專利名稱：：一種弓形蟲的檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種弓形蟲的檢測試劑盒及其檢測方法，尤其涉及一種基于環介導等溫擴增技術的弓形蟲的檢測試劑盒及其相應的檢測方法。
背景技術：
：弓形蟲病是由剛地弓形蟲引起的一種人畜共患的原蟲病。弓形蟲可感染多種動物45種哺乳動物，70種鳥類和5種冷血動物。貓和貓科動物是弓形蟲的終末宿主，在終末宿主體內弓形蟲主要侵襲小腸上皮細胞，造成腸道疾病。而在中間宿主體內，如豬、牛、羊等，弓形蟲侵入腸壁經血液或淋巴進入單核巨噬細胞系統的細胞內寄生，并擴散到全身各處組織器官，如腦、淋巴結、肝、心、肺、肌肉等，造成全身多器官性的病變，對中間宿主的危害相當大。豬是弓形蟲的主要易感動物，據有關報道顯示，我國豬場的弓形蟲感染率最高，約26.6%，最高可達60%。弓形蟲的現有檢測方法很多，大致可以分為三大類，即病原學診斷方法、血清學診斷方法和分子生物學診斷法。病原學診斷方法包括組織學診斷、動物接種試驗和細胞培養法。病原學診斷需要一定數量實驗動物，而且實驗周期較長。血清學診斷方法包括美藍染色試驗(DT)、間接熒光抗體試驗(IFAT)、凝集試驗和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。分子生物學診斷方法主要是聚合酶鏈式反應(PCR),該方法比前兩種方法快速，靈敏，但需要使用特殊的PCR儀，不適于基層應用。
發明內容本發明的目的是提供一種基于環介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技術的快速檢測弓形蟲的檢測試劑盒及其檢測方法。為了實現本發明的目的，本發明的一種弓形蟲檢測試劑盒，包括如下組分(1)LAMP反應液23(iLLAMP反應液含有0.5|imolTris-HCl、0.25pmolKCl、0.25|imol(NH4)2S04、0.04|imol的Triton-100、0.10.2(imol硫酸鎂、535(imol甜菜堿、0.020.04nmol脫氧核苷酸、0.040.06pmol的與弓形蟲AF146527基因或Bl基因結合的內側引物對、0.0040.008|imol的與弓形蟲AF146527基因或Bl基因結合的外側引物對、8U的BstDNA聚合酶和滅菌雙蒸水；(2)陽性對照弓形蟲DNA;(3)陰性對照滅菌雙蒸水；(4)熒光顯色劑；其中LAMP反應液陽性對照陰性對照熒光顯色劑體積配比為23:2:2:1~3。所述的內側引物對為上游內側引物(FIP)和下游內側引物(BIP),所述的外側引物對為上游外側引物(F3)和下游外側引物(B3)。本發明所述的與弓形蟲AF146527基因結合的外惻引物對和與弓形蟲AF146527基因結合的內側引物對為引物組1-7中的一組或兩組，其巾引物組1F3:SEQIDN03B3:SEQIDN04FIP:SEQIDN05BIP:SEQIDN06;引物組2:F3:SEQIDN07B3:SEQIDN08FIP:SEQIDN09BIP:SEQIDNO10;引物組3:F3:SEQIDNOlB3:SEQIDNOllFIP:SEQIDN012BIP:SEQIDN013;引物組4:F3:SEQIDN014B3:SEQIDN015FIP:SEQIDN016BIP:SEQIDN017;引物組5:F3:SEQIDN07B3:SEQIDN018FIP:SEQIDN09BIP:SEQIDN019;引物組6:F3:SEQIDNO20B3:SEQIDN021FIP:SEQIDN022BIP:SEQIDN023;引物組7:F3:SEQIDN024B3:SEQIDN021FIP:SEQIDN022BIP:SEQIDN025。