中美國專利No.4,658,082;美國專利申請No.913,914,1986年10月1日提交，其在美國專利No.5,262,306中引用，于1993年11月16日授權(issued);及Simpson,""/.,(1986)尸/""fM/.B/W.6:403-15(還在'306專利中引用)；全部以其全部內容以引用方式并入。一旦構建，這些質粒可以凈皮置入Ar/^oge"es或Afwme/"cz'e附中,這些載體用于轉化植物物種的細胞，其通常對Fwsar/ww或X/f感染易感。幾種其它轉基因植物也由本發明預期，包括而不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、稻米、車軸草、甘藍、香蕉、咖啡、芹菜、煙草、ii豆、棉花、甜瓜和胡斗杈。A"we/"cz'em或AWz/zoge"^的選擇將依賴于由此被轉化的植物。通常，A/wwe/"cie似是用于轉化的優選的有機體。大多數雙子葉植物、一些棵子植物、少數單子葉植物(例如，和^ra/w的一些成員)對于借助A/wwe/acie"s的感染是易感的。Ar/^oge"^也具有廣泛的宿主范圍，包括大多數雙子葉植物和一些棵子植物,其包括Z^gwwz'"oy"e、Ccw/os7'/"e、和C72ewo/0(iZ"ce"e的成員。現在單子葉^f直物可以有些成功的轉化。歐洲專利申請No.604662Al才皮露了利用土壤桿菌轉化單子葉植物的方法。歐洲申請No.672752Al披露了利用不成熟胚胎的盾片借助土壤桿菌轉化單子葉植物的方法。Ishida,W"/.論述了通過將不成熟胚胎暴露于A^we/""'e/w轉化玉蜀黍的方法(Mm/M5/o"c/mo/ogy14:745-50(1996》。一旦轉化，這些細胞可以被用于再生轉基因植物。例如，全植物可以通過弄傷(wound)所述植物并隨后將載體引入受傷部位來被這些載體感染。所述植物的任何部分可以被弄傷，包括葉子、莖和根。可替換地，外植體形式的植物組織，如子葉組織或葉盤(leafdisks),可以被這些載體植入(inoculated),在促進植物再生的條件下培養。通過用包含編碼伏馬菌素(fumonisin)降解酶的基因的AW2/z0ge"es或A化/we/ac/ew植入植物組織轉化的根或枝條可以經由軀體(somatic)胚胎發生或器官發生用作再生伏馬菌素抗性的轉基因植物的植物組織的來源。用于再生植物組織的這樣的方法的實例4皮露在以下中Shahin,(1985)T7eor.jj^/.69:235-40;美國專利No.4,658,082;Simpson,Wa/.,上文；及美國專利申請No.913,913和913,914,均于1986年10月1日提交，其被引用在美國專利No.5,262,306中，于1993年11月16日授權，其中披露的完整內容以引用方式并入本文中。直接基因轉移盡管事實是土壤桿菌-介導的轉化的宿主范圍是廣泛的，一些主要的谷類作物物種和棵子植物通常對于這種基因轉移模式是抵抗的，即使最近已經在稻米中實現了一些成功(Hiei,""/.,(1994)77^尸/""fJowm"/6:271-82)。植物轉化的幾種方法，共同地被稱為直接基因轉移，已經作為土壤桿菌-介導的轉化的可選方法而被開發。植物轉化的通常可用的方法是微拋射體(microprojectile)-介導的轉化，其中DNA被攜帶在測量約1到4的微拋射體的表面上。表達載體借助將微拋射體加速到足以穿透植物細胞壁和膜的300到600m/s的速度的彈道(biolistic)裝置被引入植物組織中(Sanford,""/.,(1987)尸"W.rec/mo/.5:27;Sanford,(1988)7Ve"^S,o/ec/z6:299;Sanford,(1990)尸/z^,》/.79:206;及Klein,"(1992)5/o"c//"o/ogy10:268)。用于DNA物理遞送到植物的另一方法是靶細胞的聲波降解法(sonication)，描述在Zang，e,(1991)3/o7^/wo/ogy9:996中。可替換地，脂質體或球狀質體(spheroplastfusions)已經用于將表達載體引入植物中。參見，例如，Deshayes,""/.,(1985)丄4:2731;和Christou,"(1987)尸rac.層.力cd5"c/.園84:3962。也已經報道了利用CaCl2沉淀、聚乙烯醇、或聚-L-烏氨酸將DNA直接攝取入原生質體。參見，例如，Hain，"a/.,(1985)Mo/.199:161;及Draper,982)尸/a"/Ce〃尸一w'o/.23:451。已經描述了原生質體和全細胞和組織的電穿孔。參見，例如，Donn,"a/.,(1990)襲,度"o/*F馬/"i17.Co，e^ow尸/"w,CW/"wc/77纖eCw/fweA4尸7C,A2-38，p.53;D，Halluin,""/.,(1992)尸/a"fCe〃4:1495-505;及Spencer,(1994)尸/a"ZMo/.5w/.24:51-61。提高NUE多肽的活性和/或水平提供了提高本發明的NUE多肽的活性和/或水平的方法。本發明的NUE多肽的水平和/或活性的提高可以通過向植物提供NUE多肽來實現。NUE多肽可以通過以下提供將編碼NUE多肽的氨基酸序列引入植物中、將編碼NUE多肽的核苷酸序列引入植物中或可替換地通過修飾編碼本發明的NUE多肽的基因組基因座。如本文其他地方論述的，用于為植物提供多肽的許多方法在本領域是已知的，包括而不限于，直接將多肽引入植物中、將編碼具有提高的氮利用活性的多肽的多核苷酸構建體引入植物中(瞬時或穩定地)。還認識到本發明的方法可以采用不能在轉化的植物中引導蛋白質或RNA的表達的多核苷酸。因此，NUE多肽的水平和/或活性可以通過改變編碼NUE多肽的基因或其啟動子來提高。參見，例如，Kmiec,美國專利5,565,350;Zarling,PCT/US93/03868。因此提供了攜帶NUE基因中的突變的誘變的植物，其中所迷突變提高了NUE基因的表達或者提高了編碼的NUE多肽的NUE活性。降低NUE多肽的活性和/或水平植物細胞來降低或消除本發明的NUE多肽的活性的方法。所述多核苷酸可以通過防止NUE信使RNA的轉錄或翻譯直接抑制NUE多肽的表達，或者通過編碼抑制編碼NUE多肽的NUE基因的轉錄或翻譯的多肽間接抑制NUE多肽的表達。抑制或消除基因在植物中的表達的方法在本領域是熟知的，并且任何這樣的方法可以用在本發明中以抑制NUE多肽的表達。按照本發明，如果NUE多肽的蛋白水平少于沒有被遺傳修飾或誘變以抑制NUE多肽的表達的植物中相同的NUE多肽的蛋白水平的700/。，那么NUE多肽的表達被抑制。在本發明的特別實施方式中，根據本發明的修飾的植物中的NUE多肽的蛋白水平少于不是突變體或者沒有被遺傳修飾以抑制NUE多肽的表達的植物中相同的NUE多肽的蛋白水平的60%、少于50%、少于40%、少于30%、少于20%、少于10%、少于5%、或少于2%。NUE多肽的表達水平可以被直接測量，例如通過分析植物細胞或植物中表達的NUE多肽的水平，或者間接地測量，例如，通過測量植物細胞或植物中NUE多肽的氮攝取活性，或者通過測量植物中的表型變化。用于進行這樣的分析的方法在本文其他地方描述。在本發明的另外的實施方式中，NUE多肽的活性通過用包含編碼抑或消除。如果NUE多肽的NUE活性少于沒有被修飾以抑制NUE多肽的NUE活性的植物中相同的NUE多肽的NUE活性的70%,那么根據本發明NUE多肽的提高的氮利用活性被抑制。在本發明的特別實施方式中，根據本發明的修飾的植物中NUE多肽的NUE活性少于未被修飾以抑制NUE多肽的表達的植物中的相同的NUE多肽的NUE活性的60%、少于50%、少于40%、少于30%、少于20%、少于10%、或少于5%。NUE多肽的NUE活性在其通過本文其他地方描述的分析方法不能檢測到時根椐本發明被"消除，，。確定NUE多肽的氮利用活性的改變的方法在本文其他地方描迷。在另外的實施方式中，NUE多肽的活性可以通過石皮壞(disrupt)編碼NUE多肽的基因而被降低或消除。本發明包括攜帶NUE基因中的突變的誘變的植物，其中所述突變減少NUE基因的表達或抑制編碼的NUE多肽的氮利用活性。因此，許多方法可以用于降低或消除NUE多肽的活性。此外，超過一種方法可以用于降低單一的NUE多肽的活性。/.^f^裙茅^W才法.'在本發明的一些實施方式中，植物被能夠表達抑制本發明的NUE多肽的表達的多核苷酸的表達盒轉化。這里所用的術語"表達"指的是基因產物的生物合成，包括所述基因產物的轉錄和/或翻譯。例如，為了本發明的目的，能夠表達抑制至少一個NUE多肽的表達的多核苦酸的表達盒是能夠產生抑制本發明的至少一個NUE多肽的轉錄和/或翻譯的RNA分子的表達盒。來自DNA分子的蛋白質或多肽的"表達，，或"產生"指的是產生所述蛋白質或多肽的編碼序列的轉錄和翻譯，而來自RNA分子的蛋白質或多肽的"表達"或"產生，，指的是RNA編碼序列的翻譯以產生所述蛋白質或多肽。抑制NUE多肽的表達的多核普酸的實例在下面給出。/.才乂"/伊賴/^",尸賴在本發明的一些實施方式中，NUE多肽的表達的抑制(inhibition)可以通過有義4卬制(sensesuppression)或共4中制(cosuppression)獲4尋。乂于于共抑制，設計表達盒以表達相應于"有義，，方向上編碼NUE多肽的信使RNA的全部或部分的RNA分子。RNA分子的過度表達可以導致天然基因的表達降低。因此，篩查被共抑制表達盒轉化的多個植物系以筌定那些表現出NUE多肽表達的最大抑制的植物系。用于共抑制的多核苷酸可以相應于編碼NUE多肽的序列的全部或部分、NUE多肽轉錄物的5'和/或3'非翻譯區的全部或部分、或編碼NUE多肽的所述編碼序列和轉錄物的非翻譯區的全部或部分。在一些實施方式中，其中所述多核苷酸包括NUE多肽的編碼區的全部或部分，所述表達盒被設計為消除所述多核苷酸的起始密碼子以便將沒有蛋白產物被翻譯。的蛋白質的不可檢測的蛋白水平的植物。參見,例如,Broin，",(2002)尸/贈Ce〃14:1417-1432。共抑制還可以用于抑制相同的才直物中多個蛋白質的表達。參見，例如，美國專利No.5,942,657。用于利用共抑制以抑制植物中內源基因的表達的方法描述在以下中Flavell,"(1994)7>oc.A^"Sc/.91:3490-3496;Jorgensen,Wa/.,(1996)尸/""M)/.