專利名稱：用于檢測環(huán)境中類雌激素化合物的雙雜交酵母以及生物測試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于4金測環(huán)境中類雌激素化合物的雙雜交酵母以及生物測試方法，具體的說是涉及一種利用酵母雙雜交技術(shù)獲得的包含重組雌激素受體基因的雙雜交酵母，以及利用該酵母來檢測環(huán)境中類雌激素化合物的生物測試方法。
背景技術(shù)：
環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物，亦被稱為環(huán)境激素，是指人類在生產(chǎn)、生活過程中釋放到環(huán)境中的某些有毒化學(xué)物質(zhì)，它們與人體和動物體內(nèi)的激素具有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并能夠產(chǎn)生類似激素的作用。它們進(jìn)入體內(nèi)，擾亂了激素的正常分泌，使人和動物的生理過程發(fā)生紊亂，導(dǎo)致生殖、免疫等
功能發(fā)生障礙。環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物的干擾效應(yīng)包括雌激素干擾效應(yīng)、雄激素干擾效應(yīng)、甲狀腺激素干擾效應(yīng)等，特別是雌激素干擾效應(yīng)能夠?qū)ι锛叭祟惿诚到y(tǒng)造成嚴(yán)重影響。盡管具有雌激素干擾活性的化合物在環(huán)境中濃度極小，但是其一旦進(jìn)入人體和動物體內(nèi)，可以與特定的雌激素受體結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)一步結(jié)合到細(xì)胞核中的雌激素反應(yīng)元件
(ERE),啟動/抑制下游基因的表達(dá)，干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能。90年代對雌激素受體作用機(jī)制的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了雌激素受體的共激活因子
(coactor),并建立了新的受體作用理論(參見，Hong, H.， Kohlit, K.,Trivedit, A., Deborah, L.， Johnson, D丄.和Stallcup， M.R.， 1996， Natl. Acad.Sci. USA. 93:4948-4952)。該理論認(rèn)為，雌激素(或者環(huán)境中類雌激素物質(zhì))與相應(yīng)雌激素受體的配體結(jié)合區(qū)(LBD)結(jié)合后引起構(gòu)象改變，進(jìn)一步結(jié)合共激活因子，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。
對環(huán)境中雌激素干擾效應(yīng)進(jìn)行研究，通常采用化學(xué)分析和生物測試技術(shù)?；瘜W(xué)分析需要高分辨色譜/高分辨質(zhì)譜，除了分析費(fèi)用高外，對儀器設(shè)備條件和人員素質(zhì)有相當(dāng)嚴(yán)格的要求。另外一種廣泛采用的是利用重組雌激素受體酵母菌(Yeast Estrogen Screen, YES)進(jìn)行測試，這種測試?yán)玫氖侵亟M雌激素受體及受體反應(yīng)元件構(gòu)建的單雜交酵母。單雜交酵母方法并未考慮到雌激素受體共激活因子的作用。而且目前國內(nèi)所用的重組酵母菌抹幾乎都來自國外實(shí)驗(yàn)室，基本上沒有國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌林的構(gòu)建工作。因此該重組菌種需要長期冷凍保存， 一旦菌種發(fā)生回復(fù)突變，性狀就很難回復(fù)。利用雙雜交酵母技術(shù)將雌激素受體基因或基因片段以及共激活因子基因片段同時(shí)導(dǎo)入酵母細(xì)胞則可以克服單雜交酵母的缺點(diǎn)，并與新的受體作用理論相一致。已經(jīng)有證據(jù)表明基于新的受體作用理論建立的核受體雙雜交酵母系統(tǒng)更加接近哺乳動物內(nèi)分泌系統(tǒng)的真實(shí)作用情況(參見，
Nishihara, T., Nishikawa, J., 2000, Journal of Health Science. 46 (4):282-298)。而且，通過實(shí)驗(yàn)室直接構(gòu)建酵母菌抹，能夠有效的控制回復(fù)突變的影響，測定環(huán)境化合物的雌激素干擾效應(yīng)時(shí)能夠得到更好的質(zhì)量控制。
目前，通常采用報(bào)道基因的方法指示外界干擾、如化合物暴露等對基因轉(zhuǎn)錄的影響。其中，LacZ就是一種常用的編碼(3"半乳糖苷酶的報(bào)道基因，其產(chǎn)物P-半乳糖苷酶具有強(qiáng)的酶催化活性，能夠與特定底物反應(yīng)生成新的有色化合物，易于檢測。因此，通過簡單測定p-半乳糖苷酶的活性，就能夠表征對基因轉(zhuǎn)錄的影響。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)使用重組雌激素受體基因單雜交酵母對類雌激素污染物進(jìn)行測定時(shí)由于缺乏受體共激活因子，因而不能模擬真核細(xì)胞真實(shí)情況，容易產(chǎn)生假陰性或是假陽性結(jié)果的缺陷，從而構(gòu)建能夠同時(shí)表達(dá)雌激素受體和受體共激活因子的雙雜交酵母，并在此基礎(chǔ)上建立一種經(jīng)濟(jì)高效的評價(jià)環(huán)境樣品對雌激素受體干擾活性的生物測試方法。該檢測方法快速簡便，成本低廉，省時(shí)省力，應(yīng)用廣泛，所需樣品量少，靈敏度高，能夠反映環(huán)境樣品中雌激素受體的誘導(dǎo)效應(yīng)，并且通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中類雌激素污染物的毒性當(dāng)量值。
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明提供一種用于檢測環(huán)境中類雌激素化合物的雙雜交酵母，該酵母包含pGBKT7-ER酵母表達(dá)質(zhì)粒和pGAD424-GRIPl酵母表達(dá)質(zhì)粒，其中所述pGBKT7-ER酵母表達(dá)質(zhì)粒包含雌激素受體基因，所述pGAD424-GRIPl酵母表達(dá)質(zhì)粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的雌激素受體共激活因子基因片段。具體而言，上述雌激素受體基因優(yōu)選人雌激
6素受體基因或具有如SEQIDNo.l所示序列的人雌激素受體基因片段。所 述類雌激素化合物選自天然雌激素化合物、酚類及經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)換能夠形成 酚類的化合物、鄰苯二曱酸酯類化合物、有機(jī)氯農(nóng)藥中的一種或幾種。
