專利名稱：：新穎的氧化還原酶及其用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及新近鑒定的包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因編碼從^^Wgz7/Mm'gw分離的新穎的氧化還原酶。本發明描述了新穎基因的全長核苷酸序列、包含新穎氧化還原酶的全長編碼序列的cDNA序列，以及全長功能蛋白質及其功能等同物的氨基酸序列。本發明還涉及在烘焙和乳制品應用中使用這些酶的方法。本發明還包括用根據本發明的多核苷酸轉化的細胞和其中根據本發明的氧化還原酶被遺傳修飾以增強或降低其活性和/或表達水平的細胞。
背景技術：
：氧化還原酶在本文中被定義為催化氧化-還原反應的酶。己知是氧化還原酶(EC1.#.#.#，其中#為數字)的酶種類由NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryontheNomenclatureandClassificationofEnzymes(EnzymeNomenclature,AcademicPress,NewYork,1992使義為催化氧化還原反應的所有酶。被氧化的底物被視為氫或電子供體。號碼中的第二個數字指出經受氧化的氫供體中的基團。第三個數字指出涉及的受體類型，3表示氧為受體。被氧化的底物被看做氫供體。氧化還原酶的例子為漆酶(EC1.10.3.2)催化鄰-和對-苯二酚二者的氧化，也時常作用于氨基苯酚和苯二胺。葡萄糖氧化酶(EC1丄3.4-GOX)催化葡萄糖和若干種其它糖的氧化。己糖氧化酶(ECl丄3.5)催化與GOX相同的反應，即葡萄糖和若干種其它糖如半乳糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖和纖維二糖的氧化。膽固醇氧化酶(EC1丄3.6)催化膽固醇的氧化還原。膽堿脫氫酶(E.C.1丄99.1)催化膽堿的氧化還原。葡萄糖脫氫酶(E.C.1丄99.10)催化葡萄糖的氧化還原。醇氧化酶(EC1丄3.13)催化伯醇的氧化。仲醇氧化酶(EC1丄3.18)催化仲醇的氧化。D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)催化天冬酶的氧化還原，其也作為天冬氨酸氧化酶已知。丁二胺氧化酶(EC1.4.3.10)催化腐胺成為4-氨基正丁醛的氧化還原，所述4-氨基正丁醛縮聚成為l-吡咯啉。胺氧化酶(EC1.4.3.4)催化胺(主要是伯胺，通常是一些仲胺和叔胺)的氧化。肌氨酸氧化酶(EC1.5.3.1)催化肌氨酸的氧化還原。多胺氧化酶(EC1.5.3.11)催化N、乙酰基精胺的氧化還原。("-6-羥基煙堿氧化酶(EC1.5.3.6)催化("-6-羥基煙堿的氧化還原。網脈番荔枝堿氧化酶(EC1.5.3.9)催化(5)-網脈番荔枝堿的氧化還原，其也被稱作小檗堿-橋-形成酶。兒茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)催化兒茶酚和多種被取代的兒茶酚的氧化還原。硫氧還蛋白還原酶(EC1.6.4.5)，其催化被氧化的硫氧還蛋白的還原。亞硫酸鹽還原酶(EC1.8丄2)，其催化硫化氫的還原。氯化物過氧化物酶(ECl.ll丄lO)，其導致有機分子氯化形成穩定的C-C1鍵，其也可以作用于Br—和1—。過氧化物酶(EC1.11丄6)，其導致若干種有機物質例如乙醇的氧化還原。氧化還原酶的其它例子為螢火蟲熒光素酶(EC1.13.12.7)、肉桂酸4-羥化酶(EC1.14.13.11)、苯甲酸4-單加氧酶(EC1.14.13.12)、膽固醇7a-單加氧酶(EC1.14.13.17)、五氯苯酚單加氧酶(EC1.14.13.50)、單加氧酶(EC1.14.14.1)、類固醇11/3-單加氧酶(EC1.14.15.4)、單苯酚單加氧酶(EC1.14.18.1)、前列腺素合酶(ECU4.99.1)和水楊酸酯水解酶(EC1.14.13.1)。所述例子以并非以任何方式表示限制性或限制本發明的方式給出。氧化還原酶可便利地在微生物中生產。微生物氧化還原酶可得自多種來源；5a"'〃w的種是細菌酶的一個常見來源，而真菌酶通常在^^e^'〃w的種中生產。已經報導了來自多種來源的具有氧化還原酶活性的微生物酶，所述來源包括尸^'"'///"附、ra/arom_ycay、C7at/ospon/am(W095/29996)、7VameZes/n>wta(WO97/22257)。己經克隆了來自若干來源的微生物氧化還原酶基因，所述來源包括FmmWww(EP1157117Al)、0nWwsv^^'co/or(DE19545780Al)、7Vamefe5(US6146865)、7Wc/^dmnfl(US6248575)和Mz'cradoc/n'謹wWe(WO9931990)。氧化還原酶可用于還使用化學氧化劑的所有應用領域中。這類化學氧化劑通常是非特異的氧化劑，如碘酸鹽、過氧化物、抗壞血酸、溴酸鉀和偶氮二酰胺。然而，若干種目前可獲得的化學氧化劑的使用遇到了消費者的抵制或不被管理機構允許，特別是在食物應用的領域中。氧化還原酶的使用已經被認為是化學氧化劑的備選方案。氧化還原酶可以被用于包括食物制劑和去污劑的多種工業應用中。氧化還原酶的上述工業應用僅是小量例子，該列表不表示是限制性的。其中可便利地使用氧化還原酶的食物制劑的一個例子是烘焙應用的領域，例如改善面團或烘焙制品的品質。例如US2,783,150公開了GOX在面粉中改善面團強度和烘焙的面包的紋理和外觀的用途。EP0338452公開了葡萄糖氧化酶與半纖維素酶和/或纖維素降解酶組合的應用。WO02/30207公開了GOX在烘焙中與蛋白質二硫化物異構酶組合以改善GOX有效性的用途。W096/39851公開了紅海藻Owm/mscn's/ms的己糖氧化酶在烘焙應用中的用途。WO98/44804公開了甘油氧化酶用于改善面團流變學(rheological)特征的用途。其中可使用氧化還原酶的其它食物制劑包括乳制品食物。例如wo02/39828公開了己糖氧化酶在批薩制備期間減少批薩乳酪中Maillard反應的用途，WO99/31990公開了碳水化合物氧化酶從乳糖(乳中最充裕的糖)生產乳糖酸的用途。目前，來自Aspergillusniger的葡萄糖氧化酶是針對上述應用的工業中使用的唯一酶。其它氧化還原酶的問題是它們的生產仍然不能以成本有效的方式進行和/或它們的性能對于它們的預期用途而言不是最適的。因此，仍然有動力改善用于特定應用的氧化還原酶，例如考慮到有效性、底物特異性和/或親和力、在所需溫度范圍內和pH范圍內的穩定性和活性等等。更特定地，對于烘焙應用而言，目前烘焙中使用的氧化還原酶(主要是來自Aspergillusniger的葡萄糖氧化酶)不具有例如溴酸鉀的性能。溴酸鉀是一種化學氧化劑，其在技術上被認為是除色的氧化劑，特別是對于長烘焙工藝而言。溴酸鹽的禁用留給烘焙者時至今日仍未填補上的性能缺口。另一個例子是為了得到優良的白色面包屑的酶面包屑漂白劑(enzymaticcrumbbleaching)。數年來，含有脂肪氧化酶的酶活性大豆粉一直被用于該目的。向市場中引入經遺傳修飾的大豆變種引起了世界范圍的消費者抵制在烘焙中使用這類大豆粉。作為選擇可使用其它豆和豌豆粉，然而它們不如大豆粉有效。因此，對面包屑漂白應用而言，仍然存在對該問題的酶解決方案的巨大需要。更特定地，對乳制品應用而言，在熱處理期間對工藝參數的輕微修飾或背離導致由增加的Maillard反應引起的提高的顏色發生。該顏色發生是不想要的，并且存在除了通過嚴格的溫度和工藝控制之外控制該變褐過程從而使得巴氏滅菌過程更有活力的需要。還在乳酪的熱處理中，例如批薩上乳酪的變褐是不想要的。WO02/39828總結了減少變褐的若干種嘗試，所述嘗試通常旨在獲得乳酪制造工藝的非常嚴格的工藝控制或工藝修飾。這些解決方案的缺點在于它們難以操作和/或可能提高成本或降低產率。本發明致力于至少一個(如果不是所有的話)上述問題。發明目的本發明的一個目的是提供下述新穎的多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有改善的特性的新穎的氧化還原酶。另一個目的是提供天然和重組生產的氧化還原酶以及生產所述氧化還原酶的重組菌株。制造和使用根據本發明的多核苷酸和多肽的方法也是本發明的一個目的。提供下述新穎的氧化還原酶也是本發明的目的之一，所述氧化還原酶解決了至少一個上述問題，或當用于乳制品和/或烘焙應用中時具有一種或多種改善的特性。乳制品的改善的特性可選自由Maillard反應引起的變褐減少、改善的抗微生物特性和改善的蛋白質交聯。面團和/或烘焙制品的改善的特性可選自提高的面團強度、提高的面團彈性、提高的面團穩定性、降低的面團粘稠度、改善的醒發耐性、改善的面團延展性、改善的面團可加工性、提高的烘焙制品體積、改善的烘焙制品碎屑結構、改善的烘焙制品柔軟性、改善的烘焙制品口味、改善的烘焙制品抗腐性(anti-staling)、改善的烘焙制品色澤、改善的烘焙制品外皮或具有廣泛的底物特異性。發明詳述多核苷酸本發明提供了編碼新穎的氧化還原酶的新穎的多核苷酸，所述氧化還原酶尤其是具有任何上述活性的酶，優選地，具有異戊醇氧化酶活性、碳水化合物氧化酶、漆酶、葡萄糖氧化酶或己糖氧化酶活性的酶。本發明提供了6種編碼氧化還原酶的新穎的多核苷酸，暫時稱作OXI01、OXI02、OXI03、OXI04、OXI05、OXI06(下文稱作OXI01-OXI06)，其具有分別根據SEQIDNO:013、SEQIDNO:014、SEQIDNO:015、SEQIDNO:016、SEQIDNO:017、SEQIDNO:018(下文稱作"SEQIDNO:013-018")的氨基酸序列或其任何的功能等同物。編碼SEQIDNO:013-018的基因的序列通過對得自Aspergillusniger的基因組克隆測序測定。令人驚奇地，我們發現，根據本發明的OXI01-OXI06多肽被用于制備面團的工藝中時能改善面團的強度。