熱循環器和加樣口的制作方法

專利名稱：熱循環器和加樣口的制作方法
技術領域：
本發明涉及熱循環器，具體來說，涉及流體在多個溫度區域之間自動和連 續循環的熱循環器。
本發明的開發研制主要用于核酸放大的熱循環器，且下文中將參照該項應 用進行描述。然而，應該認識到，本發明不局限于該特殊的應用領域。
本發明還涉及連續流動系統，尤其是涉及將一定體積的液體試樣引入到連 續流動系統內的加樣口。然而，應該認識到，本發明不局限于該特殊的應用領 域。
背景技術：
在整個說明書中對現有技術的任何討論決不應認為上承認如此的現有技術 是廣泛公知的，或其構成本技術領域內公知技術的一部分。
需要多次或循環的化學反應來產生要求產物的系統，經常需要小心的溫度 控制、以及在一定溫度下維持反應的時間上需要可再現的和精確的控制。如此
的反應例如包括諸如聚合酶鏈鎖反應(PCR)和連接酶鏈鎖反應(LCR)之類 的核酸放大反應。
PCR是涉及多次循環的技術，其導致每完成一個循環就有某些多核苷酸序 列的幾何放大。PCR技術是眾所周知的，在許多書中有描述，包括M，J，麥 克弗森等人的PCR:實踐方法(PCR: A Practical Approach) ， IRL出版社(IRL Press) (1991)，英尼斯等人的PCR協議方法和應用指南(PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications)，學術出版社(Academic Press) (1990)， 以及H'A'艾力許的PCR技術DNA放大的原理及應用(PCRTechnology: Principals and Applications for DNA Amplification)，斯托克頓出版社(Stockton Press)(1989)。PCR還在許多美國專利中有描述，包括US 4,683,195;4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; 4,889,818; 5,075,216; 5,079，352; 5,104,792; 5,023,171;
45,091,310;以及5,066,584。
PCR技術通常包括使多核苷酸變性的步驟，其后將至少一對引物寡核苷酸 退火為變性多核苷酸的步驟，即，將引物雜交至變性多核苷酸模板。退火步驟 之后，具有聚合酶活性的酶催化包含引物寡核苷酸的新多核苷酸鏈的合成，并
使用原來的變性多核苷酸作為合成模板。這一系列步驟(變性、引物的退火和 引物延伸)構成一PCR循環。
當循環重復時，新合成的多核苷酸量幾何地增加，因為前個循環新合成的 多核苷酸可用作為其后循環中合成物的模板。通常成對地選擇引物寡核苷酸， 其可退火成給定的雙鏈多核苷酸序列的相對的鏈，這樣，兩個退火部位之間的 區域就得到放大。
DNA的變性通常發生在大約90至95°C，將引物退火為變性的DNA通常 在約40至60°C下進行，用聚合酶延伸退火引物的步驟通常在約70至75°C下 進行。因此，在PCR循環中，反應混合物的溫度必須變化，并在多循環PCR 試驗中多次地變化。
用于DNA放大和序列化的多個熱"循環"在現有技術中已有揭示，其中， 一個或多個溫度控制元件或"塊"保持反應混合物，其中，塊的溫度隨時間變 化。這些裝置存在這樣的缺點它們循環反應混合物很慢，且溫度控制不夠理 想。為了克服循環地提升和下降加熱塊的溫度之需要，已有人設計出在本技術 領域內稱之為熱循環器的裝置。在該裝置中，多個溫度控制塊保持在不同的要 求的溫度，使用一機器人在塊與塊之間移動反應混合物。典型的熱循環器系統 揭示在US 5,443,791; 5,656,493和6,656,724中。然而，將會認識到，這些系 統存在它們自身的一系列缺點。例如，如人們會理解的，它們具有相當有限的 產量，它們實體體積很大，易于損壞、昂貴且需要不斷的日常維護。
US 5,270,183的發明部分地解決了上述裝置所遇到的困難。實質上，該專 利發明涉及移動通過連續管的反應劑，通過將連續管盤繞在保持變化溫度的大 致鼓形體上，而使該連續管的溫度變化。為了防止試樣之間交叉污染，將反應 混合物注入到載體流體流中，載體流體分離個別的反應混合物并通過兩個或三 個單獨的加熱區域。載體流體和反應混合物是不相混的，這樣，載體流體的各
節段將每個試樣清晰地與前面的和后面的試樣分離開來。該結構允許順序地處
5理多個試樣。然而，該裝置具有諸多缺點，例如，由于加熱區域空間上分離， 所以，實時地監視反應過程不很方便。此外，令加熱區域彼此分離實體上趨于 笨重。
WO 03/016558中描述了對于US 5,270,183所揭示發明的一種進步，其中， 單個的鼓形體沿縱向劃分而提供至少兩個節段，它們能被加熱到不同的溫度， 以使鼓形體具有不同溫度的外圍表面。當反應劑移動通過盤繞在鼓形體周圍的 連續管時，反應劑承受變化的溫度。然而，如此熱循環器的問題在于，使用掃 描鼓形體外圍的線性跟蹤裝置難于足夠快地讀出數據。
對于連續流動系統和裝置來說，通常包括上述的熱循環器，它們通常在正 壓下操作，并需要泵將載體流體泵送通過諸如反應管那樣的連續管/導管。通常 地，這些泵是高壓或非常高壓的泵。因此，這些現有技術的連續流動裝置需要 專用的高壓注射口，用來將液體試樣輸送到正在高壓下被泵送通過管子的載體 流體流內。這些高壓注射口具有各種缺點。然而，主要缺點是它們具有試樣之 間交叉污染的傾向，例如，在加載過程中試樣的污染，這很大程度上是由于用 于注射試樣的隔膜-針結構，或沿管子行進時試樣之間的污染。
因此，仍然需要有改進的連續流動系統，包括如上所述的熱循環器裝置， 以及試樣的處理和輸送裝置。
本發明的目的是克服或改善上述現有技術的至少一個缺點，或提供一有用 的替代方案。

發明內容
本發明的某些優選實施例提供了這樣一種熱循環器，其能以循環的或漸進 的方式變化管內流體的溫度，或能保持流體處于恒定的溫度，與現有技術的裝 置相比，改進了對流體所要維持的溫度的控制，并提供改進的監視管內發生的 反應的裝置。本發明的其它實施例提供了用于連續流動系統，特別是試樣被抽 吸而不是在壓力下被泵送通過柱或管的連續流動系統的加樣口。