本發明所述的與弓形蟲Bl基因結合的外側引物對和與弓形蟲Bl基因結合的內側引物對為引物組8-16中的一組或兩組，其中引物組8:F3:SEQIDN026B3:SEQIDN027FIP:SEQIDN028BIP:SEQIDN029;引物組9:F3:SEQIDNO30B3:SEQIDN031FIP:SEQIDN032BIP:SEQIDN033;引物組10:F3:SEQIDN034B3:SEQIDN035FIP:SEQIDN036BIP:SEQIDN037;引物組11:F3:SEQIDN038B3:SEQIDN039FIP:SEQIDNO40BIP:SEQIDNO化引物組12:F3:SEQIDN042B3:SEQIDN043FIP:SEQIDN044BIP:SEQIDN045;引物組13:F3:SEQIDN046B3:SEQIDN047FIP:SEQIDN048BIP:SEQIDN049;引物組14:F3:SEQIDNO50B3:SEQIDN051FIP:SEQIDN052BIP:SEQIDN053;引物組15:F3:SEQIDN054B3:SEQIDN055FIP:SEQIDN056BIP:SEQIDN057;引物組16:F3:SEQIDN058B3:SEQIDN059FIP:SEQIDNO60BIP:SEQIDN061。其中，所述的內側引物對和外側引物對是以上述的引物組所列出的作為為一個整體組使用，而且引物組兩組同時使用的時候，應該盡量避免引物二聚體的形成。本發明所述的脫氧核苷酸包括0.020.04pmo1脫氧核糖腺嘌呤核苷酸、0.020.04nmol脫氧核糖鳥嘌呤核苷酸、0.020.04(imol脫氧核糖胞嘧啶核苷酸及0.020.04pmo1脫氧核糖胸腺嘧啶核苷酸，其中脫氧核糖腺嘌呤核苷酸脫氧核糖鳥嘌呤核苷酸脫氧核糖胞嘧嚏核苷酸脫氧核糖胸腺嘧啶核苷酸的濃度比為1:1:1:1。本發明所述的弓形蟲AF146527基因序列為SEQIDNO1。所述的引物組1-7與所述的弓形蟲AF146527基因上6個特定結合區域分別為見表l。表l:引物組l-7與所述的弓形蟲AF146527基因的結合區域引物組引物名稱6個結合區域5'端位置3'端位置<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>本發明所述的弓形蟲B1基因序列SEQIDNO2。所述的引物組8-16與所述的弓形蟲Bl基因上6個特定結合區域分別為見表2。表2:引物組8-16與所述的弓形蟲Bl基因上的結合區域<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>BIP1526154514861505引物組14:F315511570B317461764FIP1588160716331654BIP1718173616571677引物組15:F314621479B316731692FIP1480149715251546BIP1641165915831604引物組16:F319912008B321卯2209HP2029204820692088BIP2161217821132134所述的6個特定區域是每組引物相對結合的特定區域。本發明所述的熒光顯色劑為熒光染料SYBRGREENI。本發明的一種弓形蟲的檢測方法，包括下列步驟(1)待檢樣品DNA的提取；(2)環介導的等溫擴增在三組裝有23pL的LAMP反應液的反應管中分別加入2pL待檢樣品DNA、2pL已知的弓形蟲DNA、2jiL滅菌雙蒸水，同時在水浴鍋上5565。C放置4590分鐘，取出；(3)顯色檢測在反應管中加入13(iL上述的熒光顯色劑；優選的在反應管中加入lpL上述的熒光顯色劑。裝有陽性對照的反應管的顏色變為綠色，裝有陰性對照的反應管的顏色為黃色，如果裝有待檢測樣品的反應管顏色為黃色則說明待檢樣品不含弓形蟲，如顏色變為綠色，則說明樣品中含有弓形蟲。所述的弓形蟲的檢測方法，在步驟(2)中，取出前還可以再調水洛鍋溫度到809(TC反應2~10分鐘，目的是能夠終止反應，以便長期保存反應結果。本發明的反應原理為特殊設計一組用于環介導等溫擴增的引物，該組引物包括兩對引物，即內側引物對(內側上游引物和內側下游引物)和外側引物對(外側上游引物和外側下游引物)。這兩對引物可分別與弓形蟲基因上不同的6個特定區域結合，在有高度鏈置換DNA聚合酶的作用下完成對模板DNA的擴增。擴增過程分為兩個階段(1)反應起始階段一端內側引物先與模板結合并啟動DNA合成。