一種培養高產亞硫酸的酵母的方法及用該酵母生產酒類飲料的方法

專利名稱：：一種培養高產亞硫酸的酵母的方法及用該酵母生產酒類飲料的方法
技術領域：
：本發明基于酵母的代謝物及基因表達水平的分析結果，提供了一種培養酵母的方法，它可在提高亞硫酸產量的同時不增加可導致異味的硫化氫的產量，這對于在釀造中維持新鮮度非常重要。另外，本發明提供一種用該酵母生產高質量酒類飲料的方法。
背景技術：
：亞硫酸是一種具有高抗氧化作用的化合物，作為抗氧化劑廣泛應用于食品、飲料、藥物等領域。已知在啤酒釀造中，更長的保質期是通過增加產品中所含的亞硫酸的濃度來實現的。亞硫酸在維持新鮮度方面起到重要作用。因此，如果提高啤酒之類的產品中亞硫酸的含量，則可得到具有穩定口味的產品。同時，硫化氫是一種具有類似"臭雞蛋"味道的化合物。在啤酒釀造中，硫化氫不僅是產品異味的原因，也是異味的前體。因此，期望酵母具有較低的產生硫化氫的能力。具體地，如果可抑制硫化氫的產生，則可提供具有較少異味和更好味道穩定性的產品，例如啤酒。已報道了涉及使用諸如基因重組技術這樣的傳統方法的實例，包括高水平表達MET3基因或MET14基因，從而通過硫酸根離子同化途徑(硫酸根離子——APS(腺普酰硫酸)——PAPS(磷酸腺苷酰硫酸)——亞硫酸——硫化氬)來增加亞硫酸的產量(例如，參見C.Korchetal，.Proc.Eur.Brew.Conv.，Congress,Lisbon,p.201-208,1991);由于破壞MET10基因(例如，參見J.Hansenetal.,NatureBiotech.,Vol.14,p.1587-1591,1996)或破壞MET2基因(例如，參見J.HansenandM.C.Kielland-Brandt,J.Biotech"Vol.50，p.75-87，1996)來增加亞硫酸的產量。而對于硫化氫，日本專利No.2005398——"酵母硫化氬生成抑制基因以及引入該基因的釀造酵母"，描述了通過引入NHS5基因來降低酵母產生硫化氫能力的方法(日本專利No.2005398)。此外，日本專利No.3514507-"減少硫化氬生成能力的酵母以及用該酵母生產啤酒的方法"，描述了通過組成型表達MET25(=MET17)基因來降低酵母產生硫化氬能力的方法(曰本專利No.3514507)。另夕卜，日本專利公開(Kokai)No.2005-65572——"生產具有亞硫酸抗性和/或降低產生辟u化氬的能力的酵母的方法"，描述了通過增加酵母SSUl基因的轉錄量和/或表達水平，從而賦予亞硫酸抗性并降低硫化氫產量的方法(日本專利公開(Kokai)No.2005-65572)。然而，所有這些技術均是依據增加或者降低單個基因表達水平的方法。使用這些方法，無法實現對所產生亞硫酸及硫化氫的量的精細調控。作為通過使用非基因工程技術來培養不產生硫化氫氣味的酵母的實施例，已有通過賦予針對曱硫氨酸類似物的抗性來選擇低水平產生硫化氫的酵母的報道(日本專利公開(Kokai)No.8-214869(1996)"培養不產生硫化氫氣味的酵母的方法")。作為通過改良釀造方式來抑制硫化氫產生的方法，已經嘗試通過改變麥芽汁組分、控制發酵溫度、或控制發酵中的通風來抑制硫化氫的產生。這些方法的困難之處在于，當應用它們時只產生低水平的亞硫酸。與此同時，作為增加亞硫酸產量的釀造方法，也已通過改變釀造中的麥芽汁組分、控制發酵溫度、或控制發酵中的通風來嘗試增加亞硫酸的產量。當應用這些方法時，會出現由于延緩了酵母生長而導致的發酵不充分并會產生高水平的硫化氫。如上所述，傳統方法在亞硫酸及硫化氫的生成上是有問題的，其中一種的生成水平越低，另一種的生成水平也越低。而且，如上所述，傳統方法在實際應用方面也是有問題的，由于改變了啤酒原來的味道和風味，因此不利于啤酒生產。通常所做的就是從大量酵母菌抹中選擇可高水平產生亞硫酸的菌抹或者可低水平產生硫化氫的菌林。不過，選擇這樣的菌抹需要耗時的發酵實驗，因此這種選擇方法效率較低。近年來，使用DNA陣列、DNA芯片或類似的將基因組中的基因或者基因以外區域的DNA片段固定在膜或玻璃上的技術，可對多種生物物種進行詳盡的基因分析。例如，對于啤酒酵母，已報道了使用Olesenetal.,femsYeastRes"Vol.2,p.536-573，2002)。此外，通過使用毛細管電泳-質譜(CE-MS)技術可以進行代謝物組分析，由此對細胞內代謝物進行完全直接定量。具體地，將樣品注入到毛細管內，然后在兩端施加高電壓，所有的陽離子化合物向陰極遷移，陰離子化合物向陽極遷移。該技術包括利用遷移速度差異來分離化合物、然后使用與毛細管末端相聯的質譜儀根據每種化合物獨特的質量數選擇性地進行檢測。例如，使用該方法(技術)，已檢測了在枯草芽孢桿菌中由于碳源改變而造成的細胞內代謝物的改變(T.Sogaetal.,Anal.Chem.，Vol.74，p.2233-2239,2002)以及在水稻葉片中代謝物濃度在24小時的變化(S.Satoetal.,PlantJ.,Vol.40,p.151-163,2004)。關于使用突變、人工突變處理方法的培養方法是已知的，譬如UV(紫外線)照射、EMS(甲磺酸乙酯)、及MNNG(N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍)。例如，通過EMS處理已獲得了一個營養缺陷型突變菌林(G.Lindegrenetal.,Can.J.Genet.Cytol.,Vol.7，p.491-499,1965)。然而，即便通過這些突變方法獲得了具有目標性狀的突變林，突變也可被隨機引入到目標基因之外的位點上，從而改變了目標性狀之外的性狀，例如，會導致釀造所需的發酵特性的喪失。同時，在微生物群體中突變可以極低頻率自發產生。如果可以精確選擇并分離這些從自發突變中獲得的突變林，那么就無需進行人工突變處理。發明概述在釀造的啤酒、發泡酒、其它混合飲料、葡萄酒、精餾酒精(Woc/m)以及威士忌中，酵母不僅僅進行乙醇發酵，而且生成了多種具有芳香味的組分。可以通過組合使用酵母菌抹、麥芽汁組分及發酵控制方法來實現啤酒、發泡酒和其它混合飲料的風味特征。因此，選擇特定的酵母菌抹對于合適的釀造控制而言是核心技術。然而，選擇可產生預期風味的酵母需要對非常多的菌抹進行發酵檢驗，這需要大量的時間和努力。此外，在菌抹庫中并非總是能找到所需的菌抹。亞硫酸是可以影響啤酒、發泡酒及葡萄酒保質期的重要化合物。而且，硫化氬在啤酒、發泡酒及葡萄酒產生氣味方面是一種可導致不宜特性的氣味組分。此外，硫化氫也可以是其它含硫的可導致異味的組分的前體。因此，如果硫化氫的量是可調節的，則可以調節其它的異味物。不過，傳統的釀造方法由于"平衡"現象——亞硫酸或者硫化氬中的某個生成水平越低，另一個的生成水平也越低，因此難以解決這個問題。使用非基因工程技術來解決"平衡"現象是非常困難的。考慮到上述情況，本發明的一個目標是提供一種培養不增加硫化氫產量，同時可產生更多亞硫酸的釀酒酵母的方法。此外，本發明的另一個目標是培養能產生不同比率的亞硫酸與硫化氫的、產亞硫酸與硫化氫的酵母，從而可以根據不同的目的培養不同類型的酵母。為了實現上述目標，本發明人已經對同時以低水平產生亞硫酸和硫化氫的面包酵母，以及同時高水平產生亞硫酸和硫化氫的生產用底層發酵酵母使用DNA微陣列進行了基因表達分析，使用毛細管電泳-質譜(CE-MS)、氣相色譜(GC)和液相色語(HPLC)根據含石克氨基酸的生物合成途徑進行了代謝組分析。結果本發明人發現生產用底層發酵酵母比面包酵母產生更多的亞硫酸和硫化氬，它們是硫酸鹽離子同化途徑中的中間代謝物。本發明人還發現生產用底層發酵酵母比面包酵母具有更低細胞內濃度的高絲氨酸和O-乙酰高絲氨酸，它們是從天冬氨酸合成高半胱氨酸途徑的中間代謝物。根據這些發現，本發明人形成了一個假說在生產用底層發酵酵母中，硫化氫產量的定速因子是胞內O-乙酰高絲氨酸的含量，在高半胱氨酸合成中，作為底物的是O-乙酰高絲氨酸而不是硫化氫。本發明人已確認，當向面包酵母中分別加入20種氨基酸，然后測定亞碌u酸和硫化氫的產量時，加入半胱氨酸或者蘇氨酸會使其產量增加。