本發明提供了包含下述基因及其完全cDNA序列(分別為SEQIDNO:007、SEQIDNO:008、SEQIDNO:009、SEQIDNO:010、SEQIDNO:011、SEQIDNO:012,下文稱作"SEQIDNO:007-012")的多核苷酸序列，所述基因編碼OXI01-OXI06氧化還原酶(分別包含SEQIDNO:001、SEQIDNO:002、SEQIDNO:003、SEQIDNO:004、SEQIDNO:005、SEQIDNO:006，下文稱作"SEQIDNO:001—006")。因此，本發明涉及經分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含根據SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的核苷酸序列或其任何的功能等同物。更具體地，本發明涉及在嚴格條件下、優選在高度嚴格條件下能與根據SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的多核苷酸雜交的經分離的多核苷酸。這類多核苷酸可有利地得自絲狀真菌，尤其是來自Aspergillusniger。更特定地，本發明涉及具有根據SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的核苷酸序列的經分離的多核苷酸。本發明還涉及經分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼分別根據SEQIDNO:013-018的多肽或其任何功能等同物的至少一個功能結構域。為了避免任何疑惑OXI01對應于核酸序列SEQIDNO:001和SEQIDNO:007和氨基酸序列SEQIDNO:013及其同源物功能等同物；OXI02對應于SEQIDNO:002、SEQIDNO:008和SEQIDNO:014及其同源物功能等同物等等，OXI06對應于SEQIDNO:006、SEQIDNO:012和SEQIDNO:018及其同源物功能等同物。本文使用的術語"基因"和"重組基因"指可從染色體DNA中分離的、包含編碼蛋白質(例如A.niger氧化還原酶)的開放讀碼框的核酸分子。基因可包含編碼序列、非編碼序列、內含子和調節序列。此外，基因是指本文定義的經分離的核酸分子。可以使用標準的分子生物學技術和本文提供的序列信息，來分離本發明的核酸分子(如具有SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的核苷酸序列的核酸分子或其功能等同物)。例如，使用SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的所有或部分核酸序列作為雜交探針，能夠使用標準雜交和克隆技術(例如描述于Sambrook，J.,Fritsh,E.F.，andManiatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd，ed"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989中)分離根據本發明的核酸分子。另外，可以使用合成的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)，來分離包含SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012所有或部分的核酸分子，所述引物以SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012中含有的序列信息為基礎設計。可以使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，并使用適當的寡核苷酸引物根據標準的PCR擴增技術，來擴增本發明的核酸。這樣擴增的核酸可以被克隆進適當的載體中并通過DNA序列分析被表征。另外，可以通過標準的合成技術(例如使用自動化DNA合成儀)制備下述寡核苷酸，所述寡核苷酸對應于本發明的核苷酸序列或能夠與本發明的核苷酸序列雜交。在一個優選的實施方案中，本發明的經分離的核酸分子包含SEQIDNO:007-012中所示核苷酸序列。SEQIDNO:007-012的序列對應于A.nigerOXI01-OXI06cDNA的編碼區。該cDNA包含編碼根據SEQIDNO:013—018的A.nigerOXI01-OXI06多肽的序列。在另一優選的實施方案中，本發明的經分離的核酸分子包含下述核酸分子，所述核酸分子是SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012中所示核苷酸序列或這些核苷酸序列功能等同物的互補體。與另一核苷酸序列互補的核酸分子是與所述另一核苷酸序列足夠互補，從而其能夠與所述另一核苷酸序列雜交形成穩定雙鏈體的核酸分子。本發明的一個方面涉及經分離的核酸分子，所述核酸分子編碼本發明的多肽或其功能等同物(如生物活性片段或結構域)，以及足夠用作雜交探針(以鑒定編碼本發明多肽的核酸分子)的核酸分子，和適合用作PCR引物(用于擴增或突變核酸分子)的這類核酸分子的片段。"經分離的多核苷酸"或"經分離的核酸"是與所述DNA或RNA來源的天然存在的生物基因組中緊鄰的兩條編碼序列(一個在5'端，一個在3'端)均不緊鄰的DNA或RNA。因此，在一個實施方案中，經分離的核酸包含與編碼序列緊鄰的部分或所有5'非編碼(例如啟動子)序列。該術語因此包括例如被整合進載體、整合進自主復制的制粒或病毒、或整合進原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA，或作為不依賴于其它序列的獨立分子(例如通過PCR或限制性內切酶處理產生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。其還包括編碼下述額外多肽的雜交基因的一部分的重組DNA，所述額外多肽基本不含細胞材料、病毒材料或培養基(通過重組DNA技術生產時)或化學前體或其它化學品(化學合成時)。另外，"經分離的核酸片段"是天然不作為片段存在并且在天然狀態下不被發現的核酸片段。本文使用的術語"多核苷酸"或"核酸分子"旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但是優選是雙鏈DNA。可以使用寡核苷酸類似物或衍生物(例如肌苷或硫代膦酸核苷酸)來合成核酸。這類寡核苷酸可被用于例如制備核酸，所述核酸具有改變的堿基配對能力或提高的核酸酶抗性。本發明的另一實施方案提供了經分離的核酸分子，所述核酸分子與OXI01-OXI06核酸分子(例如OXI01-OXI06核酸分子的編碼鏈)是反義的。還包括在本發明范圍內的是本文所述核酸分子的補體鏈。觀!l序錯誤(sequencingerrors)本文提供的序列信息不應被狹義地解釋為要求包括錯誤鑒定的堿基。本文公開的特定序列可以容易地被用于從絲狀真菌(尤其是A.niger)分離整個基因，隨后可容易地對所述基因進行進一步序列分析，從而鑒定測序錯誤。除非另有說明，通過對本文的DNA分子測序確定的所有核苷酸序列均使用自動DNA測序儀測定，由本文測定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列是通過翻譯如上測定的DNA序列來預測的。因此，如本領域所已知的，對通過該自動化途徑測定的任何DNA序列而言，本文測定的任何核苷酸序列可含有一些錯誤。通過自動化測定的核苷酸序列與被測序的DNA分子的實際核苷酸序列典型地至少約90%同一，更典型地至少約95%到至少約99.9%同一。可以通過其它途徑(包括本領域公知的手動DNA測序法)更精確地測定實際序列。又如本領域所已知的，與實際序列相比，被測定的核苷酸序列中的單個插入或刪除會引起核苷酸序列翻譯中的移碼(frameshift)，從而由被測定的核苷酸序列編碼的預測氨基酸序列會與由被測定的核苷酸序列實際編碼的氨基酸序列完全不同(從該插入或刪除的位點開始)。本領域技術人員能夠鑒定這類被錯誤鑒定的堿基，并知道如何糾正這類錯誤。核苷酸片段、探針和引物根據本發明的核酸分子可僅包含SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012所示核酸序列的部分或片段，例如可以用作探針或引物的片段或編碼0X101-OXI06蛋白質的部分的片段。通過克隆0X101-OXI06基因和cDNA測定的核苷酸序列允許生產探針和引物，所述探針和引物被設計為用于鑒定和/或克隆其它OXI01-OXI06家族成員，以及來自其它物種的OXI01-OXI06同源物。探針/引物典型地包含基本上被純化的寡核苷酸，所述寡核苷酸典型地包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列優選地在高度嚴格的條件下與SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012所示核苷酸序列或其功能等同物的至少約12或15個、優選約18或20個、優選約22或25個、更優選約30、35、40、45、50、55、60、65或75個或更多個相鄰的核苷酸雜交。以OXI01-OXI06核苷酸序列為基礎的探針可以被用于檢測轉錄本或基因組OXI01-OXI06序列，所述轉錄本或基因組OXI01-OXI06序列編碼例如其它生物中的相同或同源蛋白質。在優選的實施方案中，探針還包含與之結合的標簽基團，例如所述標簽基團可以是放射性同位素、熒光化合物、酶，或酶輔因子。這類探針也可以被用作診斷測試試劑盒的部分，所述試劑盒用于鑒定表達OXIOl-0乂106蛋白質的細胞。同一性&同源性術語"同源性"或"同一性百分比"在本文可互換使用。就本發明的目的而言，其在本文被定義來測定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的同一性百分比，所述序列就最適比較的目的被排列(例如為了與第二氨基酸或核酸序列最適比對，可以向第一氨基酸或核酸序列的序列中引入缺口)。然后比較相應的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當第一條序列中的一個位置被與第二序列中相應位置上相同的氨基酸殘基或核苷酸占據時，則所述分子在該位置上是同一的。