根據本發明第一方面，提供一種熱循環器，該熱循環器包括多個嵌套的用 于獨立地維持預定的溫度的熱交換器，由此，形成對應的多個溫度區域；所述 熱交換器適于接納反應管，以使所述反應管與所述熱交換器在熱傳遞上連通，由此，流過與所述熱交換器配合的反應管的流體循環地通過各溫度區域。
根據本發明的相關方面，提供包括一對嵌套的內和外熱交換器的熱循環器， 其中，每個熱交換器包括多個隧道并適于維持預定的溫度，由此形成多個溫度 區域；以及反應管，反應管與隧道配合以與溫度區域熱接觸，由此，反應管交 替地穿過每個熱交換器的相繼隧道，以使流過反應管的流體循環地通過各溫度 區域。
熱交換器最好同心地布置，但這種類型的布置對于熱循環器的設計或功能 并不是關鍵的。
較佳地，隧道平行于同心的熱交換器軸線延伸。在一優選的實施例中，隧 道在至少一面上敞開以提供表面槽，該表面槽將反應管基本上保持在熱交換器 的表面上。或者，隧道是局部封閉的表面槽，由此允許反應管"卡配-鎖定" 在其中。
外熱交換器可具有一環結構，該結構具有大致為圓形的橫截面，但該類型 的布置對于熱循環器的設計或功能也不是關鍵的。內熱交換器可以是管狀的或 實心棒或塊。熱交換器可選擇為螺旋形。
內熱交換器環可包括至少一個狹槽，以便用光學方法監視反應管。
在一實施例中，內熱交換器的端表面基本上與外熱交換器對應端表面齊平。 然而，在其它實施例中，內熱交換器的一個或兩個端表面可與外熱交換器對應 端表面軸向地間隔開。
可使用各種加熱和/或冷卻方法保持各個熱交換器的預定溫度。較佳地，加 熱和/或冷卻方法可選自電阻絲和珀耳帖裝置。對于核酸放大來說，預定溫度
可以是約95。C、約60。C或約72。C。當然，應該理解到，對于熱交換器的任何 特定區段，可以容易地選定和保持任何范圍的溫度。熱交換器最好保持在恒定 溫度下。然而，熱交換器可適于保持軸向變化的溫度分布，例如，溫度曲線可 從約55。C到約95。C。然而，應該認識到，根據特定的應用，可選擇任何的變 化溫度分布。
在本發明的一特定實施例中，每個熱交換器較佳地包括一組在其對應端表 面上彼此相對的反應管對齊構造物。該構造物可以是縱向凹陷徑向延伸的狹 槽，用于定位管子以使其安置成基本上與每個熱交換器的每個端表面齊平。構造物布置在外熱交換器的內周緣上和內熱交換器的外周緣上。
較佳地，每個熱交換器內的隧道徑向等距離且布置成間隔的陣列。任何數 量的隧道或槽可設置在每個熱交換器內/上，然而，隧道或槽的典型數量在約
15和75之間。較佳地，隧道數量是40至50。
較佳地，反應管基本上透明并用諸如Teflon (聚四氟乙烯)或Tefzel (乙烯 -四氟乙烯共聚物)或類似材料的惰性的彈性材料形成。較佳地，管的內表面 是疏水的。選擇的管子應與隧道保持緊配關系，以改善熱/熱量傳遞的連通特性， 由此將熱量從熱交換器傳遞到泵送通過反應管的流體。反應管相對于熱交換器 的布置應可實現一連續流動的結構。較佳地，反應管可以是被移去和更換的。
在本發明的另一實施例中，外和內熱交換器可以再分為多個離散的軸向間 隔開的熱交換器，每個熱交換器適于將溫度保持成與鄰近熱交換器溫度相同或 不同。使用該實施例，本發明可編程成執行2步、3步或4步反應，可根據給 定溫度下熱交換器的數量來變化每個溫度下的駐留時間。毗鄰的熱交換器塊可 用來在延長的時間內保持恒定的溫度。例如，四個熱交換器中的兩個可保持在 約70°C，以提供比變性或退火時間更長的反應。可供選擇地是，高溫和低溫 熱交換器的布置可重新安排，使熒光測量可在熱循環的不同時間點進行。更有 甚者，熱交換器可任何次數地劃分以提供任何數量的溫度區域，然而，應該認 識到，對于大多數PCR/LCR反應來說，4個溫度區域就足夠了。
熱循環器也可包括一個或多個包圍外熱交換器的另外的熱交換器以提供更 多的溫度區域。
較佳地，反應管包括一用來將流體引入到反應管內的入口以及一保持通過 反應管的流動的輸送裝置。在使用中，該輸送裝置在壓力下保持通過反應管的 流動。較佳地，該壓力在約70至700kPa之間。背壓通常施加在反應管的端部， 該背壓約為30至70kPa之間。在本發明的替代實施例中，通過熱循環器的液 體流動由施加到流動管出口的負壓來維持。這樣做的優點是，允許使用零接觸 和無污染方法在大氣壓下引入試樣(見下文)。
較佳地，流體包括需分析或反應的試樣、用于分析或反應的試劑以及載體 流體。在一實施例中，試樣用載體流體與后面的試樣分離，基本上防止各試樣 之間的污染，即，載體-試樣-載體的結構。然而，在一替代的實施例中，沖洗流體可散布在試樣之間，g卩，載體-沖洗-載體-試樣-載體-沖洗-載體的結構。較 佳的載體流體是硅油，或沒有生物污染的任何合成組合油。較佳地，沖洗流體 是純水。在熱循環器用于核酸放大的實施例中，載體流體應沒有諸如RNA或
DNA的核酸。較佳地，需要分析或反應的試樣是含有諸如DNA或RNA之類 核酸的試樣。試樣的其它組分通常包括寡核苷酸引物、脫氧腺苷三磷酸 (dATP)、三磷酸脫氧胞苷(dCTP)、三磷酸脫氧鳥苷(dGTP)、三磷酸脫 氧胸苷(dTTP)，以及熱穩定DNA聚合酶、它的酶活化部分、它的酶活化衍 生物以及逆轉錄酶中的至少一個。
較佳的是，通過選擇流量、熱交換器相對軸向長度和/或反應管的直徑，試 樣保持在預定溫度下的時間是可以預選擇的。在利用熱循環器用于核酸放大的 本發明的一實施例中，定時足以使以下反應發生
(a) 使DNA變性為其組分串；
(b) 將寡核苷酸引物退火到DNA中的補充序列；以及
(c) 合成新的DNA鏈； 較佳的是重復這些步驟，直到放大達到要求的水平。
熱循環器也可包括使試樣變性的預盤管，其中，試樣通常變性約2至10分 鐘之間。
較佳的是，也可將監視反應管內反應的標記試劑加入到反應流體和/或試樣。
標記試劑可從以下組群中合適地選擇熒光染料、插入染料、顯色底物，或與
熒光半體共價聯合的寡核苷酸探頭。
在其它實施例中，熱循環器可包括其它包圍外熱交換器的C形熱交換器， 以在放大產物上提供DNA熔化分析。C形熱交換器的周向間隙可以在約20至 100°之間，然而，C形熱交換器的周向間隙最好約為20。 。 C形熱交換器可 包括周向變化的溫度分布，其從約70。C變化到約95。C。然而，應該認識到， 根據特定的應用可選擇任何的溫度曲線。反應管可以布置在圍繞C形熱交換器 上或下端面的單個環路內，這樣，當試樣圍繞周界遷移時，試樣暴露于變化的 溫度。可供選擇地是，當試樣圍繞周界遷移時，探測試樣的熒光以可確定熔化 分布形式。然而，在替代實施例中，C形熱交換器包括保持反應管的槽，其中， 槽設置在熱交換器一側上。熔化探測研究通常在1至20分鐘之間進行，最好是2分鐘。