此外，本發明人通過使用DNA微陣列的基因表達分析(在向面包酵母中加入蘇氨酸時進行)以及使用CE-MS、GC和HPLC的代謝組分析還確認，當加入蘇氨酸時，胞內O-乙酰高絲氨酸的含量降低，而且產生在硫酸鹽離子同化途徑中位于亞硫酸上游的某個中間代謝物的酶基因的表達水平升高了。如上所述，本發明人已驗證了上述假說，在生產用底層發酵酵母中硫化氫產量的定速因子是胞內O-乙酰高絲氨酸的含量，在高半胱氨酸合成中，作為底物的是O-乙酰高絲氨酸而不是硫化氫。同時，在生產用底層發酵酵母中通過破壞或類似手段進行處理YNL311C基因、使得在硫酸鹽離子同化途徑中產生位于亞硫酸上游的中間代謝物的酶增加時，亞石危酸和^5危化氬的產量均增加了。然而，通過這種處理，亞硫酸的產量所受影響更大，因此，亞硫酸的產量比硫化氫的產量增多了。此外，當下述基因的表達增加時，亞硫酸和硫化氬的產量均降低，所述基因位于通過HOM3基因過表達或類似機制從天冬氨酸合成高半胱氨酸的合成途徑；然而，通過這種處理，硫化氬的產量所受影響更大，因此，硫化氫的產量比亞硫酸的產量減少了。由此可通過增加碌u酸鹽離子同化途徑中的酶的方式，在釀酒酵母中增加亞硫酸的產量。此外，可通過增加從天冬氨酸合成高半胱氨酸途徑中的酶的方式，在釀酒酵母中增加胞內O-乙酰高絲氨酸的含量并降低硫化氬的產量。總之，聯合使用這些方法可以實現在不增加硫化氫產量的同時單獨提高亞硫酸產量的代謝控制。關于由終產物引發的反饋抑制的代謝途徑，可通過去除反饋抑制來增加代謝量。例如，可通過使終產物無法結合到被終產物所抑制的酶上的突變、代謝途徑中酶基因啟動子區域的突變、或酶的過量表達來實現這種反饋抑制的去除。本發明人已了解到，如果獲得了對作為硫化氬及亞硫酸代謝途徑終產物的含硫氨基酸的類似物(例如，如果是曱硫氨酸則為乙硫氨酸)具有抗性的菌林，則含硫氨基酸合成中所涉及的反饋抑制就能得以去除，而硫酸鹽離子同化途徑中的代謝酶類會被增強，從而可獲得作為中間體的亞硫酸及硫化氫含量都增高的菌林。首先，本發明人已獲得了乙硫氨酸抗性菌株，然后從乙硫氨酸抗性菌抹中獲得了可高水平產生硫化氫、并且在含硝酸鉛的瓊脂培養皿上表現為紅褐色的菌抹。隨后，本發明人測定了所獲得的可高水平產生硫化氫的菌林所產生的亞硫酸的量，從而獲得了可高水平產生亞硫酸及硫化氫的乙硫氨酸抗性菌抹。其次，本發明人考慮對于這抹可高水平產生亞硫酸與硫化氫的菌株，如果通過獲得對蘇氨酸的類似物——羥基正纈氨酸具有抗性的菌抹來增強從天冬氨酸合成高半胱氨酸的途徑，則培養基中的硫化氫含量會降低，最終獲得的菌抹將是可高水平產生亞硫酸、但低水平產生硫化氳的菌林。接下來，本發明人獲得了能夠在含羥基正纈氨酸的培養基上生長的突變林，然后選擇在含硝酸鉛的瓊脂培養皿上形成白色菌落的低水平產生硫化氬的菌抹。隨后，本發明人測定了所獲得的可低水平產生硫化氫的菌抹所產生的亞硫酸的量，然后選擇仍可高水平產生亞硫酸的菌抹。如上所述，通過在兩個階段獲得對不同氨基酸類似物具有抗性的菌抹，本發明人設計了一種培養與親代菌林相比，能夠在不增加硫化氫產量的同時單獨提高亞硫酸產量的酵母的方法。因此，本發明人使用兩種釀酒酵母成功分離到目標突變菌抹。基于上述發現和結果實現了本發明。本發明涉及培養與親代菌抹相比能夠在不增加硫化氫產量的同時增加亞硫酸產量的酵母的方法，它包括在生成硫化氫與亞硫酸的酵母途徑中增加從硫酸鹽離子合成硫化氫的途徑中的代謝量、以及增加從o-乙酰高絲氨酸合成高半胱氨酸的途徑中的代謝量。在第一個實施方案中，本發明提供了一種培養酵母菌林的方法，它包括控制特定基因的表達水平或該基因產物的活性。具體地，通過增加SUL1、SUL2、MET3、MET14及MET16中一個或多個基因的表達水平，或者提高這些基因產物的活性來增加從疏酸鹽離子合成硫化氫途徑中的代謝量。而且，通過增加HOM3、HOM2、HOM6、MET2及MET17中一個或多個基因的表達水平或者提高這些基因產物的活性、和/或降低THR1和/或THR4基因的表達水平或者這些基因產物的活性，來增加從O-乙酰高絲氨酸合成高半胱氨酸的量。從而獲得目標酵母菌林。例如，可通過提高MET14基因產物的活性以及增加HOM3基因的表達水平來獲得所需的酵母菌抹。此外，可通過基因啟動子的突變、增加或降低基因的水平、抑制基因產物和/或調控穩定因素、改變發酵條件、根據培養基條件來增加或者降低基因產物的量或控制特定活性、控制反饋抑制等來控制基因的表達水平或該基因產物的活性。在第二個實施方案中，本發明中的方法包括以下步驟1)在含有含硫氨基酸類似物的含鉛平皿上分離出形成紅褐色菌落的突變菌抹，2)在所分離到的突變菌抹中選擇亞硫酸產量提高的突變菌林，3)在含有蘇氨酸類似物的培養基上培養所選擇的突變菌林，然后分離可在含鉛平皿上形成白色菌落的突變抹，以及4)從所分離到的突變菌抹中選擇與親代菌林相比，亞硫酸產量提高的突變菌林。在上述步驟1)中所用的含硫氨基酸類似物的實例包括乙硫氨酸、硒代甲硫氨酸以及S-乙基半胱氨酸，所用的蘇氨酸類似物的實施例是羥基正纈氨酸。本發明進一步提供了通過本發明中的方法所培養的、與親代菌抹相比可以在不增加硫化氬產量的同時亞硫酸產量提高的酵母菌抹。期望與親代菌抹相比，本發明的酵母所產生的亞硫酸的量可以提高到不會損害風味的程度。本發明中酵母菌抹的一個實例是于2006年1月19日以保藏號FERMBP-10486保藏在獨立行政法人產業l支術綜合研究所特許生物寄托中心(TsukubaCentral6，l國l國lHigashi,Tsukuba,Ibaraki,Japan)的酵母菌抹。本發明進一步提供了使用由本發明的方法所培養的酵母菌林來生產酒類飲料的方法，以及由所述方法生產的酒類飲料。由所述方法生產的酒類飲料與使用親代菌抹生產的酒類飲料不同，其特征在于只有亞硫酸的含量提高了，而硫化氫的含量沒有增加。因此，由本發明中的方法所生產的酒類飲料在保持新鮮度方面非常優異，并且具有高品質o根據本發明的方法，可以培養出在不產生高水平的硫化氫的同時能產生高水平的亞硫酸的酵母。此外，根據本發明，可以通過在2個量的酵母菌抹，^而可根據不同目的5培養不同類型的酵母^另外^使用本發明中的酵母可以在釀造時改進新鮮度保持期，并抑制異味的產生，從而可生產出高品質的酒類飲料。附圖的簡要描述圖1所示的是在面包酵母細胞中含硫氨基酸的代謝途徑以及編碼每種酶的基因。大的四方框代表酵母細胞。圖2所示的是在面包酵母S288C及生產用底層發酵酵母KBY011中天冬氨酸的胞內濃度隨時間的變化圖。從酵母細胞中提取相當于OD600=30的量的樣品懸浮在50jxL水中，通過CE-MS進行分析，然后測定濃度。圖3所示的是在面包酵母S288C及生產用底層發酵酵母KBY011中高絲氨酸的胞內濃度隨時間的變化圖。從酵母細胞中提取相當于OD600=30的量的樣品懸浮在50pL水中，通過CE-MS進行分析，然后測定濃度。圖4所示的是在面包酵母S288C及生產用底層發酵酵母KBY011中o-乙酰高絲氨酸的胞內濃度隨時間的變化圖。從酵母細胞中提取相當于OD600=30的量的樣品懸浮在50pL水中，通過CE-MS進行分析，然后測定濃度。圖5所示的是在面包酵母S288C的培養基中及生產用底層發酵酵母KBY011的培養基中總亞硫酸濃度隨時間的變化圖。母KBYOll的培養基中硫化氫濃度隨時l't的i化圖。'—、圖7所示的是在面包酵母S288C及生產用底層發酵酵母KBY011中高半胱氨酸的胞內濃度隨時間的變化圖。從酵母細胞中提取相當于OD600-30的量的樣品懸浮在50pL水中，通過CE-MS進行分析，然后測定濃度。圖8所示的是在面包酵母S288C及生產用底層發酵酵母KBY011中曱硫氨酸的胞內濃度隨時間的變化圖。從酵母細胞中提取相當于OD600=30的量的樣品懸浮在50pL水中，通過CE-MS進行分析，然后測定濃度。圖9所示的是在面包酵母S288C及生產用底層發酵酵母KBY011中蘇氨酸的胞內濃度隨時間的變化圖。從酵母細胞中提取相當于OD600=30的量的樣品懸浮在50iiL水中，通過CE-MS進行分析，然后測定濃度。中s-腺普高半胱氨酸的胞內濃度隨時間的變化圖。一從酵母細胞中提取相當于OD600=30的量的樣品懸浮在50水中，通過CE-MS進行分析，然后測定濃度。中S-腺苷曱硫氨酸的胞內濃度隨時間的變化圖。