本發(fā)明提供的上述雙雜交酵母具體為一種釀酒酵母(&cc/2aramyces "mWj/m) ER-GRIP1，其已經(jīng)于2007年12月27日在中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué) 院微生物研究所，郵編100101 )進(jìn)行了生物材料保藏，保藏編號為CGMCC No.2307。
本發(fā)明還提供一種用于檢測環(huán)境中類雌激素化合物的雙雜交酵母的 制備方法，其中包括以下步驟
(1 ) 構(gòu)建包含雌激素受體基因的pGBKT7-ER酵母表達(dá)質(zhì)粒；
(2 ) 純化包含具有如SEQ ID No.2所示序列的雌激素受體共激活因 子基因片段的pGAD424-GRIPl酵母表達(dá)質(zhì)粒；
(3 ) 釆用上述兩種質(zhì)粒構(gòu)建雙雜交酵母ER-GRIP1;
(4) 篩選雙雜交酵母ER-GRIP1 。
上述方法中所述雌激素受體基因優(yōu)選人雌激素受體基因或具有如 SEQ ID No.l所示序列的人雌激素受體基因片段。所述類雌激素化合物選 自天然雌激素化合物、酚類及經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)換能夠形成酚類的化合物、鄰苯 二曱酸酯類化合物、有機(jī)氯農(nóng)藥中的一種或幾種。所述雙雜交酵母 ER-GRIP1具體為釀酒酵母(6""cc/2arawyc^ cem^y/"e ) ER-GRIP1， 其保 藏編號為CGMCCNo.2307。
在上述步驟(1 )中，包括設(shè)計(jì)雌激素受體配體結(jié)合域ERLBD的PCR 引物，在上、下游引物的5'端分別引入EcoRI和BamHI單一酶切位點(diǎn)， 并且上游引物Pl: 5'-TCGCCGGAATTCGCTGGAGACATGAGA-3';下游 引物P2: 5'-TAACGCGGATCCTCAGACTGTGGCAGG-3';在上述步驟(3) 中，同時(shí)用pGBKT7-ER質(zhì)粒和pGAD424-GRIPl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母 細(xì)胞Y187 ( Sacc/zaramycay cewWw'ae);在上述步驟(4 )中，采用營養(yǎng)缺 陷型篩選和菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析相結(jié)合的方法篩選雙雜交酵母。其中，優(yōu)選 釆用添加雌激素的X-gal緩沖液的菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析，所述雌激素例如 17p-雌二醇；所述X-gal緩沖液為20mg . m1/1 5-溴-4-氯-3-吲哚-13-D-半 乳糖苷的二曱基曱酰胺溶液。所述營養(yǎng)缺陷型篩選中采用的培養(yǎng)基為
SD/-Trp/-Leu,其中包含20 mg . L"腺嘌呤半硫酸鹽，20 mg . L"鹽酸精氨酸，20 mg . L"—水合鹽酸組氨酸，30 mg . L"異亮氨酸，30 mg . L" 鹽酸賴氨酸，20 mg L"曱疏氨酸，50 mg L"苯丙氨酸，200 mg L"蘇 氨酸，30 mg .L"酪氨酸，20 mg丄"尿嘧啶，150 mg 'L"纈氨酸，6.7g -I/1 無氨基酸酵母氮源。
具體而言，在上述方法中，在構(gòu)建pGBKT7-ER酵母表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，首 先設(shè)計(jì)出人雌激素受體配體結(jié)合域(hER LBD)的PCR引物，并在上下 游引物的5'端分別引入EcoR I和BamH I單一酶切位點(diǎn)；以含有hERLBD (SEQIDNo,l所示序列)的pASV3質(zhì)粒(由英國Nottingham大學(xué)Heery 教授惠贈。參見，Pierrat, B.， Heery， D.M., 1992， Gene. 119 (2): 237-245 )作 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接于T-載體，構(gòu)建 的T-hER LBD質(zhì)粒；將pGBKT7(購自Clontech公司)和T-hER LBD質(zhì)粒 分別用EcoR I和BamH I雙酶切，酶切產(chǎn)物通過瓊脂津唐凝月交電泳分析后切 膠回收，pGBKT7和hER LBD插入片段的回收產(chǎn)物采用T4 DNA連接酶 連接，構(gòu)建pGBKT7-hER酵母表達(dá)質(zhì)粒。
具體而言，在上述方法中，純化pGAD424-GRIPl酵母表達(dá)質(zhì)粒時(shí)， 用pGAD424-GRIP1(美國加州大學(xué)Stallcup教授惠贈。參見，Li, H.W.， Kim, J.H.， Koh， S.S., Stallcup, M.R. 2003. J. Biol. Chem. Biol. 279(6):4212—4220.) 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，在含有氨節(jié)青霉素的培養(yǎng)基中篩選陽性克隆，提取 質(zhì)粒并純化。
具體而言，在上述方法中，構(gòu)建雙雜交酵母ER-GRIP1時(shí)，同時(shí)加入 pGBKT7-hER質(zhì)粒和pGAD424-GRIP 1質(zhì)?；旌暇鶆?，并加入感受態(tài)釀酒 酵母細(xì)胞Y187 ( Sacc/wra^ycas cerev/w'fle )孵育，得到雙雜交酵母 hER-GRIPl。
具體而言，在上述方法中，篩選雙雜交酵母ER-GRIP1時(shí)，采用營養(yǎng) 缺陷型篩選和菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析相結(jié)合的方法篩選雙雜交酵母，雙雜交酵 母通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SD/-Trp/-Leu )粗篩出陽性菌落，進(jìn)一步使用 菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析方法，將菌落影印到無菌的1#干燥濾膜上，液氮反復(fù) 凍融，破碎細(xì)胞；將1 #濾膜置于含雌激素的X-gal緩沖液的2#濾膜上， 30。C孵育至出現(xiàn)明顯藍(lán)色菌落，將顯色菌落繼續(xù)培養(yǎng)備用。
本發(fā)明還提供一種^r測環(huán)境中類雌激素化合物的生物測試方法，其中 包括如下步驟將上述雙雜交酵母細(xì)胞與待測樣品共培養(yǎng)，加入鄰硝基苯 -P-D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)終止反應(yīng)后檢測到的上清液在420nm處的吸光度值來計(jì)算類雌激素化合物的濃度。 上述方法具體包括如下步驟 (1 ) 培養(yǎng)雙雜交酵母ER-GRIP1細(xì)胞；