在另一實施例中，可在反應管圍繞在其周圍的C形熱交換器上實施放大產 物的后熔化，其中，C形熱交換器每端處的溫度維持在不同的溫度。如此熔化 裝置上的每匝管子因此處于離散的溫度，從而給出與在熱交換器上所具有的多 匝管子那樣多的熔化確定過程中的測量結果。管子還可圍繞C形熱交換器的內 周巻繞，這樣，用高速旋轉的掃描器時，根據掃描速度而不是圍繞熱交換器的 匝數來確定熔化分辨率。如果管長可以顯著地縮短(例如，IO倍以上)，則這 種方法還提供了快得多的熔化時間。
熱循環器還可包括用來監視發生在反應管內反應過程的掃描探測器。較佳 地，用熒光來測量反應過程。在一實施例中，掃描探測器包括轉動單元，其軸 向地安裝在熱循環器的熱交換器環上方(或下方)，以便直接地測量在內和外 熱交換器之間的周向間隙內的管子。該單元可包括至少一個探測通道，其具有 一入射光源和一探測器。例如，入射光源可以是帶有合適過濾鏡的汞弧燈，而
入射光源可以是LED或激光。較佳地，該轉動單元包括四個對應于藍、綠、
黃和紅入射光的探測通道。此外，該單元較佳地還包括至少一個"熔化"探測
通道，當安裝C形熱交換器時，該通道用來探測熔化分布。較佳地，轉動單元 轉速大于500rpm (每分鐘的轉數)。應該認識到，上述掃描探測器每個波長 只需一個激勵和一個探測器端口 。
在另一實施例中，掃描探測器可包括軸向轉動45。的鏡子，其中心地設置 在內熱交換器內，由此，探測通過狹槽的反應過程。在此實施例中，掃描探測 器引導入射光沿熱循環器軸線，當鏡子完成單圈轉動時，鏡子將入射光反射到 每"匝"的反應管，以在反應管通過轉動光束時使反應管可連續地得到掃描， 并探測每個反應。落射熒光可循著同樣的光路被引導返回，并通過分色鏡到達 探測器。熒光探測可與照明同步，或采用交替的照明和探測掃描而。
應該認識到，由于快速數據采集，所以，這些探測器能實時地探測發生在 反應管內的反應過程。
在其它實施例中，多個探測器安裝在熱交換器之間的周向間隙上方，其中， 對暴露的反應管數量配備同樣數量的探測器。或者，探測器測量成組的或成對 的反應管。任何類型的探測器都是合適的，包括照相機、光電二極管和光電倍增管。
根據本發明的第二方面，提供使用第一方面的熱循環器裝置來放大PCR或 LCR格式的核酸的方法。
根據本發明的第三方面，提供使用第一方面的熱循環器裝置來實施核酸熔 化探測化驗的方法。
根據本發明的第四方面，提供使用根據第一方面的裝置來準備的核酸。
應該認識到，本發明的裝置可以有利地應用于其它方法，例如，應用于分 析抗體-抗原結合反應的方法。
根據本發明的第五方面，提供一種用來將一定體積液體試樣引入到流過連 續流動管的流體載體流內的加樣口，連續流動管具有出口和引入所述載體流和 所述液體試樣兩者的公共入口，所述加樣口包括用所述流體載體連續地供應 所述入口的容器，所述容器適于在所述入口上方保持基本恒定水平的流體載體 并與所述連續流動管的所述入口可流體配合，這樣，在使用中，當所述容器基 本上處于大氣壓下時，且當所述流體載體選擇成使其特性足以維持引入其中液 體試樣的物理形狀時，所述流體載體流和所述液體試樣被抽吸通過所述連續流 動管。
較佳地，液體試樣是含水試樣，流體載體是疏水的液體。流體載體可以合 適地是諸如硅油那樣的油。根據權利要求3所述的加樣口，其中，疏水的液體 是油。
根據本發明的第六方面，提供一種連續流動的裝置，其包括根據第五方面 所述的加樣口。
較佳地，連續流動裝置是用于實施核酸放大反應的熱循環裝置。放大核酸
的較佳方法是PCR。
根據本發明的第七方面，提供一種用來將一定體積液體試樣引入到流過連 續流動管的流體載體流內的方法，連續流動管具有出口和引入所述載體流和所
述液體試樣兩者的公共入口，所述方法包括以下步驟提供根據第五方面的加 樣口；將所述連續流動管的所述入口流體配合到所述容器；將所述流體載體引 入到所述容器內和將所述液體試樣弓I入到所述流體載體內，所述流體載體選擇 成所述流體載體使其特性足以維持液體試樣的物理形狀，且當所述容器處于大致的大氣壓下時，所述流體載體流和所述液體試樣被抽吸通過所述連續流動管。
根據本發明的第八方面，提供一種用來將一定體積液體試樣引入到流過連續流動管的流體載體流內的方法，連續流動管具有出口和引入所述載體流和所述液體試樣的公共入口，所述方法包括以下步驟提供根據第五方面的加樣口；將所述連續流動管的所述入口流體配合到所述容器；將所述流體載體引入到所述容器內；將液體試樣分配器浸沒到裝在所述容器內的所述流體載體內；在所述入口附近分配所述液體試樣，并可選地用所述液體試樣分配器操縱所述分配的液體試樣，以將所述分配的液體試樣引入到所述入口內并抽吸通過所述連續流動管，所述流體載體選擇成使其特性足以維持液體試樣的物理形狀，且當所述容器基本上處于大氣壓下時，所述流體載體流和所述液體試樣被抽吸通過所述連續流動管。
除非文中另有明確要求，在整個說明書和權利要求書中，詞語"包括(動詞)"、"包括(現在分詞)"等應被認為是包含的含義，恰與排外的窮舉的含義相對；這就是說，是"包括但不局限于"的含義。
除了在操作的實例中，或另有所指明的，本文中所使用的表達成分含量或反應條件的所有數量應理解為在所有情況下可用術語"約"來修改。所有實例并不意圖限制本發明范圍。下文中，或另有所指的地方，"％"意指"重量％"，"比"意指"重量比"，"部分"意指"重量部分"。
定義
在本發明的描述和權利要求中，將按照如下闡述定義使用以下術語。還應理解到，本文中使用的術語只是為了描述本發明特定的實施例并不意圖限制。除非另有定義，本文中所使用的所有技術和科學的術語具有相同的含義，該含義是本發明所涉及技術領域內的普通技術人員共同一致理解的含義。
本文中使用的"穿過……"中的"穿過"是指與熱交換器配合的反應管。因此，例如，如圖3清楚地所示，反應管位于熱交換器隧道內或巻繞通過隧道。術語"穿過"還意指包括這樣的實施例，其中，反應管可逆地被捕獲地接納在設置在熱交換器表面上的表面槽內，即，"卡配鎖定"，或巻繞在熱交換器周圍。