脂.31:957-973;JohansenandCarrington,(2001)尸/贈尸—o/.126:930-938;Broin,""/.,(2002)尸/""fCW/14:1417-1432;Stoutjesdijk,W"/.,(2002)尸/a"f尸/z"/'o/.129:1723-1731;Yu,""/.,(2003)尸/^0c/2ew&^y63:753-763;及美國專利Nos.5,034,323、5,283,184、和5,942,657;其每一個以引用方式并入本文中。共抑制的效率可以通過包含有義序列的3'位置的表達盒中的聚-dT區和5'的多聚腺苷酸信號而提高。參見，美國專利乂>開No.20020048814，以引用方式并入本文中。典型地，這樣的核苷酸序列具有與內源基因的轉錄物的序列的實質的序列同一性，最佳地大于約65%的序列同一性、更最佳地大于約85%的序列同一性，最最佳地大于約95%的序列同一性。參見美國專利Nos.5,283,184和5,034,323;以引用方式并入本文中。在本發明的一些實施方式中，NUE多肽的表達的抑制可以通過反義抑制獲得。對于反義抑制，表達盒被設計以表達與編碼NUE多肽的信使RNA的全部或部分互補的RNA分子。反義RNA分子的過度表達可以導致天然基因的表達降低。因此，篩選被反義抑制表達盒轉化的多個植物系以鑒定那些表現出NUE多肽表達的最大抑制的植物系。用于反義抑制中的多核苷酸可以相應于編碼NUE多肽的序列的互補體的全部或部分、NUE轉錄物的5'和/或3'非翻譯區的互補體的全部或部分、或者編碼NUE多肽的轉錄物的編碼序列和非翻譯區的互補體的全部或部分。此外，反義多核苷酸可以完全互補于(即，100%相同于耙序列的互補體)或部分互補于(即，小于100%相同于靶序列的互補體)乾序列。反義抑制可以用于抑制相同的植物中多個蛋白質的表達。參見，例如，美國專利No.5,942,657。此外，反義核苷酸的部分可以用于破壞靶基因的表達。通常，可以使用至少so個核苷酸、100個核苷酸、200個核苷酸、300、400、450、500、550或更多個核苷酸的序列。Liu,e"/.，(2002)尸/a"f尸wo/.129:1732-1743及美國專利Nos.5,759,829和5,942,657中，其每一個以引用方式并入本文中。反義抑制的效率可以通過包含反義序列的3'位置的表達盒中的聚-dT區和5'的多聚腺苷酸信號而提高。參見，美國專利公開No.20020048814,以引用方式并入本文中。/〃.雙遂m4干;夢在本發明的一些實施方式中，NUE多肽的表達的抑制可以通過雙鏈RNA(dsRNA)干涉來獲得。對于dsRNA干涉，象上述那樣用于共抑子在相同的細胞中表達，導致相應內源信使RNA的表達的抑制。有義和反義分子的表達可以通過設計表達盒以包括有義序列和反義序列而實現。可替換地，分開的表達盒可以用于有義和反義序列。隨后篩查用dsRNA干涉表達盒或多個表達盒轉化的多個植物系以鑒定表現出最大的NUE多肽表達抑制的那個植物系。用于利用dsRNA干涉以抑制內源植物基因的表達的方法描述在以下中Waterhouse,(1998)A^/,"&495:13959-13964，Liu,"a/"(2002)/Vaw/V0/o/.129:1732-1743,及WO99/49029、WO99/53050、WO99/61631、和WO00/49035;其每一個以引用方式并入本文中。/v.發i厄V」#和^含/^^發'，化Wi于/,在本發明的一些實施方式中，NUE多肽的表達的抑制可以通過發卡RNA(hpRNA)干涉或包含內含子的發卡RNA(ihpRNA)干涉獲得。這些方法在抑制內源基因的表達時是高度有效的。參見，WaterhouseandHelliwell,(2003)A^.尺ev.4:29-38及其中引用的參考文獻。對于hpRNA干涉，表達盒被設計以表達與其本身雜交的RNA分子以形成包括單鏈環區和堿基配對的莖的發卡結構。堿基配對的莖區包括相應于編碼其表達要被抑制的基因的內源信使RNA的全部或部分的有義序列，以及完全或部分互補于所述有義序列的反義序列。可替換地，堿基配對的莖區可以相應于調控要被抑制的基因的表達的啟動子序列的部分。因此，所述分子的堿基配對的莖區通常確定RNA干涉的特異性。hpRNA分子在抑制內源基因的表達時是高度有效的，它們誘導的RNA干涉凈皮才直物的隨后的世代遺傳。參見，例如，ChuangandMeyerowitz，(2000)尸亂淑/.Sci.固97:4985-4990;Stoutjesdijk,""/.,(2002)尸/a"f尸/z;w'o/,129:1723-1731;及WaterhouseandHelliwell,(2003)TV"/.Wev.GeweA4:29-38。用于利用hpRNA干涉以抑制或沉默基因表達的方法描述在，例如ChuangandMeyerowitz,(2000)/Voc.A^/.{7&497:4985-4990;Stoutjesdijk,"a/.,(2002)尸/"W尸/z^wo/.129:1723-1731;WaterhouseandHelliwe!l，(2003)淑仏v.G認A4:29-38;Pandolfini""/.,SMCAofec/mo/ogy3:7,及美國專利公開No.2003/0175965中；其每一個以引用方式并入本文中。用于hpRNA構建體在體內沉默基因表達的效率的瞬時分析(transientassay)由Panstruga,a/.,(2003)Mo/.說o/./^;,30:135-140描述，以引用方式并入本文中。對于ihpRNA，干涉分子具有與hpRNA相同的一般結構，但是RNA分子另外包括能夠在其中iphRNA被表達的細胞中被剪接的內含子。內含子的應用最小化剪接后發卡RNA分子的環的大小，這提高了干涉的效率。參見，例如，Smith,"a/.,(2000)Mm^e407:319-320。實際上，Smith,W"/.表明利用ihpRNA-介導的干涉100%抑制內源基因表達。用于利用ihpRNA干涉以抑制內源植物基因的表達的方法描述在以下中，例如，Smith,a/.，(2000)A^m/re407:319-320;Wesley,"a/.,(2001)尸/a"f</.27:581-590;WangandWaterhouse,(2001)Cwr.O;z'".尸/a"f5:146-150;WaterhouseandHelliwell,(2003)A^.Aev.4:29-38;HelliwellandWaterhouse,(2003)A/e^oA30:289-295,及美國專利公開No.2003/0180945,其每一個以引用方式并入本文中。用于hpRNA干涉的表達盒還可以被設計以便有義序列和反義序列不相應于內源RNA。在這個實施方式中，有義和反義序列在環序列的側翼，所述環序列包括相應于靶基因的內源信使RNA的全部或部分的核苷酸序列。因此，是環區確定RNA干涉的特異性。參見，例如，WO02/00904;Mette，""/.,(2000)￡7l^<9J19:5194-5201;MafzAe,""/.,Cwr.Op/".Gew"._Oeve/.//:22/-227,Sc/^,'《""/.,p002乂/Voc.A^A爿cat/.Sc/.,OS/i":"659-/3662;y4wX&，""/.,f2002,A^r/.^c^/.卯(^)../64卯-/6506;Sye","a/.,Cwr.AW.f200/」7/:W6-W6^，以引用方式并入本文中。擴增子表達盒包括植物病毒-來源的序列，其包含靶基因的全部或部分，但是通常不是天然病毒的基因的全部。表達盒的轉錄產物中存在的病毒序列允許轉錄產物引導其自身的復制。由擴增子產生的轉錄物可相對于靶序列(即，NUE多肽的信使RNA)是有義或反義的。利用擴增子以抑制內源植物基因的表達的方法描述在，例如AngellandBaulcombe,(1997)￡"A^(9丄16:3675-3684，AngellandBaulcombe,(1999)尸/"W丄20:357-362，及美國專利No.6,646,805中，其每一個以引用方式并入本文中。V/'.祐雜在一些實施方式中，由本發明的表達盒表達的多核苷酸是催化RNA或具有對于NUE多肽的信使RNA的特異性的核酶活性。因此，所述多核苷酸造成內源信使RNA的降解，導致NUE多肽的表達減少。這個方法描述在，例如，美國專利No.4,987,071中，以引用方式并入本文中。v&V、^M44'-fRA^在本發明的一些實施方式中，NUE多肽的表達的抑制可以通過RNA干涉通過編碼微RNA(miRNA)的基因的表達獲得。miRNA是由約22個核糖核苷酸組成的調節劑。miRNA在抑制內源基因的表達時是高度有效的。參見，例如，Javier,"a/.,(2003)A^we425:257-263,以引用方式并入本文中。對于miRNA干涉，表達盒被設計以表達在內源miRNA基因上被模式化(modeled)的RNA分子。miRNA基因編碼形成包含互補于另外的內源基因(靶序列)的22-核苷酸序列的發卡結構的RNA。為了NUE表達的抑制，22-核苷酸序列從NUE轉錄物序列被選擇并包含有義方向上的所迷NUE序列的22個核苷酸和互補于有義序列的相應的反義序列的21個核苷酸。miRNA分子在抑制內源基因的表達時是高度有效的，并且它們誘導的RNA千涉被植物的隨后的世代遺傳。2.j成Wi在一個實施方式中，所述多核苷酸編碼結合于編碼NUE多肽的基因的鋅指蛋白，導致所述基因的表達降低。在特別的實施方式中，所迷鋅指蛋白結合于NUE基因的調節區。在另外的實施方式中，所述鋅指蛋白結合于編碼NUE多肽的信使RNA并防止其翻譯。選擇用于鋅指蛋白的耙向的位點的方法描述在，例如，美國專利No.6,453,242中，用于利用鋅指蛋白以抑制植物中基因的表達的方法描述在，例如，美國專利公開No.2003/0037355中；其每一個以引用方式并入本文中。5.,多應W資冷^'/^，翔在本發明的一些實施方式中，所述多核芬酸編碼結合于至少一個NUE多肽的抗體，降低NUE多肽的提高的氮利用活性。在另一實施方式中，所述抗體的結合導致通過細胞質量控制機制的抗體-NUE復合體的提高的周轉。抗體在植物細胞中的表達以及通過抗體的表達和結合于植物細胞中的蛋白質的分子途徑的抑制在本領域是熟知的。參見，例如，Co歸dandSomiewald,(2003)淑,飾fec/2.21:35-36,以引用方式并入本文中。