兩條序列之間的同一性百分比是所述序列共享的同一位置數的函數(即％同一性=同一位置數/位置總數(即重疊位置)x100)。優選兩條序列是相同的長度。技術人員應當明白下述事實可獲得若干種不同的計算機程序以測定兩條序列之間的同源性。例如，可以使用數學算法完成兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定。在一個優選的實施方案中，使用NeedlemanandWunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法，使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣和16、14、12、10、8、6或4的缺口權重和1、2、3、4、5或6的長度權重測定兩條氨基酸序列之間的同一性百分比，所述算法已經被整合進GCG軟件包內的GAP程序中(可得自http:〃www.gcg.com)。技術人員應當知道這些不同的參數會產生輕微差異的結果，但是使用不同的算法時兩條序列的整體同一性百分比不會被顯著改變。還在另一實施方案中，使用GCG軟件包(可得自http:〃www.gcg.com)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的缺口權重和1、2、3、4、5或6的長度權重測定兩條核苷酸序列之間的同一性百分比。在另一實施方案中，使用E.MeyersandW.Miller算法(CABIOS,4:11-17(1989))，使用PAM120權重殘表、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分測定兩條氨基酸或核苷酸序列的同一性百分比，所述算法已被整合進ALIGN程序(2.0版)中(可得自http:〃vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)。本發明的核酸和蛋白質序列還可以被用作"查詢序列"，針對公開數據庫進行搜索，以例如鑒定其它家族成員或相關序列。這類搜索可以使用Altschul，etal.(1990)J.Mol.Biol.215:403—10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進行。可以使用NBLAST程序(計分=100，字長=20)進行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發明的OXI01-OXI06核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(計分=50，字長=3)進行BLAST蛋白質搜索，以獲得與本發明的OXI01-OXI06蛋白質分子同源的氨基酸序列。為了獲得加缺口的比對用于比較的目的，可以如Altschuletal.,(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中所述使用GappedBLAST。使用BLAST和GappedBLAST程序時，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認參數。見http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。雜交本文使用術語"雜交"旨在描述用于下述雜交和洗滌的條件，典型地，在所述條件下彼此至少約50%、至少約40%、至少約70%、更優選地至少約80%、進一步更優選地至少約85%到90%、更優選地至少95%同源的核苷酸序列保持彼此雜交。這類雜交條件的一個優選的非限制性例子是于約45"C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后于50°C、優選55°C、優選60'C和進一步更優選65'C下，在1XSSC、0.1y。SDS中洗滌一次或多次。高度嚴格條件包括例如于68'C下在5xSSC/5xDenhardt's溶液/1.0%SDS中雜交并于室溫下在0.2xSSC/0.1%SDS中洗滌。或者，洗滌可以在42t:進行。技術人員應當知道對于嚴格和高度嚴格的雜交條件而言應用何種條件。涉及這類條件的其它指示在該領域能夠容易地獲得，例如在Sambrooketal.，1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;禾口Ausubeletal.(eds.),1995，CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。當然，僅與多聚A序列(例如mRNA的3'末端多聚(A))或互補的T(或U)殘基段雜交的多核苷酸不應被包括于與本發明的核酸部分特異雜交的本發明多核苷酸中，因為這類多核苷酸會與含有多聚(A)段或其補體的任何核酸分子(例如尤其是任何雙鏈cDNA克隆)雜交。從其它生物獲得全長DNA可以以一種典型的途徑，來篩選從其它生物(例如絲狀真菌，尤其是來自Aspergillus的種)構建的cDNA文庫。例如，可以通過Northern印跡針對同源的OXI01-OXI06多核苷酸篩選Aspergillus菌株。檢測到與根據本發明的多核苷酸同源的轉錄物后，可以利用本領域技術人員公知的標準技術從分離自適當菌株的RNA構建cDNA文庫。或者，可以使用能夠與根據本發明的OXIOl-0乂106多核苷酸雜交的探針來篩選總基因組DNA文庫。可以例如通過進行PCR分離同源的基因序列，所述PCR使用以本文所述核苷酸序列為基礎設計的兩個簡并寡核苷酸引物池。用于反應的模板可以是通過反轉錄mRNA獲得的cDNA，所述mRNA從已知或懷疑表達本發明多核苷酸的菌株中制備。可以對PCR產物進行亞克隆和測序，以確保被擴增的序列代表了新OXI01-OXI06核酸序列的序列或其功能等同物。然后可以通過多種己知方法，使用PCR片段來分離全長cDNA克隆。例如，被擴增的片段可以被標記，并用于篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫。或者，被標記的片段可以被用于篩選基因組文庫。也可以用PCR技術來從其它生物中分離全長cDNA序列。例如，可以根據標準步驟從合適的細胞或組織來源中分離RNA。可以使用特異于被擴增片段最5'端的寡核苷酸引物，引導第一鏈合成，針對RNA進行反轉錄反應。然后可以使用標準的末端轉移酶反應將得到的RNA/DNA雜交體"加尾"(例如用鳥嘌呤)，可以用RNaseH消化所述雜交體，然后(例如用多聚-C引物)引物起始第二鏈合成。因此，被擴增片段上游的cDNA序列可以容易地被分離。有用的克隆策略的綜述，參閱例如上文Sambrooketal.;和上文的Ausubeletal.。無論同源的DNA片段是否編碼功能OXIOl-OXI06蛋白質，其均可通過本領域已知的方法容易地被測試。載體本發明的另一方面涉及含有下述核酸的載體，優選表達載體，所述核酸編碼OXI01-OXI06蛋白質或其功能等同物。本文使用的術語"載體"指能夠轉運與之連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是"質粒"，質粒是指其中可以連接其它DNA區段的環狀雙鏈DNA環。另一種類型的載體是病毒載體，其中其它DNA區段可以被連接進病毒基因組中。某些載體在它們被引入的宿主細胞中能夠自主復制(例如具有細菌復制起點的細菌載體和附加體哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加體哺乳動物載體)在引入宿主細胞時被整合進宿主細胞的基因組中，從而隨宿主細胞的基因組一起被復制。另外，某些載體能夠指導與它們可操作地連接的基因的表達。這類載體在本文中被稱作"表達載體"。一般而言，重組DNA技術中使用的表達載體通常是以質粒的形式存在的。術語"質粒"和"載體"在本文中可互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本發明旨在包括這類表達載體的起等同作用的其它形式，如病毒載體(例如復制缺陷反轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。本發明的重組表達載體以適合核酸在宿主細胞中表達的形式包含本發明的核酸，這意味著重組表達載體含有一個或多個與待表達的核酸序列可操作地連接的調節序列，以要用于表達的宿主細胞為基礎選擇所述調節序列。在重組表達載體中，"可操作地連接"旨在表示感興趣的核苷酸序列與調節序列以允許核苷酸序列表達(例如在體外轉錄/翻譯體系中或當載體被引入宿主細胞中時在宿主細胞中)的方式連接。術語"調節序列"旨在包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如多腺苷酸化信號)。這類調節序歹U描述于例如Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)中。調節序列包括在許多類型的宿主細胞中指導核苷酸序列組成型表達的那些和僅在某種宿主細胞中指導核苷酸序列表達的那些(例如組織特異調節序列)。本領域技術人員應當知道對表達載體的設計可以以下述因素為基礎，如待轉化的宿主細胞的選擇、期望的蛋白質表達水平等。本發明的表達載體可以被引入宿主細胞中，從而生產由本文所述的核酸編碼的蛋白質或肽(例如OXI01-OXI06蛋白質，OXI01-OXI06蛋白質的突變體形式，其任何的片段、變體或功能等同物等)。本發明的重組表達載體可以被設計，以用于OXI01-OXI06蛋白質在原核細胞或真核細胞中的表達。例如OXIOl-0乂106蛋白質可以在細菌細胞如E.coli、昆蟲細胞(使用桿狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。合適的宿主細胞在Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中進一步討論。或者，可以例如使用T7啟動子調節序列和T7聚合酶體外轉錄和翻譯重組表達載體。