12本發明文內所使用的術語"隧道"意指包括其中開口完全在熱交換器壁內，即完全被包圍住的結構，以及熱交換器表面內或表面上的半圓開口、通道和/或槽也是如此，由此，可熱傳遞連通地接納反應管。術語"隧道"和"槽"在這里用作為可互換。
本發明文內所使用的術語"嵌套"意指這樣的熱交換器結構，其中，至少一個熱交換器基本上包圍另一熱交換器，或基本上放置在另一個邊界內。例如，在優選實施例中(見圖l)，設置一對環，其中， 一個環的直徑小于另一個的直徑，以使小直徑的環可放置在較大直徑環的邊界之內。
指當一抽吸力施加到連續流動管出口上時被抽吸通過連續流動管的流體載體流所采用的術語"被抽吸(被動分詞)"和"抽吸(現在分詞)"是用來與以下概念相區別當泵送力施加到入口上時，將流體載體流的"推動"、"推進"或"泵送"通過連續流動管。通常使用諸如HPCL泵那樣的高壓泵來提供泵送力。相比之下，抽吸力通常利用抽吸/吸氣/真空泵來施加，可供選擇地，可結合一真空瓶型的結構。對于本發明來說，泵送力可認為是正向力，而抽吸力是負向力。此外，對于本發明來說，當載體流體被抽吸通過連續流動管時，容器被認為沒有施加顯著大于大氣壓的壓力。流體也可通過重力作用被"抽吸"通過連續流動管(當使用某種載體流體時)。
本文中使用的術語"大氣壓力"意指大致為101.325kPa (即，760mmHg)的大氣壓力，或其在不同海拔高度處的等價壓力。然而，技術人員將會認識到，該術語允許有一定程度的偏差，且認為該數值不看作是精確值。


現將參照附圖借助于實例來描述本發明的優選實施例，附圖中圖1是根據本發明熱循環器的俯視立體圖；圖2是圖1所示熱循環器的仰視立體圖3是圖1所示熱循環器的俯視圖，示出螺紋地與隧道嚙合的反應管的一部分；
圖4是所示安裝在PCR裝置內的熱循環器的立體圖5是類似于圖4的視圖，但包括安裝在熱交換器環上方的轉動掃描探測器；
圖6是類似于圖5的視圖，其中顯示掃描探測器轉過90。；圖7是顯示探測通道的類似于圖6的視圖；圖8是類似于圖7的視圖9是所示安裝在PCR裝置內的熱循環器的俯視立體圖，為了清楚起見，用疊影方式示出內部熱交換器；
圖10是圖9所示PCR裝置的側視圖11是類似于圖10的視圖，但為了清楚起見，已移去外熱交換器，而內熱交換器用疊影方式示出而顯示45°轉動鏡面和允許對反應管進行光學測量的狹縫；
圖12是顯示分色鏡和相關光學裝置的圖9的仰視立體圖；圖13是圖12所示分色鏡和相關光學裝置的立體圖；圖14是45。轉動鏡面裝置的立體圖15是由連續掃描通過反應管的試樣而組合起來的光柵圖像；
圖16是轉換為相對強度對管圈數的曲線的圖15所示的數據；以及
圖17示出用模板分析的試樣的DNA熔化曲線(這些曲線超過閾值)和不
用模板分析的試樣的DNA熔化曲線(這些曲線不超過閾值)；
圖18是根據本發明第五方面裝置的側視圖，顯示為將液體試樣引入到連續
流動管入口之前的情形；
圖19是類似于圖1的視圖，但示出引入到流體載體容器內的液體試樣；圖20是類似于圖2的視圖，但示出抽吸入連續流動管入口內的液體試樣；
以及
圖21是一替代裝置的側視圖。
具體實施例方式
首先參照圖1至3，熱循環器包括一對離散的、嵌套的分別為內和外直圓柱形熱交換器環1和2。每個環包括多個縱向通過其壁延伸的隧道3。隧道數量可以在大約15和70之間，然而，在典型結構中設置約40個隧道。每個熱交換器環1和2適于保持不同的預定溫度，由此，形成兩個溫度區域。使用加熱
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和/或冷卻裝置來保持溫度，所述裝置呈一個或多個電阻絲或珀耳帖裝置(未示出)的形式。沿熱交換器環1和2軸向長度的溫度分布保持在基本恒定值上。熱交換器的內環1和/或外環2也可分為一對離散的軸向間隔開的副環(未示出)。每個副環可適于保持不同的預定溫度，由此，形成第三和/或第四溫度區域。溫度區域可保持在任何溫度下，但對于使用PCR方法的核酸放大而言，
它們通常選自約95i:、約6(TC和約72t:。然而，在替代的實施例中，熱循
環器可包括一個或多個圍繞外熱交換器的另外的熱交換器，以提供另外的溫度區域。
反應管4以緊配合的關系螺紋嚙合于隧道3，由此，將熱量從熱交換器環l和2傳導到反應管內的流體。或者，反應管也可穿過每個環1和2的相繼的隧道，以使通過反應管4的的流體循環地通過各個溫度區域。
通常地，反應管4為透明的，并用諸如Teflon、 Tefzel或類似材料的惰性材料形成，反應管較佳地呈彈性，以使其能穿過隧道。此外，反應管4的內表面應疏水的以防止試樣、其內含物或其它可能的污染物粘附在上面。
每個環1和2在對應的端表面8和9上包括彼此相對的反應管對齊構造物7的陣列5和6。構造物7設置在外環2的內周緣10上和內環1的外周緣11上。構造物7較佳地是縱向凹陷徑向延伸的狹槽，用于定位管4以使其安置成基本上與每個環1和2的每個端表面8和9齊平。
反應管4還包括一將流體引入到管內的入口以及一保持恒定流通過管(未示出)的輸送裝置。該輸送裝置合適地呈一正排量泵的形式，該泵保持在約70至約700kPa之間的壓力下的通過反應管的100—200y L / min的流量。也可在反應管的端部處施加一背壓，并該背壓可保持在約30至約70KPa之間，然而，沒有背壓情況下系統也可很好地操作。如果施加背壓，則流體保持在壓力之下而避免或盡可能減小流體流的脫氣或蒸發。
引入到反應管內的流體包括一待分析或反應的試樣、在分析或反應中要使用的試劑以及載體流體。載體流體使要分析或反應的試樣與后面的試樣分離，并基本上防止試樣之間的污染。載體流體通常是硅油，但也可使用沒有諸如RNA (核糖核酸)或DNA (脫氧核糖核酸)那樣的生物污染的任何合成油。
核酸放大的典型試樣可包括DNA、寡核苷酸、脫氧腺苷三磷酸(dATP)、三磷酸脫氧胞苷(dCTP)、三磷酸脫氧鳥苷(dGTP)、三磷酸脫氧胸苷(dTTP)，以及 熱穩定DNA聚合酶、它的酶活化部分、它的酶活化衍生物以及逆轉錄酶中的 至少一個。
正如以后將會認識到的，流量、熱交換器環1和2的相對軸向長度和/或 反應管4的直徑可控制試樣保持在預定溫度下的時間。在典型的核酸放大反應 中，該時間足以使以下反應發生
(a) 使DNA變性為其組分鏈；
(b) 將寡核苷酸引物退火到DNA的補充序列中；以及
(c) 合成新的DNA鏈。