4效破銀fA酒f/o"J在本發明的一些實施方式中，NUE多肽的活性通過破壞編碼NUE多肽的基因而被降低或消除。編碼NUE多肽的基因可以通過本領域已知的任何方法被破壞。例如，在一個實施方式中，所述基因通過轉座子標簽(tagging)被破壞。在另一實施方式中，所述基因通過利用隨機或靶向的誘變來誘變植物，選擇具有降低的氮利用活性的植物而被破壞。/.脊jf標^在本發明的一個實施方式中，轉座子標簽被用于降低或消除一個或多個NUE多肽的NUE活性。轉座子標簽包括在內源NUE基因中插入轉座子以降低或消除NUE多肽的表達。"NUE基因"意圖指編碼根據本發明的NUE多肽的基因。在這個實施方式中，一個或多個NUE多肽的表達通過在編碼NUE多肽的基因的調節區或編碼區插入轉座子而降低或消除。NUE基因的外顯子、內含子、5'或3'非翻譯序列、啟動子、或任何其它調節序列內的轉座子可以被用于降低或消除編碼的NUE多肽的表達和/或活性。見，1"列^(口，Maes,"a/.,(1999)7Ve"6^尸/""/Sc/.4:90-96;DharmapuriandSonti,(1999)FEMSM/c,0Z)/0/.丄e〃.179:53-59;Meissner，W(2000)尸/朋f丄22:265-274;Phogat,""/.,(2000),/.S/o"25:57-63;Walbot，(2000)C釘.一w.尸/""/腸/,2:103-107;Gai,e//.,(2000)iVwc/eic』c油尺化28:94-96;Fitzmaurice,(1999)Ge"e〃"'153:1919-1928)。此外，用于在被選的基因中選擇Mu插入的TUSC過程已經描述在Bensen,〃(1995)尸/"加CW/7:75-84;Mena,"/.,(1996)Sc,e"ce274:1537-1540;及美國專利No.5,962,764中；其每一個以引用方式并入本文中。用于減少或消除植物中內源基因的表達的另外的方法在本領域也是已知的，可以類似地應用于本發明。這些方法包括其他形式的誘變，例如曱烷石黃酸乙酯(ethylmethanesulfonate)-誘導的誘變、缺失誘變、及在反求遺傳學意義中使用的快中子缺失誘變(借助PCR)以鑒定其中內源基因已經缺失的植物系。這些方法的實例參見Ohshima,W"/.，(1998)P7ro/ogy243:472-481;Okubara，""/.，(1994)Ge"e"^137:867-874;及Quesada，W(2000)Ge"e"^154:421-436，其每一個以引用方式并入本文中。此外，用于篩查化學誘導的突變的快速和可自動化的方法，TILLING(TargetingInducedLocalLesionsInGenomes),利用變性HPLC或所選的PCR產物的選擇性內切核酸酶消化，也可以應用于本發明。參見，McCallum,"(2000)Ma/1.j5/o&c/mo/.18:455-457,以引用方式并入本文中。影響基因表達或干擾編碼的蛋白質的功能(提高的氮利用活性)的突變在本領域是熟知的。基因外顯子中插入的突變通常導致零-突變體(null-mutant)。保守的殘基中的突變在抑制編碼的蛋白質的活性方面特別有效。已經描述了適于目的是消除NUE活性的誘變的植物NUE多肽的保守的殘基。這樣的突變體可以根據熟知的過程分離，不同NUE基因座的突變可以通過遺傳雜交(geneticcrossing)堆疊(stack)。參見，例如，Gruis,w"/.,(2002)尸/朋fCe〃14:2863-2882。在本發明的另一實施方式中，優勢突變體由于基因倒位和雙鏈的(duplicated)基因的基因座的重組而用于觸發RNA沉默。參見，例如，Kusaba，Wa/.,(2003)尸/滅C"/15:1455-1467。本發明包括另外的用于降低或消除一個或多個NUE多肽的活性的領域已知的，包括而不限于RNA:DNA載體、RNA:DNA突變的載體、RNA:DNA修復載體、混合的雙鏈寡核苷酸、自身互補的RNA:DNA寡核苷酸、及產生重組的寡核酸》成基(oligonucleobases)的應用。這樣的栽體和應用方法在本領域是已知的。參見，例如，美國專利Nos.5,565,350;5,731,181;5,756,325;5,760,012;5,795,972;和5,871,984;其每一個以引用方式并入本文中。還參見，WO98/49350,WO99/07865，WO99/25821,和Beetham,"/.,(1999)尸roc.iV"".5W.96:8774-8778;其每一個以引用方式并入本文中。源，肩/^7活^在特定的方法中，植物中NUE調節劑的水平和/活性通過提高植物中NUE多肽的水平或活性而降低。負性調節分子的提高的表達可以降低負責提高的NUE表型的下游一個或多個基因的表達水平。用于提高植物中NUE多肽的水平和/或活性的方法在本文其它地方論迷。簡短地，這樣的方法包括將本發明的NUE多肽提供給植物并由此提高NUE多肽的水平和/或活性。在另外的實施方式中，編碼NUE多肽的引入植物中來提:，表達NUE序列、提高NUE多肽:活性、并由此P;低植物或植物部分中組織細胞的數量。在另外的實施方式中，引入植物中的NUE核苷酸構建體被穩定地并入植物的基因組中。在另外的方法中，植物組織的生長通過降低植物中NUE多肽的水平和/或活性而提高。這樣的方法詳細披露于本文的其他地方。在一個這樣達降低了NUE多肽的活性，'并由此提高了植物或植物部分中的組織生長。在另外的實施方式中，被引入植物中的NUE核苷酸構建體被穩定的并入植物的基因組中。如上所述，技術人員將認識到用于調節植物中NUE的水平/活性的合披露:_々、、-、、._,、、在另外的實施方式中，這樣的植物已經穩定地將包含可操作地連接酸分子并入它們的基因組中。/v.源，旅發,提供了用于調節植物中的根發育的方法。"調節根發育"意圖指與對照植物比較時植物根的發育中的任何改變。根發育中這樣的改變包括，而不限于，初生根的生長速率、新鮮根重、側根和不定根形成的程度、維管系統(vasculaturesystem)、分生組織發育、或徑向擴張的改變。提供了用于調節植物中根發育的方法。所述方法包括調節植物中的NUE多肽的水平和/或活性。在一個方法中，本發明的NUE序列被提供給植物。在另一方法中，通過將包含本發明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物中提供NUE核苷酸序列，表達N"UE序列，并且由此改變根發育。在又一方法中，被引入植物中的NUE核苷酸構建體被穩定地并入植物的基因組中。在另外的方法中，通過改變植物中NUE多肽的水平或活性調節根發育。NUE活性的變化可以導致至少一個或多個根發育的下面的改變，包括而不限于，根生物量和長度的改變。如本文所用的，"根生長"包括單子葉植物和雙子葉植物中根系統發育的不同階段組成根系統的不同部分的生長的全部方面。還將理解提高的根生長可以起因于包括初生根、側根、不定根等的其部分的一個或多個的提高的生長。測量根系統中這樣的發育改變的方法在本領域是已知的。參見，例如，美國申請No.2003/0074698和Werner，"a/.,(2001)尸WAS18:10487-10492,這兩者均以引用方式并入本文中。如上所述，技術人員將認識到用于調節植物中的根發育的合適的啟(root-preferred^的啟^子。示例性的根-優先的啟動子已經在本文^它:t也方4皮露。通過降低NUE多肽的活性和/或水平刺激根生長和提高根質量(mass)還發現在提高植物的站立能力(standabiHty)方面的應用。術語"對倒伏的抗性"或"站立能力，，指的是植物將其本身固定于土壤的能力。對于具有直立或半直立生長習性的植物，這個術語還指的是在不利(環境)條件下維持垂直位置的能力。這個性狀涉及根系統的大小、深度和形態。此外，通過改變NUE多肽的水平和/或活性刺激根生長并提高根質量還發現在促進外植體的體外繁殖中的應用。此外，由于NUE活性的更高根生物量產生對產量具有直接作用，生的化合物的產生具有間接作用。根培養物中產生的感興趣的化合物的一個實例是紫草寧，其產量可以通過所述方法有利地提高。因此，本發明進一步提供了當與對照植物的根發育相比時具有調節的根發育的植物。在一些實施方式中，本發明的植物具有本發明的NUE多肽的提高的水平/活性，并且具有提高的根生長和/或根生物量。在其它實施方式中，這樣的植物具有穩定地并入它們的基因組中的包含可操作地連接到驅動在植物細胞中的表達的啟動子的本發明的NUE核苷酸序列的核酸分子。v.舒戎務村W,還提供了用于調節植物中枝條和葉子發育的方法。"調節枝條和/或葉子發育"意指植物枝條和/或葉子的發育中的任何改變。枝條和/或葉子發育中的這樣的改變包括，而不限于，枝條分生組織發育、葉子數量、葉子大小、葉子和莖維管系統、節間長度、和葉子衰老中的改變。如本文所用的，"葉子發育"和"枝條發育"包括單子葉植物和雙子葉植物中，在它們發育的不同階段，分別形成葉子系統和枝條系統的不同部分的生長的所有方面。用于測量枝條和葉子系統中這樣的發育改變的方法在本領域中是已知的。參見，例如，Werner,"a/.,(2001)尸AC4S98:10487-10492和美國申請No.2003/0074698,其每一個以引用方式并入本文中。調節植物中枝條和/或葉子發育的方法包括調節本發明的NUE多肽的活性和/或水平。在一個實施方式中，提供了本發明的NUE序列。在另外的實施方式中，NUE核苷酸序列可以通過將包含本發明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物中而提供，表達NUE序列，并由此改變枝條和/或葉子發育。在另外的實施方式中，引入植物中的NUE核苷酸構建體被穩定地并入植物的基因組中。在特定的實施方式中，通過改變植物中NUE多肽的水平和/或活性調節枝條或葉子發育。NUE活性的改變可以導致枝條和/或葉子發育中與對照植物相比的至少一個或多個下面的改變，包括，而不限于，葉子數量的變化、改變的葉子表面、改變的維管系統、節間和植物生長、及葉子衰老中的改變。如上所述，技術人員將認識到用于調節植物的枝條和葉子發育的合枝條-優先的啟動子、枝l分生-組織-優先的啟動子、及葉子:優先的啟動子。示例性的啟動子已經在本文其他地方披露。明的;法發現在產生改變的才i物中的應用。'此外，如上所述，、植物中的nue活性調節根和枝條生長。因此，本發明進一步提供了用于改變根/枝條比例的方法。