(2) 繪制誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)曲線首先將上述雙雜交酵母細(xì)胞分別與已知系 列濃度雌激素共培養(yǎng)，加入鄰硝基苯-卩-D-吡喃半乳糖苷反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)， 終止反應(yīng)后4企測上清液在420nm處的吸光度值，并以此作為表示p-半乳糖 苷酶活性的參數(shù)，繪制系列雌激素濃度相對雙雜交酵母ER-GRIP1細(xì)胞的 p-半乳糖苷酶活性誘導(dǎo)的劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(3) 檢測樣品將上述雙雜交酵母細(xì)胞與待測樣品共培養(yǎng)，加入鄰 硝基苯-J3-D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，終止反應(yīng)后檢測上清液在 420nm處的吸光度值，對照步驟(2)制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中類雌 激素化合物的含量。
對于上述生物測試方法而言，在步驟(1 )中，將ER-GRIP1細(xì)胞接種 時(shí)調(diào)節(jié)菌液600nm處的吸光度值為0.1-0.2, 30。C培養(yǎng)24h后調(diào)整菌液 600nm處的吸光度值為0.7 ~ 0.8準(zhǔn)備進(jìn)行測試；所述待測樣品為有機(jī)溶劑 提取液，其中雌激素當(dāng)量濃度為1(T11 10-"moH/;所述類雌激素化合物 選自天然雌激素化合物、酚類及經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)換能夠形成酚類化合物、鄰苯 二曱酸酯類化合物、有機(jī)氯農(nóng)藥中的一種或幾種。所述雙雜交酵母 ER-GRIP1具體為釀酒酵母(5bcc/^ra^yce;y cwev/wV e) ER-GRIP1,其保 藏編號為CGMCCNo.2307。
具體而言，在上述4企測環(huán)境中類雌激素化合物的生物測試方法中，雙 雜交酵母ER-GRIP1細(xì)胞的培養(yǎng)方法為將上述重組基因酵母hER-GRIPl 的細(xì)胞接種到SD/-Trp/-Leu液體培養(yǎng)基中，檢測菌液600nm處的吸光度值 為0.1 ~ 0.2， 3(TC培養(yǎng)24h后調(diào)整酵母菌液600nm處的吸光度值為0.7 ~ 0.8。
繪制誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)曲線具體步驟為將17P-雌二醇溶解到二曱基亞砜 (DMSO)中，制備一系列的17 |3-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)濃度反應(yīng)液(濃度范圍 2xl(T12~2xlO-6mol/L)，按照0.5%的比例添加17 P-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)濃度反應(yīng) 液到hER-GRIPl酵母菌液中，制備暴露液；將暴露液接種至96孔板中 (200)iL/孔)；3(TC培養(yǎng)2h后檢測600nm處的吸光度值；再將含有過量鄰 硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng)液加入到96孔板中；30。C下充分反應(yīng) 后，添加1 mol . L"的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)；在420nm處用分光光度計(jì)檢測終產(chǎn)物鄰硝基酚鈉的吸光度值，并以此作為表示(3 -半乳糖香酶的參數(shù)， 繪制E2 (即雌二醇)對重組基因酵母hER-GRIPl細(xì)胞的P -半乳糖苷酶活 性誘導(dǎo)的劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線。
13-半乳糖苷酶活性u的計(jì)算公式如下u = (As-AB)/t .V .D 'ODs， 式中，u為P-半乳糖苷酶活性；t為反應(yīng)時(shí)間(min); V為測試體積(mL); D為稀釋因子；ODs為測試樣品在595nm處的吸光度值；As為測試樣品 在420nm處的吸光度值OD42。； AB為空白對照在420nm處的吸光度。
上述檢測樣品的具體步驟為按照0.5%的比例添加二曱基亞砜 (DMSO)溶解的待測樣品到hER-GRIPl酵母菌液中，制備暴露液；暴露 液接種至96孔板中(200juL/孔)；30。C培養(yǎng)2h后檢測600nm處的吸光度 值；再將含有過量鄰硝基苯-p-D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng)液加入到96孔板 中；30。C下充分反應(yīng)后，添加lmol L"的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)；在420nm 處用分光光度計(jì);險(xiǎn)測終產(chǎn)物鄰硝基酚鈉的吸光度值，來檢測待測化合物是 否具有雌激素受體誘導(dǎo)活性，即將測得的結(jié)果與上述標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，進(jìn)而 可以計(jì)算出環(huán)境樣品中類雌激素化合物的含量，從而評價(jià)環(huán)境中類雌激素 化合物的毒性效應(yīng)。
本發(fā)明提供的用于檢測環(huán)境樣品中類雌激素化合物的雙雜交酵母以 及生物檢測方法的優(yōu)益之處在于1 ) ER-GRIP1雙雜交酵母細(xì)胞能夠同時(shí) 表達(dá)雌激素受體蛋白、雌激素受體共激活因子蛋白，支持最新的受體作用 理論，最能模擬哺乳動物細(xì)胞內(nèi)雌激素受體的作用機(jī)制，且表達(dá)基因產(chǎn)生 的卩-半乳糖香酶的酶活性易于檢測，很適合作為化合物毒性篩選、環(huán)境樣 品類雌激素效應(yīng)評價(jià)方面的試驗(yàn)研究；2)酵母細(xì)胞試驗(yàn)快速、簡便可以 對大量環(huán)境樣品或化學(xué)物質(zhì)的內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)進(jìn)行前期篩選，為活體試 驗(yàn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持，彌補(bǔ)了活體試驗(yàn)試驗(yàn)周期長，費(fèi)用高的不足；3) 添加17p-雌二醇(lxl(T1(} mol.L")的X-gal緩沖液在菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析中 的應(yīng)用，大大的縮短了操作時(shí)間，相當(dāng)程度上減輕了假陽性結(jié)果干擾的可 能性；4)利用SD/-Trp/-Leu營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基進(jìn)行酵母培養(yǎng)，能夠有效 防止重組酵母細(xì)胞的回復(fù)突變，減輕傳代過程中質(zhì)粒丟失的情況，使得重 組酵母細(xì)胞的蛋白表達(dá)穩(wěn)定，試驗(yàn)測試結(jié)果之間的平行性較好；5)利用 重組雌激素受體基因雙雜交酵母進(jìn)行類雌激素污染物的篩選和毒性毒理 研究時(shí)，操作筒便，省時(shí)省力，所需樣品量少，成本低廉；6)本發(fā)明克 隆了人的雌激素受體基因，能夠反映環(huán)境樣品中的類雌激素化合物可能對人體產(chǎn)生的影響；7 )與Nishihara文獻(xiàn)才艮道克隆鼠的雌激素受體不同的是， 本發(fā)明直接克隆人的雌激素受體基因或基因片段構(gòu)建雙雜交酵母，因此在 測定環(huán)境化合物的雌激素干擾效應(yīng)時(shí)能夠直接體外預(yù)警化合物對人體內(nèi) 分泌系統(tǒng)可能存在的風(fēng)險(xiǎn)。在技術(shù)上采用了更先進(jìn)的pGBKT7酵母表達(dá)質(zhì) 粒和釀酒酵母菌抹Y187( 5Wcc/zaram;;cM )，使得構(gòu)建的ER-GRIP1