當試樣被逐步地泵送通過各個溫度區域時，重復這三個步驟，直到達到理 想的放大程度為止。放大步驟的數量正比于設置在熱循環器內的隧道數量，艮P， 試樣通過指定溫度區域的次數。
也可將監視反應管內化學反應的標記試劑添加到試樣中。該標記試劑通常 是熒光染料，但可以是插入染料、顯色底物，或與熒光半體共價聯合的寡核苷 酸探頭。
在另一些實施例中，熱循環器包括一包圍外熱交換器2的C形熱交換器(未 示出)，用來在放大產品上提供后熔化。C形熱交換器的周向間隙通常約為 20°而熱交換器包括介于約7(TC至約95'C之間的周向變化的溫度分布。在特 別優選的實施例中，管4圍繞C形熱交換器的外周設置，以在試樣圍繞周界泵 送時，試樣可經受熔化分布形式。然而，在最佳的實施例中，反應管4保持在 一設置在C形熱交換器面上的槽內。
在替代的實施例中，熱循環器可包括一掃描探測器，其用來探測標記反應 劑，并因此監視發生在反應管4內的反應過程。在一實施例中，如圖5至8中 清楚地所示，掃描探測器包括一安裝在環1和2上方(或下方)的可轉動單元12， 用來在熱交換器、或構造物7、或設置在C形熱交換器面上的槽之間，直接掃 描周向間隙13內的管4。例如， 一入射光線和探測系統可安裝在定位在熱交換 器環1和2上方的轉動單元的邊緣上。可安裝四個探測通道(LED / 二極管或激 光/二極管組合)，從而多達四個熒光團可在一個試樣內多路傳輸，且所有四 個通道可同時地獲得數據。諸如IR二極管那樣的沿著轉動軸線的光耦合裝置可將數據流從探測器饋送到主數據處理單元，或數據可饋送到探測器內。然而， 任何無線的數據傳輸裝置都是合適的。從安裝在轉動單元12上的"熔化"通 道20中收集熔化數據。
掃描探測器理想地由安裝在轉動探測器頭內的小發電機供電。或者，可采 用旋轉刷。然而，可采用任何對探測器供電的裝置，例如，步進電動機21。
在其它結構中，內熱交換器環包括一環形狹槽14，以便用光學方法監視反 應管。如圖10清晰地所示，分色鏡15軸向地安裝在PCR裝置一側， 一軸向 轉動45°的鏡16設置在內環內，由此，探測通過環形狹槽14的反應管內反應 過程。掃描探測器引導入射光線沿著熱循環器的軸線，當鏡16完成一圈轉動 時，光線反射在每一圈的管子上。管子可被連續地掃描，且在管通過轉動光束 時探測每一反應。落射熒光沿同一光路返回，并通過分色鏡16到一探測器(未 示出)。借助于電機17使鏡快速轉動可使管連續地得到掃描，且在管通過轉動 光束時使每一反應得到探測。使用交替的照明和探測掃描，熒光探測可以與照 明同步或延遲。
在還有其它的實施例中，掃描探測器的每次掃描將光強度數據送到一數據 處理計算機中，用于試樣的識別。每次掃描中的字節數相同，以使數據可被儲 存在緩沖器內，當添加上每一新的掃描時，將數據轉換為新的數據。這可形成 管熒光的動態圖像，伸展開到一線性平面上。然后， 一獨立的計算機程序用邊 緣探測圖像分析技術來探測試樣。試樣"小塊"或團塊內的數據點被進行平均， 并在該循環數下對該"小塊"產生一熒光水平。熒光水平和循環數然后被用來 產生標準的Rotor^gene REX文件數據格式，以便用Rototgene軟件進行分 析，然而，任何合適的數據格式都是可接受的。
現轉到加樣口組件和其與連續流動系統的使用，正如將會認識到的，根據 本發明的加樣口允許將液體試樣引入到一連續的流動柱內，無需現有技術的高 壓注射口或專用的注射裝置。與現有技術的高壓注射口相比，該加樣口相對較 便宜，其沒有移動零件和沒有磨損部件(諸如隔片)。此外，根據本發明的加樣 口允許試樣在大氣壓下用標準空氣移動的吸液管末端進行加載，由于末端與針 筒注射器裝置相比相對便宜，所以，末端可容易地進行批量消毒，并且每個末 端用后即可丟棄，由此，消除了試樣的交叉污染。相比之下，現有技術的針筒注射裝置必須在試樣注射之間進行清洗/消毒。更有甚者，"發射(touch Off)" 的加載技術是"零接觸"的，這意味著加載加樣口內不存在污染。還有，根據 本發明的加樣口特別適用于自動化試樣加載，事實上，用市場上出售的任何機 器人系統就可實現。
較佳地，通過對管出口施加一抽吸力，流體載體被"抽吸"(與通過高壓 下泵送的"推動"相對)通過連續流動管。與現有技術裝置相比，由于現不需 要高壓泵，更為重要的是，不需高壓注射口，所以，抽吸流體載體流通過連續 流動管帶來了成本收益。然而，在一替代的實施例中，選擇流體載體使其在重 力作用下被抽吸通過連續流動管。
施加到連續流動管出口的抽吸力可以相當容易地提供，例如，將連續流動
管出口配合到一簡單的真空泵結構中。例如，將約10至100kPa的真空負壓施 加到內直徑為lmm的15米長的連續流動管，可提供約50至500u L / min之 間的流量。然而，應該認識到，流量正比于管內直徑和/或油的等級和/或施 加到管出口的真空量。管甚至可以是重力饋送，通過合適地選擇油等級和管內 直徑就可實現這一點。本技術領域內的技術人員將會認識到，根據特定的應用， 可以提供其它的真空和流量。較佳地，應控制真空以保持通過連續流動管的均 勻流量。
較佳地，容器敞開于大氣壓或保持在大氣壓下，由此，提供一 "零壓加載 加樣口"。較佳的容器包括一中心成錐度的底部，其適于捕獲地接納連續流動 管。然而，在一替代的實施例中，容器可以與一段導管預先配裝，以使預配裝 段導管的出口可以與預先存在的連續流動管的入口流體配合。為了確保沒有空
氣夾帶在連續流動管內，容器應構造成當容器完全充滿流體載體時，管的入 口浸沒在裝在容器內的流體載體的體積之內。管入口最好基本上是垂直地構 造，以便從上面接納液體試樣。較佳地，連續流動管的一部分插入到容器內， 從而當容器充滿流體載體時，使連續流動管入口設置大約在裝在容器內的流體 載體的體積高度的中心處。 一合適的泵(諸如蠕動泵)向容器供流體載體， 一光 學傳感器通過控制添加到容器內流體載體的流量來保持預定的流體液位。或 者，可提供一堰型的結構來保持流體液位。然而，只要容器在基本上大氣壓下 充分地保持有流體載體，本技術領域內的技術人員將會明白其它的結構。
18首先將諸如吸液管末端之類的試樣分配器的末端定位在剛好連續流動管入 口上方，然后緩慢地分配液體試樣，由此可將液體試樣引入到連續流動管內。
較佳地，液體試樣約為20PL。然而，液體試樣可以少至1pL或多至50uL。