相同一端的外側引物隨后與模板結合啟動DNA合成，并發生鏈置換釋放出含有內側引物序列的DNA單鏈。該單鏈DNA作為模板先后與另一端的內側引物和外側引物結合，啟動DNA合成并發生鏈置換，最后形成一個初始的莖環DNA。而后以該莖環DNA為模板進行合成，反應進入循環階段。(2)反應循環階段內側引物與初始莖環DNA結合啟動鏈置換DNA合成，最后可產生另一個初始莖環DNA和一個新的兩倍莖長度的莖環DNA。這些莖環DNA可作為模板繼續與內側引物結合啟動鏈置換DNA合成，并且每次合成均可使莖環DNA的莖長度成倍增長。經過一個小時的等溫擴增，目的DNA可累積109拷貝。最后通過熒光染料來觀察擴增結果。釆用本發明所提供的弓形蟲的檢測試劑盒檢測弓形蟲，根據弓形蟲基因序列保守區的特定區域設計了兩對引物(內側引物對和外側引物對)，兩對引物和弓形蟲基因序列保守區的六個特定區域的序列完全配對，確保反應的徹底進行，也保證了弓形蟲檢測方法的特異性。本發明的弓形蟲的檢測方法檢測靈敏度高，可檢測出610個拷貝的目的DNA。與PCR檢測方法比較，本發明的方法不需要昂貴的PCR儀，只需普通的金屬水浴鍋即可，并且檢測結果使用熒光染料來觀察即可，操作簡單方便。本發明的弓形蟲的檢測方法特別適于基層臨床醫學檢測工作及現場即時檢測。具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例l試劑盒的制備(l)選用引物組1;(2)配制LAMP反應液將0.5(imolTris-HCl、0.25jimo1KC1、0.25(imol(NH4)2S04、0.04拜olTritonx-lOO、0.1(imolMgSO4、5|amol甜菜堿(Betaine)、0.02umol脫氧核苷酸(dNTPs)、0.04jimo1上游內側引物(FIP)、0.04|imol下游內側引物(BIP)、0.004pmol上游外側引物(F3)、0.004)imol下游外側引物(B3)、8U的BstDNA聚合酶，其余的為滅菌雙蒸水，混合配置23pLLAMP反應液；(3)陽性對照2(iL弓形蟲DNA;(4)陰性對照2pL滅菌雙蒸水；(5)l)iL熒光染料SYBRGREENI。本實施例所用的0.02pmol脫氧核苷酸包括0.02|amol脫氧核糖腺嘌呤核苦酸、0.02pmol脫氧核糖鳥嘌呤核苷酸、0.02jxmol脫氧核糖胞嘧啶核苷酸及0.02pmol脫氧核糖胸腺嘧啶核苷酸。實施例2試劑盒的制備(1)選用引物組2;(2)配制LAMP反應液按照0.5pmolTris-HCl、0.25pmolKCl、0.25fimol(NH4)2S04、0.04|imolTritonx-100、0.2(_imolMgSO4、35|imol甜菜堿(Betaine)、0.04,ol脫氧核苷酸(dNTPs)、0.06|imol上游內側引物(FIP)、0.06pmol下游內側引物(BIP)、0.008|imol上游夕卜側引物(F3)、0.008limol下游外側引物(B3)、8U的BstDNA聚合酶，其余為滅菌雙蒸水，配置23iaLLAMP反應液；(3)陽性對照2pl的弓形蟲DNA;(4)陰性對照2pl的滅菌雙蒸水；(5)3^1的熒光染料SYBRGREENI。本實施例所用的0.04nmol脫氧核苷酸包括0.04jamo1脫氧核糖腺喋呤核苷酸、0.04)imol脫氧核糖鳥嘌呤核苷酸、0.04pmo1脫氧核糖胞嘧嚏核苷酸及0.04pmo1脫氧核糖胸腺嘧啶核苷酸。實施例3試劑盒的制備(1)選用引物組3和4;(2)配制LAMP反應液按照0.5|imolTris-HCl、0.25pmolKC1、0.25pmol(NH4)2S04、0.04(imolTritonx-lOO、0.2|imolMgS04、20|imol甜菜堿(Betaine)、O腳mol脫氧核苷酸(dNTPs)、0.03,1上游內側引物(FIP)、0.03pmol下游內側引物(BIP)、0.006pmol上游夕卜側引物(F3)、0.006,1下游外側引物(B3)和8U的BstDNA聚合酶；(3)陽性對照2fiL的弓形蟲DNA;(4)陰性對照2pL的滅菌雙蒸水；(5)2pL的熒光染料SYBRGREENI。