菌抹具有更高的靈敏度，其ECs。值為YJxlO-Umol.L-1,而Nishihara報(bào)道 為〉3xl0^mol'L—1。
以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明，其中
圖1為17卩-雌二醇對重組釀酒酵母ER-GRIP 1 ( CGMCC No.2307 )酶 活性誘導(dǎo)的劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中橫坐標(biāo)是17P-雌二醇濃度，縱 坐標(biāo)是17(3-雌二醇誘導(dǎo)的p-半乳糖苷酶活性；
圖2為利用化學(xué)分析、單雜交重組雌激素受體基因酵母和雙雜交重組 釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )三種方法測試環(huán)境樣品類雌激素 效應(yīng)的結(jié)果；其中橫坐標(biāo)是化學(xué)分析結(jié)果，縱坐標(biāo)是單雜交重組雌激素受 體基因酵母和雙雜交重組釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )方法的 測試結(jié)果；其中令表示雙雜交酵母細(xì)胞抹(釀酒酵母ER-GRIP1 (CGMCC No.2307));圓表示單雜交酵母細(xì)胞抹；EEQ表示17(3-雌二醇當(dāng)量濃度 (pg.L"); YES表示酵母檢測方法。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供的釀酒酵母(Sacc/zaram;;c" ) ER國GRIP1已經(jīng)于
2007年12月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC,北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101) 進(jìn)行了生物材料保藏，保藏編號為CGMCC No.2307。以下結(jié)合實(shí)施例具 體說明釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )的制備及其在檢測環(huán)境中 類雌激素化合物的生物測試方法中的應(yīng)用。
實(shí)施例1:釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )細(xì)胞的制備
1.構(gòu)建包含雌激素受體基因片段(即SEQ ID No.l所示序列)的 pGBKT7-hER酵母表達(dá)質(zhì)粒。
首先設(shè)計(jì)出雌激素受體配體結(jié)合域(hER LBD)的PCR引物，并在上下游引物的5'端分別引入EcoRI和BamHI單一酶切位點(diǎn)，即上游引物 Pl: 5'-TCGCCGGAATTCGCTGGAGACATGAGA-3'(下劃線部分為EcoR
I 的酶切位點(diǎn))；下游引物 P2 : 5'-TAACGCGGATCC TCAGACTGTGGCAGG-3'(下劃線部分為BamHI的酶切位點(diǎn))；以含有 hER LBD ( SEQ ID No.l所示序列)的pASV3質(zhì)粒(由英國Nottingham 大學(xué)Heery教授惠贈)2.5ng作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物(0.3pmo1) 用T4 DNA連接酵(1mL)連接于t-載體，構(gòu)建的T-hER LBD質(zhì)粒；將 pGBKT7( lpg,購自Clontech公司)和T-hER LBD (lpg)質(zhì)粒分別用EcoR
I (lpL)和BamH I (l)LiL)雙酶切，酶切產(chǎn)物通過0.8 %瓊脂并唐凝月交電泳分析 后切膠回收，pGBKT7(0.03pmol)和hER LBD插入片段(0.3pmol)的回收產(chǎn) 物采用T4 DNA連接酶(liiiL)連接，構(gòu)建pGBKT7-hER酵母表達(dá)質(zhì)粒。對 質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列測定，測序引物為 5'-TTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTC畫3'。
2. 純化包含雌激素受體共激活因子基因片段(即SEQ ID No.2所示序 列)的pGAD424-GRIPl酵母表達(dá)質(zhì)粒。
用lO(iL靶質(zhì)粒pGAD424-GRIPl (美國加州大學(xué)Stallcup教授惠贈) 轉(zhuǎn)化lOOiiL感受態(tài)大腸桿菌DH5a，在含有氨千青霉素的培養(yǎng)基中篩選陽 性克隆，提取質(zhì)粒并純化。0.8。/。瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒DNA大小，同 時(shí)對質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列測定，測序引物為pGAD424通用引物(測序工作 由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成)。所述含有氨節(jié)青霉素的培養(yǎng) 基包含100mg . L"氨爺青霉素，10g . L"胰蛋白胨，5g . L"酵母提取物， 10g L'1 NaCl， 15g . I/1瓊脂糖。
3. 構(gòu)建雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )。
同時(shí)加入0.1|ig pGBKT7-hER質(zhì)粒和O.lpg pGAD424-GRIPl質(zhì)粒混合 均勻，并加入O.lmL新鮮制備的感受態(tài)釀酒酵母細(xì)胞Y187( Sacc/zaramyc" cerev/w'ae), 200rpm, 30。C孵育30min。加入70|iL 二曱基亞砜(DMSO ) 混合均勻后，42。C水浴放置15min;細(xì)胞迅速轉(zhuǎn)移到冰浴，靜置l-2min， 構(gòu)建雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )。
4. 篩選雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )。 在上述方法中，篩選雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )
時(shí)，采用營養(yǎng)缺陷型篩選和菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析相結(jié)合的方法篩選雙雜交酵 母，雙雜交酵母通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SD/-Trp/-Leu )粗篩出陽性菌落，
12進(jìn)一步使用菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析方法，將菌落影印到無菌的1 #干燥濾膜上，
液氮反復(fù)凍融3 ~ 5次，破碎細(xì)胞；將1 #濾膜置于含17 |3 -雌二醇(1 x l(T1Gmol L")的X-gal緩沖液的2#濾膜上，30。C孵育直到克隆出現(xiàn)明顯 的藍(lán)色。顯色的菌落即為陽性菌落，陽性菌落繼續(xù)培養(yǎng)24h后備用。所述 SDATrpALeu包含20 mg . L"腺嘌呤半硫酸鹽，20 mg . I/1鹽酸精氨酸， 20 mg . L" —水合鹽酸組氨酸，30 mg L"異亮氨酸，30 mg . L"鹽酸賴 氨酸，20 mg . L"曱碌b氨酸，50 mg L"苯丙氨酸，200 mg U1蘇氨酸， 30 mg ' L-1酪氨酸，20 mg L-1尿嘧咬，150 mg L-1纈氨酸，6.7g L-1無 氨基酸酵母氮源；X-gal緩沖液為20mg . mL" 5-溴-4-氯-3-吲哚-13-D-半乳 糖苷的二曱基曱酰胺溶液。
實(shí)施例2:利用雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )測 定17(3-雌二醇(E2)的效應(yīng)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
酵母細(xì)胞培養(yǎng)將制備的雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 (CGMCC No.2307)細(xì)胞接種到SD/-Trp/-Leu液體培養(yǎng)基(組成與實(shí)施例1中相同) 中，檢測菌液600nm處的吸光度值(以培養(yǎng)基為空白)，調(diào)節(jié)吸光度值為 0.1 ~ 0.2， 30。C空氣浴搖床中培養(yǎng)24h后調(diào)整菌液600nm處的吸光度值為 0.7-0.8。
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取菌懸液0.995mL至對應(yīng)的Eppendorf管中，加入5^L DMSO (空白)或5pL用DMSO溶解的E2;將以上溶液各200iiL依次轉(zhuǎn) 移到96孔板中。然后于130rpm, 30°C于96孔板搖床振蕩培養(yǎng)2h;培養(yǎng) 結(jié)束后，首先檢測600nm處的吸光度值；去除150jliL酵母菌液；加入120pL 測試緩沖液(每lOOmL基礎(chǔ)緩沖液中加入3.33mL濃度為0.1%的SDS溶 液和270pL P-巰基乙醇)和20pL氯仿，在30。C的恒溫?fù)u床上預(yù)培養(yǎng)lOmin; 再加入40pL鄰硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng)液(0.04g'L"),啟動酶反 應(yīng)，隨著進(jìn)一步的培養(yǎng)，可以逐漸看到培養(yǎng)液呈現(xiàn)越來越強(qiáng)的黃色；30°C 下充分反應(yīng)后(對于17P-雌二醇來說，這樣的過程約需要20min)，添加 100|xL碳酸鈉溶液(1 mol.L")終止反應(yīng)；取200pL上清液在420nm處用 分光光度計(jì)檢測終產(chǎn)物鄰硝基酚鈉的吸光度值，并以此作為表示P-半乳糖 苷酶的參數(shù)，繪制E2對重組基因釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 ) 細(xì)胞的P-半乳糖苷酶活性誘導(dǎo)的劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。
卩-半乳糖苷酶活性u的計(jì)算公式如下u = (As-AB)/t'V'DODs,式中，u為p-半乳糖苷酶活性；t為反應(yīng)時(shí)間(min); V為測試體積(mL); D 為稀釋因子；0DS為測試樣品595nm處的吸光度值；As為測試樣品在 420nm處的吸光度值OD42Q; As為空白對照在420nm處的吸光度。
上述含有過量鄰硝基苯-13 -D-吡喃半乳糖香的反應(yīng)液包含21.51g .L-1 Na2HP04 12H20, 6.22g L-1 NaH2P04 . 2H20, 0.75g L"KC1， 0.25g I/1 MgS04 ' 7H20, 0.04g . L"鄰硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苦。
由圖1可知，E2對雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 ) 細(xì)胞P-半乳糖苷酶活性誘導(dǎo)的劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線的ECs。值為 7.3xl(TUmol丄'1,在2xl0-n-2xl(r" mol丄"范圍內(nèi)存在線性關(guān)系；與國 際報(bào)道的E2在重組酵母系統(tǒng)中EQo為lxlO-u 3xl(rViol.L"之間的結(jié)果 相符，說明本發(fā)明制備的雙雜交酵母對于E2的敏感性與報(bào)道的其它方法建 立的系統(tǒng)相近，初步表明雙雜交雌激素受體基因酵母測評體系可以作為環(huán) 境中類雌激素化合物的毒性效應(yīng)的定量分析標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例3:利用雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307)生 物測試方法評價(jià)環(huán)境樣品的類雌激素污染物毒性。
分別采集某市不同水廠進(jìn)水、出水作為樣品。釆用固相萃取的方法， 加入二氯甲烷、正己烷提取樣品中的類雌激素污染物，將提取到的有機(jī)溶 劑在高純氮?dú)庵写蹈?，加入DMSO溶解并制備成在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)任 一濃度的測試用樣品溶液。
利用實(shí)施例1中所述的雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 (CGMCC No.2307)生物測試方法評價(jià)環(huán)境樣品的類雌激素污染物毒性，測定結(jié)果 與單雜交重組雌激素受體基因酵母方法、質(zhì)譜分析方法的測定結(jié)果進(jìn)行了 比較，見圖2。