由于表面張力的作用，分配到疏水油載體中的含水液試樣基本上呈球形。可供 選擇地是，吸液管的末端保持與液體試樣球的接觸，以幫助操縱該球到連續流 動管入口，并防止它"落掉"到容器壁。由于流體載體流動到連續流動管入口 內，所以，液體試樣球就可"發射"到入口中，并且，它從那里通過施加到出 口的抽吸力被抽吸到連續流動管內。可以認識到，多個液體試樣可以規定的時 間間隔引入到連續流動管內。液體試樣可以相同或不同的試樣。較佳地，盡管 不是必要的，但可將插入的"沖洗"流體添加到試樣之間。為作解釋， 一較佳
的試樣加載包括以下順序沖洗一試樣一沖洗一試樣一沖洗等。當然，每一沖 洗/試樣流體被載體流體所分離。該順序減少了試樣的交叉污染，這是因為可 能被移走的試樣任何部分被沖洗流體而不是被前一試樣所"捕獲"。沖洗流體 較佳地是水。
本發明的加樣口特別適用于高產量的自動化系統。在本發明的一實施例中， 借助于機器人試樣操作系統，可用多個序列的試樣(如需要的話，以及沖洗流 體劑量)對加樣口進行裝載。在高產量應用的加樣口的其它實施例中，可提供 多個連續流動管。連續流動管的入口較佳地間隔成容器內的一個陣列。該實施 例也有助于藉助其機器人系統可將多個液體試樣引入到多個連續流動管入口 內的機器人試樣操作。或者，連續流動管的陣列可以并聯結構在下游合并成單 個連續流動管，由此，形成一"并聯"的總管。在該實施例中，液體試樣順序 地從總管一端加載到另一端，由此，當液體試樣被抽吸入并通過連續流動管時， 使液體試樣能均勻地間隔開。然而，在其它實施例中，連續流動管開口的陣列 可在下游串聯地合并到單個連續流動管內，由此，形成一"串聯"的總管。有
利地是，在此實施例中，液體試樣可同時地加載。
在另一替代方面，提供一用于高壓連續流動系統的低壓試樣加樣口。在該 方面，提供一對間隔開的管，它們容納在一對間隔開的轉動板之間以形成一轉 動臺。在一個位置，兩個管之一敞開到大氣中，而另一個管與高壓連續流動管 對齊。通向大氣的那根管含有流體載體并可接納液體試樣。 一旦加載液體試樣
19轉該動臺就轉動，使通向大氣的管子切換到"對齊"，使另一管可接納其后液 體試樣。然后重復該過程。應該認識到，該加樣口結構提供用一次性可丟棄的 末端來引入試樣，而無需針筒的注射器裝置，因為沒有可刺穿的隔膜，因此減 少試樣交叉污染的可能性。
應該認識到，根據本發明的加樣口將適用于許多類型的連續流動裝置。當 然，需要將抽吸力施加到連續流動管的出口以抽吸流體/液體通過其中，而不 是通過高壓泵送方法來"推動"流體流。然而，由于真空泵是相對常用且便宜 的實驗室裝置，它相當容易地適于對連續流動管的出口提供抽吸力，所以，本 申請人:相信，用本發明裝置來修改現有的連續流動系統所涉及的成本將是相對 小的。
在一實施例中，本發明適用于任何用抽吸力進行操作的連續流動裝置。例
如，本發明可適用于PCT公報第WO 03 / 016558號中所描述的連續流動裝置。 根據W0 03 / 016558，被多個液體試樣間斷的流體載體流在壓力下被泵送通過 盤繞在圓柱形熱交換器周圍的連續流動管，所述熱交換器具有多個不同溫度區 域。選擇溫度區域來提供以下操作將核酸變性到其組分鏈內；將寡核苷酸引 物退火到核酸內的補充序列；以及合成新的核酸鏈。流過連續流動管液體試樣 以循環的方式經受這些變化的溫度，直到達到要求水平的放大(放大成比例于 連續流動管圍繞熱交換器盤繞的次數)。上述的和類似的現有技術裝置必須要 求使用高壓泵來強制流體載體流通過連續流動管，以及必須要求使用高壓注射 口將液體試樣引入到流體載體流內。該設備相對復雜、昂貴，需要定期維護和 熟練的操作者。與之不同，通過使用本文所述的新穎加樣口，且通過抽吸而不 是推動/推進/泵送流體載體流通過連續流動管，本發明有利地避免使用如此 的高壓設備。
當使用連續流動系統進行PCR時，所使用的流體載體最好沒有生物污染物， 例如，RNA或DNA那樣外來的核酸，并將流體載體選擇成基本上防止流過連 續流動管的液體試樣之問的污染。然而，在本發明中，也較佳的是選擇流體載 體以保持液體試樣的物理特性。本申請人業已發現，硅油特別適用于本發明。 理想地是，流體載體是粘度在約5至50厘沲之間的硅油。然而，應該認識到， 油粘度不局限于此范圍。如果不希望受理論的局限，那么，可以認為合適的硅油主要是取決于相對均勻的鏈長度。因此，合適粘度和具有這些鏈長度特征的 任何油都可用作為流體載體。本申請人還已經發現較佳的硅油是對液體試樣提
供中性浮力的硅油，艮卩，密度在約0.95至O.99g/cc之間的硅油。然而，應該
認識到，油密度不局限于此范圍。
較佳地，液體試樣是用于PCR試驗的組分的混合物。例如，液體試樣包括
待分析或反應的試樣和用于分析或反應的試劑。較佳地，待分析或反應的試樣
是包含諸如DNA或RNA之類核酸的試樣。試樣的其它組分通常包括寡核苷酸 引物、脫氧腺苷三磷酸(dATP)、三磷酸脫氧胞苷(dCTP)、三磷酸脫氧鳥苷 (dGTP)、三磷酸脫氧胸苷(dTTP)，以及熱穩定DNA聚合酶、它的酶活化部分、 它的酶活化衍生物以及逆轉錄酶中的至少一個。
連續流動管較佳地基本上為透明、彈性的，并由具有疏水內表面的惰性材 料形成。例如，由Teflon或Tefzel或類似材料形成的連續流動管是首選的。然 而，連續流動管可由使流體在抽吸力下能被抽吸穿過其的任何合適材料形成。 較佳地，管的內直徑在約1至1.6mm之間。
應該認識到，盡管本發明的加樣口特別適用于連續流動的PCR裝置，但是 本發明的裝置和方法不局限于該領域。例如，本發明適用于蛋白質分離系統和 等溫反應，其中，在每個循環中測量試樣熒光。然而，本發明特別適用于機器 人方法，以減少試樣加載到連續流動系統內的污染。
現將參照說明加樣口及其在連續流動系統中的使用的附圖，在所有附圖中， 相同的標號表示相同的零件。首先參照圖18，本發明提供呈加樣口 1形式的裝 置和將一定體積液體試樣2引入到流入和流過連續流動管4的流體載體3內的 方法。連續流動管4較佳地由Teflon形成，并包括一出口(未示出)和一引入流 體載體3流和液體試樣2的公共入口 5。加樣口 1包括一容器6，其用流體載 體3連續地供應到入口5。由于容器6較佳地構造成通向大氣，所以，借助于 重力或在對出口施加足夠的抽吸力時，可抽吸流體載體3流通過連續流動管4。