從酵母細胞中提取相當于OD600=30的量的樣品懸浮在50水中，通過CE-MS進行分析，然后測定濃度。中參與甲硫氨酸合成的基因的表達水平隨時間的變化圖。對于面包酵母，給出了在6、24、48小時測定的S288C中每種基因的表達水平相對于作為對照的S288C中0小時時這些基因表達水平的比率。對于生產用底層發酵酵母，給出了在6、24、48小時測定的KBY011中每種基因的表達水平相對于作為對照的KBYOll中0小時時這些基因表達水平的比率。圖13所示的是當加入或者未加入蘇氨酸時，在面包酵母S288C中高絲氨酸的胞內濃度隨時間的變化圖。從酵母細胞中提取相當于OD600-30的量的樣品懸浮在50pL水中，通過CE-MS進行分析，然后測定濃度。圖14所示的是當加入或者未加入蘇氨酸時，在面包酵母S288C中0-乙酰高絲氨酸的胞內濃度隨時間的變化圖。從酵母細胞中提取相當于OD600=30的量的樣品懸浮在50pL水中，通過CE-MS進行分析，然后測定濃度。圖15所示的是當加入或者未加入蘇氨酸時，面包酵母S288C的培養基中游離亞硫酸的濃度隨時間的變化圖。圖16所示的是當加入或者未加入蘇氨酸時，面包酵母S288C的培養基中硫化氫的濃度隨時間的變化圖。圖17所示的是在面包酵母DBY7286和來源于破壞了YNL311C的DBY7286的菌抹中ScMetl4和LgMetl4蛋白的穩定性。圖18所示的是在面包酵母SYTOOl的培養基中和來源于破壞了YNL311C的SYTOOl的菌林的培養基中游離亞硫酸的濃度隨時間的變化圖。圖19所示的是在生產用底層發酵酵母KBY001的培養基中及其減數分裂分離子B43的培養基中游離亞硫酸的濃度隨時間的變化圖。圖20所示的是在生產用底層發酵酵母KBY001的培養基中及其減數分裂分離子B43的培養基中硫化氫的濃度隨時間的變化圖。圖21所示的是在通過破壞B43的Lg類型及Sc類型基因所獲得的每個菌林的培養基中游離亞硫酸的濃度隨時間的變化圖。圖22所示的是在通過破壞B43的Lg類型及Sc類型基因所獲得的菌抹的培養基中硫化氫的濃度隨時間的變化圖。圖23所示的是在通過破壞B43的Lg類型及Sc類型基因所獲得的菌抹的含鉛培養基中所測得的硫化氫的產量。將瓊脂培養基在20。C培養4天。圖24所示的是在過表達B43的Lg類型基因的菌林的培養基中游離亞硫酸的濃度隨時間的變化圖。圖25所示的是在過表達B43的Lg類型基因的菌林的培養基中硫化氫的濃度隨時間的變化圖。圖26所示的是在過表達B43的Lg類型基因的菌林的含鉛培養基中所測得的硫化氫的產量。將瓊脂培養基在20。C培養4天。圖27所示的是在含鉛培養基中所測得的釀酒酵母VTT-A67025、可高水平產生亞硫酸及硫化氬的乙硫氨酸抗性菌才朱(從VTT-A67025中分離)、以及YM073的硫化氫的產量。將瓊脂培養基在20。C培養4天。圖28所示的是在釀酒酵母VTT-A67025的培養基中以及在YM073的培養基中游離亞硫酸的濃度隨時間的變化圖。圖29所示的是在釀酒酵母VTT-A67025的培養基中以及在YM073的培養基中硫化氫的濃度隨時間的變化圖。KBYOOl的、可高水平產生亞硫酸及硫化氬的乙硫氨酸抗性菌林(從KBYOOl中分離)、以及在YMO106的硫化氬的產量。將瓊脂培養基在20。C培養4天。圖31所示的是在生產用底層發酵酵母KBYOOl的培養基中以及在YMO106的培養基中游離亞硫酸的濃度隨時間的變化圖。圖32所示的是在生產用底層發酵酵母KBYOOl的培養基中以及在YMO106的培養基中硫化氬的濃度隨時間的變化圖。圖33所示的是制備破壞了B43菌抹中的YNL311C的菌抹的方法，以及通過PCR對每個基因破壞進行確認的結果。圖34所示的是在B43菌林的培養基中以及在YM03113菌抹的培養基中游離亞硫酸的濃度隨時間的變化圖。圖35所示的是在含鉛培養基中所測得的B43菌林、來自破壞了YNL311C的B43菌株的菌抹、以及來自破壞了YNL311C的B43菌抹并過表達ScH0M3基因的YM03113菌抹的硫化氫的產量。將瓊脂培養基在20。C培養4天。本說明書包括了在作為本申請優先權文件的日本專利申請No.2006-15278中所述的部分或全部內容。發明的優選實施方案本發明的目的是通過在酵母硫化氬及亞硫酸代謝途徑中增加從硫酸鹽離子合成硫化氫途徑的代謝量以及增加從0-乙酰高絲氨酸合成高半胱氨酸途徑的代謝量，來培養與親代菌抹相比，僅使亞硫酸的產量提高而不使硫化氫的產量提高的酵母。用于改變具體合成途徑的代謝量的一般方法的實例包括包含分離出代謝途徑所涉及基因的突變抹的方法；及包含利用基因工程技術過表達或者破壞參與代謝途徑的基因的方法。因此，下面將對通過基因工程來獲得目標酵母的方法以及通過分離突變林來培養目標酵母的方法逐一進4于詳細介紹。1.通過基因工程培養酵母的方法在本發明的第一個實施方案中，通過控制或者使用特定基因的表達作為指示來獲得親代菌林相比僅使亞硫酸產量提高而不使硫化氫的產量提高的酵母。上述方法包含以下兩個階萃殳通過提高SUL1、SUL2、MET3、MET14及MET16基因的表達水平或者這些基因產物的活性來獲得從硫酸鹽離子合成硫化氫途徑的代謝量增加的酵母菌抹(第一個階段)；以及通過提高HOM3、HOM2、HOM6、MET2及MET17基因的表達水平或者這些基因產物的活性、和/或降低THR1和/或THR4基因的表達水平或者降低這些基因產物的活性來獲得從O-乙酰高絲氨酸合成的高半胱氨酸的量增加的酵母菌林(第二個階段)。SUL1、SUL2、MET3、MET14及MET16基因編碼參與從硫酸鹽離子生成硫化氫途徑的酶。因此，如果這些基因可高水平表達或者這些基因所編碼的酶的活性提高，則可以預期亞硫酸與硫化氫的合成途徑的代謝量會增加(參見圖1)。HOM3、HOM2、HOM6、MET2及MET17基因編碼參與從天冬氨酸合成高半胱氨酸途徑的酶。可以期望通過增加HOM3、HOM2、HOM6、MET2及MET17基因的表達水平或者提高其酶活性，從而增加從O-乙酰高絲氨酸合成高半胱氨酸的量(參見圖1)。同時，THR1和THR4基因編碼參與從高絲氨酸生成蘇氨酸途徑的酶。可以期望通過降低THR1和THR4的表達水平或者其酶活性來增加從0-乙酰高絲氨酸合成高半胱氨酸的量(參見圖1)此外，可通過基因啟動子的突變、增加或降低基因的水平、抑制基因產物和/或調控穩定因素、改變發酵條件、根據培養基條件來增加或者降低基因產物的量或控制特定活性、控制反饋抑制等來控制基因的表達水平或該基因產物的活性。本發明人證實了HOM3、HOM2、HOM6、MET2及MET17基因被破壞的酵母菌林可以高水平產生硫化氬。而且，當與Metl4降解相關的因子——YNL311C基因在釀酒酵母中被破壞時，會穩定Metl4基因產物，從而增加了硫酸鹽離子同化途徑中的酶量、增加了亞硫酸的產量、并增加了硫化氫的產量。隨后，當在YNL311C基因被破壞的菌抹中HOM3基因過表達時，從天冬氨酸合成高半胱氨酸途徑中的酶的水平也同時提高了。因此，可獲得與親林相比不改變硫化氫產量的同時能使亞硫酸產量提高的酵母。如上所述，可通過基因工程，具體地，通過培養下述酵母菌林的方式來獲得目標酵母菌抹，所述酵母菌抹中從硫酸鹽離子合成硫化氫途徑的代謝量增加、并且從O-乙酰高絲氨酸合成高半胱氨酸的量也增加。此外，上述基因SUL1、SUL2、MET3、MET14和MET16、以及HOM3、HOM2、HOM6、MET2、MET17、THR1和THR4基因的正式名稱與GenBank登錄號如下所示。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>這些基因中的每一個基因均可用于篩選可產生低水平硫化氫及高水平亞硫酸的酵母，特別地，可用作預測酵母中從硫酸鹽離子合成硫化氫的途徑以及從0-乙酰高絲氨酸合成高半胱氨酸的量的標記物。2.通過分離突變抹進行酵母育種的方法在本發明的第二個實施方案中，通過分離突變抹的方法來獲得與親代菌林相比亞硫酸產量提高而硫化氫產量不提高的酵母。上述培養方法包含下述2個階段及4個步驟(1)獲得可高水平產生硫化氫的、具有含硫氨基酸類似物抗性的菌林，(2)從中選擇可高水平產生亞硫酸的菌林(第一個階段)；以及(3)獲得具有蘇氨酸類似物抗性的菌抹，其中由于增強了高半胱氨酸合成途徑從而使得硫化氫的代謝量高；(4)從中選擇可高水平產生亞硫酸的菌林(第二個階段)。