從圖2可以看出，無論是單雜交酵母細(xì)胞和雙雜交酵母細(xì)胞生物測試， 所得到的結(jié)果與質(zhì)譜分析類雌激素污染物的毒性當(dāng)量之間有很好的相關(guān) 關(guān)系。雙雜交酵母細(xì)胞生物測試結(jié)果更接近化學(xué)分析(即質(zhì)i普分析)，而 且和國際上目前通常采用的單雜交重組基因酵母細(xì)胞測試方法有很好的 可比性。圖2的結(jié)果表示可以用本發(fā)明提出的方法，判斷環(huán)境樣品中類雌 激素污染物的毒性當(dāng)量或其潛在生態(tài)毒性的大小。序列表
SEQ ID No.l
<110> 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心
<120> 用于檢測環(huán)境中類雌激素化合物的雙雜交酵母以及生物測試方法 <130> DIC07110101 <160> 2
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 942
<212> DNA
<213> 人
<400> 1
gctggagaca tgagagctgc caacctttgg ccaagcccgc tcatgatcaa acgctctaag 60
aagaacagcc tggccttgtc cctgacggcc gaccagatgg tcagtgcctt gttggatgct 120
gagcccccca tactctattc cgagtatgat cctaccagac ccttcagtga agcttcgatg 180
atgggcttac tgaccaacct ggcagacagg gagctggttc acatgatcaa ctgggcgaag 240
agggtgccag gctttgtgga tttgaccctc catgatc鄉(xiāng)tccaccttct agaatgtgcc 300
tggctagaga tcctgatgat tggtctcgtc tggcgctcca tggagcaccc agggaagcta 360
ctgtttgctc ctaacttgct cttggacagg aaccagggaa aatgtgtaga gggcatggtg 420gagatcttcg acatgctgct ggctacatca tctcggttcc gcatgatgaa tctgcaggga 480
gaggagtttg tgtgcctcaa atctattatt ttgcttaatt ctggagtgta cacatttctg 540
tccagcaccc tgaagtctct ggaagagaag gaccatatcc accgagtcct ggacaagatc 600
acagacactt tgatccacct gatggccaag gcaggcctga ccctgcagca gcagcaccag 660
cggctggccc agctcctcct catcctctcc cacatcaggc acatgagtaa caaaggcatg 720
gagcatctgt acagcatgaa gtgcaagaac gtggtgcccc tctatgacct gctgctggag 780
atgctggacg cccaccgcct acatgcgccc actagccgtg gaggggcatc cgtggaggag 840
acggaccaaa gccacttggc cactgcgggc tctacttcat cgcattcctt gcaaaagtat 900
tacatcacgg gggaggcaga gggtttccct gccacggtct ga 942
SEQ ID No.2 <210> 2 <211> 4374 <212〉 DNA <213> 鼠
<400> 2
ggagaaaaca cctctgaccc gtccagggca gagaccagaa aacgcaagga atgtcccgac 60
cagctcggac ccagccccaa aaggagcact gagaaaegga accgcgagca ggagaataag 120
tacatagagg agctggccga tctgatcttc gcaaacttta atgatattga caacttcaac 180
ttcaaacctg acaaatgtgc catcctaaaa gaaactgtga agcagatccg ccagatcaaa 240gagcaagaga aagcagcagc tgccaacata gatgaagtgc agaagtcaga tgtgtcgtcc
acggggcagg gtgtcatcga caaggatgca ctggggccca tgatgcttga ggccctcgat
gggttcttct tcgttgtgaa cctggaaggc agtgtggtgt tcgtgtcaga gaatgtgaca
cagtatctac ggtataacea agaagagctg atgaacaaga gtgtctacag catcctgcat
gtcggggacc acactgaatt tgtcaagaac ctgctgccaa agtccatggt gaatggagga
tcctggtctg gagaacctcc caggcggacg agccatacct tcaactgtcg catgctggtg
aagcctttgc cagattcaga agaggaaggc catgatagcc aggaagccca tcagaaatac
gaggcgatgc agtgcttcgc tgtgtctcag cccaagtcca tcaaagagga aggcgaagat
ttgcagtcct gcttgatttg tgtggcacga agagtcccca tgaaggaaag accaactctt
ccctcatcag aaagctttac cacccgccag gacctccaag gcaagatcac ttcactggac
actagcacca tgagagccgc catgaagccg ggctgggaag atctggtaag aagatgcatt
cagaagttcc acacacagca tgaaggggag tctctatcat atgccaagag gcatcaccat
gaagttctga gacaagggtt ggcgttcagt cagatctatc gtttttcttt gtctgatggc
actctcgttg ctgcacaaac caagagcaaa ctcatccgtt ctcagactac taatgagcct
cagcttgtaa tatctttaca catgcttcac agagagcaga atgtatgtgt aatgaatccg
gatctgactg gacaagcgat ggggaagcca ttgaatccaa ttagctctag cagccctgcc
300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 卯O 960 1020 1080 1140 1200caccaggccc tgtgcagtgg gaacccaggt caggacatga ccctcggtag caatataaat 1260
tttcccatga atggcccaaa ggaacaaatg ggcatgccta tgggcaggtt tggtggttct 1320
gggggcatga accatgtgtc aggcatgcag gcaaccactc ctcagggtag taactatgca 1380
ctcaaaatga acagtccctc gcaaagcagc cccggcatga acccggggca agccagctcc 1440