枝條或葉子發育可以進一步通過改變植物中nue多肽的水平和/或活性而被調節。因此，本發明進一步提供了與對照植物相比時具有調節的枝條和/或葉子發育的植物。在一些實施方式中，本發明的植物具有本發明的nue多肽的提高的水平/活性。在另外的實施方式中，本發明的植物具有降低的本發明的nue多肽的水平/活性。W,諷，^J^ig織發'f"提供了用于調節再生組織(^productivetissue)發育的方法。在一個實施方式中，提供了調節植物中花(floral)發育的方法。"調節花發育，，意指與其中nue多肽的活性或水平沒有被調節的對照植物相比時植物的再生組織的結構中的任何改變。"調節花發育"進一步包括與其中nue多肽的活性或水平沒有被調節的對照植物相比時植物的再生組織的發育的定時(timing)中的任何改變(即，花發育的延遲或加速的定時)。宏觀改變可以包括以下的變化再生器官的大小、形狀、數量、或位置、這些結構形成的發育時期、或者環境應激時維持或進行開花過程的能力。微觀改變可以包括形成再生器官的細胞的類型或形狀的變化。方法中，提供了本發明的nue序列。nue核苷酸序列可以通過將包含本發明的nue核普酸序列的多核苷酸引入植物中而提供，表達nue序列，并由此改變花發育。在另外的實施方式中，引入植物中的nue核苷酸構建體被穩定地并入植物的基因組中。在特別的方法中，通過提高植物中nue多肽的水平或活性調節花發育。nue活性的變化可以導致與對照植物相比時花發育中下面的改變的至少一個或多個，包括而不限于，改變的開花、變化的花的數量、改變的雄性不育、及改變的種子set。誘導延遲的開花或抑制開花可以用于提高飼料作物如苜蓿的產量。用于測量花發育中這樣的發育改變的方法在本領域是已知的。參見，例如，Mouradov,"(2002)7TzeCe〃S111-S130,以引用方式并入本文中。如上所述，技術人員將認識到用于調節植物的花發育的合適的啟動子。用于這個實施方式的示例性的啟動子包括組成性啟動子、可誘導的啟動子、枝條-優先的啟動子、及花序-優先的啟動子。在另外的方法中，通過改變本發明的NUE序列的水平和/或活性調節花發育。這樣的方法可以包括將NUE核苷酸序列引入植物中并改變NUE多肽的活性。在另外的方法中，引入植物中的NUE核普酸構建體被穩定的并入植物的基因組中。改變本發明的NUE序列的表達可以調節應激期間花發育。這樣的方法描述在本文的其他地方。因此，本發明進一步提供了在與對照植物的花發育相比時具有調節的花發育的植物。組成包括具有改變的本發明的NUE多肽的水平/活性并具有改變的花發育的植物。組成還包括具有本發明的NUE多肽的改變的水平/活性的植物，其中所述植物在應激時維持或進行開花過程。還提供了用于利用本發明的NUE序列以提高種子大小和/或重量的方法。所述方法包括提高植物或植物部分，如種子中的NUE序列的活性。種子大小和/或重量的提高包括種子大小或重量的提高和/或一個或多個種子部分(包括，例如胚胎(embryo),胚乳、種皮、糊粉、或子葉)的大小或重量的提高。如上所述，技術人員將認識到用于提高種子大小和/或種子重量的合適的啟動子。這個實施方式的示例性的啟動子包括組成性啟動子、可誘導的啟動子、種子-優先的啟動子、胚胎-優先的啟動子、及胚乳-優先的啟動子。用于改變植物中種子大小和/或種子重量的方法包括提高植物中的NUE活性。在一個實施方式中，NUE核苷酸序列可以通過將包含本發明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物來提供，表達NUE序列，并由此降低種子重量和/或大小。在另外的實施方式中，引入植物中的NUE核苷酸構建體被穩定地并入植物的基因組中。進一步認識到提高種子大小和/或重量還可以伴隨有幼苗的生長速度的提高或早期活力(earlyvigor)的提高。如本文所用的，術語"早期活力"指的是植物在早期發育中快速生長的能力，并且涉及充分發育的根系統和充分發育的光合器官(apparatus)在萌發后的成功建立。此外，種子大小和/或重量的提高還可以導致與對照相比時種子產量的提高。因此，本發明進一步提供了與對照植物相比時具有提高的種子重量和/或種子大小的植物。在另外的實施方式中，提供了具有提高的活力和植物產量的植物。在一些實施方式中，本發明的植物具有本發明的NUE多肽的改變的水平/活性并具有提高的種子重量和/或種子大小。在另外的實施方式中，這樣的植物具有穩定地并入它們的基因組中的包含可操序列的核酸分子。v".M7五/裙芬^、《這盆、及^斧W/祐茅^時^V^才法本文披露的核苷酸、表達盒和方法用于調節宿主植物中任何異源核普酸序列的表達以便改變植物的表型。表型的各種變化是感興趣的，包括改變植物中脂肪酸的組成、改變植物的氨基酸含量、改變植物的病原體防御機制等。這些結果可以通過提供植物中異源產物的表達或提高的內源產物的表達來實現。可替換地，所述結果可以通過提供植物中一個或多個內源產物，尤其是酶或輔因子的表達的減少來實現。這些變化導致轉化的植物的表型變化。感興趣的基因反應商業市場和植物發育中涉及的那些的興趣。感興趣的作物和市場改變，并且隨著發展中國家打開國際市場，也將出現新的作物和技術。此外，隨著我們對農藝學性狀和特征(如產量和雜種優勢)的理解提高，用于轉化的基因的選擇將因此改變。感興趣的基因的一般種類包括，例如信息中涉及的那些基因，如鋅指，傳達中涉及的那些，如激酶，管家(housekeeping)中涉及的那些，如熱休克蛋白。轉基因的更特別的種類，例如，包括編碼農業經濟學的重要性狀、昆蟲抗性、疾病抗性、除草劑抗性、不育性、谷粒特征、及商業產品的基因。感興趣的基因通常包括油、淀粉、碳水化合物、或營養物代謝中涉及的那些以及影響仁(kernel)大小、蔗糖負載等的那些。在一些實施方式中，本發明的核酸序列可以與感興趣的其它多核苷酸序列組合("堆疊，，)使用，以便形成具有希望的表型的植物。產生的組合可以包括感興趣的任何一個或多個多核苷酸的多個拷貝。本發明的多核苷酸可以與任何基因或基因的組合堆疊以產生具有多種希望的性狀組合的植物，包括而不限于對于動物飼料希望的性狀，如高油基因(例如，美國專利No.6,232,529);平衡的氨基酸(例如，hordothionins(美國專利Nos.5,990,389;5,885,801;5,885,802;及5,703,409);大麥高賴氨酸(Williamson,W"/.,(1987)丄5z'oc/zem.165:99-106;和WO98/20122);及高蛋氨酸蛋白(Pede腦,"a/.,(1986)Wo/.CT綴261:6279;Kirihara,W"/.,(1988)71:359;及Musumura,(1989)尸/""/M/.5z'o/.12:123));提高的消化性(例如，修飾的儲備蛋白(美國申請系列No.10/053,410,于2001年11月7日提交)；和硫氧還蛋白(美國申請系列No.10/005，429,于2001年12月3日提交))，其披露的內容以引用方式并入本文。本發明的多核苷酸還可以與昆蟲、疾病或除草劑抗性希望的性狀堆疊(例如，5ac/〃wsAW7"g/'e似^y毒性蛋白(美國專利Nos.5,366，892;5,747,450;5，737,514;5723,756;5,593,881;Gdser,""/.,(1986)Ge"e48:109);凝集素(VanDamme,""/.,(1994)A/o/.24:825);伏馬菌素解毒基因(美國專利No.5,792,931);無毒和疾病抗性基因(Jones,""/.,(1994)266:789;Martin,W"/.,(1993)Sc/e"ce262:1432;Mmdrinos，""/.,(1994)CW/78:1089);導致除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突變體如S4和/或Hra突變；谷氨酰胺合酶的抑制劑如草丁膦或basta(例如，bar基因);和草甘膦抗性(EPSPS基因))；加工或加工產品希望的性狀如高油(例如，美國專利No.6,232,529);修飾的油(例如，脂肪酸去飽和酶基因(美國專利No.5,952,544;WO94/11516));改性淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)，淀粉合酶(SS)，淀粉分支酶(SBE)和淀粉脫支酶(SDBE));及聚合物或bioplastics(例如,美國專利No.5.602，321;卩-酮硫解酶(beta-ketothiolase),聚羥基丁酸合酶(polyhydroxybutyratesynthase),和乙酰乙酰-CoA還原、酶(Schubert,"a/.,(1988)^"mo/.170:5837-5847)促進聚羥基鏈烷酸酯(polyhydroxyalkanoates)(PHAs)的表達)，其披露的內容以引用方式并入本文。人們還可以將本發明的多核苷酸與影響農藝學性狀的多核苷酸組合，所述農藝學性狀如雄性不育(例如，參見美國專利No.5.583,210)、莖桿(stalk)強度、開花時間、或轉化技術性狀，如細胞周期調節或基因靶向(例如，WO99/61619;WO00/17364;WO99/25821),其4皮露的內容以引用方式并入本文中。在一個實施方式中，感興趣的序列提高了植物生長和/或作物產量。例如，感興趣的序列包括導致提高的初生根或側根系統的農藝學上重要的基因。這樣的基因包括，而不限于，營養素/水運輸物和生長誘導物。這樣的基因的實例，包括而不限于，玉蜀黍質膜H+-ATPase(MHA2)(Frias,"a/.,(1996)尸/鍾Ce〃S:1533-44);AKT1,^ra^卻^中鉀攝取器官的成分(Spalding,""/.,(1999)7尸—o/113:909-18);RML基因,其激活根頂端細胞中的細胞分裂周期(Cheng，Wa/.,(1995)尸/a^尸wW108:881);玉蜀黍谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya,W"/.，(1994)尸/朋fAfo/5Zo/26:1935-46)和血紅蛋白(Duff,"a/"(1997)丄Ao/.C&m27:16749-16752,Arredondo-Peter,efa/.，(1997)尸/a"f尸wo/.115:1259-1266;Arredondo-Peter,""/.