在第一個階段，通過獲得對作為硫化氬及亞硫酸代謝途徑終產物的含硫氨基酸類似物具有抗性的菌抹，可以解除參與含硫氨基酸合成的反饋抑制，從而獲得作為中間物的亞硫酸與硫化氬的含量均增加的菌林。可通過下述方法獲得對含硫氨基酸類似物具有抗性、并且可高水平產生硫化氫的菌抹。具體地，在合適的液體培養基中培養酵母，通過離心等手段獲得酵母菌體，然后在含有含硫氨基酸類似物、葡萄糖、無機氮源、維生素、無機鹽、硝酸鉛及瓊脂的培養基(下文中均稱之為含有含硫氨基酸類似物的鉛基本培養基)中培養酵母。將所獲得的紅褐色菌落在含有硝酸鉛、葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、硫酸銨及瓊脂的培養基(下文中均稱之為含硝酸鉛的培養基)中進行單菌落分離，/人而分離并選4奪紅褐色菌落。優選地，對這種分離過程重復3次或以上。培養在含硝酸鉛的培養基中具有良好增殖率的可形成紅褐色菌落的菌林。將表現出良好增殖的菌抹在合適的液體培養基中進行厭氧振蕩培養。選擇比親代菌抹可產生更多硫化氳及亞硫酸的菌抹作為可高水平產生亞硫酸及硫化氫、并且對含硫氨基酸類似物具有抗性的菌抹。在本說明書中，"含硫氨基酸"是指在酵母細胞中所含的含硫氨基酸，譬如甲硫氨酸或者半胱氨酸。"含硫氨基酸類似物"是指含硫氨基酸的結構類似物，它通常是酵母細胞中所沒有的，包括但不限于，譬如乙硫氨酸、硒代甲硫氨酸或者S-乙基半胱氨酸。因為酵母對含硫氨基酸類似物的抗性會因目標酵母菌抹而異，故培養基中所含的含硫氨基酸類似物的使用濃度沒有特別的限定，推薦當乙硫氨酸是DL-乙硫氨酸時，為2.5mg/ml或者更多，優選地，在5mg/ml到20mg/ml范圍之間。在含乙硫氨酸的鉛培養基中，除了乙硫氨酸之外的其它培養基組分沒有特別的限制，只要培養基是不含氨基酸的合成培養基即可。例如，完全可以使用已商品化的合成培養基，譬如通過向0.17%BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)中添加0.5%硫酸銨、2%葡萄糖、0.1%硝酸鉛及2%瓊脂而制備的培養基。在含有含硫氨基酸類似物的鉛基本并沒^特:的限制。、通常:例如，i薦在口20。C維持約1。天的需氧條件。例如，可通過使用含有硝酸鉛的瓊脂培養基對硫化氬的產量進行目測。具體地，當被測酵母菌抹生成硫化氫時，硫化氬可與培養基中的硝酸鉛反應，在菌落周圍生成硫化鉛，菌落的顏色會變成紅褐色。通過從中選擇紅褐色的菌落可以獲得可高水平產生硫化氫的菌抹。通過從中選擇淡褐色到白色的菌落可以獲得低水平產生硫化氫的菌林(G.J.CostandJ.D.Boeke，Yeast,Vol.12,p.939-941,1996)。此外，用于獲得酵母細胞的培養基沒有特別的限制，只要酵母可以生長、可以獲取酵母細胞即可。優選地，使用YPD10(l。/。酵母提取物、2%蛋白胨及10%葡萄糖)。培養溫度也沒有限制，只要酵母能夠生長即可。推薦的溫度通常在18。C到25。C之間，優選地為20°C。使用液體培養基進行培養的方法也沒有特別的限制，可以是靜置培養或者振蕩培養。用于收集生長在液體培養基中的生物體的方法也沒有特別的限制，通常通過約3000rpm的離心收集生物體。在此時，需要用無菌水對所獲得的細胞清洗一次或多次。在第二個階段，通過從可高水平產生亞疏酸及硫化氫的菌抹中獲得對蘇氨酸類似物具有抗性的菌抹，可獲得其中從天冬氨酸合成高半胱氨酸的途徑增強的、可低水平產生硫化氬的菌林(即，在硫化氫代謝中的限速步驟被取消了)。通過下述方法可獲得生長在含有蘇氨酸類似物的基本培養基上的、低水平產生硫化氫的菌林。具體地，在合適的液體培養基中培養酵母，通過離心等手段獲得酵母菌抹，然后在含有蘇氨酸類似物、葡萄糖、無機氮源、維生素及無機鹽的培養基(下文中稱之為含有蘇氨酸類似物的基本培養基)中培養酵母。在本說明書中，"蘇氨酸類似物"是指蘇氨酸的結構類似物，它通常是活酵母細胞中所沒有的，包括但不限于羥基正纈氨酸。隨后，使用含有硝酸鉛的瓊脂培養基從所獲得的具有蘇氨酸類似物抗性的酵母中選擇專門抑制硫化氬產量的菌林。如上所述，當被測酵母菌林生成硫化氫時，硫化氫可與培養基中的硝酸鉛反應，在菌落周圍生成硫化鉛，菌落的顏色會變成紅褐色。通過從中選擇白色的菌落可以選出低水平產生硫化氫的目標菌抹。對于含有硝酸鉛的培養基，可以使用含有0.5%酵母提取物、0.3%蛋白胨、4%葡萄糖、0.02%硫酸銨、0.1%硝酸鉛及2%瓊脂的培養基(下文中稱之為含硝酸鉛的瓊脂培養基)。在含硝酸鉛的瓊脂培養基上培養酵母的條件沒有特別的限制，只要酵母可在此條件下生長即可。通常，在18。C到25°C培養酵母4到8天。優選地，推薦在20。C的有氧條件下培養5天。優選地，在含硝酸鉛的培養基中進一步培養所獲得的可形成白色菌落的酵母菌抹3次或更多次，然后選擇生長良好的酵母菌抹。隨后，使用合適的液體培養基進行厭氧振蕩培養。選擇與親代相比在不產生更多硫化氫的同時可產生更多亞硫酸的菌抹作為目標酵母菌抹。這樣即可分離到在含有含硫氨基酸類似物的含鉛平皿上可形成紅褐色菌落的突變林。從中選擇可高水平產生亞硫酸的菌林(第一個階段)。然后在含有蘇氨酸類似物的基本培養基中培養菌抹，分離在含鉛平皿上形成白色菌落的突變菌林，測定所獲得的低水平產生硫化氫的菌林所產生的亞硫酸產量，然后選擇可維持高產亞硫酸的能力的菌才朱(第二個階段)。從而，可培養出目標酵母。3.酒類飲料的釀造通過本發明方法所獲得的酵母菌抹與已知酵母相比較，可在更高水平產生對于釀造過程中保持新鮮度非常重要的亞硫酸，同時，它可低水平產生作為導致異味的原因之一的硫化氫。因此，使用本發明中的酵母菌林通過釀造所獲得的酒類飲料具有良好的風味且品質優異。特別地，本發明還提供了使用本發明中的酵母菌抹來生成酒類飲料的方法，以及通過這種方法所生成的酒類飲料。使用本發明中的酵母所釀造的"酒類飲料"的實例包括啤酒、發泡酒以及其它混合飲料及葡萄酒。啤酒是通過向從麥芽所制備的糖溶液中加入啤酒花的苦味、然后用酵母進行發酵與熟化所生成的具有相對較低酒精含量的澄清發泡飲料。發泡酒是指使用麥芽作為部分原材料所生產的屬于酒類飲料的混合發泡液體。其它混合飲料是指使用除麥芽以外的原材料通過酵母發酵與熟化所生產的酒類飲料。葡萄酒是使用葡萄作為原材料通過酒精發酵所生產的飲料。生產酒類飲料的方法包括，例如以啤酒為例，從大麥中生產麥芽原材料的麥芽制造步驟、從麥芽中生成麥芽汁的麥芽汁制造(W/bmO步驟、通過酵母進行酒精發酵的發酵步驟及隨后的熟化、以及將所生產的啤酒進行過濾及包裝的包裝步驟。關于產生酒類飲料的方法的細節，請參見FermentationHandbook(KYORITSUSHUPPANCO.,LTD,supervisionofShinrokuroTochikura,HideakiYamada，TeruhikoBeppu,andKenjiSouda)。例如，可通過下述方法對酒類飲料中的硫化氫進行定量。具體地，對所獲得的釀造飲料進行取樣，在小瓶中使硫化氫氣化，然后使用硫化學發光檢測器(SCD)通過氣相色譜對小瓶中液面上空間中的硫化氬進行定量(A.K.Vickers，J.EllisandC.George,GulfCoastConference,Poster#75)。依所用的親代菌抹的不同本發明中在第一天對硫化氫的產量進行比較，或者在第二天進行相同比較(在檢驗開始后)。此外，例如可通過下述方法對酒類飲料中的亞硫酸進行定量。具體地，對所獲得的釀造飲料進行取樣，之后過濾除去微生物。然后將產物與甲醛反應，從而獲得穩定的羥基曱磺酸。將產物注射入HPLC,P逸后通過片主后焚光監觀J(ShimadzuCorporationApplicationNews,No.L258)對熒光進行監測和定量。依所用的親代菌抹的不同本發明中在第二天對亞硫酸的產量進行比較，或者在第三天進行相同比較(在檢驗開始后)。使用作為原材料的哞酒麥芽汁，以及含硫氨基酸類似物抗性菌抹、含硫氨基酸類似物抗性且對蘇氨酸類似物抗性菌抹、及其親代菌林來進行哞酒釀造。比較這些啤酒中的硫化氫濃度。