專利名稱：：一種大黃歐文氏菌及其在制備異麥芽酮糖中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于發酵工程和酶工程
技術領域：
，涉及一種產蓆糖異構酶的微生物菌株大黃歐文氏菌(Erwiniacarotovora)NX-5，以及將它用于異麥芽酮糖的生產。
背景技術：
：異麥芽酮糖(6-0-a-D-吡喃葡糖基-D-果糖，Isomaltulose)是一種還原性糖，在天然蜂蜜和甜菜汁中少量存在，具有與蔗糖最為類似的物理性質和口感。作為蔗糖的替代品它具有如下優點(1)由于它被人體食用后在血液中釋放單糖的速度比蔗糖慢且不刺激胰島素分泌，可供糖尿病人群和減肥人士食用；(2)不被導致齲齒的口腔鏈球菌代謝，不腐蝕牙齒；(3)在人腸的微生物群區中，選擇性刺激雙歧桿菌的生長；(4)性能食用安全性高，被美國FDA給予食品安全最高等級"GRAS(公認安全)"，對其每閂攝入量不作限制，不會令人產生腹脹、腸鳴等不良反應。(5)擁有極低的吸濕性，用它做的硬糖不會像用普通的糖或其他糖替代品一樣變粘，甚至可以被松散地包裝。因為吸濕性小，所以穩定性強，貨架期也更長。這是木糖醇和麥芽糖醇等功能糖醇難實現的。(6)異麥芽酮糖醇被市場認可的另一主要優點是口味純正，它幾乎可以代替蔗糖的任何用途，消費者分辨不出與有糖食品的區別，使無糖食品"美味不打折"。由于這些特點，異麥芽酮糖(醇)成為目前最受歡迎的蔗糖替代品。異麥芽酮糖由蔗糖異構酶EC5.4.99.11(Sucroseisomerase)，或叫異麥芽酮糖合成酶(Isomaltulosesyntheses),庶糖葡萄糖基變位酶(Sucroseglucosylmutase)'a-葡糖基轉移酶(a-glucosyltransferase)催化蔗糖轉變而成，已知有一些菌種能產生該酶。美國專利4,359，531采用大黃歐文氏菌轉化蔗糖，大約70-95%的蔗糖轉變成異麥芽酮糖。美國專利4，390,627描述了從Protaminobacterubrum,Serratiaplymuthica(紅色精朊桿菌)固定蔗糖變位酶生產異麥芽酮糖的方法。美國專利4,670,387描述了使用Erwiniacarotovora,Protaminobacterubrum,Serratiaplymuthica(粘質沙雷氏菌)的固定化菌體生產異麥芽酮糖的過程，大約可以轉化70-95%蔗糖。美國專利4,857,461公開了從Protaminobacterubrum,Serratiaplymuthica和Erwiniacarotovora菌得到的固定化粗酶連續生產異麥芽酮糖的過程。美國專利No.5,229,276和No.5,336,617描述了用^ro6acz^ri"/zrac/io&"er(放射性土壤桿菌)的固定化菌體生產海藻酮糖和異麥芽酮糖的過程，異麥芽酮糖占10%以下。雖然上述幾種細菌能夠把蔗糖轉變成異麥芽酮糖，但產量很不穩定，轉化率為886%。而且，這些生產異麥芽酮糖的菌株在催化蔗糖轉化過程中，除了主產物外，酶轉化液中還存在海藻酮糖、異麥芽糖、異松三糖及由于蔗糖水解而生成的葡萄糖、果糖副產物，產物特異性不高，一方面降低了目的產物的收率，另一方面使下游過程變得十分困難，生產成本大大增加。我們對不同來源的異麥芽酮糖生產菌進行對比分析。發現大黃歐文氏菌NX-5CGMCCNo.2222轉化所生成的副產物少，更利于進一步工業化生產，如表1所示。近來專利CN1434861涉及兩個新菌株，新加坡克雷伯氏菌(A7e&/e7hsi/7卵/^r朋sh)LX3及LX21，有較高的酶活，異麥芽酮糖的含量超過87%，公開了新型蔗糖異構酶的核苷酸序列以及該基因克隆表達于甘蔗、玉米、甜菜等植物使其生成異麥芽酮糖。篩選能夠高效生產異麥芽酮糖的菌株，進一步理解酶的催化作用機制仍是十分有意義的。