可用于本發明的表達載體包括來自染色體、附加體和病毒的載體，例如來自細菌質粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒(如桿狀病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反轉錄病毒)的載體和來自其組合的病毒，如來自質粒和噬菌體遺傳元件的病毒(如粘粒和噬菌粒)。DNA插入物應與合適的啟動子可操作地連接，所述啟動子如噬菌體XPL啟動子，五.co/Hac、trp和tac啟動子，SV40早期和晚期啟動子和反轉錄病毒LTR的啟動子，但不限于這些。其它合適的啟動子是技術人員應當知道的。在一個特定的實施方案中，能夠在絲狀真菌中指導氧化還原酶高水平表達的啟動子是優選的。這類啟動子是本領域已知的。表達構建體可含有轉錄起始位點、終止位點和(在被轉錄的區域中)用于翻譯的核糖體結合位點。構建體表達的成熟轉錄本的編碼部分應包含位于起點的翻譯起始AUG和適當地位于待翻譯多肽末端的終止密碼子。可以通過常規的轉化或轉染技術將載體DNA引入原核或真核細胞中。本文使用的術語"轉化"和"轉染"旨在表示用于向宿主細胞中引入外源核酸(例如DNA)的多種本領域公認的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導的轉染、轉導、感染、脂質轉染、陽離子脂質介導的轉染或電穿孔。用于轉化或轉染宿主細胞的合適方法可見于Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY,1989)，Davisetal.,BasicMethodsinMolecularBiology(1986)和其它實驗室手冊中。對于哺乳動物細胞的穩定轉染而言，已知取決于使用的表達載體和轉染技術，只有非常小的細胞級分可以將外源DNA整合進它們的基因組中。為了鑒定并選擇這些整合體，通常將編碼可選擇標記(例如抗性或抗生素)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細胞中。優選的可選擇標記包括賦予藥物(例如G418、潮霉素和甲氨喋呤)抗性的基因。編碼可選擇標記的核酸可以被引入宿主細胞中與編碼OXI01-OXI06蛋白質的核酸相同的載體上，或可以被引入獨立的載體上。可以通過藥物選擇來鑒定用被引入的核酸穩定轉染的細胞(例如，已經整合了可選擇標記基因的細胞能夠存活，而其它細胞死亡)。蛋白質在原核生物中的表達常在E.coli中用下述載體完成，所述載體含有指導蛋白質表達的組成型或誘導型啟動子。如所指出的，表達載體優選地含有可選擇標記。這類標記包括用于真核細胞培養的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，和用于在五.a^'和其它細菌中培養的四環素或氨節西林抗性。合適的宿主細胞的代表性例子包括細菌細胞，如co/Z、iS^^Zom少c&y禾口iSa/mowe〃a0;//'mwn'"m;真菌細胞，如酵母；昆蟲細胞如Z)msopMaS2和5^oJop&raSf9;動物細胞如CHO,COS和5owmme/a朋mfl;和植物細胞。用于上述宿主細胞的適當培養基和條件是本領域已知的。載體中優選用于細菌的是可得自Qiagen的pQE70、pQE60和PQE-9;可得自Stratagene的pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A和可得自Pharmacia的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。優選的真核載體為可得自Stratagene的PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pZTl和pSG;和可得自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它合適的載體是技術人員顯而易見的。用于本發明的己知的細菌啟動子包括Kco/Hacl和lacZ啟動子，T3和T7啟動子，gpt啟動子，XPR、PL啟動子和trp啟動子，HSV胸苷激酶啟動子，早期和晚期SV40啟動子，反轉錄LTR的啟動子如Rous肉瘤病毒("RSV")的啟動子和金屬硫蛋白啟動子如小鼠金屬硫蛋白-I啟動子。可以通過向載體中插入增強子序列，來提高高等真核生物對編碼本發明多肽的DNA的轉錄。增強子是DNA的順式作用元件，通常約10到300bp，其作用于提高啟動子在給定的宿主細胞類型中的轉錄活性。增強子的例子包括SV40增強子(其位于復制起點下游的bp100到270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、復制起點下游的多瘤增強子和腺病毒增強子。為了將翻譯的蛋白質分泌進入內質網腔中、進入壁膜間隙中或進入細胞外環境中，可以向被表達的多肽中整合進適當的分泌信號。所述信號對多肽可以是同源的或它們可以是異源信號。多肽可以以經修飾的方式被表達，并可不僅含有分泌信號而且含有額外的異源功能區。因此，例如額外氨基酸區(尤其是帶電荷的氨基酸)可被添加至多肽的N端，以促進純化期間或隨后的操作和儲存期間在宿主細胞中的穩定性和持久性。還可向多肽添加肽基元，以便于純化。根據本發明的多肽本發明提供了經分離的多肽，所述多肽具有根據SEQIDNO:013-018的氨基酸序列、可通過在適當的宿主中表達SEQIDNO:001-077的多核苷酸獲得的氨基酸序列，以及可以通過在合適的宿主中表達SEQIDNO:007-012的多核苷酸序列獲得的氨基酸序列。包含上述多肽的功能等同物的肽或多肽也包含在本發明中。上述多肽集體包含在術語"本發明的多肽"中。術語"肽"和"寡肽"被認為是同義的(如其通常被認為的那樣)，且當上下文需要表示通過肽鍵偶合的至少兩個氨基酸鏈時，每個術語可以互換使用。詞語"多肽"在本文中使用表示含有多于七個氨基酸殘基的鏈。所有的寡肽和多肽式或序列在本文中從左到右和從氨基端到羧基端的方向書寫。本文使用的單字母氨基酸代碼是本領域普遍已知的，并可見于Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989)。"分離的"多肽或蛋白質表示被從其天然環境中取出的多肽或蛋白質。例如，就本發明的目的而言，在宿主細胞中表達的重組產生的多肽和蛋白質被認為是分離的，與通過任何合適的技術已基本純化的天然或重組多肽一樣，所述合適的技術例如SmithandJohnson,Gene67:31-40(1988)中公開的單步驟純化方法。可以通過公知的方法從重組細胞培養物中回收和純化根據本發明的OXI01-0乂106氧化還原酶，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸萃取、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、親和色譜、羥基磷灰石色譜和凝集素色譜。最優選地，使用高效液相色譜("HPLC")用于純化。本發明的多肽包括天然純化的產物、化學合成步驟的產物，和通過重組技術從原核或真核宿主生產的產物，所述宿主包括例如細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞。取決于重組生產步驟中使用的宿主，可以將本發明的多肽糖基化或不糖基化。另外，本發明的多肽也可以包含最初被修飾的殘基(在一些情況下由宿主介導的過程產生)。蛋白質片段本發明還包括根據本發明的多肽的生物活性片段。本發明的多肽的生物活性片段包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與OXI01-OXI06蛋白質的氨基酸序列(其包含比全長蛋白質更少的氨基酸，并限制相應的全長蛋白質的至少一種生物活性)足夠同一或來自后者(例如SEQIDNO:013-018的氨基酸序列)。典型地，生物活性片段包含具有OXI01-OXI06蛋白質的至少一種活性的結構域或基序。優選的是具有葡萄糖氧化酶活性(E.C.l丄3.4)的片段。本發明的蛋白質的生物活性片段可以是多肽，所述多肽長度為例如10、25、50、100或更多個氨基酸。另外，其它生物活性部分(其中蛋白質的其它區域被刪除)可以通過重組技術被制備，并針對本發明多肽的天然形式的一種或多種生物活性做出評價。本發明還包括編碼OXI01-OXI06蛋白質的上述生物活性片段的核酸片段。功能等同物術語"功能等同物"和"功能變體"在本文可互換使用。OXI01-OXI06DNA的功能等同物是編碼下述多肽的經分離的DNA片段，所述多肽顯示本文公開的0X101-0X106DNAAm'gw氧化還原酶的具體功能。根據本發明的OXI01-OXI06多肽的功能等同物是顯示本文定義的A.niger氧化還原酶的至少一種功能的多肽。因此，功能等同物包括生物活性片段。功能蛋白質或多肽等同物可含有SEQIDNO:013-018的僅一個或多個氨基酸的保守取代或非必需氨基酸的取代、插入或刪除。因此，非必需氨基酸是SEQIDNO:013-018中能夠被改變而基本不改變生物功能的殘基。例如，在本發明的OXI01-OXI06蛋白質間保守的氨基酸殘基被預測為尤其不應進行改變。另外，在根據本發明的OXI01-0乂106蛋白質和其它氧化還原酶間保守的氨基酸可能不適合被改變。術語"保守取代"旨在表示下述取代其中氨基酸殘基被具有相似側鏈的氨基酸殘基取代。這些家族是本領域已知的，并包括具有堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側鏈(天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、]8-分支側鏈(蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。典型地，功能核酸等同物可含有沉默突變或不改變所編碼的多肽生物功能的突變。因此，本發明提供了編碼下述OXI01-OXI06蛋白質的核酸分子，所述蛋白質含有對于具體生物活性并非必需的氨基酸殘基改變。這類OXI01-OXI06蛋白質在氨基酸序列上與SEQIDNO:013-018差異，但仍保留至少一種生物活性。