如上所討論，本發明特別適用于使用PCR來放大核酸的連續流動裝置，還 特別適用于采用機器人系統的自動化高產量的試樣處理。通常地，在這些裝置 中，將多個液體試樣2引入到連續流動管4內，其中，每個液體試樣2被一定 體積的流體載體3分離，以防止液體試樣2之間的污染。在現有技術的裝置中，該液體試樣2流和流體載體3被泵送通過連續流動管4，且連續流動管4暴露 于至少一個由合適熱交換器7提供的溫度區域。然而，在本發明的該方面，液 體試樣2流和流體載體3可通過對連續流動管的出口施加抽吸力而被抽吸通過 連續流動管4，例如，通過一真空瓶型的裝置8施加抽吸力。液體試樣2可以 是用于PCR試驗的液體的混合物，而流體載體3是諸如油那樣的疏水流體， 它最好是沒有外來生物污染物，例如，諸如RNA或DNA之類的核酸。
再參照圖18，容器6較佳地包括一中心錐形的底部9。連續流動管入口 5 浸沒在容器6中裝的流體載體3的體積內，并垂直地構造成從上方接納液體試 樣2。設置一堰10來維持流體載體3的液位。容器6的表面11通向大氣壓， 諸如蠕動泵那樣的一泵(未示出)通過入口 12對容器6提供流體載體3。井14 內的流體載體3的溢流13返回到泵以作再循環。
現參照圖18至20，本發明的方法包括首先將連續流動管4配合到含有流體 載體3的容器6，以及將抽吸力施加到出口上，以使流體載體3均勻地被抽吸 通過連續流動管4。然后，通過將吸液管16的末端15定位在連續流動管入口 5上方，并分配約10uL的液體試樣2，將液體試樣2引入到連續流動管4內。 分配到硅油3內的含水液體試樣2基本上呈球形。較佳地，吸液管16的末端 15保持與液體試樣2球接觸，以幫助操縱球到連續流動管入口 5，并防止它"落 掉"到容器6的壁。由于有流體載體3流動進入連續流動管入口5內，所以， 液體試樣2的球可被"射發"到入口 5內(見圖20)，通過施加在出口的抽吸力， 液體試樣可從入口 5被抽吸到連續流動管4內。
如上所討論，盡管流體載體3防止流過連續流動管4的液體試樣2之間的 污染，但本申請人已確定，也應選擇流體載體3來保持液體試樣2的物理特性。 為了作解釋，流體載體3最好是硅油，且該硅油具有約5至50厘沲之間的粘 度以及約0.98g/cc的密度，由此，對液體試樣2提供中性的浮力。本申請人 業已發現，如果使用不合適的油，則液體試樣2的球趨于"落掉"到容器6的 壁并變為粘附/駐留在壁上。此外，如果球下降得太快，則它可在連續流動管 入口 5附近被"捕獲"且不被完全地抽吸入到連續流動管4內。
現參照圖21，在一替代的加樣口結構中設置一對試樣管17、 18。試樣管17、 18被容納在一對間隔開的平行板19之間以形成一轉動臺20。試樣管17之一連續地從泵補充流體載體3，而另一試樣管17自由地接受大氣壓下的液體試樣
2。 一旦液體試樣2加載到試樣管18內，管18就可通過轉動可轉動臺20而切 換到"對齊"，由此將液體試樣2引入到連續流動管4內。因此被試樣管18 "代替"的試樣管17(剛被切換到"對齊")可接納其后的液體試樣2。
在高產量應用中的一替代結構中，可提供多個連續流動管4來同時地進行 多個核酸放大。連續流動管入口5較佳的是間隔成容器6內的一陣列內。該實 施例有助于機器人試樣操作，由此， 一機器人系統可將多個液體試樣2引入到 多個連續流動管入口 5內。或者，連續流動管陣列可在下游以并聯結構合并到 單個連續流動管4內，由此，形成一"并聯"總管。在該實施例中，液體試樣 2從總管的一端順序地加載到另一端，由此，當液體試樣2被抽吸入和流過連 續流動管4時，使液體試樣2均勻地間隔開。在其它實施例中，連續流動管開 口 5的陣列可在下游串聯地合并到單個連續流動管4內，由此，形成一"串聯" 總管。如將會認識到的，在此實施例中，液體試樣2可同時地加載。
根據本發明的加樣口容易地適于許多類型的連續流動裝置。除了加樣口本 身，這些現有裝置的唯一實質變化是，對連續流動管出口提供抽吸力(如果重 力饋送不足夠的話)以抽吸流體通過，而不是通過高壓泵來"推動"液體流通 過。抽吸力(需要的話)可用標準真空泵等提供。
現將參照以下實例來描述本發明，這些實例應在所有方面看作是說明性的 并無限制意義。
實例
實例l:試樣注射(正向加壓系統)
本發明的一重要方面是沒有污染的試樣注射，S卩，當試樣通過裝置時完全 分離試樣，在油的流動中不打碎含水試樣的能力，且一個試樣的熒光不會污染 下一個試樣。在實踐中，重要的是，清洗不銹鋼注射器的內部和外部，然后， 注射試樣，其后實施另一清洗步驟。例如，具有300mm長度的不銹鋼針安裝 在一 CAS機器人頭部上，并用來收集和加載試樣。較佳地，針的內部容積大 于試樣體積，以最大程度地減小污染。在這些實施例中，針的內部容積近似為 8|aL，于是，多達5pL的試樣可安全地進行加載，而不會有試樣被抽出針的后 部外而進入注射器筒內。加載的注射器系統用米利Q (milliQ)水進行清洗，而試樣如下地加載到針內 1 ) 加載2pL油
2) 加載5iaL試樣
3) 用"水起泡器"清洗針的外面
4) 加載2pL油
從靜止管中加載油，然而，在替代的實施例中，可使用一 "油起泡器"， 從而不再需要用"水起泡器"清洗針外面。
5) 將8pL加載到系統的加樣口內
6) 從加樣口移去針
7) 用100pL水清洗針以清洗針的內部和外部
8) 等待15-30秒
9) 將20|aL的MilliQ水注入到加樣口內
10) 等待15-30秒
11) 重復l)
實例2:實時監視反應管
參照圖15，該圖提供連續掃描通過反應管的試樣而組合起來的光柵圖像水平線代表每個掃描，在水平線中熒光用遞增的灰度表示。圖上的數字表示三 個移動通過管子的試樣。試樣中熒光顯影之后，只有最后幾匝管子顯示在該圖 像中。
圖15所示數據可變換為圖16，圖中繪出試樣對于管子匝數的相對強度。圖 16中所示數據允許對通過流動裝置的試樣中的熒光變化作動態分析。在該特定 實例中，試樣C2、 C4和C6含有用于所用的特定擴增子的DNA模板，而替代 的試樣C1、 C3、 C5和C7不含有模板。
實例3: DNA熔化-探測研究
參照圖17，該圖顯示用模板(這些曲線超過閾值)和沒用模板(這些曲線 不超過閾值)所作分析的試樣的DNA熔化曲線。產物熔化的溫度可用作為己 經形成基本上正確產物的確認。
實例4:大氣壓加樣口 ("零污染"試樣注射)
