專利名稱：微生物藥敏培養和檢驗裝置的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種對微生物藥敏的培養和醫學檢驗的專用裝置，尤其是分枝桿菌 快速培養藥敏及鑒定微量連續檢測裝置。
技術背景微生物的藥敏培養和醫學檢驗的專用裝置，尤其是分枝桿菌快速培養藥敏及鑒定微 量連續檢測裝置。典型的如分枝桿菌快速培養藥敏及鑒定微量連續檢測:第四次全國結核病流行病學抽樣調査，對59個點進行全人口感染率調査結果實驗人口為365， 097人,活動性肺結 核患病率367/10萬、菌陽肺結核患病率為160/10萬，全國的結核病疫情仍很嚴重。在 衛生部公布的27種重點傳染病中，結核的發病數居第二位，均排在SARS之前。結核病的實驗室檢査是結核病的臨床診斷和流行病調査的主要手段，其中細菌學檢 査是結核病診斷的金標準。當前結核病治療仍然以抗結核藥物化學療法為主，但是目前 對一種或多種抗結核藥物同時耐藥的菌株(多耐藥菌)明顯增多，還有一些依賴菌(即 對某藥有依賴性，該藥存在時甚至生長更好)，因此及早檢出哪些藥物是敏感，哪些耐 藥以指導治療十常重要。結核的病原體是抗酸分枝桿菌。大多數分枝桿菌，特別是遲緩生長分枝桿菌菌群， 例如結核分枝桿菌，牛型分枝桿菌等，生長十分緩慢。目前分枝桿菌培養藥敏試驗仍多 采用傳統方法(以下簡稱《規程》法)，即絕對濃度法和比例法(全國臨床檢驗操作規 程第三版2006 916 917)。在傳統改良羅(L-J)氏固體培養基上，要經4 8周培 養才能生長出菌落，再經4周才能獲得藥敏結果，不能滿足臨床化療的需要。因此抗酸 桿菌培養藥敏檢查的發展，主要集中于快速試驗的研究。近年來國內外學者都努力尋找快速的培養和藥物敏感試驗方法。BACTEC 460tb快速分支桿菌自動檢測裝置，可將傳統培養時間提早10天以上，藥敏時間平均7天(林 健雄，鄭崇輝BACTEC460-TB自動快速檢測結核菌的臨床應用及評價國際醫藥衛生 導報2001V N9 94)，但此法由于使用"C同位素棕櫚酸作基質，放射性物質造成環境 污染，在使用多年后，現在已被許多發達國家和我國禁用。近20年來國內外著重對非放射性方法進行了研究，發表了許多這方面方法文章(1) 生物發光法ATP是細菌能量代謝的指標，生物半衰期短，當細菌生長抑 制或死亡后，胞內ATP含量即明顯下降，因而可作為活菌的標志。結核分支桿菌培養一 段時間后，抽提菌內ATP，然后加入生物發光試劑，通過光度計進行定量檢測。可在5-7 天內獲得結果，但同時存在無法區分致病菌和非致病菌，ATP抽提煩瑣等缺點。(2) 噬菌體生物發光檢測方法采用生物發光技術檢測可表達熒光素酶的分枝 桿菌噬菌體phage 40，對不同細菌的發光反應和藥敏試驗進行測定。在含抗結核藥物的 培養基中，耐藥結核菌的發光強度比非耐藥結核菌強,其強度差異有顯著性意義。Phage40的藥敏試驗結果與常規羅氏培養基法符合率一致，可在72h內得到結果。(呂斌，徐 順清，陳志飛用重組噬菌體檢測結核分枝桿菌耐藥性中華檢驗醫學雜志 2000V23N3 144-147)綜上所述，各種新的方法均比傳統的方法快速，但也存在許多不足之處，因此還。 不管那一種方法，只有朝著快速、準確、靈敏、防污、特異和經濟的方向發展和完善， 才有望取代傳統的方法在臨床推廣應用。目前在國內臨床使用較多的快速培養方法和檢測裝置有以下幾種 (1 ) Becton Dickinson公司BACTEC MGIT960儀在國內外已經應用， BACTEC-TB960利用對氧敏感的熒光釕復合物作為熒光探頭，檢測培養基中氧的含量。 當細菌生長良好時，培養基中氧含量下降，即可激發熒光，熒光增強表示細菌生長或耐 藥(王巍，李洪敏，王安生BAC TEC—M GIT960快速培養藥敏對肺結核診治的應用和 評價中國防癆雜志 2003年12月第25巻第6期，379 *)。但其儀器和專用培養管價 格昂貴(儀器在百萬元左右，每個試驗藥管在70元左右)，試劑必須依賴進口，在國內特 別在基層難于普及。另外提供的抗結核菌藥物僅4 5種。