gtgctctccc caaggcagcg catgagcccc ggcgtggctg gcagtcctcg catcccaccc 1500
agtcagtttt cccctgcagg aagcttgcat tcccctgtgg gagtttgcag cagcacagga 1560
aatagccata gttataccaa cagttccctc aatgcactgc aagccctcag cgagggccat 1620
ggggtctcac tcgggtcctc gctggcttca ccggacctaa aaatgggcaa tttgcaaaac 1680
tccccagtta atatgaatcc tcccccactc agcaagatgg gaagcttgga ctccaaagac 1740
tgttttggac tttatgggga gccctcagaa ggtacaactg gacaagcaga ggccagctgc 1800
catcctgaag aacaaaaggg gcccaatgat tccagcatgc cccaggcggc cagcggggac 1860
agggctgagg gacacagccg gctgcatgac agcaaagggc agaccaaact cctgcagctg 1920
ctgaccacca agtccgacca gatggagcct tcacccttgc ccagctcctt gtcggacaca 1980
aacaaggact caacagggag cttgcctggg cctgggtcca cgcatggcac ctcgctcaag 2040
gagaagcata agattttgca cagactctta caggacagca gttcccctgt ggacttggcc 2100
aagctgacag cagaagccac aggcaaagag ctgagccagg agtccagcag cacagctcct 2160gggtcggaag tgactgtcaa acaggagcca gcgagcccca agaagaaaga gaatgcacta 2220 ctgcgctatt tgctcgacaa agatgatact aaagatattg gtttaccgga aataaccccc 2280 aaactcgagc gactggacag taagacagat cctgccagta acacaaagtt aattgctatg 2340 aaaactgtga aggaggaggt gagctttgag cccagtgacc agcctggcag cgagctggac 2400 aacttggaag agattttgga tgatttgcag aacagtcagt taccacagct tttcccagac 2460 acaaggccag gagctcctac tgggtcagtt gacaagcaag ccatcatcaa tgacctcatg 2520
caactcacag ctgacagcag tcccgtccca cctgccggag cccagaaggc agcactgcgc 2580
atgtcacaga gcacttttaa taacccacga ccagggcaac tgggcaggtt attgccaaac 2640
cagaacttac cacttgacat cactttgcaa agcccaactg gtgctggacc tttcccacca 2700
atcagaaaca gtagccccta ctcagtgata cctcagccag gaatgatggg taaccaaggg 2760
atgctaggaa gccaaggaaa cttagggaac aatagcacag gaatgattgg cagcagcact 2820
tcccggccca gcatgccttc tggggaatgg gcaccacaga gtccagctgt gagagtcact 2880
tgtgctgcta ccactggtgc catgaaccga ccagtccaag gaggcatgat tcggaaccca 2940
acagccagca tccccatgcg agccaacagc cagcctggcc aaagacagat gcttcagtct 3000
caggtcatga acataggccc ttctgagtta gagatgaaca tgggaggacc tcagtataat 3060
caacagcagg cccctccgaa ccaaactgcc ccgtggcctg agagcatcct gcctatagac 3120<formula>formula see original document page 20</formula>ttctcacagc agtccccacc acactttggg caacaagcaa acaccagcat gtatagtaac 4140
aacatgaaca tcagtgtgtc gatggcaacc aacacgggtg gcttgagcag catgaaccag 4200
atgacatgcc agatgagcat gacctcagtg acctccgtgc ctacgtcagg actgccctcc 4260
atgggtcccg agcaggtcaa tgaccctgct ctgaggggag gcaacctttt cccaaaccaa 4320
ctgcctggaa tggacatgat caagcaggag ggagatgcat ctcggaaata ctgc 437權(quán)利要求
1. 一種用于檢測環(huán)境樣品中類雌激素化合物的雙雜交酵母，其特征在于，該酵母中含有pGBKT7-ER酵母表達(dá)質(zhì)粒和pGAD424-GRIP1酵母表達(dá)質(zhì)粒，其中所述pGBKT7-ER酵母表達(dá)質(zhì)粒包含雌激素受體基因，pGAD424-GRIP1酵母表達(dá)質(zhì)粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的雌激素受體共激活因子基因片段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙雜交酵母，其特征在于，所述雌激素受體 基因?yàn)槿舜萍に厥荏w基因或具有如SEQIDNo.l所示序列的人雌激素受體 基因片段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙雜交酵母，其特征在于，所述類雌激 素化合物選自天然雌激素化合物、酚類及經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)換能夠形成酚類的化 合物、鄰苯二曱酸酯類化合物、有機(jī)氯農(nóng)藥中的一種或幾種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的雙雜交酵母，其特征在于，所 述只又雜交酵母為酉良酒酵母(iSacc/2"ramyc&s c^ev^/ae )ER-GRIP1,其保藏 編號為CGMCCNo.2307。