使用本發明的加樣口能獲得一種無污染試樣施加的改進方法，以及能使用可容易地進行消毒的標準吸液管末端來注射試樣，且按照要求，每個末端在試 樣施加之后就可丟棄。
根據本發明的加樣口流體地配合ETFE (乙烯四氟乙烯)(Tefzel)連續流 動管，該連續流動管具有l.Omm內直徑，1.6mm外直徑和約15m長度。拖拉 硅油具有與水相似的密度和5厘沲的粘度。當注射口比連續流動管的出口高約 50cm時，該油足以在重力作用下流過管子，且油以100)uL/min的流量流動。 當拖拉密度與水相似且粘度為50厘沲的硅油時，需要對管出口施加20kPa的 真空以獲得200pL/min的流量。
市購的PCR緩沖液和TAQ供應時包括表面活性劑。該表面活性劑致使DNA 在流動過程中從水態遷移到油態。運行正向和負向PCR控制在正向之后約20 次循環中在負向試樣產生污染(即百萬分之一)。因為通常達到十億分之一水 平的放大的PCR應用來說，該污染水平是不可接受的。
在另外一組試驗中，每個試樣在用milliQ水進行清洗后加載如下
1) 加載5pL水
2) 加載5iaL試樣
3) 重復l)
通過在每個PCR反應試樣(即，"沖洗"流體)之間注入純水試樣，在循 環3下放大的正試樣和運行到43次循環的負試樣之間沒有觀察有污染。注入 的試樣是1120-正-1120-負-1120-正……等。因此，每個試樣之間的注水提供了大 于十億分之一的污染水平。
盡管參照特定的實例描述了本發明，但本技術領域內的技術人員將會認識 到本發明可實施為許多其它的形式。
權利要求
1.一種熱循環器，該熱循環器包括多個嵌套的用于獨立地維持預定的溫度的熱交換器，由此，形成對應的多個溫度區域；所述熱交換器適于接納反應管，以使所述反應管與所述熱交換器在熱傳遞上連通，由此，流過與所述熱交換器配合的反應管的流體循環地通過各所述溫度區域。
2. —種使用如權利要求1所述的熱循環器裝置來放大PCR或LCR格式的 核酸的方法。
3. —種使用如權利要求1所述的熱循環器裝置來實施核酸熔化探測化驗 方法。
4. 一種使用如權利要求1所述的裝置制備的核酸。
5. —種用來將一定體積的液體試樣引入到流過連續流動管的流體載體流 內的加樣口，所述連續流動管具有出口和引入所述載體流和所述液體試樣兩者的公共入口，所述加樣口包括用所述流體載體連續地供應所述入口的容器，所述容器適于在所述入口上方保持基本恒定的流體載體液位，并與所述連續流 動管的所述入口可流體配合，從而，在使用中，當所述容器基本上處于大氣壓 下時，且當所述流體載體選擇成使其特性足以維持引入到所述載體內的液體試 樣的物理形狀時，所述流體載體流和所述液體試樣被抽吸通過所述連續流動 管。
6. 如權利要求5所述的加樣口，其特征在于，所述液體試樣是含水試樣。
7. 如權利要求5或6所述的加樣口，其特征在于，所述載體流體是疏水液體。
8. 如權利要求7所述的加樣口，其特征在于，所述疏水液體是油。
9. 如權利要求8所述的加樣口，其特征在于，所述油是硅油或硅基油。
10. —種用來將一定體積的液體試樣引入到流過連續流動管的流體載體流 內的方法，所述連續流動管具有出口和引入所述載體流和所述液體試樣兩者的 公共入口，所述方法包括以下步驟提供如權利要求5所述加樣口；將所述連 續流動管的所述入口流體配合到所述容器；將所述流體載體引入到所述容器內 和將所述液體試樣引入到所述流體載體內，所述流體載體選擇成所述流體載體的特性足以維持所述液體試樣的物理形狀，且當所述容器基本上處于大氣壓 下時，所述流體載體流和所述液體試樣被抽吸通過所述連續流動管。
11. 一種用來將一定體積的液體試樣引入到流過連續流動管的流體載體流 內的方法，所述連續流動管具有出口和引入所述載體流和所述液體試樣兩者的 公共入口，所述方法包括以下步驟提供如權利要求5所述加樣口；將所述連 續流動管的所述入口流體配合到所述容器；將所述流體載體引入到所述容器 內；將液體試樣分配器浸沒到裝在所述容器內的所述流體載體內；在所述入口 附近分配所述液體試樣，并可選地用所述液體試樣分配器操縱所述分配的液體 試樣，以使所述分配的液體試樣引入到所述入口內并抽吸通過所述連續流動 管，所述流體載體選擇成使其特性足以維持所述液體試樣的物理形狀，且當 所述容器基本上處于大氣壓下時，所述流體載體流和所述液體試樣被抽吸通過 所述連續流動管。
12. —種連續流動裝置，該裝置包括如權利要求5所述的加樣口。
13. 如權利要求12所述的連續流動裝置，其特征在于，它是執行核酸放大 反應的熱循環裝置。
14. 一種放大PCR或LCR格式的核酸的方法，該方法使用如權利要求13 所述的連續流動裝置。
15. 如權利要求1所述的熱循環器，其特征在于，還包括用來監視發生在所 述反應管內的反應的過程的掃描探測器。
16. 如權利要求15所述的熱循環器，其特征在于，用熒光來測量所述反應。
17. 如權利要求15或16所述的熱循環器，其特征在于，所述掃描探測器包 括轉動單元，該轉動單元軸向地安裝在內熱交換器環上方或下方或其內，以便直接地測量發生在所述反應管內的所述反應。
18. 如權利要求17所述的熱循環器，其特征在于，在所述內和外熱交換器 之間的間隙內和/或通過觀察狹槽直接測量所述反應管。
19. 如權利要求15或16所述的熱循環器，其特征在于，多個探測器安裝在 所述嵌套的熱交換器之間的間隙上方，以監視發生在所述反應管內的反應的過 程，其中，為一定數量的暴露的反應管提供相等數量的探測器。
全文摘要
一種用來將一定體積液體試樣引入到流過連續流動管的流體載體流內的加樣口，該連續流動管具有出口和引入所述載體流和所述液體試樣兩者的公共入口，所述加樣口包括用所述流體載體連續地供應所述入口的容器，調整所述容器以在所述入口上方保持基本恒定的流體載體液位，并與所述連續流動管的所述入口可流體配合，從而，在使用中，當所述容器基本上處于大氣壓下時，且當所述流體載體選擇成使其特性足以維持引入到所述載體內的液體試樣的物理形狀時，所述流體載體流和所述液體試樣被抽吸通過所述連續流動管。
文檔編號C12Q1/68GK101517417SQ200780004499
公開日2009年8月26日 申請日期2007年2月2日 優先權日2006年2月2日
發明者J·庫洛貝特, K·斯坦利 申請人:考貝特生命科學控股有限公司