因此，本發明還包括包含編碼蛋白質的核苷酸序列的經分離的核酸分子，其中所述蛋白質含有與SEQIDNO:013所示氨基酸序列至少約63%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更同源的基本同源的氨基酸序列。在另一實施方案中，經分離的核酸分子包含編碼蛋白質的核苷酸序列，其中所述蛋白質含有與SEQIDNO:014-018所示氨基酸序列至少約40%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更同源的基本同源的氨基酸序列。例如，涉及如何制造表型沉默的氨基酸取代的指導在Bowie，J.U.etal.,Science247:1306-1310(1990)中提供，其中作者指出，存在兩種途徑，用于研究氨基酸序列對改變的耐受。第一種途徑依賴于進化過程，其中突變由自然選擇接受或拒絕。第二種途徑使用基因工程在被克隆的基因的特定位點引入氨基酸改變并選擇或篩選，以鑒定保留功能性的序列。如作者所述，這些研究已揭示了蛋白質令人驚奇地對氨基酸取代耐受。作者還指出蛋白質某位置上的何種改變很可能被允許。例如，最深埋(buried)的氨基酸殘基需要非極性側鏈，而表面側鏈的很少特征是普遍保守的。其它這類表型沉默取代在上文Bowieetal及其中所引用的參考文獻中描述。可以如下文所述來制造編碼與根據SEQIDNO:013-018的蛋白質同源的OXI01-OXI06蛋白質的經分離的核酸分子向根據SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的編碼核苷酸序列中引入一個或多個核苷酸取代、添加或刪除，使得一個或多個氨基酸取代、刪除或插入被引入所編碼的蛋白質中。這類突變可以通過標準技術引入，如定點誘變和PCR-介導的誘變。術語"功能等同物"還包括A.nigerOXI01-OXI06蛋白質的直向同源物。A.nigerOXI01-OXI06蛋白質的直向同源物是能夠從其它菌株或物種中分離并具有相似或相同生物活性的蛋白質。這類直向同源物可容易地被鑒定，因為含有與SEQIDNO:013-018基本同源的氨基酸序列。本文定義術語"基本同源"是指含有與第二氨基酸或核苷酸序列足夠或最少的同一或等同(例如具有相似側鏈)的氨基酸或核苷酸的第一氨基酸或核苷酸序列，使得所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的結構域。例如，含有下述共有結構域的氨基酸或核苷酸序列在本文中被定義為足夠同一，所述共有結構域具有約40%、優選65%、更優選70%、進一步更優選75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性或更多。此外，編碼其它OXI01-OXI06家族成員的核酸(其因而具有與SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012不同的核苷酸序列)也在本發明的范圍內。另外，編碼來自不同物種的OXIOl-0乂106蛋白質的核酸(其因此具有與SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012不同的核苷酸序列)在本發明的范圍內。可以根據它們與本文公開的OXI01-OXI06核酸的同源性，使用本文公開的cDNA或其合適的片段作為雜交探針，根據標準的雜交技術，優選地在高度嚴格的雜交條件下，來分離對應于本發明的OXI01-OXI06DNA的變體(例如天然等位基因變體)或同源物的核酸分子。除了OXI01-OXI06序列的天然存在的等位基因變體外，技術人員知道，可以通過突變向SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的核苷酸序列中引入改變，從而導致OXI01-OXI06蛋白質的氨基酸序列中的改變，而不顯著改變OXI01-0乂106蛋白質的功能。在本發明的另一方面，提供了經改進的OXI01-OXI06蛋白質。經改進的OXI01-OXI06蛋白質是其中至少一種生物活性被改進的蛋白質。這類蛋白質可以如下獲得沿全部或部分OXIOl-0乂106編碼序列隨機地引入突變，重組表達得到的突變體并針對生物活性進行篩選。例如，本領域提供了用于測量氧化還原酶酶活性的標準實驗，因而經改進的蛋白質可以容易地被選擇。在一個優選的實施方案中，OXI01-OXI06蛋白質具有根據SEQIDNO:013-018的氨基酸序列。在另一實施方案中，OXI01-OXI06多肽與根據SEQIDNO:013-018的氨基酸序列基本同源，并保留根據SEQIDNO:013-018的多肽的至少一種生物活性，但是由于如上所述的天然變異或誘變而在氨基酸序列上有差異。在又一個優選的實施方案中，OXI01-0乂106蛋白質具有由下述經分離的核酸片段編碼的氨基酸序列，所述經分離的核酸片段能夠與根據SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的核酸優選地在高度嚴格的雜交條件下雜交。對于包含根據SEQIDNO:013的氨基酸序列的蛋白質而言，與功能酶最接近的同系物是來自^spwgz7/i/wm^fl似s的異戊醇氧化酶，該異戊醇氧化酶顯示與SEQID01362%的同一性。在一個實施方案中，經分離的核酸分子包含編碼蛋白質的核苷酸序列，其中所述蛋白質包含與SEQIDNO:013所示氨基酸序列至少約63%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根據SEQIDNO:013的氨基酸序列的蛋白質的功能等同物。對于包含根SEQIDNO:014的氨基酸序列的蛋白質而言，與功能酶最接近的同源物是來自J"http://ra6acter的6-羥基煙堿氧化酶，該酶顯示與SEQID014xx^的同一性。在一個實施方案中，經分離的核酸分子包含編碼蛋白質的核苷酸序列，其中所述蛋白質包含與SEQIDNO:014所示氨基酸序列至少約40%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根據SEQIDNO:014的氨基酸序列的蛋白質的功能等同物。對于包含根SEQIDNO:015的氨基酸序列的蛋白質而言，與功能酶最接近的同源物是來自^pe^7/M/am^ctw的雜色曲霉素B合酶，該酶顯示與SEQID01531%的同一性。在一個實施方案中，經分離的核酸分子包含編碼蛋白質的核苷酸序列，其中所述蛋白質包含與SEQIDNO:015所示氨基酸序列至少約40%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根據SEQIDNO:015的氨基酸序列的蛋白質的功能等同物。包含根SEQIDNO:016的氨基酸序列的蛋白質顯示與任何功能酶無同源性。在一個實施方案中，經分離的核酸分子包含編碼蛋白質的核苷酸序列，其中所述蛋白質包含與SEQIDNO:016所示氨基酸序列至少約40%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根據SEQIDNO:016的氨基酸序列的蛋白質的功能等同物。對于包含根SEQIDNO:017的氨基酸序列的蛋白質而言，與功能酶最接近的同源物是來自^^raZ^cter的6-羥基-D-煙堿氧化酶，該酶顯示與SEQID017<25%的同一性。在一個實施方案中，經分離的核酸分子包含編碼蛋白質的核苷酸序列，其中所述蛋白質包含與SEQIDNO:017所示氨基酸序列至少約40%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根據SEQIDNO:017的氨基酸序列的蛋白質的功能等同物。包含根SEQIDNO:018的氨基酸序列的蛋白質顯示與任何功能酶無同源性。在一個實施方案中，經分離的核酸分子包含編碼蛋白質的核苷酸序列，其中所述蛋白質包含與SEQIDNO:018所示氨基酸序列至少約40%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根據SEQIDNO:018的氨基酸序列的蛋白質的功能等同物。因此，OXI01蛋白質是包含下述氨基酸序列的蛋白質，所述氨基酸序列與SEQIDNO:013所示氨基酸序列至少約63%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源，并保留根據SEQIDNO:013的多肽的至少一種功能活性。類似地，OXI2-OXI06蛋白質是包含下述氨基酸序列的蛋白質，所述氨基酸序列分別與SEQIDNO:014-018所示氨基酸序列至少約40%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源，并保留根據SEQIDNO:014-018的多肽的至少一種功能活性。也可以如下文所述來鑒定根據本發明的蛋白質的功能等同物例如，針對氧化還原酶活性，篩選本發明蛋白質的突變體(例如截短突變體)的組合文庫。在一個實施方案中，通過核酸水平上的組合誘變產生有斑文庫(variegatedlibrary)。可以通過例如將合成的寡核苷酸混合物酶連接為基因序列來產生變體的有斑文庫，從而可能的蛋白質序列的簡并集合(degenerateset)可作為個體多肽表達。存在可用于從簡并寡核苷酸生產本發明多肽的可能變體文庫的多種方法。用于合成簡并寡核苷酸的方法是本領域已知的(見例如Narang(1983)Tetrahedron39:3;Itakuraetal.(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakuraetal.(1984)Science198:1056;Ikeetal.(1983)NucleicAcidRes.11:477)。另外，本發明多肽的編碼序列的片段文庫可以被用于產生有斑的多肽群，用于篩選隨后的變體選擇。例如，可以如下產生編碼序列片段的文庫在每個分子僅發生約一次切割的條件下用核酸酶處理感興趣的編碼序列的雙鏈PCR片段，變性雙鏈DNA，將DNA復性形成雙鏈DNA(其可包含來自被不同切割的產物的有義/反義對)，通過用Sl核酸酶處理從再形成的雙鏈體上去除單鏈部分，并將得到的片段文庫連接進表達載體中。通過該方法，可以得到下述表達文庫，所述表達文庫編碼感興趣的蛋白質的不同大小的N-末端和內部片段。