發明內容本發明的目的是提供一種高產蔗糖異構酶的大黃歐文氏菌(Erwiniarhapontici)。本發明的另一個目的是提供利用上述大黃歐文氏菌制備異麥芽酮糖的方法。本發明目的可以通過下列措施來達到本發明人實驗室選育并保藏的微生物菌株大黃歐文氏菌(Erwiniarhapontici)NX-5，目前該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC),保藏單位地址中國.北京市朝陽區大屯路.中國科學院微生物研究所。登記入冊的編號是CGMCCNo.2222，保藏日期是2007年10月22日。以此菌作為生產菌株。CGMCCNo.2222菌株具有下述性質(1)菌落形態學特征在營養瓊脂上，30℃培養24h出現淡黃色小菌落，菌落呈圓形，表面光滑，粘狀，中央凸起，不透明。適當延長培養，菌落增大，細胞的尺寸和形狀變化很小。(2)生理與生化特性a.培養溫度2535°C,最適溫度為30°C;b.在pH58范圍內生長；C.色素產生產黃色素；d.耐NaCl濃度在5%濃度可以生長。(3)營養特征大黃歐文氏菌NX-5的培養基中不需要添加生長因子。有機氮或無機氮都可以作為氮源使用。本發明利用大黃歐文氏菌CGMCCNo.2222生產蔗糖異構酶進而生成異麥芽酮糖的方法是將該菌株接種于含碳源、氮源、無機鹽和水的無菌培養基中進行好氣培養，離心或超濾獲得含蔗糖異構酶的細胞，進而直接采用游離的含蔗糖異構酶的細胞轉化蔗糖生成異麥芽酮糖或固定化含蓆糖異構酶的細胞后轉化蔗糖生成異麥芽酮糖。產酶條件將大黃歐文氏菌NX-5CGMCCNo.2222斜面活化一天后(斜面培養基成分除含有碳源、氮源、無機鹽等之外，還含有2%的瓊脂)，接種于含碳源、氮源、無機鹽和水的無菌培養基中。培養基中各組分的含量均為重量體積百分比，即g/100ml培養基，以下同。碳源用量與培養基之比210g/100ml，氮源用量與培養基之比0.25g/100ml，無機鹽用量與培養基之比0.01lg/100ml，其余為水。培養基的碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉水解液中的一種或多種；氮源為牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、(NH,)2Sft,、NH,C1中的一種或多種；無機鹽為鈉鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽中的一種或多種。培養基的初始pH范圍為6.08.0，發酵溫度2535。C，搖床轉速100200r/min，培養820h，細胞濕重達20g/L,發酵液酶活達2.55.0U/ml，然后離心或超濾獲得含蔗糖異構酶的細胞，離心條件室溫條件下，500010000r/min，1030min。采用超濾法所用超濾膜孔徑0.010.1"m，操作壓力0.10.6Mpa,超濾膜截流分子量為105106道爾頓。蔗糖異構酶酶活測定方法用0.1M的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)配制含40%(w/v)蔗糖和75g/L細胞懸浮液的混合物，取該混合物lml于3CTC的水浴內反應60min后，置于IOO'C的沸水中10min以終止酶反應，然后用自來水冷卻至室溫。反應混合物經過離心和過濾后用HPLC法測定異麥芽酮糖生成量。一個單位的蔗糖異構酶酶活定義為在3(TC下，pH為7.0的條件下每分鐘生成lumol的異麥芽酮糖的酶量。酶法轉化將含蔗糖異構酶的細胞進行固定化，固定化方法為配制13%(即13g/100ml)濃度的海藻酸鈉，加入1025%的細胞(即每100ml海藻酸鈉溶液中加入1025克的細胞)，并添加510%硅藻土(即每100ml海藻酸鈉溶液中加入510克的硅藻土)，再用濃度為14%的CaCl2溶液(g/100ml)將包埋材料海藻酸鈉固定成型，以此作為酶源進行反應。除了海藻酸鈉作為固定化載體包埋外，還可以用卡拉膠、甲殼素等載體包埋細胞。具體地說將游離含蔗糖異構酶的細胞或固定化后含蔗糖異構酶的細胞填充至反應罐中，加入450600g/L的蔗糖溶液，或者將按照上述固定化方法制得的固定化細胞裝入填充式柱反應器中，柱的體積不限。該反應器可以0.55ml/min單向流加或循環連續流加450600g/L的蔗糖溶液，在2535。C的條件下進行酶轉化反應，反應時間1015h，通過調整流速，控制蔗糖的轉化率在90100%之間，收集流出液，濃縮結晶得到異麥芽酮糖。本發明的有益效果本發明篩選到一種能夠高效轉化蔗糖生成異麥芽酮糖的菌株，蔗糖轉化率最高可達99.5%(w/w)，異麥芽酮糖轉化率可達90%,轉化液中異麥芽酮糖濃度可達500g/L，異麥芽酮糖/海藻酮糖比率近10:1，最主要的沒有水解副反應，轉化液中幾乎不含葡萄糖和果糖，另外隨著反應進行也不會從產物異麥芽酮糖轉化為其他成分，這些性質是以往報道的菌株所不具有的，這對工業化生產異麥芽酮糖十分有益。參考