(2) 阿克蘇公司的BacT ALERT 3D培養系統BacT ALERT 3D儀是利用顏色感應 器來監測分支桿菌生長過程中釋放的C02，隨著C02濃度的升高，培養基中H+濃度也直接 升髙，從而使感應器的顏色由墨綠色變為金黃色(Thorpe T C， Wilson M L， Turner J E, et al. Bact/Alert: an automated colorimetric microbial detection system J. Clin Microbiol, 1990， 28(7): 1608-1612; 廖傳玉蔣克珉高萬痰分支桿菌快速 培養和藥敏試驗的評價臨床肺科雜志2005年1月第10巻第l期115)。(3) DIFC0公司的ESP系統是利用壓力感應器，檢測密封培養瓶中，在培養過 程細菌生長代謝產生C02、 H2、 N2和消耗02引起培養瓶內氣體壓力的改變。(4) 噬菌體裂解法分支桿菌噬菌體只能夠感染相應的活的分枝桿菌，并在菌 體內繁殖，使指示菌菌體裂解，出現噬菌斑。發明內容本實用新型目的是提出微生物藥敏培養和醫學檢驗裝置，尤其是分枝桿菌快速培 養藥敏及鑒定超千倍放大連續微量檢測裝置；尤其由無級超千倍放大、連續微量培養直 視觀察組成的微生物藥敏培養、尤其是分枝桿菌超快速培養藥敏及鑒定系統。快速檢測 從結核病人分離培養出的抗酸分枝桿菌，對各種抗菌藥物的敏感性，為臨床治療提供依 據。提出一種快速、簡單、直觀、經濟、安全防污和更接近人體內環境狀態的培養藥敏 裝置。微生物藥敏的培養和檢驗的專用裝置，包括生物安全櫥、微量培養板和圖象采集放 大檢測裝置構成在微量培養板的透明平臺底部置有放大物鏡，微量培養板底部透明并 置于透明平臺上，微量培養板或透明平臺置于一二維螺旋調節平臺上，物鏡的光路輸出 通過設置一反光光路接可移動調節放大倍數的CCD， CCD輸出圖象并外接監視器，微 量培養板的上部設有照明光源。上部設有照明光源采用LED，尤其是光源罩內置5-10支LED半導體冷光源，中間一支，周圍均布4-9支LED， LED顏色不限，亦可以采用雙色LED，功率在10mW及 以上均可。直接從微量培養板底部連續觀察細菌增殖狀態，通過橫向可移動調節放大倍數的調 節，對CCD放大倍數可進行無級調節。圖像清晰可見。由于設計的觀察方向從培養板 底部進行，因此可以在活體培養條件下連續觀察細菌的增殖過程。微量培養板的培養孔為圓柱加錐型臺體，孔底是錐型臺的小頭，直徑僅有1 ± 0.3mm，具有鏡面平整和載玻片樣透光性，作為采集圖象的觀察窗口。在加樣后通過自 然沉降，使細菌集中于孔底觀察窗口，可提高細菌增殖時觀察效率。板蓋對應每一孔上 方，有一突出的密封圈，蓋合后嵌入孔口內，有效的防止孔內液外溢。 分枝桿菌快速培養藥敏及鑒定微量檢測法① 標本處理后，接種于培養基，經過培養，在生物安全櫥內將生長出的抗酸分枝 桿菌取出，并制成規定濃度的菌懸液；② 在生物安全櫥內，將設有的專用微量培養板上蓋打開，板內各孔預先加好培養 基和相應藥物，另有陽性對照孔(含有培養基無藥)和陰性對照孔(無培養基無藥)， 向各孔內加入O.lml規定濃度的菌懸液，將上蓋蓋好，并將蓋和底間封好；以上均根據 培養規程進行；③ 將各個板放入密封濕盒內，置于37士2。C恒溫培養箱內培養；④ 每天或隔天取出培養板，放置在活體細菌直視放大系統上觀察；從專用培養板 各孔底部的觀察窗，在底部成像，連續觀察細菌增殖狀況。通過光學放大系統，采集細 菌生長圖象，并與陰陽對照孔圖象比較，與陽性對照孔相似判為耐藥，反之為敏感。本實用新型的有益效果快速通過連續超千倍放大系統可將培養中的分枝桿菌 放大l卯0 4000倍，可以在培養過程早期，觀察到單個細菌的增殖和微小菌簇的增殖形 態，因此可以早期判斷藥物作用的結果。而經典的方法是要在細菌經過大量繁殖，長出 肉眼可見的菌落，才能判斷結果，故《規程》規定要4周才報告結果。此外，通過培養 基的改進(使用改良7H9培養基內加入適當量的藥物)，使其更適合抗酸分枝桿菌的生 長，與其他培養基相比，加快生長速度，因此可以提前獲得藥敏結果(施旭東，劉正華， 吳曉淵等.