結果，在使用KBYOl1(釀酒酵母)釀造的啤酒中檢測的游離亞硫酸為14.7ppm(50小時后)，而在基于乙硫氨酸抗性及羥基正纈氨酸抗性所選擇的突變菌林(通過上述方法獲得)中游離亞硫酸的水平為39.2ppm(50小時后)。而且，親代菌抹與每個突變菌抹之間在硫化氬的產量上沒有觀測到顯著性差異。實施例下面將通過參考實施例進一步詳細描述本發明。但本發明不受這些實施例的限制。l.用于建立假說的發現對于可高產亞硫酸及硫化氳的底層發酵酵母以及亞硫酸及碌u化氫產量低的面包酵母在相同條件下進行了發酵檢驗。分析每個樣品中的基因表達水平與代謝水平，以揭示處于表達控制下的位點，并識別代謝瓶頸的位置。為了說明在生成亞硫酸及硫化氬途徑中的限速步驟進行了下面的實驗。將生長在添加了2%瓊脂的YPD瓊脂培養基上的生產用底層發酵酵母巴斯德酵母(51.;aWon'a""s)KBY011菌林(由KirinBreweryCompany的菌抹保藏獲得)或者面包酵母釀酒酵母(<S.cwecWWae)S288C菌4朱(由KirinBreweryCompany的菌才朱保藏獲得，H.Takagietal.,J.Bacteriol.Vol.182,p.4249-4256，2000)的單菌落，每個均接種到5mLYPD液體培養基中，然后在20。C培養1天。將每個培養液接種到500mLYPD10(1%酵母提取物、2%蛋白胨及10%葡萄糖)中，然后在20。C進行有氧振蕩培養3天。離心(3000rpmx5分鐘)培養液，獲得酵母菌體部分，之后將其懸浮在無菌水中。將酵母菌抹(0.5%(w/v))接種到含有0.4%BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.2%硫酸銨、10%葡萄糖的液體培養基(下文中稱之為SD基本培養基)中，然后在20。C進行厭氧振蕩培養3天以制備酵母醪。于20。C在含有1000mLSD基本培養基的1000mL瓶中對酵母醪(0.5%(w/v))進行厭氧振蕩培養以進行發酵。在培養起始后的0、6、12、22、46、70、94、118、142及166小時共10個時間點上取樣。測定細胞濃度(OD)、糖消耗(通過培養液密度測量來獲得)、亞硫酸的產量及硫化氫的產量。對于相同的樣品，使用CE-MS進行代謝組分析、使用HPLC進行氨基酸分析、使用DNA微陣列進行基因表達分析。結果如圖2至11所示。通過底層發酵酵母與面包酵母間代謝物的比較，發現代謝物可以前者中的代謝物包括硫化氫、高半胱氨酸、S-腺苷曱硫氨酸等。此外，發現后者中代謝物的濃度，譬如高絲氨酸和o-乙酰高絲氨酸，在底層發酵酵母中比釀酒酵母中要低。基于這些結果可以認為底層發酵酵母高產亞硫酸及硫化氫的能力高是因為在作為生成高半胱氨酸底物的o-乙酰高絲氨酸與硫化氫之間，由于o-乙酰高絲氨酸的濃度低，硫化氫未被使用所以累積起來。此外，比較了底層發酵酵母與面包酵母間的基因表達水平。在硫基化合物的代謝途徑中，觀察到MET16、METIO、HOM3及MET2基因的表達模式存在差異。結果如圖12所示。基于這些結果可以確認在底層發酵酵母與面包酵母中代謝物的瓶頸存在于從高絲氨酸到O-乙酰高絲氨酸的途徑上；在MET16、METIO、HOM3及MET2基因中觀察到基因表達調控的差異。因此，可通過使用CE-MS的代謝組分析以及使用DNA微陣列的基因表達分析來確認底層發酵酵母與面包酵母中的代謝瓶頸及基因表達調控中的差異。根據上述發現，建立了一個假說在底層發酵酵母與面包酵母中代謝物的瓶頸是O-乙酰高絲氨酸，生成硫化氫的限速因子是O-乙酰高絲氨酸。此外，如在MET14過表達中所示，可以知道通過增加參與合成亞硫酸的代謝途徑的基因來提高亞硫酸的產量。所以認為從硫酸鹽離子到亞硫酸的代謝量在調控亞硫酸生成方面是很重要的(U.E.B.DonaliesandU.Stahl，Yeast,Vol.19,p.475-484,2002)。2.假說的驗證為了證明是否O-乙酰高絲氨酸是生成硫化氫過程中的限速因子，進行了向面包酵母中添加或者不添加蘇氨酸的發酵檢驗。在基因表達水平及代謝水平對所獲得樣品進行了分析。具體地，進行了下面的實驗。將生長在添加了2%瓊脂的YPD瓊脂基本培養基上的面包酵母S.cera:WWaeS288C的單菌落接種到5mLYPD液體培養基中，然后在20。C培養1天。將培養液接種到4000mLYPD10(1%酵母提取物、2%蛋白胨及10%葡萄糖)中，然后在20。C進行有氧振蕩培養3天。離心(3000rpmx5分鐘)培養液。獲得酵母菌體組分，之后將其懸浮在無菌水中。將酵母(0.5%(w/v))接種到含有0.4%BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.2%硫酸銨、10%葡萄糖的液體培養基(下文中稱之為SD培養基)中，然后在20。C進行厭氧振蕩培養3天以制備酵母醪。于20。C在含有4500mLSD基本液體培養基的5000mL瓶中對酵母醪(0.5%(w/v))進行厭氧振蕩培養以進行發酵。在培養起始后的0、6、24及48小時共4個時間點上進行取樣。測定細胞濃度(OD)、糖消耗(通過培養液密度測量來獲得)、亞硫酸的產量及硫化氫的產量。對于相同的樣品，使用CE-MS進行代謝組分析、使用HPLC進行氨基酸分析、使用DNA微陣列進行基因表達分析。結果如圖13至16及表2所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表2給出了在添加蘇氨酸的實驗中與作為對照的0時刻(在添加蘇氨酸之前)酵母的表達水平相比較，在6、24和48小時表達水平增加了2倍或更多的基因的數目與名稱、通過比較6次測量所得的表達水平數據的平均值以及標準差。編碼甲硫氨酸轉運蛋白的MUP1基因的表達與編碼水解蘇氨酸的酶的CHA1基因的表達在添加蘇氨酸后的48小時內一直都受到誘導。在其它方面，參與曱硫氨酸合成的一組基因(MET5、MET14、MET17、MET3和MET32)在添加蘇氨酸后24小時受到誘導，但其表達在6小時及48小時時沒有誘導。觀察到硫化氫的生成模式在24小時時達到最高，對曱硫氨酸合成基因表達的誘導與生成的硫化氫的量一致(在二者之間觀察到相關性)。此外，O-乙酰高絲氨酸的量在6小時時達到最大，其峰比代表硫化氫產量的峰出現的要早一些。這個結果與底層發酵酵母與面包酵母間相互比較的實驗結果相一致。上述結果表明，當加入蘇氨酸時，減少了細胞內o-乙酰高絲氨酸的量，增加了硫化氫的產量。因此，獲得了支持假說的結果。面包酵母有大約6000個基因。已經通過基因破壞技術制備了完備的基因破壞菌抹。OPENBIOSYSTEMS已經將其中任一基因被破壞的一系列酵母菌抹市場化。為了分離到可在含鉛瓊脂培養基上形成紅褐色菌落的高產硫化氫的突變菌林，使用以BY4742為親代菌林所制備的一系列非必需基因被破壞的大約5000個菌林來進行全面篩選。從而，鑒定了其中hom3、hom2、hom6、met2、metl7和ynl311c分別被破壞的菌林。HOM3、HOM2、HOM6、MET2和MET17基因均參與O-乙酰高絲氨酸代謝或合成。已表明O-乙酰高絲氨酸的合成與硫化氫產量有密切聯系。如使用酵母雙雜交系統所進行的詳盡分析所揭示的那樣，已有YNL311C基因可與MET14基因相互作用的報道(P.Uetzetal.，Nature,Vol.403,p.623-627,2000)。Ynl31lc與哺乳動物Fbox蛋白SKP2具有同源性，表明其參與細胞內蛋白的泛素化。本發明中發現Ynl311c與Metl4蛋白的穩定性相關，在YNL311C被破壞的菌林中Metl4蛋白是穩定的。具體地，將其中5，末端添加了c-Myc抗原決定簇的ScMET14基因或者LgMET14基因連接到pYES2.0的半乳糖誘導啟動子的下游，從而構建表達質粒。將每個質粒轉入到尿嘧啶營養缺陷的面包酵母DBY7286(H.Yoshimotoetal.,J.Biol.Chem.，Vol.277，p.31079-31088，2002)中。于30。C在含有0.67%YeastNitrogenBasew/oAminoAcids及10%半乳糖的20ml液體培養基(下文中稱之為含有半乳糖的基本培養基)中進行有氧振蕩培養1天。