背景技術：
文獻材料對不同異麥芽酮糖生產菌進行對比分析，結果如表1所示<table>complextableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>表l.不同異麥芽酮糖生產菌的比較結果發現大黃歐文氏菌NX-5CGMCCNo.2222轉化所生成的副產物少，更利于進一歩工業化生產。具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一歩說明，但對本發明沒有限制。實施例1斜面培養基蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaC15g/L，瓊脂20g/L，pH7.0。搖瓶培養基蔗糖—)Og/L，酵母膏10g/L，Na3P04.12H205g/L,pH7.0。把大黃歐文氏菌NX-5CGMCCNo.2222在斜面培養基上3(TC培養24h，然后接一環此菌于搖瓶培養基中，30'C培養10h，搖瓶轉速200r/min，得到的發酵液中菌體的含量為20g/L，產酶達2.55.OU/ml，以游離細胞轉化，稱取10g的細胞加入100ml450g/L的蔗糖溶液中(細胞添加量按每100g細胞轉化比55%的蔗糖溶液計)，在30'C的條件下，于搖瓶中振蕩轉化生產異麥芽酮糖，反應時間8h，反應中止后測底物轉化率和產物濃度。蔗糖轉化率為99.5%，異麥芽酮糖轉化率達90%。實施例2以50g/L麥芽糖為碳源，5g/L豆餅粉為氮源，培養基其它成分和菌體培養條件同實施例l，配制1.5%的海藻酸鈉膠體溶液，與生理鹽水調制的菌懸液混合均勻后，加入8%的硅藻土吸附后，用注射器滴入2y。的CaCL溶液中固化，制成直徑約為34,的球狀固定化細胞，于4'C冰箱中靜置數小時，然后傾去上清液，經蒸餾水洗滌2次，將10g濕細胞以海藻酸鈉包埋得到20g固定化細胞，在3(TC的條件下，在搖瓶中以此轉化100ml550g/L的蔗糖溶液，每批轉化時間10h，轉化40批次，得到蔗糖的平均轉化率為99.5%，異麥芽酮糖的平均轉化率為88%。實施例3將葡萄糖225g，玉米漿45g，NaC122.5g，PH6.0，用水定容到4.5L，配成培養基，裝入一個7.5升玻璃攪拌發酵罐中，121'C蒸汽滅菌15min。配制種子培養基蔗糖50g/L，酵母膏10g/L，Na異.12貼5g/L，pH6.0。將大黃歐文氏菌NX-5CGMCCNo.2222接一環于種子培養基中，3(TC培養8h得種子液，將種子液按發酵液體積3%的接種量接入冷卻后的發酵培養基中，3(TC培養(通風量lvvm，攪拌轉速為600r/min)12h。將發酵液在超濾器內進行濾菌處理，超濾膜截流分子量為106道爾頓，操作壓力為0.2MPa，控制溫度5(TC,膜面速度4m/s，將截流得到的90g菌體按實施例2的方法固定化后，裝入2L的反應罐中，加入550g/L的蔗糖溶液900ml，反應溫度3(TC，攪拌轉速50r/min，反應時間13h,蔗糖轉化率為99%,異麥芽酮糖轉化率達85%。實施例4以50g/L淀粉水解液為碳源，20g/L尿素為氮源，培養基其它成分和菌體培養條件同實施例l，稱取160g濕菌體，加無菌水100mL，于3CTC水浴保溫；稱取10g卡拉膠，加無菌水200mL，充分浸泡，加熱溶解。將兩者迅速混合，鋪平板，于4。C冰箱放置30min,凝固后切成2*2*2左右大小的顆粒，再于2mol/LKCl溶液中浸泡30min，使其充分凝固。濾出顆粒用生理鹽水洗滌2-3次，4'C保存備用。所得菌體形成固定化細胞350g，裝入64X45cm的填充床式柱反應器中，(兩根串聯的夾套式固定化柱)，固定化細胞的裝柱量為80%(v/v)，以lml/min的流速單向流加550g/L的蓆糖溶液，30°C的條件下進行酶轉化，15h為一個批次。