本實施例所用的0.03|imol脫氧核苷酸包括0.03|imol脫氧核糖腺喋呤核苷酸、0.03pmol脫氧核糖鳥嘌呤核苷酸、0.03pmol脫氧核糖胞嘧啶核苷酸及0.03pmol脫氧核糖胸腺嘧啶核苷酸。實施例4除引物序列選用引物組5、引物組6、引物組7、引物組8、引物組9、引物組IO、引物組ll、引物組12、引物組13、引物組14、引物組15、引物組16中的一組或兩組外，其余的步驟同實施例l。實施例5選取弓形蟲血液為檢測對象。(1)血液DNA的提取收集血液，按血液抗凝劑=5:1的比例加入抗凝劑檸檬酸葡萄糖溶液，4。C下6000r/min離心15min，去除上清液，吸取血細胞約lmL懸浮于15mL裂解液中，并于37。C溫育lh，緩慢加入20mg/mL蛋白酶K至100ug/mL，置于50。C水洛中3h,水洛期間間隔5min旋轉液體，冷卻至室溫，加入等體積苯酚,用O.lmol/LTris-Cl平衡pH8.0，緩慢顛轉lh左右使形成乳濁液，室溫6500r/min離心15min，收集水相于新離心管。重復苯酚抽提2次。向最后一次抽提的水相中加入0.2倍體積10mol/L醋酸氨以及2倍體積的乙醇，旋轉離心管混勻液體，形成沉淀，室溫6500r/min離心15min,收集沉淀即為DNA。用70%乙醇洗滌DNA2次。待乙醇揮發后，加入TE溶解DNA，于4'C保存。提取的弓形蟲DNA含有弓形蟲AF146527基因和B1基因上內側引物對和外側引物對所結合的6個特定的區域。(2)環介導的等溫擴增在3支裝有23pL的LAMP反應液的反應管中加入2pL步驟(1)提取得到的弓形蟲DNA,做為檢測組；在3支裝有23[iL的LAMP反應液的反應管中加入2pL弓形蟲DNA，做為陽性對照組；在3支裝有23pL的LAMP反應液的反應管中加入2fxL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應管同時在水洛鍋上55'C放置90分鐘，取出。(3)顯色檢測在反應管中加入lpL熒光染料SYBRGREENI。檢測結果裝有陽性對照組的反應管的顏色變為綠色，裝有陰性對照組的反應管中的顏色為黃色。裝有檢測組的反應管的顏色變為綠色，證明樣品中含有弓形蟲。其中LAMP反應液、弓形蟲DNA、滅菌雙蒸水和熒光染料SYBRGREENI均如實施例1中所述。本實施例檢測的靈敏度最低可檢測到6~10個拷貝的檢測DNA。實施例6(1)、血液DNA的提取方法同實施例5。(2)、環介導的等溫擴增在3支裝有LAMP反應液的反應管中加入2pL步驟(1)提取得到的待檢血液DNA,做為檢測組；在3支裝有23|aL的LAMP反應液的反應管中加入2pL弓形蟲DNA,做為陽性對照組；在3支裝有23|iL的LAMP反應液的反應管中加入2|aL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應管同時在水洛鍋上65'C放置45min,取出。(3)、顯色檢測在反應管中加入lpL熒光染料SYBRGREENI。檢測結果裝有陽性對照組的反應管的顏色變為綠色，裝有陰性對照組的反應管中的顏色為黃色，裝有檢測組的反應管的顏色變為綠色，說明樣品中含有弓形蟲。其中LAMP反應液、弓形蟲DNA、滅菌雙蒸水和熒光染料SYBRGREENI均如實施例1中所述。本實施例檢測的靈敏度最低可檢測到6~10個拷貝的檢測DNA。實施例71、血液DNA的提取同實施例5。2、環介導的等溫擴增在3支裝有23nL的LAMP反應液的反應管中加入2pL步驟(1)提取得到的待檢血液DNA,做為檢測組；在3支裝有23jiL的LAMP反應液的反應管中加入2pL弓形蟲DNA，做為陽性對照組；在3支裝有23|iL的LAMP反應液的反應管中加入2pL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應管同時在水洛鍋上60。C放置70min,取出。3、顯色檢測在反應管中加入3pL熒光染料SYBRGREENI。檢測結果裝有陽性對照組的反應管的顏色變為綠色，裝有陰性對照組的反應管中的顏色為黃色。裝有檢測組的反應管的顏色變為綠色，說明樣品中含有弓形蟲。