本領域已知有若干種技術可用于篩選組合文庫(其通過截短的點突變制造)的基因產物，和用于篩選cDNA文庫以獲得具有選定特性的基因產物。用于篩選大基因文庫的、適用于高通量分析的、最廣泛使用的技術典型地包括將基因文庫克隆進可復制的表達載體中，用得到的載體文庫轉化合適的細胞，和在下述條件下表達組合基因，所述條件下想要的活性的檢測簡化編碼基因(其產物被檢測)的載體的分離。循環總體誘變(Recursiveensemblemutagenesis,REM)，一種增強文庫中功能突變體頻率的技術，可以與篩選實驗組合使用以鑒定本發明蛋白質的變體(ArkinandYourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7811-7815;Delgraveetal.(1993)ProteinEngineering6(3):327-331)。除了SEQIDNO:1中所示的OXI01-OXI06基因序列外，本領域技術人員應當知道給定的種群中可存在DNA序列多態，所述多態導致OXI01-OXI06蛋白質氨基酸序列中的改變。這類遺傳多態性可存在于來自不同種群的細胞中或由于天然等位基因變異而存在于一個種群中。等位基因變體也可包括功能等同物。根據本發明的多核苷酸的片段也可包括不編碼功能多肽的多核苷酸。這類多核苷酸可作為PCR反應的探針或引物作用。根據本發明的核酸無論是編碼功能多肽還是無功能的多肽，均可被用作雜交探針或聚合酶鏈式反應(PCR)引物。不編碼具有OXI01-OXI06活性的多肽的本發明核酸分子的用途尤其包括(l)從cDNA文庫分離編碼OXI01-OXI06蛋白質的基因或其等位基因變體，所述cDNA文庫例如來自除A.niger之外的其它生物；(2)與中期染色體涂片原位雜交(例如FISH)以提供OXI01-OXI06基因的精確染色體定位，如Vermaetal.,HumanChromosomes:aManualofBasicTechniques,PergamonPress,NewYork(1988)所述；(3)Northem印跡分析，用于檢測OXI01-OXI06mRNA在特定組織中的表達；和4)能夠被用作診斷工具來分析給定的生物(例如組織)樣品中核酸存在的探針和引物，所述核酸能與OXI01-OXI06探針雜交。本發明還包括獲得OXI01-OXI06基因或cDNA功能等同物的方法。這類方法需要獲得被標記的含有被分離的核酸的探針，所述被分離的核酸編碼根據SEQIDNO:013-018的序列或其變體的全部或部分；在允許探針與文庫中的核酸片段雜交從而形成核酸雙鏈體的條件下，用被標記的探針篩選核酸片段文庫，和從任何被標記的雙鏈體中的核酸片段制備全長的基因序列，以獲得與OXI01-OXI06基因相關的基因。宿主細胞在另一實施方案中，本發明包括細胞，例如含有本發明所包括的核酸的經轉化的宿主細胞或重組的宿主細胞。"經轉化的細胞"或"重組細胞"是其中(或其祖先中)已經借助于重組DNA技術引入了本發明核酸的細胞。原核和真核細胞均包括在內，例如細菌、真菌、酵母等等，特別優選的是來自絲狀真菌(尤其是Aspergillusniger)的細胞。可選用調控插入序列表達并以特異的、期望的方式加工基因產物的宿主細胞。蛋白質產物的這類修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)可促進蛋白質發揮最佳功能。多種宿主細胞具有用于翻譯前加工和修飾蛋白質和基因產物的特性和特異機制。可選用分子生物學和/或微生物學領域技術人員熟悉的適當細胞系或宿主系統，以確保對所表達的外源蛋白質的想要的和正確的修飾與加工。為此，可以使用具有下述細胞機制的真核宿主細胞，所述細胞機制用于適當地加工原始轉錄本、糖基化和磷酸化基因產物。這類宿主細胞是本領域公知的。宿主細胞還包括但不限于哺乳動物細胞系如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38和脈絡叢細胞系。如果想要的話，可以由穩定轉染的細胞系來生產根據本發明的多肽。公眾可獲得多種適用于穩定轉染哺乳動物細胞的載體，用于構建這類細胞系的方法也是公眾己知的，例如Ausubeletal.(上文)中。氧化還原酶在工業過程中的用途本發明還涉及根據本發明的氧化還原酶在選定數量的工業過程中的用途。盡管用這些過程獲得了長期的經驗，但是根據本發明的氧化還原酶具有超出目前所用酶的大量顯著優點。根據特定的應用，這些優點可包括下述方面，如更好的性能、更低的生產成本、更高的底物特異性、更低的抗原性、更少的不想要的副活性、在合適的微生物中生產時更高的產率、更合適的pH和溫度范圍、更好的最終產物味道以及食物級別和猶太教規方面(kosheraspect)。本發明的氧化還原酶可被用于下述任何應用中，所述應用中期望氧化底物或獲得其特定反應產物。例如，根據本發明的氧化還原酶的應用能夠與醛、醇、羧酸等一起產生過氧化氫。可以使用根據本發明的新穎氧化還原酶的工業過程之一是烘焙應用。本發明還涉及提供面粉面團的方法(其具有經改進的流變學特性)，并涉及從這類面團制造的完成烘焙的或干燥的制品(其具有經改進的結構、食用品質和尺寸特性)。本發明還涉及烘焙預混合物，所述預混合物包含面粉、酶制劑和合適的運載體。本發明導致產生更強的面團，其具有經改進的流變學特性以及具有經改進的品質的最終烘焙制品。對小規模和大規模應用而言，面團的強度均是烘焙的重要方面。結實的面團在面團轉運期間具有更大的混合時間、醒發時間和機械振動耐性，而軟弱的面團對這些處理更不耐受。具有更好的流變學和操作特性的結實面團來自含有強谷蛋白網狀系統的面粉。具有低蛋白質含量或差的谷蛋白品質的面粉導致軟弱的面團。面團調節齊l」(conditioner)是烘焙工業公知的。向面包面團中添加調節劑導致產生經改進的面團可加工性和經改進的面包結構、體積、口味和新鮮度(抗腐性)。非特異性的氧化劑(如碘酸鹽、過氧化物、抗壞血酸、溴酸鉀和偶氮二酰胺)被用于促進面粉的烘焙性能、獲得具有經改進的流變學特性的面團以及獲得具有想要的強度和穩定性的面團。已經提出這些調節劑誘導蛋白質之間鍵的形成，所述鍵強化谷蛋白從而強化面團。然而，若干種目前可獲得的化學氧化劑的使用遇到了消費者的抵制，或不被管理機構允許。酶作為面團調節劑的用途已經被認為是化學調節劑的備選方案。目前大量的酶已經被用作面團和/或面包改進劑，尤其是作用于面團中大量存在的成分的酶。這類酶的例子是淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、木聚糖酶和(半)纖維素酶，包括聚戊糖酶(pentosanase)和脂酶、磷脂酶和半乳糖脂酶。烘焙制品從下述面團制備，所述面團通常由堿性成分面粉、水和任選的鹽制成。取決于烘焙制品，其它任選的成分為糖、調味劑等。對發酵劑制品而言，在化學發酵系統之后主要使用面包酵母(baker'syeast)，所述化學發酵系統如酸(產酸化合物)和碳酸氫鹽的組合。為了改進面團的操作特性和/或烘焙制品的最終特性，存在開發加工助劑(aids)的持續努力，所述加工助劑具有改進的特性。待改進的面團特性包括可加工性、氣體保留能力等。可以被改進的烘焙制品的特性包括面包體積、面包屑易碎性(crustcrispiness)、粉碎結構和柔軟性、口味和香味和保質期。目前存在的加工助劑可以被分為兩組化學添加劑和酶。具有改進特性的化學添加劑包括化學氧化劑如抗壞血酸、溴酸鹽和偶氮碳酸氫鹽(azodicarbonate)，還原劑如L-半胱氨酸和谷胱甘肽，作為面團調節劑(如二乙酰酒石酸酯)發揮作用的乳化劑如單/雙甘油酯(DATEM)、硬脂酰乳酸鈉(sodiumstearoyllactylate,SSL)或硬脂酰乳酸鈣(CSL)，或作為面包防硬劑發揮作用的如單硬脂酸甘油酯(GMS)等，脂肪材料如甘油三酯(脂肪)或卵磷脂等等。最近，存在用酶代替化學添加劑的趨勢。酶被認為是更天然的化合物并屈此更被消費者接受。合適的酶可選自氧化酶，由淀粉降解酶、阿拉伯木聚糖和其它半纖維素降解酶、纖維素降解酶、脂肪材料裂解酶和蛋白質降解酶組成的組。本發明還涉及用于制備面團或烘焙制品的方法，所述方法包括向面團中摻入有效量的本發明的氧化還原酶，這相對于其中未摻入多肽的面團或烘焙制品而言促進面團或得自面團的烘焙制品的一種或多種特性。短語"摻入面團中"在本文中定義為向面團中、要用于制造面團的任何成分中、和/或要制造面團的面團成分的混合物中添加根據本發明的氧化還原酶。換言之，根據本發明的氧化還原酶可以在面團制備的任何步驟中被添加，并可以在一個、兩個或更多步驟中被添加。根據本發明的氧化還原酶被添加進面團的成分中，所述成分使用本領域公知的方法被揉捏和烘焙以制造烘焙制品。參閱例如U.S.專利No.4,567,046、EP-A-426，211、JP隱A-60-78529、JP-A-62-111629和JP-A-63-258528。術語"有效量"在本文中定義為根據本發明的氧化還原酶的下述量，所述量足夠對面團和/或烘焙制品的至少一個感興趣的特性提供可測量的作用。術語"經改進的特性"在本文中定義為面團和/或得自面團的制品(尤其是烘焙制品)的任何特性，所述特性相對于其中未摻入本發明氧化還原酶的面團或產物而言被本發明的氧化還原酶的作用改進。經改進的特性可包括但不限于提高的面團強度、提高的面團彈性、提高的面團穩定性、經改進的烘焙制品香味、經改進的烘焙制品抗腐性和經改進的面包屑白度。可以根據以下實施例中所述的本發明的方法，通過將添加和不添加本發明多肽而制備的面團和/或烘焙制品進行比較，來測定經改進的特性。感覺品質可以使用烘焙工業中明確的流程來評價，并可包括例如使用一組受過訓練的口味測試人員(apaneloftrainedtaste-testers)。術語"提高的面團強度"在本文中定義為面團的下述特性，所述面團一般具有更具彈性的特性和/或需要更多的勞動輸入來用模具成形和造型。術語"提高的面團彈性"在本文中定義為面團的下述特性，所述面團具有在經受過某些物理張力之后恢復其原始形狀的更高趨勢。術語"提高的面團穩定性"在本文中定義為面團的下述特性，所述面團對機械損傷更不敏感，因此更好地維持其形狀和體積。術語"降低的面團粘稠度"在本文中定義為面團的下述特性，所述面團具有更小的與表面(例如在面團生產機器中)粘附的趨勢，并如本領域所已知的，由熟練的測試烘焙者根據經驗評價或通過使用紋理分析儀(例如TAXT2)測量。