，(1997)尸/""/尸;2"/0/114:493-500及其中引用的參考文獻)。感興趣的序列在表達負性影響根發育的基因的反義核苷酸序列中也是有用的。此外，除了利用傳統的育種方法，農藝學上重要的性狀如油、淀粉、及蛋白含量可以被遺傳改變。變更包括提高油酸、飽和和不飽和的油的含量、提高賴氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸、及淀粉的修飾。Hordothionin蛋白修飾描述在美國專利Nos.5,703,049,5，885，謝,5,885,802,和5,9卯，389中，以引用方式并入本文中。另一實例是由大豆2S白蛋白編碼的賴氨酸和/或疏豐富的種子蛋白，描述在美國專利No.5,850,016中，和來自大麥的糜蛋白酶抑制劑，描述在Williamson,"a/.,(1987)AoAew.165:99-106中，其披露的內容以引用方式并入本文中。編碼序列的衍生物可以通過位點-引導的誘變制備以提高編碼的多肽中預選的氨基酸的水平。例如，編碼大麥高賴氨酸多肽(BHL)的基因源自大麥糜蛋白酶抑制劑，美國申請系列No.08/740,682，于1996年11月1日提交，以及WO98/20133,其披露的內容以引用方式并入本文中。其它蛋白質包括蛋氨酸豐富的植物蛋白質，如來自向日葵種子(Lilley，efa/.,(1989)尸尸oceed/"gso/Ae]^o/*/t/Co"gress0"「egetoZ)/e/Vo"/"/力//歸"w尸oog^awt/爿"/麵/Feet/sfi^，ed.Applewhite(AmericanOilChemistsSociety,Champaign,Illinois),pp.497-502;以引用方式并人本文中)；玉米(Pedersen,Wa/.，(1986)丄5/o/.CAem.261:6279;Kirihara,w(1988)Ge"e71:359;兩者以引用方式并入本文中)；以及稻米(Musu匿a,"fl/.，(1989)尸/慮嵐飾/.12:123,以引用方式并入本文中)。其它農藝學上重要的基因編碼膠乳、Floury2、生長因子、種子儲藏因子、及轉錄因子。昆蟲抗性基因可以編碼對具有較大產量制約的害蟲的抗性，如食蟲、切根蟲、歐洲玉米螟(Eur叩eanCornBorer)等。這樣的基因包括，例如，毒性蛋白基因(美國專利Nos.5,366,892;5,747,450;5,736,514;5,723,756;5,593,881;及Geiser,(1986)48:109);等等。編碼疾病抗性性狀的基因包括解毒基因、如針對fumonosin(美國專利No.5,792,931);無毒(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones,"a/.,(1994)266:789;Martin,"a/.,(1993)Sc/麼e262:1432;及Mindrinos,"《(1994)0〃78:1089);等等。除草劑抗性性狀可以包括編碼對除草劑抗性的基因，其起作用以抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用，尤其是磺酰脲類除草劑(例如，包含導致這樣的抗性的突變的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，尤其是S4和/或Hra突變)、編碼對作用以抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草劑的抗性的基因，如草丁膦或basta(例如，bar基因)，或本領域已知的其它這樣的基因。6ar基因編碼對除草劑basta的抗性，"pr//基因編碼對抗生素卡那霉素和遺傳霉素的抗性、ALS-基因突變體編碼對除草劑氯磺隆的抗性。不育基因也可以在表達盒中編碼并且提供physical去雄的可選方性不育表型的基因，如QM,描述在美國專利No.5,583,210中。其它基因包括激酶和那些編碼對雄性或雌性配子體發育有毒的化合物的基因。谷粒的質量反映在如下性狀中，如飽和和不飽和的油的水平和類型、必需氨基酸的質量和量、纖維素的水平。在玉米中，修飾的hordothionin蛋白描述在美國專利Nos.5,703,049,5,885,801，5,885,802,和5,990,389中。商業性狀也可以編碼在基因或多個基因上，其可以提高，例如，用于乙醇生產的淀粉，或提供蛋白的表達。轉化的植物的另一重要的商業應用是聚合物和bioplastics的產生，如美國專利No.5,602,321中描述的。基因如P-酮硫解酶、PHBase(聚羥基丁酸合酶)、和乙酰乙酰-CoA還原酶(參見，Schubert,988)J.B""eno/.170:5837-5847)促進聚羥基鏈烷酸酯(PHAs)的表達。外源產物包括植物酶和產物以及來自包括原核生物和其它真核生物的其他來源的那些。這樣的產物包括酶、輔因子、激素等。蛋白質的水平，尤其是具有提高的氨基酸分布以提高植物的營養價值的修飾的蛋白質的水平，可以被提高。這通過具有提高的氨基酸含量的這樣的蛋白質的表達實現。參照下面的非限制性實施例可以更好地理解這個發明。本領域技術人員將認識到可以實踐本發明的其它實施方式而不偏離本文"l皮露和要求的本發明的精神和范圍。實施例實施例1.NUE序列的分離用于鑒定基因家族的所有成員的程序可以用于檢索感興趣的提高的氮利用效率基因。將制備作為蛋白質序列的基因家族的所有已知成員的不同的組。這個數據包括來自其它物種的序列。這些物種隨后被針對專有的(proprietary)玉蜀黍序列數據組(dataset)檢索并且重疊命中(hits)的非冗余組被鑒定。分別地，人們處理感興趣的任何基因的核苷酸序列并且針對所述數據庫檢索，所有重疊命中的非冗余組被檢索到。蛋白質命中的組隨后與核苷酸命中比較。如果基因家族是完全的，所有蛋白質命中包含在核苷酸命中內。實施例2.NUE通過功能的分類<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>實施例3.玉蜀黍中利用MPSS的表達模式MPSS代表MassivelyParallelSignatureSequencing，由LynxTherapeutics,Inc.ofHayward,California發明并商業化的技術。MPSS和相關的技術已經描述在Brenner,w"/.，(Atowre歷o"c/z"o/.(2000)18:630-634,and/WJS(2000)97:1665-1670)的公開出版物中。象SAGE(SerialAnalysisofGeneExpression),MPSS產生從mRNA內的限定位置產生的短序列信號(signature),這些信號在給定文庫中的相對豐度代表那個基因的表達的定量估計。MPSS信號為17bp長，可以獨特的鑒定Arabidopsis中的所有基因的〉95%。NUE序列被匹配于MPSS數據，匹配標簽(GATC-17mers)被安排(curated)。理想地，用于基因的正確的標簽是在正鏈中，接近但是從polyA尾向上，它是基因特異性的。當超過一個標簽匹配基因時，人們通常選擇最接近polyA尾的那個，其也通常是具有最高的基因表達的那個。當標簽匹配超過一個基因時，正確的基因聯合通常是具有最佳地相應于由MPSS數據揭示的表達模式的EST分布的那個。實施例4,轉基因植物的轉化和再生用包含可操作地連接到千旱-可誘導的啟動子RAB17啟動子(Vilardell,""/.,(1990)尸/"",A必/Ao/14:423-432)和提供對除草劑雙丙氨磷的抗性的可選擇的標記物基因PAT的NUE序列的質粒轟擊來自溫室供體植物的不成熟的玉蜀黍胚胎。可替換地，可選擇的標記物基因在分開的質粒上提供。轉化如下進行。介質配方如下。革巴組織的制備耳穗被脫殼并在30%次氯酸鈉漂白劑(Cloroxbleach)加0.5%微洗滌劑(Microdetergent)中表面滅菌20分鐘，用無菌水漂洗兩次。不成熟的胚胎被切下并且放置在560Y培養基上4小時，胚軸側向下(盾片側向上)，每個盤25個胚胎，隨后排列在2.5-cm耙區域內準備轟擊。DNA的制備制備包含可操作地連接于泛蛋白啟動子的NUE序列的質粒載體。這個質粒DNA加上包含PAT可選擇的標記物的質粒DNA,利用如下的CaCl2沉淀程序被沉淀到1.1Mm(平均直徑)的鵠粒上水中100(il制備的鴒粒TrisEDTA緩沖劑中10pi(1pg)DNA(1總DNA)100(il2.5MCaCl210plO.lM亞精胺每個試劑被順序地加入鎢粒懸浮液，同時維持在多管渦旋機(vortexer)上。最后的混合物被簡單地超聲并且允許在恒定的渦旋下孵育10分鐘。在沉淀期后，所迷管被簡單地離心，去除液體，用500ml100%乙醇沖洗，并離心30秒。再次去除液體，將105pi100%乙醇加到最終的鵠粒沉淀物。對于基因槍(粒子槍)轟擊，鎢/DNA粒子被簡單地超聲并且10pi點到每個大運栽體(macrocarrier)的中心上，并且允許在轟擊前干燥約2分鐘。基因槍處理在基因槍中在水平#4轟擊樣品盤。所有的樣品接受在650PSI的單擊，總共10個等分試樣取自制備的粒子/DNA的每個管。隨后的處理轟擊后，胚胎被保持在560Y培養基上2天，隨后轉移到包含3mg/L的雙丙氨磷的560R選擇培養基，并每2周傳代培養。在約10周的選擇后，選擇抵抗的愈傷組織克隆被轉移到288J培養基以開始植物再生。在體細胞胚成熟后(2-4周)，充分發育的體細胞胚被轉移到用于萌發的培養基并轉移到光亮的培養室。約7-10天后，發育中的小植物被轉移到管中272V無激素培養基達7-10天直到小植物被充分地建立。隨后將植物轉移到包含盆栽土的平面中的插入口(insert)(相當于2.5"罐)并在生長室中生長l周，隨后在溫室中生長另外的l-2周，隨后轉移到經典的600罐(1.6加侖)并生長至成熟。對植物監測并對提高的干旱耐性計分。測量提高的干旱耐性的分析在本領域是常規的并包括，例如，在與相同的環境條件下的對照玉蜀黍植物相比時在干旱條件下提高的仁-耳穗容量(kernel-earringcapacity)產量。可替換地，轉化的植物可以被監測在分生組織發育中的調節(即，耳穗上小穗形成的減少)。參見,例如Bruce,",(2002)Jow/t"/o/Ex/e"'膨W"/5o她少53:1-13。