其中LAMP反應液、弓形蟲DNA、滅菌雙蒸水和熒光染料SYBRGREENI均如實施例2中所述。本實施例檢測的靈敏度最低可檢測到610個拷貝的檢測DNA。實施例81、血液DNA的提取同實施例5。2、環介導的等溫擴增在3支裝有23(aL的LAMP反應液的反應管中加入2pL步驟(1)提取得到的待檢血液DNA，做為檢測組；在3支裝有23|iL的LAMP反應液的反應管中加入2pL弓形蟲DNA,做為陽性對照組；在3支裝有23pL的LAMP反應液的反應管中加入2pL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。于水洛鍋上65'C放置90min，調水浴鍋溫度到80'C反應10min,取出。3、顯色檢測在反應管中加入l)iL熒光染料SYBRGREENI。檢測結果裝有陽性對照組的反應管的顏色變為綠色，裝有陰性對照組的反應管中的顏色為黃色。裝有檢測組的反應管的顏色變為綠色，說明檢測組的樣品中含有弓形蟲。其中LAMP反應液、弓形蟲DNA、滅菌雙蒸水和熒光染料SYBRGREENI均如實施例1中所述。本實施例檢測的靈敏度最低可檢測到6~10個拷貝的檢測DNA。實施例91、血液DNA的提取同實施例5。2、環介導的等溫擴增在3支裝有23pL的LAMP反應液的反應管中加入2(iL步驟(1)提取得到的待檢血液DNA，做為檢測組；在3支裝有23(iL的LAMP反應液的反應管中加入2iiL弓形蟲DNA，做為陽性對照組；在3支裝有23pL的LAMP反應液的反應管中加入2pL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應管同時在水洛鍋上6(TC放置70min，調水洛鍋溫度到90。C反應2min,取出。3、顯色檢測在反應管中加入2pL熒光染料SYBRGREENI。檢測結果裝有陽性對照組的反應管的顏色變為綠色，裝有陰性對照組的反應管中的顏色為黃色。裝有檢測組的反應管的顏色變為綠色，說明檢測組的樣品中含有弓形蟲。其中LAMP反應液、弓形蟲DNA、滅菌雙蒸水和熒光染料SYBRGREENI均如實施例3中所述。本實施例檢測的靈敏度最低可檢測到610個拷貝的檢測DNA。注其他組織的DNA可按照本領域常用的方法提取。序列表<110>中國農業大學<120〉一種弓形蟲的檢測試劑盒及其檢測方法<130><160〉61<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211>529<212>DNA<213>丐形蟲<■>1ctgcsgggsggttgttttttt3tttttttttctttttgtttttctgsttt60ttgttttttttgactcgggcccsgctgcgtctgtcgggstgagaccgcggagccgaagtg120cgttttctttttttgscttttttttgttttttcacaggcssgctcgcctgtgcttggsgc180cacagssggg3csg33gtcg3aggggsctacagacgcgstgccgctcctccsgccgtctt240tstcaggsctgtagstgaaggcg3gggtgsggatgagggggtggcgtggt300tggg33gcg3cgagsgtcgggatgtttccggcttggctgcttttcctggs360gggtgg333agastgcgstccagscgagacgacgctttcctcgtggtg3t420ggcggsgsg33ttg33g3gtgcgagggsgacsgsgtcggaggcttggscg480gaggggtagg3g3gg33tccagstgcsctgtgtctgcsg529<210>2<211>2214<212>DNA<213>丐形蟲<400>2gaattcgttcgacagaaagggagcaagagttgggactasi3tcg33gctgsgatgctcas360gtcgsccgcgsg3tgc3cccggctgsctcgaaccagatgtgct333ggcg1201"1"1"rrni"rrt1"「1"