術語"經改進的面團延展性"在本文中定義為面團的下述特性，所述面團可以接受提高的張力或拉伸而不破裂。術語"經改進的面團可加工性"在本文中定義為面團的下述特性，所述面團一般更不粘和/或更堅硬和/或更有彈性。術語"提高的面團醒發抗性"被定義為面團經受延長的醒發時間的能力。術語"提高的烘焙制品的體積"被測量為給定的面包的比體積(specificvolume,體積/重量)，這典型地通過傳統的油菜籽替換方法測定。術語"經改進的烘焙制品面包屑結構"在本文中定義為烘焙制品的特性，所述烘焙制品的面包屑中具有更精細和/或更薄的細胞壁和/或細胞在面包屑中更均一/同質的分布，并通常由熟練的測試烘焙者根據經驗評價。術語"經改進的烘焙制品柔軟性"是"硬度"的反義詞，并在本文中定義為烘焙制品的特性，所述烘焙制品更容易被壓縮，并且如本領域已知由熟練的測試烘焙者根據經驗評價或通過使用紋理分析儀(例如TAXT2)測量。術語"經改進的烘焙制品香味"由受過訓練的測試組評價。術語"經改進的烘焙制品抗腐性"在本文中被定義為烘焙制品的特性，所述烘焙制品儲存期間具有降低的品質參數(例如柔軟度和/或彈性)衰退速率o術語"面團"在本文中定義為面粉和其它成分的混合物，所述混合物足夠堅硬到被揉捏或滾動。面團可以是新鮮的、冷凍的、預先暴露的(pre-bared)或預先烘焙的。冷凍面團的制備由KulpandLorenz在FrozenandRefrigeratedDoughsandBatters中描述。術語"烘焙制品"在本文中定義為從面團制備的、具有軟或脆特征的任何制品。可有利地由本發明生產的烘焙制品(無論是白色、淺色或深色類型)的例子為面包(尤其是白面包、全麥面包或裸麥面包)，典型地以棍或巻(loavesorrolls)的形式，法棍面包，意大利面，皮塔(pita)面包，玉米餅(tortillas),墨西哥玉米巻，蛋糕，煎餅，餅干，曲奇，餡餅皮(piecrust)，饅頭和脆面包(crispbread)等等。本發明的氧化還原酶和/或本發明方法中要使用的其它酶可以是適用于所述用途的任何形式，例如干粉、凝聚的粉末、顆粒(尤其是無塵顆粒)、液體(尤其是經穩定的液體)或受保護的酶(如WO01/11974和WO02/26044中所述)的形式。可以通過常規方法制備顆粒和凝聚的粉末，例如通過將根據本發明的氧化還原酶噴霧在流動床顆粒劑上的運載體上。運載體可由顆粒核心組成，所述顆粒核心具有合適的顆粒大小。運載體可以是可溶的或不溶的，例如鹽(例如NaCI或硫酸鈉)、糖(例如蔗糖或乳糖)、糖醇(例如山梨糖醇)、淀粉、稻、玉米粒或大豆。根據本發明的氧化還原酶和/或其它酶可以含在緩釋的配方中。用于制備緩釋配方的方法是本領域公知的。添加營養學可接受的穩定劑(如糖、糖醇或其它多元醇和/或乳酸或根據已知方法的其它有機酸)可例如對液體酶制劑加以穩定。根據本發明的氧化還原酶也可以被摻入包含酵母的組合物中，如EP-A-0619947、EP-A-0659344和WO02/49441中公開的組合物。對于包含在面粉的預先混合物中而言，根據本發明的多肽是干燥制品(例如無塵顆粒)是有利的，而對于與液體一起被包含而言，液體形式是有利的。也可以向面團中摻入一種或多種其它酶。所述其它酶可以是任何來源，包括哺乳動物和植物來源，優選地為微生物(細菌、酵母或真菌)來源，并可通過本領域常用技術獲得。在一個優選的實施方案中，其它酶可以是淀粉酶如a-淀粉酶(適用于提供可被酵母發酵的糖并延緩腐敗)或/3-淀粉酶，環糊精葡萄糖轉位酶，肽酶尤其是外肽酶(適用于增強香味)、轉谷氨酰胺酶，脂酶/磷脂酶/半乳糖脂酶(適用于修飾面團或面團組分中存在的脂解化合物)，氧化還原酶，纖維素酶，半纖維素酶，尤其是戊聚糖酶如木聚糖酶(適用于戊聚糖的部分水解，這提高面團的延展性)，蛋白酶(適用于削弱谷蛋白，尤其是使用硬小麥粉時)，蛋白質二硫化物異構酶，例如WO95/00636中公開的蛋白質二硫化物異構酶，糖基轉移酶，過氧化物酶(適用于改進面團的稠度)，漆酶，兒茶酚氧化酶或其它氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂肪氧化酶或L-氨基酸氧化酶(適用于改進面團的稠度)。當根據本發明的方法要添加一種或多種其它酶添加劑時，這些添加劑可以單獨地或與根據本發明的多肽一起，任選地作為面包改進和/或面團改進組合物的組分被添加。其它酶活性可以是上述的任何酶，并可以根據己確立的烘焙實踐確定劑量。本發明還涉及用于制備烘焙制品的方法，包括烘焙通過本發明方法獲得的面團，以生產烘焙制品。烘培面團以生產烘培制品可以通過本領域公知的方法進行。本發明還涉及分別通過本發明的方法生產的面團和烘焙制品。本發明還涉及用于面團和/或由面團制成的烘焙制品的預混合物(例如為面粉組合物形式)，其中所述預混合物包含本發明的多肽。術語"預混合物"在本文定義為以其常規含義理解，即作為烘焙劑的混合物，一般包含不僅可用于工業面包烘焙劑中的面粉，一般包含不僅可用于工業面包烘焙工廠/設施、而且也可用于零售面包房的面粉。可以通過將本發明的多肽或包含多肽的本發明的面包改進和/或面團改進組合物與合適的運載體(如面粉、淀粉、糖或鹽)混合來制備預混合物。預混合物可含有其它面團改進和/或面包改進添加劑，例如包括上述酶的任何添加劑。本發明還涉及顆粒或凝聚粉末形式的烘焙添加劑，所述添加劑包含本發明的多肽。烘焙添加劑優選地具有狹窄的顆粒大小分布，多于95%(按重量計)的顆粒在25到500/xm的范圍內。在面團和面包制造中，本發明可與前文定義的加工助劑組合使用，所述加工助劑如化學加工助劑，如氧化劑(例如抗壞血酸)、還原劑(例如L-半胱氨酸)、磷脂酶和/或其它酶，如多糖修飾酶(例如ce-淀粉酶、半纖維素酶、分支酶等)和/或蛋白質修飾酶(內切蛋白酶、外切蛋白酶、分支酶等)。還發現OXI01蛋白質能夠在面團中產生過氧化氫。其令人驚奇地使甩至少9,12，13-三羥基-10-十八碳烯酸作為底物，從而生產氧代-二羥基-lO-十八碳烯酸。該底物存在于例如面粉中，并因此使得OXI01蛋白質特別適用于烘焙。這類酶在烘焙中的用途之前是未知的。因此，本發明還包括下述酶在烘焙中的用途，所述酶催化羥基脂肪酸(例如單羥基脂肪酸或二羥基脂肪酸或三羥基脂肪酸如9,12,13-三羥基-10-十八碳烯酸)的氧化從而產生過氧化氫。合適的酶類型的一個例子是醇氧化酶，例如仲醇氧化酶或異戊醇氧化酶。在一個優選的實施方案中，能夠氧化羥基脂肪酸的酶與脂肪氧合酶和/或過氧化物酶組合。本發明還涉及適用于烘焙的組合物，包括能夠氧化羥基脂肪酸的酶和脂氧合酶和/或過氧化物酶。優選地，能夠氧化羥基脂肪酸的該酶能夠氧化9,12，13-三羥基-10-十八碳烯酸。更優選地，能夠氧化羥基脂肪酸的該酶為OXI01蛋白質，進一步更優選為包含根據SEQIDNO:013的氨基酸序列的蛋白質。根據本發明的氧化還原酶的另一用途是乳制品應用領域內的。對乳的熱處理總是伴隨著一些程度的麥拉德反應(Maillardreaction),導致被處理的乳發生輕微的褐色。盡管在一些情況下這可以是想要的(例如在牛油糖(butterscotchconfection)或焦糖中)，但是變褐通常是不想要的。麥拉德反應是還原乳中存在的糖(特別是乳糖、葡萄糖和乳糖)與乳蛋白質(如酪蛋白或乳清蛋白)中存在的游離氨基反應的結果。根據本發明的氧化還原酶OXI01-06可用于在提高的溫度下降低乳、乳衍生制品或含有這類乳衍生(乳)制品的食物中的麥拉德反應。這類處理的一個例子是巴氏消毒乳，以提高其保質期穩定性。在低溫長時間(LTLP)巴氏消毒(也稱作大桶(vat)巴氏消毒)中，典型地將乳在62.80。C保持不少于30分鐘。在連續的過程中，使用高溫短時間(HTST)巴氏消毒，其中乳在不低于71.7(TC的溫度下保持最少15秒(或在更高溫度下更短時間段的等同條件)。更最近開發的是超高溫處理(UHT)巴氏消毒，其中乳被加熱至至少135X:保持最少l秒。UHT處理特別需要、LTLP和HTST處理也以較小的程度需要非常嚴格的溫度和過程控制。使用根據本發明的氧化還原酶的合適的應用的一個例子是涂在批薩上面的乳酪。在許多情況下，在批薩餡料中使用莫扎里拉(Mozzarella)型乳酪。在該領域中，凝乳(pastafileta)是指莫扎里拉。許多批薩制造者在>260°C的溫度下烘焙批薩。在這些高溫下，乳酪成為褐色的傾向極度成為摩蘇里拉工業的具體擔心，因為摩蘇里拉制造者必須使用在這些高溫下烘烤時不會產生黑色水泡和棕色區域的乳酪。變褐色的效應典型地由乳糖和特別是半乳糖的殘余量產生。本領域已知半乳糖和被烘焙的乳酪的顏色水平之間存在強的相關系數，并且文獻中提到了降低莫扎里拉中半乳糖和乳糖水平的許多嘗試。這些是最難以操作的和/或可提高成本或降低產率。在熱處理之前使用根據本發明的氧化還原酶減少麥拉德反應，提供了在提高的溫度下處理時控制乳變為褐色的有效途徑。根據本發明的氧化還原酶優選在乳處理的早期被添加，從而允許酶有最大的時間來氧化還原糖。因為該酶依賴于氧的可用性，所以早期添加是優選的，從而允許在乳加工期間進入氧，并因此使得還原糖濃度水平盡可能高的減少。根據本發明的氧化還原酶具有廣泛的底物特異性，允許大范圍還原糖的氧化。對于在乳制品或含乳食物中的乳制品應用而言，根據本發明的氧化還原酶能夠有效地氧化乳糖、葡萄糖和半乳糖。酶可以與更多的固體食物(例如乳酪)以若干種方式接觸。可以通過在制造工藝中的一些階段添加酶(例如添加至乳酪乳中)而將乳酪與酶在乳酪制造工藝中接觸，導致酶被摻入乳酪基質中。存在氧時酶會開始有活性；這在一些程度上可以在乳酪自身中進行，但是在乳酪加工如切割或磨碎(這導致暴露于空氣的乳酪表面和氧暴露的顯著增加)期間和/或之后最為有效。或者，可以在加熱之前將酶噴霧在含乳酪食品上，以這種方式防止麥拉德反應最有效發生的表面上的麥拉德反應。在該情況下酶可以在溶液中或分散系中被提供，并被噴霧在食物表面上。溶液/分散系可以包含用量為l-50單位OXI01-OXI06/ml的酶。或者，可以添加干燥形式(如粉末)的酶。干燥形式或液體形式的酶可以單獨或與其它添加劑組合添加。令人驚奇地，己經發現，使用本發明的氧化還原酶也能夠降低乳中的需氧微生物的生長，從而有助于新鮮乳的保存。在這類情況下，氧化還原酶可以被用作乳制品應用中(例如在乳、乳衍生制品和含這類制品的食物中)的抗微生物劑。