結核分枝桿菌培養和藥敏試驗及菌群鑒定快速法方法的研究.中華檢驗醫學 雜志 2005 28 (8) 790-792)。對80例的臨床菌株測定，藥敏測定時間平均5.2天，71.3%在5天內，90.3%在 7天內獲得結果。比目前任何一種培養藥敏方法都快(如3D法藥敏時間平均要12天； BACTEC^M GIT960快速培養藥敏時間平均要6. 5天)。簡單在微量培養板各個微量培養孔內，預先已加入配置好的含一定藥量的培養 基(可以作成凍干試劑使商品化)，直接加入從初培養來的菌懸液，置于37'C恒溫培養 箱，隔天或每天置活體細菌直視連續超千倍放大系統上觀察,根據監視器顯示的細菌生 長的數量和微小菌簇的形態,與陽性對照孔比較判定結果，通過電腦采集圖象儲存記錄， 結果可打印圖文報告。方法簡單，凡具有一定經驗的臨床檢驗人員，經過一周培訓即可 學會操作。而進口的大型儀器結構復雜，需要較高的技術和外文水平。直觀通過活體細菌直視連續超千倍放大系統，可以直接觀察到細菌在藥物作用 下的生長狀態，觀察是在密閉生活狀態下，可以根據細菌個體的數量和微小菌簇的形態 來判斷，該菌株對該藥是敏感、耐藥或依賴(即該菌株在該藥存在下生長更好)，并可 以根據形態判斷是否有霉菌或一些雜菌污染。《規程》方法雖然也屬于直視觀察法，但 它是用肉眼觀察菌落，無法看到每一個細菌，因此需要的時間長，而且不能看到細菌在生長過程中的微細變化；而其他方法(如BACTECMGIT960儀、ESP系統、BacT ALERT 3D儀等)，都是間接的以測定生物的生命現象為指標(如氧的消耗、產生氣體的壓力改 變和二氧化碳產生等)，并不一定與抗酸分枝桿菌生長完全相關，常出現假陽性。經濟:使用的活體細菌直視連續超千倍放大系統和專用微量培養板是完全用國產 原材料構建和制造的，成本很低，專用微量培養板每塊五元(含40個檢測孔板)。微量 板使用的培養基很少，每個檢測孔板(test)僅0.1ml，(僅為常法的1/25 1/40)。因此 本法每test的成本價僅一元，因此節約了大量試劑成本。安全防污將已裝好培養基和相應藥物的培育板置于生物安全櫥內，打開上蓋加 入菌懸液后將蓋蓋上，用透明膠帶密封后置于37'C培養箱培養，在以后觀測檢查時不 再開蓋， 一直到結果報告后整體培養板高壓消毒或微波消毒。而有些快速法(如噬菌體 法和流式細胞儀法)，需要反復開蓋、取出、轉管和開放測定，增加了污染風險。更接近人體內環境使用液體培養基，使細菌在液體內部生長，與《規程》使用 的固體培養基，細菌在培養基的表面直接與空氣接觸的環境下生長相比，更接近于人體 內環境。因為結核菌是寄生于細胞內，所以在液體內培養的結果更接近臨床狀態。特別適合抗菌藥物的MIC和混合藥敏試驗無論是MIC或混合藥敏試驗，其對每 一種藥物都需要多個不同濃度的管或多個不同藥物和濃度搭配的管，不論成本上還是在 操作上，在其他快速法都不可能在臨床檢驗中實施。本法由于使用多孔微量培養板，培 養基用量很少，很容易進行倍比稀釋和藥物搭配混合，成本低操作簡便，因此可以實現 臨床意義上是MIC或混合藥敏試驗。
圖l是本實用新型光學檢測結構示意圖，圖2是本實用新型培養活體細胞(細菌)和直視放大觀察檢測流程圖具體實施方式
圖中1、輸出圖象外接監視器；2、放大物鏡；3、標本微量培養板和標本；4、 光源箱內置七支半導體冷光源(正面及側面)；5、 CCD， 6、是光路反射鏡；7、螺旋 二維調節平臺；8、 CCD可移動調節方向。光學系統通過光學顯微鏡物鏡和放大CCD圖象采集系統一道構成，通過物鏡頭3 將圖像進行顯微放大，經光路反射6至CCD圖象采集系統5， CCD放大可直接從監視 器觀察。可移動調節放大倍數的CCD、 二維螺旋調節平臺用于使標本微量培養板正好 對準物鏡窗口、圖中光源箱內置七支半導體冷光源(正面及側面)。CCD輸出圖像并外 接監視器，可以用電腦系統的監視器，并可以在電腦控制下工作，并沒有超出本實用 新型的范圍。