rr1~n廣十a1~180cgcctccttcgtccgtcgt3ststcaggccttctgttctgttcgctgtctgtctagggc3240cccttactgctttgsggtcstatcgtcccatgaagtcgacC3cctgtttc300CtCtCttC3Ctgtcacgtacgscstcgcsttcasgggsagg3tctcgttc360gtgtattcgsgtccgccccctgaagaatgc33csttcttg420tgctgcctcctctcstggc3aatgccagaagsagggtscgtgttgcatca480tgt3tttcccgctggcs33ttgtscctccag3a33gcc3cctsgtstcgt540gcggc33tgtgccscctcgcctcttgggsg3g3g3cgctgccgctgtttt600gca33tga33sggsttC3ttttcgcagtacacc3gg3gt"tgg3ttttgtagsgcgtctct660cttcasgcsgcgt3ttgtcg3gt3gstcsg33sggaactgC3tccgttc3tgagtataag720gagacgctaatgtgtttgc3taggttgcagtcsctg3cga780gctcccctctgctggcgaaasgtga33ttcatgagtatctgtgc3sctttggtgtattcg840cag3ttggtcgcctgcs3tcg3tsgttg3catcgtgasagactgcggatg3CttC3CtCCcgtcgcaccagatgcctagacgtgttatgaggaacatattsggg3tgctcagaaaatggc3C3gtatcsc3cg3sagggggtcgcacc3aagagatggsgtgaaccaccacttcsctttgtgc3g33gc3ttgcccgtccctccattccgt3C3gtcttcttcttttagcctc33七3gcaggstgscgcccaccgacgssctctctgtsgtscsgsgacgtgtcatcsggagcsttttt3gastgcacctttcggscctcgtctcttcaagasctatctgtgtcgacascagaacagctgcsgtccgg33sgt3gc3cctasactgctaagsscgtcgccgctsctgcccagttgtcstga33ttsatattgttagtaaagC3ttC3333tgca33ccatgcgcagccatC3gctt33C3cttctgaaaatggsttscttcta33gcgtttctaaagtagccgc3csatgcatgttgtgcctcsccccccsgctcgtgcg<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>33aggcgsgggtgsgg3tg<210>4<211〉18<212>DNA<213>人工序列<400>4sgcctccgsctctgtctc<210>5<211>42<212〉DMAC3cgascgcttt333g33c3ggaga3g33g900gagatagaagtcgctgcggagacagcgaag960gcagcagaggagtgccgggcaagaaaatga1020acaastctattgaggtttcgcgsagaggag1080sgscgtgccgcatgtcgctaagcc3tcgg31140attacagttccgttgattcgtctgatggtg1200sactggct3gttgtt3ttttgaagasgacg1260aaaatcgatggtgtcacgttttttgtcaga1320aaactgcaacaactgctctagcgtgttcgt1380a3g3ga3cattcc3gc3scttctgcctttg1440tccctcct3tctttcsgcc33cccagc33a15Q03g33ggc3333cgcgccatc3cg33csctc1560acs3ggttggtcgcttasttttctgt3tst162033caaccgtgcsa33gg3tcgccacctggt1680tatatctctcaaggaggactggcaacctgg1740atsgaaagccstgaggc3Ctccaacgggcg1800acggtccgggtga33cwtagagagtsctg1860ccatcgacgtagacccagaaatgaggcgag1920agttccggtcgagaggctaaaccacaaaag1980aaagcagttggtgatggttgcctcgagttc2040cccaccacgcagaatcatgctttcccagtg2100cggastgctaaggggstcgcctaLcgtagc32160ctcattctcctttcgtgcgcggct2214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組9:F3:SEQIDNO30B3:SEQIDNO31FIP:SEQIDNO32BIP:SEQIDNO33;引物組10:F3:SEQIDNO34B3:SEQIDNO35FIP:SEQIDNO36BIP:SEQIDNO37;引物組11:F3:SEQIDNO38B3:SEQIDNO39FIP:SEQIDNO40BIP:SEQIDNO41;引物組12:F3:SEQIDNO42B3:SEQIDNO43FIP:SEQIDNO44BIP:SEQIDNO45;引物組13:F3:SEQIDNO46B3:SEQIDN047FIP:SEQIDN048BIP:SEQIDN049;引物組14:F3:SEQIDNO50B3:SEQIDN051FIP:SEQIDN052BIP:SEQIDN053;引物組15:F3:SEQIDN054B3:SEQIDN055FIP:SEQIDN056BIP:SEQIDN057;引物組16:F3:SEQIDN058B3:SEQIDN059FIP:SEQIDNO60BIP:SEQIDN061。4、如權利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的脫氧核苷酸包括如下組分0.020.04nmo1脫氧核糖腺嘌呤核苷酸、0.020.04pmo1脫氧核糖鳥嘌呤核苷酸、0.020.04|imol脫氧核糖胞嘧啶核苷酸及0.02~0.04pmol脫氧核糖胸腺嘧啶核苷酸，其中脫氧核糖腺嘌呤核苷酸脫氧核糖鳥嘌呤核苷酸脫氧核糖胞嘧嗖核苷酸脫氧核糖胸腺嘧啶核苷酸的濃度比為1:1:1:1。5、如權利要求1-4任一所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的熒光顯色劑為熒光染料SYBRGREENI。6、一種利用權利要求1-5任一項所述的試劑盒檢測弓形蟲的方法，其包括下列步驟(1)待檢樣品DNA的提取；(2)環介導的等溫擴增在三組裝有23pL的LAMP反應液的反應管中分別加入2pL待檢樣品DNA、2pL弓形蟲DNA、2pL滅菌雙蒸水，在水洛鍋上5565。C放置4590分鐘，取出；(3)顯色檢測在反應管中加入l3pL的熒光顯色劑。7、如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的步驟(3)中在反應管中加入lpL的熒光顯色劑。8、如權利要求6或7所述的檢測方法，其特征在于，所述的步驟(2)還包括調水浴鍋溫度到8090。C反應210分鐘。全文摘要本發明提供了一種弓形蟲的檢測試劑盒，其包括如下組分(1)LAMP反應液；(2)陽性對照；(3)陰性對照；(4)熒光顯色劑。本發明還提供了一種應用本發明的弓形蟲檢測試劑盒檢測弓形蟲的檢測方法。采用本發明的弓形蟲檢測試劑盒和檢測方法，檢測靈敏度高，6～10個拷貝即可檢測出目的DNA，操作簡單方便，特別適于基層臨床醫學檢測工作及現場即時檢測。文檔編號C12Q1/68GK101182583SQ200710178190公開日2008年5月21日申請日期2007年11月27日優先權日2007年11月27日發明者吳文學,凱師,張躍偉,朱引潔,王文歡,勛索,杰鄒,郭盼盼申請人:中國農業大學