使用根據本發明的氧化還原酶的一個額外優點是過氧化物的形成。己知這類過氧化物能與蛋白質反應，導致蛋白質交聯(參閱例如J.A.Gerrard，TrensinFoodScience&technology(2002)，13,391-399)。然而，交聯的程度取決于產生的過氧化氫的量。令人驚奇地，根據本發明的氧化還原酶能夠大量交聯乳中的蛋白質。交聯的程度還取決于底物的預處理、氧化還原能得到的氧量等等。蛋白質的交聯具有下述優點包含交聯的蛋白質的制品具有被改變的構造特性，例如從這類交聯蛋白質形成的凝膠的存水能力。實施例實施例1流變學測試粉質圖(farinograph)和伸展圖(extensograph)被全世界的烘焙者用來評價面團的流變學和技術特性。可以通過根據InternationalAssociationofCerealChemistry(ICC)禾口theAmericanAssociationofCerealChemistry(AACC)的標準方法，來測量氧化還原酶對面團的流變學特性的影響，所述標準方法包括快速黏度分析儀(RapidViscoAnalyser)、粉質儀方法(AACC54-2,ICC115)和拉伸儀(AACC54-10，ICC114)。事實上，用伸展圖方法來測量面團的相對強度。結實的面團顯示比軟弱的面團更高的和(在一些情況下)更長的伸展圖曲線。AACC方法54-10以以下的方式定義了伸展圖"伸展圖記錄測試的一塊面團的負荷-伸展曲線，直至其斷裂。負荷-伸展曲線或伸展圖的特征被用于評價面粉的一般品質機器對促進劑(improvingagent)的反應"。粉質圖方法測定具體面粉的水攝入和得到的面團的混合耐性。更好的烘焙面粉和面團會顯示更高的粉質圖值。如果具體的面粉顯示相對高的水攝入，并且得到的面團的混合耐性良好，則粉質圖曲線在全部時間顯示保留大部分(如果不是所有的話)初始高度。這類面團的可加工性和烘焙品質可能是極好的。AACC方法54-12定義粉質圖如下"粉質圖測量并記錄面團對混合的抗性。其被用于評價面粉的吸收和測定面團在混合時的穩定性和其它特征"。實施例2測量面團的游離硫醇含量可以通過測量面團中游離巰基的含量來研究氧化還原酶對硫醇交聯形成的作用。所述方法描述于CerealChemistry,1983，70,22-26中。該方法以下述原則為基礎5,5'-二硫代-二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)與面團中的硫醇反應形成高度有色的2-硝基-5-巰基-苯甲酸陰離子，在412nm處用分光光度計對其加以測量。實施例3迷你巴塔德(Mini-batard)烘焙測試針對谷蛋白強化使用迷你巴塔德烘焙測試。為了檢測酶對谷蛋白強化的作用，省略化學氧化劑的添加。所有的測試一式兩份進行。配方_<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>工藝<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>Scaling2x150g第一次醒發25分鐘，室溫模塑Bertmnd棒狀制模機調節16最終醒發90分鐘，32。C，85%RH烘焙240/235°C下20分鐘，0.21蒸汽針對面團的穩定性測量高度/寬度比。烘焙爐膛面包時，當不存在氧化劑時面團是不穩定的并變成又扁又寬。相同的特征也出現在最終的面包中。促進面團穩定性的酶的添加導致更高的高度/寬度比。在加工期間，由烘焙者評價面團品質。用尺子測量高度/寬度比。結果用ANOVA，Statgraphicsplus5.1進行統計學評價。實施例3.1在迷你巴塔德中測試具有根據SEQIDNO:013、014、015、016、017和018的氨基酸序列的氧化還原酶。所有的測試一式兩份進行。所有的酶作為超濾濃縮物被遞送被在每kg面粉5mg總蛋白質下測試。陰性對照是不添加氧化還原酶的面團。使用抗壞血酸(68mm)作為參考。結果:<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>*帶有不同字母的結果是在90.0%置信水平上統計學顯著差異的。用于在均值間鑒別的方法是Fisher's最小顯著差數(LSD)程序。清楚地看到含有根據本發明的氧化還原酶的面包顯示與不含這些酶的面包相比更好的高度/寬度比。實施例3.2在迷你巴塔德中測試包含根據SEQIDNO:013的氨基酸序列的酶對高度/寬度比的劑量應答。測試了三種劑量1、2和3mg總蛋白質/kg面粉。陰性對照是不添加氧化還原酶的面團。使用抗壞血酸(68mm)作為參考。測試一式兩份進行。結果:<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>*帶有不同字母的結果是在90.0%置信水平上統計學顯著差異的。用于在均值間鑒別的方法是Fisher's最小顯著差數(LSD)程序。發現根據本發明的氧化還原酶在烘焙的迷你巴塔德的高度/寬度比中顯示良好的劑量應答。與實施例3.1的結果相比，該測試中高度/寬度比的絕對值更高。這與下述事實相關實施例3.1的測試用來自2005年收獲的面粉完成，而實施例3.2用來自2006年收獲的面粉完成。權利要求1.經分離的多核苷酸，其能夠與SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012中任一多核苷酸雜交。2.根據權利要求1的經分離的多核苷酸，所述多核苷酸能夠在高嚴格度條件下與SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012中任一多核苷酸雜交。3.根據權利要求1或2的經分離的多核苷酸，其能從絲狀真菌獲得。4.根據權利要求3的經分離的多核苷酸，其能從Aspergillusniger獲得。5.編碼下述氧化還原酶的經分離的多核苷酸，所述氧化還原酶包含氨基酸序列SEQIDNO:013-018之任一或其任何的功能等同物。6.編碼下述氧化還原酶的至少一個功能結構域的經分離的多核苷酸，所述氧化還原酶包含氨基酸序列SEQIDNO:013-018之任一或包含其中任何的功能等同物。7.經分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含核苷酸序列SEQIDNO:001-077或SEQIDNO:007-012之任一或其任何的功能等同物。8.由SEQIDNO:001—006或SEQIDNO:007—012之任一組成的經分離的多核苷酸。9.包含根據權利要求1到8中任一項的多核苷酸序列的載體。10.根據權利要求9的載體，其中根據權利要求1到8中任一項的所述多核苷酸序列與下述調節序列可操作地連接，所述調節序列適用于所述多核苷酸序列在合適的宿主細胞中表達。11.根據權利要求IO的載體，其中所述合適的宿主細胞是絲狀真菌。12.制造根據權利要求1-8中任一項的多核苷酸或根據權利要求9到11中任一項的載體的方法，所述方法包括下述步驟培養用所述多核苷酸或所述載體轉化的宿主細胞，并從所述宿主細胞中分離所述多核苷酸或所述載體。13.具有氨基酸序列SEQIDNO:013-018之任一或其任何的功能等同物的經分離的氧化還原酶。14.根據權利要求13的經分離的氧化還原酶，其能從Aspergillusniger獲得。15.通過在適當的宿主細胞例如Aspergillusniger中表達根據權利要求1到8中任一項的多核苷酸或根據權利要求9到11中任一項的載體能夠獲得的經分離的氧化還原酶。16.包含根據權利要求13到15中任一項的任何氧化還原酶功能結構域的重組氧化還原酶。17.制造根據權利要求13到16中任一項的氧化還原酶的方法，所述方法包括下述步驟用根據權利要求1到8中任一項的經分離的多核苷酸或根據權利要求9到11中任一項的載體轉化合適的宿主細胞，在允許所述多核苷酸表達的條件下培養所述細胞，和任選地，從所述細胞或培養基中純化被編碼的多肽。18.重組宿主細胞，其包含根據權利要求1到8中任一項的多核苷酸或根據權利要求9到11中任一項的載體。19.重組宿主細胞，其表達根據權利要求13到16中任一項的多肽。20.經純化的抗體，其與根據權利要求13到16中任一項的氧化還原酶具有反應性。21.用于制造面團的工藝，所述工藝包括添加根據權利要求13-16中任一項的氧化還原酶。22.用于從通過權利要求21的工藝制備的面團生產烘焙制品的工藝。23.根據權利要求13-16中任一項的氧化還原酶用于制備面團和/或其烘焙制品的用途。24.能夠水解羥基脂肪酸的酶用于制備面團和/或其烘焙制品的用途。25.根據權利要求13-16中任一項的氧化還原酶用于制備乳制品的用途。26.根據權利要求13-16中任一項的氧化還原酶用于在乳制品中降低Maillard反應的用途。27.根據權利要求13-16中任一項的氧化還原酶用于在乳制品中防止Maillard反應的用途。28.根據權利要求13-16中任一項的氧化還原酶作為乳制品中抗微生物劑的用途。29.根據權利要求28的氧化還原酶的用途，其特征在于所述抗微生物劑被用于乳中的乳過氧化物酶-硫氰酸體系。30.根據權利要求25-28中任一項的氧化還原酶的用途，其特征在于所述乳制品為乳或乳酪。全文摘要本發明涉及新鑒定的包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因編碼從Aspergillusniger分離的新穎的氧化還原酶。本發明描述了新穎基因的全長核苷酸序列、包含新穎氧化還原酶的全長編碼序列的cDNA序列，以及全長功能蛋白質及其功能等同物的氨基酸序列。本發明還涉及在烘焙和乳制品應用中使用這些酶的方法。本發明還包括用根據本發明的多核苷酸轉化的細胞和其中根據本發明的氧化還原酶被遺傳修飾以增強或降低其活性和/或表達水平的細胞。文檔編號A23C9/12GK101379184SQ200780004609公開日2009年3月4日申請日期2007年2月6日優先權日2006年2月6日發明者彼得呂斯·雅各布斯·西奧多瑞斯·蒂克爾,約翰娜·亨瑞克娜·格迪娜·瑪麗亞·馬特瑟斯,羅埃爾弗·伯恩哈德·梅瑪,阿伯圖斯·阿拉德·范蒂克申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司