離心(3000rpmx5分鐘)培養液。獲得酵母菌體組分，之后懸浮在含有0.67%yeastNitrogenBasew/oAminoAcids及10%葡萄糖的液體培養基(下文中稱之為含有葡萄糖的基本培養基)中。隨后于30。C進行有氧振蕩培養12.5小時，然后取樣。離心(3000rpmx5分鐘)每次取樣時的培養基。獲得酵母菌體組分，并將其懸浮在SDS-PAGE上樣緩沖液中。將等體積的懸浮液進行SDS-PAGE電泳，然后轉移到PVDF膜上。隨后，使用抗c-Myc抗體(Sigma,單克隆抗體)通過Western印跡來確認ScMetl4和LgMetl4蛋白的穩定性。結果如圖17所示。基于這些結果可以確認，YNL311c凈皮石皮壞的菌4朱與過表達MET14基因的菌才朱表現出相同的效應。在含有0.5%酵母提取物、0.3%蛋白胨、10%葡萄糖及0.02%硫酸銨的培養基中對野生型面包酵母SYT001菌抹(通過用野生型面包酵母URA3基因片段轉化具有尿嘧啶營養缺陷的ura3突變的DBY7286而制備的URA3+菌林)和其中YNL311C基因被破壞的菌抹(通過將G418抗性標記基因插入到SYT001來破壞YNL311C基因而制備的菌林)進行厭氧振蕩培養。使用HPLC來測量所得到的硫化氬產量。結果如圖18所示。可以確認菌林(ynl311c破壞林)除了硫化氫外還可以高產亞硫酸。具體地，對這個通過篩選基因破壞的面包酵母菌抹所分離到的菌抹(ynl31lc破壞抹)進行的分析結果并不與"硫化氫生成的限速因子是O-乙酰高絲氨酸"這個假說相矛盾。相反，它們支持了"在硫化氫生成調控中從硫酸鹽離子到亞硫酸的代謝量是至關重要的"這個事實。3.用于建立培養突變菌抹的方法的發現底層發酵酵母具有異源多倍性，即，它是由約含有各兩套Sc型及Lg型基因的基因簇所組成的四倍體。由于在底層發酵酵母中進行完全基因破壞需要破壞掉4個基因，所以制備其中某個基因被完全破壞的菌抹是很困難的。因此，使底層發酵酵母進行減數分裂，然后選擇與親代菌抹具有類似性質的減數分裂分離抹，從而獲得用于制備后續基因破壞菌4朱的親代菌抹。從而，從KBYOll中選出了與KBY011具有相似亞硫酸及硫化氬產量的、作為減數分裂分離抹的B43。結果如圖19和20所示。然后，使用B43制備hom3、thrl、metl7、ynl311c破壞才朱。關于基因破壞菌抹的制備，對HOM3、THR1、MET17及YNL311C基因的Lg型基因LgHOM3、LgTHRl、LgMET17及LgYNL311C基因進行了全長克隆。為了克隆這些基因，對其中已插入KBYOll來源的基因組DNA的粘粒(其中克隆兩端的核苷酸序列已確定)基于每個Sc型基因的序列進行同源性檢索。從而鑒定出含有全長的每種基因的粘粒克隆。隨后，測定這種粘粒克隆中的核普酸序列。然后基于序列信息設計引物通過PCR來分離全長的各個基因。這些基因編碼區的核苷酸序列分別如SEQIDNOs:1到4所示。關于基因破壞菌抹的制備，通過向基因編碼區插入G418抗性標記來破壞Sc型基因；通過向基因編碼區插入殺稻瘟菌素S抗性標記來破壞Lg型基因。通過使用YPD10培養基的厭氧振蕩培養來測定這些菌抹中亞硫酸與硫化氬的產量。此外，也測定在含鉛培養基中的硫化氬產量。結果如圖21到23所示。與親代菌林B43相比較，hom3、metl7、ynl311c破壞抹其亞硫酸及碌"匕氫的產量均有所增加。然而，ynl311c石皮壞才朱與其它兩個石皮壞沖朱相比較，硫化氫產量僅略有提高。使用B43制備分別過表達LgHOM3、LgTHRl和LgMET17基因的菌林。為了構建用于過表達的質粒，用連接有可賦予G418抗性的標記基因的面包酵母來源的PGK啟動子替代pYES2.0(Invitrogen)的半乳糖誘導啟動子，并在pYES2.0A^eI剪切位點插入含有酵母來源的GAP啟動子的表達盒及一個PGK終止子。從而構建了用于在酵母中過表達目標基因的質粒(pYES2-PGK-G418)。將全長的LgHOM3、LgTHRl和LgMET17基因分別插入到pYES2-PGK-G418的表達盒位點，從而構建了用于過表達各基因的質粒。通過使用含有300pg/mlG418的YPD培養基的厭氧振蕩培養來分別測定4吏用質粒所制備的過表達LgHOM3、LgTHRl和LgMET17基因的菌抹中亞硫酸與硫化氫的產量。此外，也在400pg/mlG418的含鉛瓊脂培養基中測定硫化氬的產量。結果如圖24到26所示。發現在過表達LgHOM3基因和LgMET17基因的菌林中硫化氬的產量顯著降低，亞硫酸的產量也有所下降。在過表達LgTHRl基因的菌林中，硫化氫的產量增加，亞硫酸的產量也略有上升。基于上述基因破壞菌林及基因過表達菌林的結果表明，在硫基化合物的代謝控制中，過表達參與從天冬氨酸到高半胱氨酸生物合成系統的基因會顯著影響硫化氫的產量，過表達參與從硫酸鹽離子到硫化氬還原過程的基因會顯著影響亞硫酸的產量。根據上述有關硫化氫及亞硫酸在酵母代謝途徑中的發現，我們認為通過增加從硫酸鹽離子合成硫化氫途徑中的代謝量以及增加從0-乙酰高絲氨酸合成高半胱氨酸途徑中的代謝量，能培養出與親代菌抹相比，在不增加硫化氫產量的同時可使亞硫酸的產量提高的酵母。因而，本發明人進行了下面實施例1到3中所示的試驗，其中包括了對假說的驗證。實施例1通過下述方法從生產用底層發酵酵母VTT-A69025菌林(由KirinBreweryCompany的酵母庫獲得)獲得DL-乙硫氨酸抗性菌抹。具體地，將生長在添加了2%瓊脂的YPD瓊脂培養基上的VTT-A69025的單菌落接種到5mLYPD液體培養基中，然后在20。C培養3天。離心(3000rpmx5分鐘)培養基，獲得酵母菌體組分。向細胞部分加入10mL無菌水，將產物充分振蕩，然后離心產物再次獲得酵母菌體組分。重復此過程以洗滌酵母細胞。將清洗后的酵母細胞沉淀懸浮在5mL無菌水中。用150pL懸浮液涂布添加了10mg/mLDL-乙硫氨酸、0.17%BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.5%硫酸銨、2%葡萄糖、0.1%硝酸鉛及2%瓊脂的瓊脂培養基。在小Petri平皿中的瓊脂培養基涂布2xl()S個酵母細胞。于20。C培養10天后，平均可獲得200個具有乙硫氨酸抗性的菌落。共用了約5.8xl0"個酵母細胞，所以獲得了654個紅褐色的具有乙硫氨酸抗性的菌落。使用添加了0.5%酵母提取物、0.3%蛋白胨、4%葡萄糖、0.02%疏酸銨、0.1%硝酸鉛及2%瓊脂的含硝酸鉛瓊脂培養基以及添加了10mg/mLDL-乙硫氨酸、0.17%BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.5%硫酸銨、2%葡萄糖及2%瓊脂的含乙硫氨酸瓊脂培養基來培養獲得的菌落。獲得了162個可高水平產生硫化氬的DL-乙硫氨酸抗性的菌林。經單菌落分離后，將其在含有硝酸鉛的瓊脂培養基及含有乙硫氨酸的瓊脂培養基上培養，選出了43個可高水平產生硫化氫的DL-乙硫氨酸抗性的菌林。這些菌才朱在含有DL-乙辟b氨酸的瓊脂培養基上具有良好的增殖率，并且在含有硝酸鉛的瓊脂培養基上可形成代表具有高硫化氫產量的紅褐色菌落。使用YPD10液體培養基測定所獲得的43個可高水平產生硫化氫的DL-乙硫氨酸抗性的菌林中IO林的硫化氫及亞硫酸的產量，并將其亞硫酸的產量與親代菌林的亞硫酸產量進行比較。具體地，將包括親代菌抹在內的酵母菌抹從瓊脂培養基上接種到YPD10液體培養基中，然后于20。C進行有氧振蕩培養3天。離心(3000rpmx5分鐘)培養基。獲得酵母菌體組分，然后懸浮在無菌水中。再次將酵母(0.5%(w/v))接種到YPD10液體培養基中，然后于2(TC進行厭氧振蕩培養3天，以制備酵母醪。于20。C在含有200mLYPD10液體培養基的250mL瓶中對酵母醪(0.5%(w/v))進行厭氧振蕩培養以進行發酵。在培養起始后的第三天使用HPLC測定培養基中亞硫酸的產量。從這些受檢菌林中選出3個表現出極高亞硫酸產量的菌林(YM012、YM0222及YM0433菌林)，然后再進行類似的厭氧振蕩培養。此時，除了亞硫酸產量外，還測定細胞濃度(OD)與糖消耗(通過培養液密度測量來獲得)，以檢查發酵過程。