該裝置連續運行30天，轉化蔗糖溶液55L，得到蔗糖的平均轉化率為99.5%，異麥芽酮糖的平均轉化率為88%。實施例5菌體培養同實施例l，稱取過30目篩的甲殼素，用40%NaOH在80℃下脫乙酰基，然后按濕菌體含量2%配成水溶液，用NaOH調節pH至微酸性；把菌體細胞與等量生理鹽水混勻；用注射針筒把上述混合物滴入3%的Na4PO4溶液中，在磷酸緩沖溶液中浸泡固化24h，即成直徑為2隱的小球。將400g固定化小球裝入至反應罐中，加入2L600g/L的蔗糖溶液，按實施例3的條件進行酶轉化反應，轉化42批次，得到蔗糖的平均轉化率為99%，異麥芽酮糖的平均轉化率為85%。權利要求1、一種大黃歐文氏菌NX-5，其分類命名為大黃歐文氏菌(Erwiniarhapontici)NX-5，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號是CGMCCNo.2222。2、權利要求1所述的大黃歐文氏菌在生產異麥芽酮糖中的應用。3、根據權利要求2所述的應用，其特征在于該應用的具體方法為將該黃株CGMCCNo.2222接種于含碳源、氮源、無機鹽和水的無菌培養基中進行培養，離心或超濾獲得含蔗糖異構酶的細胞，進而直接采用游離的含蔗糖異構酶的細胞轉化蔗糖生成異麥芽酮糖或固定化含蔗糖異構酶的細胞后轉化蔗糖生成異麥芽酮糖。4、根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述培養基中，各組分用量為碳源用量為210g/100ml，氮源用量為0.25g/100ml，無機鹽用量為0.01lg/100ml，其余為水。5、根據權利要求3或4所述的應用，其特征在于所述培養基的碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉水解液中的一種或多種；氮源為牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、(NH.,)2S04、NH4C1中的一種或多種；無機鹽為鈉鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽中的一種或多種。6、根據權利要求3所述的應用，其特征在于將菌株CGMCCNo.2222進行培養的條件是培養基初始pH為6.08.0，培養溫度為2535°C，培養時間為820h。7、根據權利要求3所述的應用，其特征在于采用離心或超濾的方法獲得含蔗糖異構酶細胞，所用超濾膜孔徑0.01-0.1ym，操作壓力0.1-0.6Mpa，超濾膜截流分子量為105106道爾頓。8、根據權利要求3所述的應用，其特征在于含蔗糖異構酶的細胞轉化蔗糖生產異麥芽酮糖是將游離細胞或固定化后的細胞填充至反應罐中，加入450600g/L的蔗糖溶液；或者將固定化細胞裝入填充床式柱反應器中，該反應器以0.55ml/min的流速單向流加或循環連續流加450600g/L的蔗糖溶液，進行酶轉化反應，反應溫度2535。C，每批轉化時間815h。9、根據權利要求8所述的應用，其特征在于固定化細胞是采用海藻酸鈣、卡拉膠或甲殼素作為固定化載體。全文摘要本發明公開一種大黃歐文氏菌(Erwiniarhapontici)NX-5及利用該菌生產蔗糖異構酶進而制備異麥芽酮糖的方法。將該菌株CGMCCNo.2222接種于含碳源、氮源、無機鹽和水的無菌培養基中進行好氣培養，離心或超濾獲得含蔗糖異構酶的細胞，進而直接采用游離的含蔗糖異構酶的細胞轉化蔗糖生成異麥芽酮糖或固定化含蔗糖異構酶的細胞后轉化蔗糖生成異麥芽酮糖。采用該菌株使蔗糖轉化率高達99.5％(w/w)，異麥芽酮糖轉化率達90％，轉化液中異麥芽酮糖濃度達500g/L，無水解副反應，轉化液中幾乎不含葡萄糖和果糖，隨著反應進行也不會使產物異麥芽酮糖轉化為其他成分，對工業化生產異麥芽酮糖十分有益。文檔編號C12P19/12GK101200750SQ20071019075公開日2008年6月18日申請日期2007年11月29日優先權日2007年11月29日發明者虹徐,莎李,璐林,歐陽平凱,環民霞,恒蔡申請人:南京工業大學