5. —種根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的雙雜交酵母的制備方法， 其特征在于，該方法包括以下步驟(1) 構(gòu)建包含所述雌激素受體基因的pGBKT7-ER酵母表達(dá)質(zhì)粒；(2) 純化包含所述雌激素受體共激活因子基因的pGAD424-GRIPl 酵母表達(dá)質(zhì)粒；(3 ) 采用上述兩種質(zhì)粒構(gòu)建雙雜交酵母ER-GRIP1; (4 ) 篩選雙雜交酵母ER-GRIP1 。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)包括設(shè) 計(jì)雌激素受體配體結(jié)合域ER LBD的PCR引物，其中在上、下游引物的 5'端分別引入EcoR I和BamH I單一酶切位點(diǎn)，并且上游引物Pl: 5'-TCGCCGGAATTCGCTGGAGACATGAGA-3';下游引物 P2 : 5'-TAACGCGGATCC TCAGACTGTGGCAGG-3'。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的制備方法，其特征在于，在步驟(3) 中同時(shí)用pGBKT7-ER質(zhì)粒和pGAD424-GRIPl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母細(xì) 胞Y187 (iSacc/^ra附7ees cerev/57'"e )。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，在步驟(4)中采用營養(yǎng)缺陷型篩選和菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析相結(jié)合的方法篩選所述雙雜交酵母。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，在步驟(4)中采 用添加雌激素的X-gal緩沖液的菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述雌激素為17卩-雌二醇。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述X-gal緩沖 液為20mg mL"5-溴-4-氯-3-吲。呆-(3-D-半乳糖苷的二甲基甲酰胺溶液。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述營養(yǎng)缺陷型 篩選中釆用的培養(yǎng)基為不添加色氨酸和亮氨酸的SD培養(yǎng)基，其中包含20 mg . L"腺噪呤半硫酸鹽，20 mg . L"鹽酸精氨酸，20 mg . L"—水合鹽酸 組氨酸，30 mg . L"異亮氨酸，30 mg . L"鹽酸賴氨酸，20 mg L"曱碌u 氨酸，50mg L"苯丙氨酸，200mg L"蘇氨酸，30mg'L"酪氨酸，20 mg.L"尿嘧咬，150mg . L"纈氨酸，6.7g L"無氨基酸酵母氮源。
13. —種檢測環(huán)境中類雌激素化合物的生物測試方法，其特征在于， 該方法包括如下步驟將權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的雙雜交酵母細(xì)胞 與待測樣品共培養(yǎng)，加入鄰硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苦的反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)， 根據(jù)終止反應(yīng)后檢測到的上清液在420nm處的吸光度值來計(jì)算類雌激素 化合物的濃度。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的生物測試方法，其特征在于，所述方法包 括如下步驟(1) 培養(yǎng)雙雜交酵母ER-GRIP1細(xì)胞；(2) 繪制誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)曲線首先將所述雙雜交酵母細(xì)胞分別與已知系 列濃度雌激素共培養(yǎng)，加入鄰硝基苯-(3-D-吡喃半乳糖苷反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)， 終止反應(yīng)后4全測上清液在420nm處的吸光度值，并以此作為表示p-半乳泮唐 苦酶活性的參數(shù)，繪制系列雌激素濃度相對所述雙雜交酵母ER-GRIP1細(xì) 胞的P-半乳糖苷酶活性誘導(dǎo)的劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3) 檢測樣品將所述雙雜交酵母細(xì)胞與待測樣品共培養(yǎng)，加入鄰 硝基笨-P-D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，終止反應(yīng)后檢測反應(yīng)上清液 在420nm處的吸光度值，對照步驟(2)制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中類 雌激素化合物的含量。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的生物測試方法，其特征在于，在步驟(l)中，將ER-GRIP 1細(xì)胞接種時(shí)調(diào)節(jié)菌液600nm處的吸光度值為0.1 ~ 0.2, 3(TC培養(yǎng)24h后調(diào)整菌液600nm處的吸光度值為0.7 ~ 0.8準(zhǔn)備進(jìn)行測試。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的生物測試方法，其特征在 于，所述待測樣品為有機(jī)溶劑提取液，其中雌激素當(dāng)量濃度為1O-u l(T10 mol.L-1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測環(huán)境樣品中類雌激素化合物的雙雜交酵母及其制備方法，其中該酵母中含有pGBKT7-ER酵母表達(dá)質(zhì)粒和pGAD424-GRIP1酵母表達(dá)質(zhì)粒，其中pGBKT7-hER酵母表達(dá)質(zhì)粒包含雌激素受體基因，pGAD424-GRIP1酵母表達(dá)質(zhì)粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的雌激素受體共激活因子基因片段。本發(fā)明還提供了一種檢測環(huán)境中類雌激素化合物的生物測試方法，其中包括將上述雙雜交酵母細(xì)胞與待測樣品共培養(yǎng)，加入鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)終止反應(yīng)后檢測到的上清液在420nm處的吸光度值來計(jì)算類雌激素化合物的濃度。本發(fā)明采用重組雌激素受體基因的雙雜交酵母用于測試，更加接近哺乳動物內(nèi)分泌系統(tǒng)的真實(shí)作用情況，構(gòu)建的酵母細(xì)胞基因性狀穩(wěn)定，易于培養(yǎng)、篩選，整個(gè)類雌激素效應(yīng)的篩選過程操作簡單，所需樣品量少，成本低廉。
文檔編號C12N1/19GK101469315SQ200710308509
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日
發(fā)明者劍 李, 王子健, 饒凱鋒, 梅 馬 申請人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心