此外，也使用GC測定硫化氫的產量。基于上述結果，確認了YM012、YM0222及YM0433菌抹具有乙硫氨酸抗性，并能夠高水平產生亞硫酸與硫化氫。隨后，根據下述方法從YM0222菌抹中獲得了低水平產生硫化氬的DL-羥基正纈氨酸抗性的菌抹。將生長在添加2%瓊脂的YPD瓊脂培養基上的YM0222單菌落接種到5mLYPD液體培養基中，然后于20。C培養3天。離心(3000rpmx5分鐘)培養基，隨后獲得酵母菌體組分。向各組分加入10mL無菌水后，將產物充分振蕩，然后再次離心從而獲得酵母菌體組分。重復此過程以洗滌酵母細胞。將所獲得的(清洗后的)酵母細胞沉淀懸浮在5mL無菌水中，然后將100nL產物加入到5mL添加100mg/mLDL-羥基正纈氨酸、0.17%BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.5%硫酸銨及2%葡萄糖的培養基中。于25。C進行5天有氧培養。將每個培養液稀釋10000倍后，用100pL稀釋液涂布含有0.5%酵母提取物、0.3%蛋白胨、4%葡萄糖、0.02%硫酸銨、0.1%硝酸鉛及2%瓊脂的含硝酸鉛瓊脂培養基。用1.5xl()S個酵母細胞涂布小Petri平皿中的瓊脂培養基。于20。C培養7天后，平均可獲得1到2個淡褐色菌落。一共涂布了約1.4><105個酵母細胞，所以獲得了172個淡褐色菌落。將獲得的菌落再次涂布含硝酸鉛的瓊脂培養基。確認了所獲得的菌落形成了淡褐色菌落。分離單菌落后，將其在含硝酸鉛的瓊脂培養基上培養，選出了41個低水平產生硫化氫的菌林。這些菌抹在含硝酸鉛的培養基上形成了代表低硫化氬產量的淡褐色菌落，并具有良好的增殖率。從所獲得的低水平產生硫化氫的DL-乙硫氨酸抗性、DL-羥基正纈氨酸抗性菌林中選出13個菌林。使用YPD10液體培養基測定亞硫酸的產量，然后與親代菌林的亞硫酸產量進行比較。此處所用培養方法如下所述。具體地，將包括親代菌抹在內的酵母菌林從瓊脂培養基上接種到YPD10液體培養基中，然后于2(TC進行3天有氧振蕩培養。離心(3000rpmx5分鐘)培養基。從而獲得酵母菌體組分，然后懸浮在無菌水中。再次將酵母(0.5%(w/v))接種到YPD10液體培養基中，然后于20。C進行4天厭氧振蕩培養，以制備酵母醪。于20。C在含有200mLYPD10液體培養基的250mL瓶中對酵母醪(0.5%(w/v))進行厭氧振蕩培養以進行發酵。在培養起始后的第三天使用HPLC測定培養基中亞硫酸的產量。使用YPD10液體培養基對受檢菌抹中表現出極高亞硫酸產量的YM073菌抹以及VTT-A69025菌抹(親代菌林)再次進行類似的厭氧振蕩培養。比較亞硫酸與硫化氫的產量。此處所用培養方法如下所述。具體地，將包括親代菌林在內的酵母菌抹從瓊脂培養基上接種到YPD10液體培養基中，然后于2(TC進行3天有氧振蕩培養。離心(3000rpmx5分鐘)培養基。從而獲得酵母菌體組分，然后懸浮在無菌水中。將酵母(0.5%)接種到500mLYPD10液體培養基中，然后于20。C進行4天厭氧振蕩培養，以制備酵母醪。隨后于20。C在含有500mLYPD10液體培養基的500mL瓶中對酵母醪(0.5%)進行厭氧振蕩培養以進行發酵。此時，除了檢測亞硫酸產量外還檢測發酵過程，比較細胞數目上的變化，并通過測定細胞培養液密度的變化來比較糖的消耗。在培養起始后的第三天使用HPLC測定培養基中亞硫酸的產量。此外，使用GC測定硫化氫的產量。上述實驗重復3次，其中一個示例的結果如圖27到29所示。通過上述結果表明，具有乙硫氨酸抗性及羥基正纈氨酸抗性的突變菌抹——YM073菌株，產生硫化氫的能力降低了，產生亞硫酸的能力卻增強了。該YM073菌抹于2006年1月19日以保藏號FERMBP-10486保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(TsukubaCentral6,1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki,Japan)。實施例2通過以下方法從生產用底層發酵酵母KBY011菌林中獲得DL-乙硫氨酸抗性的菌林。具體地，將生長在添加2%瓊脂的YPD瓊脂培養基上的KBYOll的單菌落接種到5mLYPD液體培養基中，然后在20。C培養3天。離心(3000rpmx5分鐘)培養基，獲得酵母菌體組分。向每部分加入lOmL無菌水后，將其充分振蕩并再次離心，以獲得酵母菌體組分。重復此過程以洗滌酵母細胞。將所獲得的(清洗后的)酵母細胞沉淀懸浮在5mL無菌水中，然后用200nL懸浮液涂布添加了10mg/mLDL-乙硫氨酸、BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.5%硫酸銨、2%葡萄糖、0.1%硝酸鉛及2%瓊脂的瓊脂培養基。用2xl06個酵母細胞涂布小Petri平皿中的瓊脂培養基用來培養，然后于20°C培養細胞14天。從而，平均獲得了200個具有乙硫氨酸抗性的菌落。一共涂布了約1.4><108個酵母細胞，所以獲得了14個具有乙硫氨酸抗性的紅褐色的菌落。使用添加了0.5%酵母提取物、0.3%蛋白胨、4%葡萄糖、0.02%硫酸銨、0.1%硝酸鉛及2%瓊脂的含硝酸鉛的瓊脂培養基以及添加了10mg/mLDL-乙硫氨酸、0.17%BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.5%硫酸銨、2%葡萄糖及2%瓊脂的瓊脂培養基來培養獲得的菌落。確認了所獲得的菌抹是可高水平產生硫化氬的DL-乙硫氨酸抗性菌抹。隨后，對14個菌抹進行單菌落分離后，將其接種在含硝酸鉛的瓊脂培養基及含乙硫氨酸的瓊脂培養基上。從而選出了13個可高水平產生碌u化氫并具有DL-乙硫氨酸抗性的菌林。這13個菌沖朱在含DL-乙碌u氨酸的培養基中具有良好的增殖率，并可在含硝酸鉛的培養基上形成代表高硫化氬產量的紅褐色菌落。使用YPD10液體培養基測定所獲得的13個可高水平產生硫化氬的具有DL-乙硫氨酸抗性的菌林中的3林的亞硫酸及石危化氫的產量，并將其亞硫酸的產量與親代菌林的亞硫酸產量進行比較。此處所用培養方法如下所述。具體地，將包括親代菌抹在內的酵母菌抹從瓊脂培養基上接種到YPD10液體培養基中，然后于20。C進行3天有氧振蕩培養。離心(3000rpmx5分鐘)培養基。獲得酵母菌體組分，然后懸浮在無菌水中。再次將酵母(0.5%(w/v))接種到YPD10液體培養基中，然后于20。C進行3天厭氧振蕩培養，以制備酵母醪。于20°C在含有200mLYPD10液體培養基的250mL瓶中對酵母醪(0.5%(w/v))進行厭氧振蕩培養以進行發酵。使用HPLC測定培養3天后培養基中亞硫酸的產量。此外，使用GC測定硫化氫的產量。上述結果表明上述3個菌林具有乙硫氨酸抗性，并且可高水平產生亞硫酸及硫化氫。為了從來自上述3個菌林的YM02菌株中獲得低水平產生硫化氫的菌抹，通過下述方法獲得了具有DL-羥基正纈氨酸抗性的菌林。具體地，將生長在添加2%瓊脂的YPD瓊脂培養基上的YM02菌林的單菌落接種到5mLYPD液體培養基中，然后在2(TC培養3天。離心(3000rpmx5分鐘)培養基，獲得酵母菌體組分。向每部分加入10mL無菌水后，將其充分振蕩并再次離心，以獲得酵母菌體組分。重復此過程以洗滌酵母細胞。將所獲得的(清洗后的)酵母細胞沉淀懸浮在5mL無菌水中，然后向20mL添加了10mg/mLDL-羥基正纈氨酸、0.17。/。BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.5%硫酸銨及2%葡萄糖的培養基中加入100懸浮液，隨后于20。C有氧培養3天。用200iiL培養液涂布含有0.5%酵母提取物、0.3%蛋白胨、4%葡萄糖、0.02%硫酸銨、0.1%硝酸鉛及2%瓊脂的含硝酸鉛瓊脂培養基。用1.0><108個酵母細胞涂布小Petri平皿中的瓊脂培養基，在20。C培養7天。因此獲得了IO個淡褐色菌落。再次使用含硝酸鉛的瓊脂培養基培養獲得的菌落。確認了所獲得的菌抹可形成淡褐色菌落。