① 病人的標本(痰、胸腹水、腦脊液、尿、便或灌洗液等)按衛生部《規程》規定方法處理后，接種于培養基，經過培養(L-J法或其他快速法)，在生物安全櫥內將生長出的抗酸分枝桿菌取出，并制成規定濃度的菌懸液。② 在生物安全櫥內，將專用微量培養板上蓋打開，板內各孔已經預先加好培養基和 相應藥物，另有陽性對照孔(含有培養基無藥)和陰性對照孔(無培養基無藥)，向各孔內加入0.1ml規定濃度的菌懸液，將上蓋蓋好，用透明膠帶將蓋和底間封好。③ 將各個板放入密封濕盒內，置于37'C恒溫培養箱內培養。④ 每天或隔天取出培養板(不要打開蓋)，放置在活體細菌直視連續超千倍放大系統 上觀察。從專用培養板各孔底部的觀察窗，通過超千倍放大系統，采集細菌生長圖象， 并與陰陽對照孔圖象比較，與陽性對照孔相似判為耐藥，反之為敏感。專用微量培養板每孔容積3.5ml，具有樣品濃集光學孔底和密閉蓋。該板無菌處 理后，預先在各個孔內分別加入含有各種不同抗菌藥物的培養基。培養中活體細菌連續直視超千倍放大系統。該系統可將培養中的細菌放大1000 4000倍(放大倍數無級可調)顯示在監視器上，結果由計算機控制采集圖象儲存并可 打印圖文報告。細菌微量培養板-微量培養板具有圓柱錐形微量培養孔，孔底直徑僅有1 mm，具有鏡面平整和載 玻片樣透光性，作為采集圖象的觀察窗口。板蓋對應每一孔上方，有一突出的密封圈， 蓋合后嵌入孔口內，有效的防止孔內液外溢。微量培養板具要圓柱錐形微量培養孔，培 養板的培養孔為圓柱錐型臺體，在加樣后通過自然沉降，使細菌集中于孔底觀察窗口， 可提高細菌增殖時觀察效率。微量培養板的培養孔為圓柱加一錐型臺體，孔底即錐型臺 底是純平面。而不似現有產品的截面為U形的結構。微量培養板的板蓋上設有一突出 的密封圈。直觀放大檢測儀可做到無級超千倍放大，由置于微量培養孔上部的光源和光學放大 CCD圖象采集系統構成，通過微量培養板下部物鏡成像光路經放大后可直接從微量培 養板底部連續觀察細菌增殖狀態，放大倍數可無級調節。使非染色的活體標本呈立體圖 象，清晰可見。由于設計的觀察方向是從培養板底部進行，因此可以在活體培養條件下 連續觀察細菌的增殖過程。
權利要求1. 微生物藥敏的培養和檢驗裝置，包括生物安全櫥、微量培養板和圖象采集放大檢測裝置構成其特征是在微量培養板的透明平臺底部置有放大物鏡，微量培養板底部透明并置于透明平臺上，微量培養板或透明平臺置于一二維螺旋調節平臺上，物鏡的光路輸出通過設置一反光光路接CCD，CCD輸出圖象，微量培養板的上部設有照明光源。
2、 根據權利要求l所述的微生物藥敏的培養和檢驗裝置，其特征是微量培養板 上部照明光源采用LED。
3、 根據權利要求2所述的微生物藥敏的培養和檢驗裝置，其特征是光源是內置 5-10支LED半導體冷光源，中間一支，周圍均布4-9支LED。
4、 根據權利要求1所述的微生物藥敏的培養和檢驗裝置，其特征是CCD是可 移動調節放大倍數的CCD。
5、 根據權利要求l所述的微生物藥敏的培養和檢驗裝置，其特征是微量培養板 的培養孔為圓柱加一錐型臺體，孔底即錐型臺底是純平面。
6、 根據權利要求5所述的微生物藥敏的培養和檢驗裝置，其特征是微量培養板 的板蓋上設有一突出的密封圈。
7、 根據權利要求5所述的微生物藥敏的培養和檢驗裝置，其特征是孔底直徑1 ± 0.3mm。
專利摘要微生物藥敏的培養和檢驗裝置，包括生物安全櫥、微量培養板和圖象采集放大檢測裝置構成在微量培養板的透明平臺底部置有放大物鏡，微量培養板底部透明并置于透明平臺上，微量培養板或透明平臺置于一二維螺旋調節平臺上，物鏡的光路輸出通過設置一反光光路接CCD，CCD輸出圖象并外接監視器，微量培養板的上部設有照明光源。構成活體細菌直視放大系統；從專用培養板各孔底部的觀察窗，通過光學放大系統，采集細菌生長圖象，并與陰陽對照孔圖象比較，與陽性對照孔相似判為耐藥，反之為敏感。
文檔編號C12Q1/18GK201092573SQ20072004039
公開日2008年7月30日 申請日期2007年7月27日 優先權日2007年7月27日
發明者劉正華 申請人:劉正華