轟擊和培養介質轟擊培養基(560Y)包含4.0g/lN6基礎鹽(basalsalts)(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson'sVitaminMix(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/1疏胺素HCl、120.0g/1蔗糖、1.0mg/12,4-D、及2.88g/1L-脯氨酸(在用KOH調節到pH5.8之后用D-IH20加到體積(broughttovolume));2.0g/1Gelrite(在用D-IH20加到體積后加入)；及8.5mg/1硝酸銀(在將培養基滅菌后加入并冷卻到室溫)。選擇培養基(560R)包含4,0g/1N6基礎鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson'sVitaminMix(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/1硫胺素HCl、30.0g/1蔗糖、及2.0mg/12,4-D(在用KOH調節到pH5.8之后用D-IH20加到體積)；3.0g/1Gelrite(在用D-IH20加到體積后加入)；及0.85mg/1硝酸銀和3.0mg/1雙丙氨磷(bialaphos)(均在將培養基滅菌后加入并冷卻到室溫)。植物再生培養基(288J)包含4.3g/1MS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS維生素類儲備溶液(0.100g煙酸、0.02g/1硫胺素HCL、0.10g/1吡。多醇HCL、及0.40g/1甘氨酸，用精制的(polished)D-I&0加到體積)(M薦higeandSkoog(1962)尸一o/.尸/威15:473)、100mg/1肌醇、0.5mg/1玉米素、60g/1蔗糖、及1.0ml/1的0.1mM脫落酸(在調整到pH5.6后用精制的D-IH20加到體積)；3.0g/1Gelrite(在用D-IH20加到體積后加入)；及1.0mg/l叼l咮乙酸和3.0mg/1雙丙氨磷(在將培養基滅菌后加入并冷卻到60°C)。無激素培養基(272V)包含4.3g/iMS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS維生素類儲備溶液(0.100g/1煙酸、0.02g/1硫胺素HCL、0.10g/1吡。多醇HCL、及0.40g/1甘氨酸，用精制的D-IH20加到體積)、0.1g/l肌醇、及40.0g/1蔗糖(在調整pH到5.6后用精制的D-IH20加到體積);及6g/1細菌瓊脂(bacto-agar)(在用精制的D-IH20加到體積后加入)，滅菌并冷卻到6(TC。實施例5.i壤々^介,^脊必為了用本發明的NUE序列的反義序列的土壤桿菌介導的玉蜀黍轉化，優選采用Zhao的方法(美國專利No.5,981,840，及PCT專利公開W098/32326;其內容以引用方式并入本文中)。簡短地，從玉蜀黍分離不成熟的胚胎并且將胚胎與土壤桿菌的懸浮液接觸，其中細菌能夠將反義NUE序列轉移到不成熟胚胎的至少一個的至少一個細胞(步驟1:感染步驟)。在這個步驟中不成熟的胚胎被優選地浸入土壤桿菌懸浮液用于接種的起始。胚胎與土壤桿菌共培養一段時間(步驟2:共培養步驟)。優選地，不成熟的胚胎在感染步驟后在固體培養基上培養。在這個共培養期后，預期進行可選的"靜止"步驟。在這個靜止步驟中，在至少一個已知抑制土壤桿菌的生長的至少一個抗生素的存在下孵育胚胎，而沒有添加用于植物轉化體的選擇性試劑(步驟3:靜止步驟)。優選地，不成熟的胚胎在具有抗生素而沒有選擇性試劑的固體培養基上培養，用于消除土壤桿菌并且用于感染的細胞的靜止期。隨后，接種的胚胎在包含選擇性試劑的培養基上培養并且生長的轉化的愈傷組織被回收(步驟4:選擇步驟)。優選地，不成熟的胚胎在具有導致轉化的細胞的選擇性生長的選擇性試劑的固體培養基上培養。愈傷組織隨后再生為植物(步驟5:再生步驟)，優選地在選擇性培養基上生長的愈傷組織在固體培養基上培養以再生植物。植物被監測并計分在分生組織發育中的調節。例如，大小的改變和枝條和花分生組織的出現和/或提高的葉子、花朵、和/或果實的產量。實施例6.大豆胚胎轉化用包含可操作地連接到如下的泛蛋白啟動子的反義NUE序列的質粒轟擊大豆胚胎。為了誘導體細胞胚，從大豆栽培種A2872的表面滅菌的、不成熟的種子切下的長度為3-5mm的子葉在合適的瓊脂培養基上在26。C的光亮或黑暗中培養六到十周。產生二級胚胎(secondaryembryo)的體細胞胚隨后被切下并置入合適的液體培養基中。在重復地選擇繁殖為早期、球形期胚胎的體細胞胚的集簇后，懸浮液被如下維持。大豆胚發生懸浮培養物可以被維持在旋轉振蕩器上的35ml液體介質中，150rpm,26°C，16:8小時日/夜時間表的焚光。每兩周通過將約35mg的組織接種入35ml的液體培養基來傳代培養培養物。隨后通過基因槍轟擊的方法轉化大豆胚發生懸浮培養物(Klein,w"/"(1987)淑,327:70-73,美國專利No.4,945,050)。DuPontBiolisticPDS1000/HE儀器(heliumretrofit)可以用于這些轉化。可以用于促進大豆轉化的可選擇的標記物基因是由來自CauliflowerMosaicVirus的35S啟動子(Oddl，Wa/.,(1985)A^化,e313:810-812)、來自質粒pJR225的潮霉素磷酸轉移酶基因(來自五.co//;Gritz,"/.,(1983)25:179-188)、及來自爿g尸o6ac"r/i/w^/wey^"'ews的Ti質粒的T-DNA的胭脂堿合酶基因的3'區組成的轉基因。包含可操作地連接到泛蛋白啟動子的反義NUE序列的表達盒可以被作為限制性片段分離。這個片段可以隨后被插入攜帶標記物基因的載體的獨特的限制性位點。向50pl的60mg/ml1pm金粒懸浮液中加入(按次序)5plDNA(1pg/Ml)、20pl亞精胺(0.1M)、及50^CaCl2(2.5M)。粒子制備物隨后^皮攪拌三分鐘、在孩i量離心機(microfuge)中離心(spun)10秒、去除上清液。DNA-包覆的粒子隨后在400pl70%乙醇中沖洗一次，重新懸浮在40pl的無水乙醇中。DNA/粒子懸浮液可以被超聲三次，每次一秒。5pl的DNA-包覆的金粒子隨后被加載在每個大運載盤上。將約300-400mg的兩周大的懸浮培養物置于空的60x15mm培養皿中并用吸管從組織去除殘余的液體。對于每個轉化實驗，組織的約5-10個盤通常被轟擊。膜破裂壓設定在1100psi,所述室被抽空為28英寸水銀的真空。所述組織被放置在離阻滯篩約3.5英寸遠并被轟擊三次。在轟擊后，所述組織可以被分成兩半，放置回液體中，并如上所述培養。轟擊后5-7天，液體介質可以用新鮮介質交換，轟擊后11-12天用包含50mg/ml的潮霉素的新鮮介質交換。這個選擇性介質可以每周更新。轟擊后7-8周，綠色、轉化的組織可以被觀察到從未轉化的、壞死的胚胎發生集簇生長。分離的綠色組織被去除并接種入單獨的燒瓶以產生新的、克隆繁殖的、轉化的胚胎發生懸浮培養物。每個新的系可以作為獨立的轉化事件對待。這些懸浮物可以隨后被傳代培養并維持為不成熟的胚胎的集蔟或通過單獨的體細胞胚的成熟和萌發再生為全植物。實施例7.向日葵分生組織轉化用包含可操作地連接到如下的泛蛋白啟動子的反義NUE序列的表達盒轉化向日葵分生組織(還參見，歐洲專利No.EP0486233,以引用方式并入本文中，及Malone-Schoneberg,"a/.,(1994)尸/aWS"'e"ce103:199-207)。利用單小麥頭脫粒機將成熟向日葵種子(//6//""^2^"朋m/sL.)去殼。種子在每50ml溶液中添加有兩滴吐溫20的20%次氯酸鈉漂白劑溶液中表面滅菌30分鐘。所述種子用無菌蒸餾水漂洗兩次。通過Schrammeijer,W(Schrammeijer,W"/.,(1990)尸/awfCe〃ie/.9:55-60)描述的過程的改良制備分裂的(split)胚軸外植體。在表面滅菌程序后種子被吸入蒸餾水達60分鐘。每個種子的子葉隨后被破裂，在胚軸的面上產生清楚的裂口。在切除根尖后，外植體在初葉之間縱向切開。兩半切割面朝上被放置在GBA培養基上，所述GBA培養基由Murashige禾口Skoog礦質元素(Murashige,""/.,(1962)尸/;Ayz'o/,尸/""A,15:473-497)、Shepard's維生素添加劑(Shepard,(1980)in7^c/mz々w"/orAeGe""/c/m/roveme"fo/Oo/w(UniversityofMinnesotaPress,StPaul,Minnesota),40mg/1碌u酸腺嘌呤、30g/1蔗糖、0.5mg/16-苯曱基-氨基嘌呤(BAP)、0.25mg/1吲哚-3-乙酸(IAA)、0.1mg/1赤霉酸(GA3),pH5.6,及8g/1Phytagar組成。在土壤桿菌處理前對外植體進行微拋射轟擊(Bidney,"/.,(1992)尸/""/M/.Ao/.18:301-313)。30-40個外植體被置于為這個處理的60X20mm盤的中心的圓圈中。約4.7mg的1.8mm鎢微拋射體被重新懸浮在25ml的無菌TE緩沖劑(10mMTrisHCl，1mMEDTA,pH8.0)中，每個轟擊使用1.5ml等分試樣。每個盤通過PDS1000粒子加速裝置中《立于沖羊品上2cm處的150mmnytexscreen^皮轟擊兩次。去除武裝的(disarmed)y4gra6a"e〃.纖/歸e/""'m菌抹EHA105被用在所有的轉化實驗中。包括包含可操作地連接到泛蛋白啟動子的NUE基因的表達盒的雙質粒載體經由凍融？I入土壤桿菌菌林EHA105，如Holsters,"a/.,(1978)A^/.Ge".163:181-187所述。這個質粒進一步包含卡那霉素可選擇的標記物基因(即，"/7W)。用于植物轉化實驗的細菌在具有植物菌抹和雙質粒維持所需的合適的抗生素的液體YEP培養基(IOgm/1酵母提取物，10gm/1Bactopeptone,和5gm/1NaCl,pH7.0)中過夜生長(28。C和100RPM持續攪拌)。懸浮液在達到約0.4-0.8的0D6。。時被使用。土壤桿菌細胞被沉淀(pelleted)并以0.5的最終OD,被重新懸浮在包含12.5mMMESpH5.7、Igm/1NH4C1、和0.3gm/1MgS04的接種培養基中。