使用YPD10液體培養基測定所獲得的IO個可低水平產生硫化氫的具有DL-羥基正纈氨酸抗性的菌抹中亞硫酸的產量，并將亞硫酸的產量與親代菌林的亞硫酸產量進行比較。此處所用培養方法如下所述。具體地，將包括親代菌抹在內的酵母菌抹從瓊脂培養基上接種到YPD10液體培養基中，然后于20。C進行3天有氧振蕩培養。離心(3000rpmx5分鐘)培養基。獲得酵母菌體組分，然后懸浮在無菌水中。再次將酵母(0.5%(w/v))接種到YPD10液體培養基中，然后于20。C進行3天厭氧振蕩培養，以制備酵母醪。于2(TC在含有200mL對酵母醪(0.5%)進行厭氧振蕩培養以進行發酵。使用HPLC測定培養3天后培養基中亞硫酸的產量。使用啤酒麥芽汁對所檢測菌林中具有極高亞硫酸產量的YMO106菌林以及親代菌抹一起進行相同的厭氧振蕩培養，比較亞硫酸與硫化氫的產量。此處所用培養方法如下所述。具體地，將包括親代菌林在內的酵母菌抹從瓊脂培養基上接種到YPD10液體培養基中，然后于20。C進行3天有氧振蕩培養。離心(3000卬mx5分鐘)培養基。獲得酵母菌體組分，然后懸浮在無菌水中。再次將酵母(0.5%(w/v))接種到500mL啤酒麥芽汁中，然后于20。C進行3天厭氧振蕩培養，以制備酵母醪。隨后于20。C在含有900mL麥芽汁的1000mL瓶中對酵母醪(0.5%)再次進行厭氧振蕩培養以進行發酵。此時，除了檢測亞硫酸產量外還檢測發酵過程，比較細胞數目上的變化，并通過測定細胞培養液密度的變化來比較糖的消耗。使用HPLC測定培養了3天的培養基中亞硫酸的產量。此外，使用GC測定硫化氫的產量。所獲得的結果如圖30到32所示。如圖31和32所示，在使用KBYOll(釀酒酵母)釀造的啤酒中檢測的游離亞硫酸為14.7ppm(50小時后)，而在基于乙硫氨酸抗性及羥基正纈氨酸抗性所選擇的突變菌抹YMO106釀造的啤酒中游離亞硫酸的水平為39.2ppm(50小時后)。而且，親代菌抹與突變菌林之間在硫化氫的產量上沒有觀測到顯著性差異。基于上述結果可以確認，所分離的具有乙硫氨酸抗性及羥基正纈氨酸抗性的YMO106菌抹在硫化氫產量上略有降低，而在亞硫酸產量上有很大提高。實施例3隨后，為了培養與親代菌抹相比，由于在酵母硫化氫及亞硫酸代謝途徑中增加了從硫酸鹽離子合成硫化氫途徑中的代謝量、并增加了從0-乙酰高絲氨酸合成高半胱氨酸途徑中的代謝量，而可在不增加硫化氫產量的同時提高亞硫酸產量的菌林，利用基因重組方法進行了實驗。使生產用底層發酵酵母KBYOll菌抹形成孢子并進行減數分裂。利用所分離到的減數分裂分離林B43,通過下面的方法獲得了基因重組子。破壞參與穩定Metl4蛋白的YNL311C基因，以增加從硫酸鹽離子合成疏化氫途徑中的代謝量。然后過表達HOM3基因，以增加從0-乙酰高絲氨酸合成高半胱氨酸途徑中的代謝量。根據常規的方法，通過電轉化依次破壞LgYNL311C及ScYNL311C基因，從而制備了原本存在于B43中的YNL311C基因被完全破壞的菌抹。通過PCR驗證了該基因被完全破壞。結果如圖33所示。通過將含有來源于面包酵母的GPD啟動子、來源于面包酵母的PGK終止子、以及全長ScHOM3基因的表達盒插入到具有金擔子素A抗性標記的質粒pAUR101,構建了用于過表達ScHOM3的質粒pAUR-ScHOM3。使用pAUR-ScHOM3來轉化其中YNL311C被完全石皮壞的B43菌4朱，從而獲得YM03113菌才朱。使用YPD10液體培養基測定YM03113菌抹中亞硫酸的產量，并與親代菌抹的亞硫酸產量進行比較。此處所用培養方法如下所述。具體地，將包括親代菌抹在內的酵母菌抹從瓊脂培養基上接種到YPD10液體培養基中，然后于20。C進行3天有氧振蕩培養。離心(3000rpmx5分鐘)培養基。獲得酵母菌體組分，然后懸浮在無菌水中。再次將酵母(0.5%)接種到YPD10液體培養基中，然后于20。C進行4天厭氧振蕩培養，以制備酵母醪。隨后，于20。C在含有200mLYPD10液體培養基的250mL瓶中對酵母醪(0.5%)進行厭氧振蕩培養以進行發酵。此外，為了在檢測亞硫酸產量外還檢測發酵過程，比較了細胞數目上的變化，并通過測定細胞培養液密度的變化來比較糖的消耗。使用HPLC測定培養了4天的培養基中亞硫酸的產量。所獲得的結果如圖34所示。此外，于20。C在含有0.5%酵母提取物、0.3%蛋白胨、4%葡萄糖、0.02%硫酸銨、0.1%硝酸鉛及2%瓊脂的含硝酸鉛瓊脂培養基上培養4天，測定硫化氫的產量，然后用目測觀察菌落的顏色。所獲得的結果如圖35所示。基于上述結果可以確認，YM03113菌抹具有高產亞硫酸的能力，而硫化氫的產量卻與親代菌抹相同。本描述中所引用的全部出版物、專利及專利申請均作為參考完全并入在本申請中。工業應用根據本發明，能夠培養出可高水平產生亞硫酸卻不產生更多硫化氫的酵母。這使得在抑制可導致異味的硫化氫產量的同時，增加維持釀造中新鮮度所必需的亞硫酸的產量成為可能。這也使得生產高品質的酒類飲料等成為可能。因此，本發明可用于生產包括酒類飲料在內的食品、藥物及其它。序列表文本SEQIDNO:1-來源于KBY011菌林的LgHOM3基因的編碼區SEQIDNO:2-來源于KBY011菌林的LgTHRl基因的編碼區SEQIDNO:3-來源于KBY011菌抹的LgMET17基因的編碼區SEQIDNO:4-來源于KBYOll菌抹的LgYNL311C基因的編碼區權利要求1.培養與親代菌株相比，在不增加硫化氫產量的同時可增加亞硫酸產量的酵母的方法，該方法包括，在酵母硫化氫及亞硫酸代謝途徑中，增加從硫酸鹽離子合成硫化氫途徑的代謝量，并且增加從O-乙酰高絲氨酸合成高半胱氨酸途徑的代謝量。2.權利要求1所述的方法，包括通過增加SUL1、SUL2、MET3、MET14及MET16中一個或多個基因的表達水平或者提高這些基因產物的活性來增加從硫酸鹽離子合成硫化氬途徑中的代謝量；及通過增加HOM3、HOM2、HOM6、MET2及MET17中一個或多個基因的表達水平或者提高這些基因產物的活性、和/或減少THR1和/或THR4基因的表達水平或者降低這些基因產物的活性來增加從O-乙酰高絲氨酸合成高半胱氨酸的量。3.權利要求2所述的方法，包括提高MET14基因產物的活性及增加HOM3基因的表達水平。4.根據權利要求1到3任一項所述的方法所培養的、與親代菌抹相比在不增加硫化氬產量的同時可增加亞硫酸產量的酵母菌抹。5.生產酒類飲料的方法，包括使用權利要求4所述的酵母。6.酒類飲料，它是通過權利要求5所述的方法生產的。7.培養與親代菌林相比，在不增加硫化氬產量的同時可增加亞硫酸產量的酵母的方法，包括以下步驟1)分離出可在含有含硫氨基酸類似物的含鉛平皿上形成紅褐色菌落的突變菌才朱；2)從所分離到的突變菌抹中選出亞硫酸產量增加的突變菌抹；3)在含有蘇氨酸類似物的培養基中培養所選出的突變菌抹，然后分離出可在含鉛平皿上形成白色菌落的突變菌林；及4)從所分離到的突變菌林中選出與親代菌林相比亞硫酸產量增加的突變菌才朱。8.權利要求7所述的方法，其中所述的含硫氨基酸類似物是乙硫氨酸、硒代甲硫氨酸或S-乙基半胱氨酸，所述的蘇氨酸類似物是羥基正纈氨酸。9.通過權利要求7或8所述的方法培養的、與親代菌林相比在不增加硫化氬產量的同時可增加亞硫酸產量的酵母菌林。10.保藏號為FERMBP-10486的酵母菌抹。11.用權利要求9或10所述的酵母菌抹生產酒類飲料的方法。12.酒類飲料，它是通過權利要求11所述的方法生產的。全文摘要基于酵母代謝物及酵母基因表達水平的分析結果，本發明涉及培養可高水平產生對于在釀造中維持新鮮度非常重要的亞硫酸、卻不產生更多可導致異味的硫化氫的酵母的方法。本發明還涉及使用該酵母來生產高品質的酒類飲料的方法。具體地，本發明涉及培養通過在酵母硫化氫及亞硫酸生成途徑中增加了從硫酸鹽離子合成硫化氫途徑中的代謝量以及增加了從O-乙酰高絲氨酸合成高半胱氨酸的量，從而與親代菌株相比亞硫酸增加卻不產生更多硫化氫的酵母的方法。本發明進一步涉及使用該酵母來生產酒類飲料的方法。文檔編號C12C11/00GK101421389SQ20078001053公開日2009年4月29日申請日期2007年1月24日優先權日2006年1月24日發明者吉田聰,善本裕人,曾我朋義,港紀子申請人:麒麟控股株式會社;學校法人慶應義塾