新鮮轟擊的外植體被置于土壤桿菌懸浮液中，混合、不受打擾地留置30分鐘。外植體隨后被轉移到GBA培養基并共培養、切割面朝下，26°C,每天18小時(18-hourdays)。在三天的共培養后，外植體被轉移到補充有250mg/1頭孢噻肟(cefotaxime)和50mg/1硫酸卡那霉素的374B(GBA培養基，缺乏生長調節劑，及1%的減少的蔗糖水平)。外植體在選擇上被培養2-5周，隨后被轉移到缺乏卡那霉素的新鮮374B培養基，用于持續的發育1-2周。沒有產生適于切除的枝條的具有分化、抗生素抗性的生長區域的外植體被轉移到包含250mg/1頭孢p塞將的GBA培養基，用于第二個3天的植物激素處理。來自綠色、卡那霉素抗性的枝條的葉子樣品通過ELISA被分析NPTII的存在并且通過分析在分生組織發育中的調節(即，枝條和花分生組織的大小和外觀的改變)分析轉基因表達的存在。NPTII-陽性的枝條被嫁接到體外生長的向日葵幼苗根莖中的Pioneer⑧雜種6440。表面滅菌的種子在48-0培養基(半強度Murashige和Skoog鹽，0.5%蔗糖，0.3%固化劑(gelrite),pH5.6)中發芽并在外植體培養所描述的條件下生長。去除幼苗的上部，lcm垂直薄片在下胚軸中制備，轉化的枝條被插入切口。完整的區域用封口膜(parafilm)包繞以固定枝條。嫁接的植物在體外培養的一周后被轉移到土壤。土壤中的嫁接物維持在高濕度條件下，隨后緩慢適應溫室環境。溫室中成熟的T。植物(親代)的轉化的區段通過NPTIIELISA和/或通過葉子提取物的NUE活性分析鑒定，而從NPTII-陽性T。植物收獲的轉基因種子通過干種子子葉的小部分的NUE活性分析筌定。可替換的向日葵轉化方案允許回收轉基因子代而不使用化學選擇壓力。種子被脫殼并在每100ml溶液添加有2-3滴吐溫20的20%次氯酸鈉漂白劑溶液中表面滅菌20分鐘，隨后用蒸餾水漂洗3次。滅菌的種子在用水弄濕的濾紙上在黑暗中26°C吸收20小時。子葉和rootradical被去除，分生組織外植體在黑暗下在374E(GBA培養基，由MS鹽，Shepard維生素，40mg/1石危酸腺嘌呤，3%蔗糖，0.5mg/16-BAP,0.25mg/1IAA,0.1mg/lGA,和0.8%Phytagar組成，pH5.6)上培養24小時。去除初生葉以暴露頂端分生組織，約40個外植體^皮放置在374M(GBA培養基，具有1.2。/。Phytagar)的中心的2cm圓圈內，頂端頂面向上，隨后在黑暗中在所迷培養基上培養24小時。約18.8mg的1.8pm鎢粒被重新懸浮在150^1純乙醇中。在超聲后，8的它被滴在大運載體的表面的中心上。每個盤用650psi破裂盤(rupturediscs)在26mm的Hg氦槍真空時在第一架中轟擊兩次。感興趣的質粒經由先前所述的凍融被引入爿gra^cfenwmfwme/ac/ew菌株EHA105。在50的卡那霉素的存在下在液體YEP培養基(10g/1酵母提取物、10g/1Bactopeptone、及5g/1NaCl,pH7.0)中在28。C過夜生長的細菌的沉淀(pellet)被重新懸浮在接種培養基(12.5mM2-mM2-(N-嗎啉代)乙基磺酸(ethanesulfonicacid),MES,1g/1NH4C1和0.3g/lMgSO4，pH5.7)中以達到在OD600的4.0的終濃度。粒子-轟擊的外植體被轉移到GBA培養基(374E)，細菌懸浮液的小滴被直接置于分生組織的頂部上。外植體在培養基上共同培養4天，其后外植體被轉移到374C培養基(GBA,具有1%蔗糖，沒有BAP,IAA,GA3，補充有250pg/ml頭孢噻肟)。小植物在所述培養基上在每天16小時和26。C孵育條件下培養約2周。來自在374C培養基中培養兩周的外植體(約2cm長)被篩查在分生組織發育中的調節(即，枝條和花分生組織的大小和外觀的改變)。在鑒定了陽性外植體后，沒有展現出改變的NUE活性的那些枝條被丟棄，每個陽性外植體被再分成結節(nodal)外植體。一個結節外植體包含至少一個潛在的結節。結節節段在GBA培養基上培養三到四天以促進從每個結節的輔助芽的形成。隨后它們被轉移到374C培養基并允許發育另外的四周。發育中的芽被分離并在374C培養基上培養另外的4周。從每個新收集的枝條匯集的(pooled)葉子樣品通過合適的蛋白活性分析再次篩查。此時，從單一的結節回收的陽性枝條將通常富集在結節培養前在最初的分析中檢測的轉基因節段。對于改變的NUE表達陽性的回收的枝條被嫁接到在體外生長的向日葵幼苗根莖中的Pioneer雜種6440。根莖以下面的方式制備。種子被脫殼并在每100ml溶液中添加有2到3滴吐溫20的20%次氯酸鈉漂白劑溶液中表面滅菌20分鐘，并用蒸餾水漂洗3次。滅菌的種子在用水潤濕的濾器上發芽3天，隨后它們被轉移入48培養基(半強度MS鹽,0.5%蔗糖，0.3°/。固化劑pH5.0)并在黑暗下在26"生長3天，隨后在每天16小時培養條件下孵育。去除選擇的幼苗的上部，在每個下胚軸中制備垂直的薄片，轉化的枝條被插入V-切口。切口區用封口膜包裹。在培養基上培養l周后，嫁接的植物被轉移到土壤。在最初的兩周內，它們被維持在高濕度條件下以適應溫室環境。實施例8.稻米組織轉化WE基因的遺傳確認本領域技術人員可獲得的用于將DNA轉化入高等植物的細胞內的一個方法是利用包覆有感興趣的核酸構建體的金屬粒子的高速彈道轟擊(參見，Klein,"a/.,A^/t^(1987)(London)327:70-73,以及參見美國專利No.4,945,050)。BiolisticPDS-1000/He(BioRADLaboratories,Hercules,CA)用于這些互補實驗。粒子轟擊技術用于用DNA片段轉化NUE突變體和野生型稻米。來自5^e/^ow少c^/^grosco//ci^提供對抗生素的抗性的細菌潮霉素B磷酸轉移酶(HptII)基因用作稻米轉化的可選擇的標記物。在載體中，pML18，HptII基因用來自花椰菜花葉病毒(CauliflowerMosaicVirus)的35S啟動子和來自爿gn^""enww^we/"c/e似的章魚堿合酶基因的終止和多聚腺苷酸信號工程化。pML18在WO97/47731中描述，WO97/47731于1997年12月18日公開，其4皮露的內容以引用方式并入本文中。源自發芽稻米種子的盾片的胚發生愈傷組織培養物被用作轉化實驗的原料。這個材料通過在愈傷組織起始介質(MS鹽，Nitsch和Nitsch維生素，1.0mg/12,4-D和10pMAgNO3)上在黑暗中在27-28。C使無菌稻米種子發芽來產生。從胚胎的盾片增殖的胚發生愈傷組織被轉移到CM介質(N6鹽，Nitsch和Nitsch維生素，1mg/12,4-D,Chu，"a/.,1985,S/mca18:659-668)。愈傷組織培養物通過兩周間隔的常規傳代培養被維持在CM上并用于在起始的IO周內的轉化。通過傳代培養置于CM介質上放置的Whatman#541紙的圓圈的中心中，直徑為約4cm的圓形區域中排列的間隔為約lmm的0.5-1.0mm薄片制備用于轉化的愈傷組織。所述具有愈傷組織的盤在黑暗中、27-28。C孵育3-5天。在轟擊前，具有愈傷組織的濾器被轉移到補充有0.25M甘露醇和0.25M山梨糖醇的CM,在黑暗中達3小時。隨后培養皿的蓋在無菌罩中微開20-45分鐘，以允許組織上的濕氣消散。每個基因組DNA片段與包含用于稻米轉化的可選擇的標記物的pML18共沉淀到金粒的表面上。為了完成這個，以2:1比例的性狀可選擇的標記物DNA的總共10|ug的DNA被加入到已經以60mgml"的濃度被重新懸浮的金粒的50pl等分試樣。氯化鉀(50pl的2.5M溶液)和亞精胺(20pl的O.lM溶液)隨后隨著管子被渦旋3分鐘被加入到金-DNA懸浮液。金粒在微量離心機中被離心1秒，去除上清液。金粒隨后用lml純乙醇沖洗2次，隨后重新懸浮在50^1的純乙醇中并超聲(bathsonicator)1秒以分散金粒。金懸浮液在-70。C被孵育5分鐘并且被超聲(bathsonicator)(如果需要分散粒子)。6^1的DNA-包覆的金粒子隨后被加栽到mylar大運載體盤上，乙醇被允許蒸發。在干燥期末，包含組織的培養皿被置于PDS-1000/He的室中。室中的空氣隨后被抽空到28-29英寸Hg的真空。大運載體被用氦沖擊波利用防爆膜加速，所述防爆膜在沖擊管中的He壓力達到1080-1100psi時破裂。組織的位置距離停止篩約8cm，愈傷組織被轟擊2次。組織的2到4個盤以這種方式用DNA-包覆的金粒轟擊。在轟擊后，愈傷組織凈皮轉移到沒有補充山梨糖醇或甘露醇的CM介質。在轟擊后3-5天內，愈傷組織被轉移到SM介質(包含50mg/1潮霉素的CM培養基)。為完成這個，愈傷組織從盤轉移到無菌50ml圓錐管并稱重。40。C的熔化頂層-瓊脂(Moltentop-agar)利用2.5ml的頂層瓊脂/100mg的愈傷組織被加入。愈傷組織塊通過重復的通過10ml吸管的分散被碎裂成小于2mm直徑的片段。3ml的愈傷組織懸浮液的等分試樣被平鋪在新鮮SM介質上，所述盤在黑暗中在27-28。C被孵育4周。4周后，轉基因愈傷組織事件被鑒定，轉移到新鮮的SM盤并在黑暗中在27-28。C生長另外的2周。生長的愈傷組織被轉移到RM1介質(MS鹽，Nitsch和Nitsch維生素，2%蔗糖，3%山梨糖醇，0.4%固化劑+50ppmhygB)在黑暗中在25°C達2周。2周后，愈傷組織被轉移到RM2介質(MS鹽，Nitsch和Nitsch維生素，3%蔗糖，0.4%固化劑+50ppmhygB)并在冷白光下(40pEm2s—、，光周期為12小時，在25。C和30-40。/。濕度下放置。在光中2-4周后，愈傷組織開始有機化(organize)，并形成枝條。枝條從周圍的愈傷組織/介質去除，并溫和地轉移到phytatrays(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO)中RM3介質(l/2xMS鹽，Nitsch和Nitsch維生素，1%蔗糖+50ppm潮霉素B),利用先前步驟所述的相同的條件繼續孵育。在2-3周后，植物從RM3轉移到包含Metro混合物350的4"罐，此時充分的根和枝條生長已經存在。從轉基因植物獲得的種子被檢查實施例9.NUE序列的變體A不炎身i^4^^差虔^/y^M/五W^^裙茅凝y^/yNUE核苷酸序列被用于產生與相應的SEQIDNO的起始未改變的ORF核苷酸序列相比時具有約70%、75%、80%、85%、卯％、和95%的核苷酸序列同一性的開放閱讀框的核苷酸序列的變體核苷酸序列。這些功能性變體利用標準密碼子表產生。雖然變體的核苷酸序列被改變，但是由開放閱讀框編碼的氨基酸序列不變。5,M7五-應Wf產生NUE多肽的變體氨基酸序列。在這個實施例中，一個氨基酸被改變。特別地，檢查開放閱讀框以確定合適的氨基酸改變。改變的氨基酸的選擇通過參考蛋白質對準(與來自多種物種的其它直系同源物(orthologs)和其它基因家族成員)進行。選擇認為不在高選擇壓力下(不是高度保守的)并且相當容易由具有相似的化學性質(即，相似的功能側鏈)的氨基酸替換的氨基酸。利用所迷蛋白質對準，合適的氨基酸可以被改變。一旦鑒定了靶向的氨基酸，進行下面的C部分列出的程序。利用這個方法產生具有約70%、75%、80%、85%、90%、和95%的核酸序列同一性的變體。在這個實施例中，形成相對于參考蛋白質序列具有80%、85%、90%、和95%的同一性的人工蛋白質序列。這個后面的努力需要從對準鑒定保守和可變區，隨后明智地應用氨基酸替換表。這些部分將在下面更i，細的論述。主要地，基于NUE蛋白質中或其它NUE多肽中的保守區進行哪個氨基酸序列被改變的確定。基于序列對準，可以可能地被改變的NUE多肽的變化區以小寫字母示出，而保守區以大寫字母示出。認識到保守的替換可以在下面的保守區內進行而不該變功能。此外，技術人員將理解本發明的NUE序列的功能變體可以具有保守的結構域中的較小的非保守的氨基酸改變。人工蛋白質序列可以隨后形成，其不同于原始序列，間隔為80-85%、85-90%、90-95%和95-100%的同一性。這些間隔的中點祐_耙向，例如，具有加或減1%的自由活動范圍。氨基酸替換將^皮customPerlscript影響。替換表在下面的表2中提供。<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>首先，蛋白中不應該被改變的任何保守的氨基酸被鑒定并"區分"用于與替換隔離。起始蛋氨酸將當然被自動地加到這個列表中。其次，進行改變。在任何情況下H、C、和P不被改變。改變將首先用異亮氨酸發生，從N-末端掃到C-末端。隨后亮氨酸，等等沿列表向下直到它達到希望的靶標。可以進行臨時數量的替換以便不造成改變的反轉。所述列表被排序1-17,因此在亮氨酸前以如所需的一樣多的異亮氨酸改變開始，等等向下到蛋氨酸。清楚地，以這種方式，許多氨基酸將不需要被改變。L、I和V將涉及兩個可選的最佳替換的50:50替換。變體氨基酸序列作為輸出寫出。Perlscript被用于計算百分比同一性。利用這個過程，NUE多肽的變體產生與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、in、113、115、U7、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311或313的起始未改變的ORF核苷酸序列具有約80%、85%、90%、和95%的氨基酸同一性。實施例〗0.轉基因玉蜀黍植物產生包含在啟動子控制下的NUE構建體的TQ轉基因玉蜀黍植物。這些植物在溫室條件中在FASTCORN系統下生長，詳見美國專利公開2003/0221212,美國專利申請No.10/367,417。每個植物以下面的方式被分析一個或多個下面的特征的可測量的改變分析源自自花授精每個To植物的T!子代在低KN03下的提高的生長速率，所述To植物包含被發現以1:1分開用于轉基因事件的每個NUE構建體的單一拷貝。在積累性植物生長時生長被監測到開花，對于轉基因陽性的，轉基因零的，和非轉化的對照事件，確定生長速率和耳穗重比較。計算對于每個組的方差并利用F檢驗比較，比較所述事件的方差與非轉基因對照組方差和試驗中其余事件的合并方差。對KN03的反應越大，事件組(set)中方差越大，F值越大。陽性結果將與事件內轉基因的分布比較以確定轉基因內反應分離。實施例U.來自田地塊的轉基因事件分析轉基因事件在田地塊中評估，其中產量通過減少施肥30%或更多限制。這些減少的氮肥土地中轉基因和非轉基因植物之間產量、產量成分、或其它農藝學性狀的提高用于評估由轉基因事件的表達貢獻的氮利用的提高。在補充有建議的氮fertilityrates的土地中進行類似的比較。有效的轉基因事件是那些在氮-限制的和正常氮實驗中實現類似的產量的事件。這個說明書中的所有出版物和專利申請表明這個發明所屬的領域的普通技術人員的水平。所有的出版物和專利申請以引用方式并入本文到相同的程度，好像每個單獨的出版物或專利申請以引用方式被具體和逐一的表明。已經參照各種具體和優選的實施方式和技術描述了本發明。然而，應當理解，可以進行許多改變和變更同時保持在本發明的精神和范圍內。權利要求1.一種分離的多核苷酸，選自由下列組成的組a.與選自由SEQIDNOS1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311和313組成的組的多核苷酸的全長序列具有通過GAP算法在缺省參數下確定的至少70％的序列同一性的多核苷酸；其中所述多核苷酸編碼用作氮利用效率的改性劑的多肽；b.編碼選自由SEQIDNO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312和314組成的組的多肽的多核苷酸；c.選自由SEQIDNOS1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311和313組成的組的多核苷酸；以及d.與(a)、(b)、或(c)的多核苷酸互補的多核苷酸。2.—種重組表達盒，包含權利要求1的所述多核苷酸，其中所述多核香酸以有義或反義方向可操作地連接到啟動子。3.—種宿主細胞，包含權利要求2的所述表達盒。4.一種轉基因植物，包含權利要求2的所述重組表達盒。5.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物是單子葉植物。6.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物是雙子葉植物。7.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物選自由玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻米、大麥、黍、花生和可可組成的組。8.來自權利要求4的所述轉基因植物的轉基因種子。9.一種調節植物中的氮利用效率的方法，包括a.將包含可操作地連接到啟動子的權利要求1的所述多核苷酸的重組表達盒引入植物細胞；以及b.在植物細胞生長條件下培養所述植物；其中所述植物細胞中的所述氮利用被調節。10.根據權利要求9所述的方法，其中所述植物細胞來自選自由玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻米、大麥、黍、花生和可可組成的組的植物。11.一種調節植物中的氮利用效率的方法，包括a.將包含可操作地連接到啟動子的權利要求1的所迷多核苷酸的重組表達盒引入植物細胞；b.在植物細胞生長條件下培養所述植物細胞；以及c.從所述植物細胞再生植物；其中所述植物中的所述氮利用效率被調節。12.根據權利要求11所述的方法，其中所述植物選自由玉蜀黍、大豆、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻米、大麥、黍、花生和可可組成的組。13.—種降低植物細胞中的NUE多肽活性的方法，包括a.提供包含SEQIDNO:1、3、5、7,9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311或313的互補體的至少15個連續核苷酸的梭苷酸序列;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>313中陳列的序列的mRNA的植物細胞；以及c.將步驟(a)的所述核普酸序列引入步驟(b)的所迷植物細胞，其中所述核苷酸序列抑制所述mRNA在所述植物細胞中的表達。14.根據權利要求13所述的方法，其中所述植物細胞來自單子葉植物。15.根據權利要求M所述的方法，其中所述單子葉植物是玉蜀黍、小麥、稻米、大麥、高粱或黑麥。16.根椐權利要求13所迷的方法，其中所述植物細胞來自雙子葉植物。17.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物中的所述氮利用效率活性被提高。18.根據權利要求17所述的轉基因植物，其中所述植物具有增強的根生長。19.根據權利要求17所述的轉基因植物，其中所述植物具有增加的種子大小。20.根據權利要求17所述的轉基因植物，其中所述植物具有增加的種子重量。21.根據權利要求17所述的轉基因植物，其中所述植物具有胚胎大小增加的種子。22.根據權利要求17所述的轉基因植物，其中所述植物具有增加的葉子大小。23.根據權利要求17所述的轉基因植物，其中所述植物具有增加的幼苗活力。24.根據權利要求17所述的轉基因植物，其中所述植物具有增強的絲突出體(silkemergence)。25.根據權利要求17所述的轉基因植物，其中所述植物具有增加的耳穗大小。26.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物中的氮利用效率活性被降低。27.根據權利要求26所述的轉基因植物，其中所述植物具有減少的根生長。28.根據權利要求26所述的轉基因植物，其中所述植物具有減小的種子大小。29.根據權利要求26所述的轉基因植物，其中所述植物具有減小的種子重量。30.根據權利要求26所述的轉基因植物，其中所述植物具有減小的胚胎大小。31.根據權利要求26所述的轉基因植物，其中所述植物具有減少的雄穗產生。全文摘要本發明提供了分離的NUE(氮利用效率)核酸和它們編碼的蛋白質。本發明提供了涉及改變植物中的氮利用和/或攝取的方法和組合物。本發明進一步提供了重組表達盒、宿主細胞、和轉基因植物。文檔編號C12N15/82GK101421295SQ200780012807公開日2009年4月29日申請日期2007年1月30日優先權日2006年2月9日發明者C·R·西蒙斯,D·羅塞爾特,H·P·赫爾希申請人:先鋒高級育種國際公司