專利名稱：：東方伊薩酵母的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及東方伊薩酵母的新用途，具體地說是在木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物發(fā)酵中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：以非糧食物質(zhì)一木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乙醇是保證國(guó)家能源安全、保護(hù)環(huán)境、使我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一。木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物的成分葡萄糖+木糖的混合糖濃度6%,乙酸10g/L，糠醛2g/L,羥甲基糠醛lg/L，并含有酚類化合物和芳香烴類化合物。木質(zhì)纖維素的高效快速水解以及水解產(chǎn)物的高效乙醇發(fā)酵是國(guó)內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)燃料乙醇的兩個(gè)技術(shù)瓶頸。在木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中除含有混合糖外，還含有糠醛、羥甲基糠醛，酚類化合物等發(fā)酵抑制劑，嚴(yán)重地影響著微生物的生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵。在木質(zhì)纖維素中，占纖維素原料20-30%的半纖維素水解主要產(chǎn)物是木糖。葡萄糖可被傳統(tǒng)釀酒酵母發(fā)酵成酒精，而木糖則傳統(tǒng)釀酒酵母不能轉(zhuǎn)化成酒精，因此，木質(zhì)纖維素原料酒精發(fā)酵的菌種，除具有高效轉(zhuǎn)化葡萄糖產(chǎn)酒精和抑制劑外，應(yīng)具有轉(zhuǎn)化木糖的能力。研究表明糠醛量達(dá)到lg/L時(shí)，乙醛脫氫酶的活性下降70%以上,如果有其他的抑制物協(xié)同作用時(shí),其活性將會(huì)更低；在含有1.35g/L5-羥甲基糠醛、0.37g/L糠醛的水解產(chǎn)物中以a5h-l的稀釋率發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)糠醛能被降解63%，5-羥甲基糠醛能被降解43%，葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為70%;利用細(xì)胞固定化和細(xì)胞循環(huán)的方法進(jìn)行發(fā)酵，在稀釋率數(shù)為0.2h-l，發(fā)酵失??；水解產(chǎn)物含有0.7g/L糠醛，0.16g/L5-羥甲基糠醛，釀酒酵母在加入水解產(chǎn)物的體積占培養(yǎng)基總體的90%時(shí)生長(zhǎng)停止；含有2g/L糠醛的合成培養(yǎng)基中，工業(yè)和實(shí)驗(yàn)用途的釀酒酵母都不能生長(zhǎng)；將幾種釀酒酵母菌株接到含有l(wèi)g/L糠醛的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)所有被測(cè)菌株均不能生長(zhǎng)；利用Sflcc/iflramycescewv^aeCBS8066在含有0.95g/L糠醛不經(jīng)過任何脫毒處理的水解液批式發(fā)酵，己糖的利用率僅為23%，細(xì)胞數(shù)量減少99%，同時(shí)在這過程中葡萄糖和其他水解產(chǎn)物沒有明顯減少。木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物用東方伊薩酵母(/ssflfc/^whaY4進(jìn)行乙醇發(fā)酵，快速降解木質(zhì)纖維素水解物中發(fā)酵抑制劑，高效代謝水解物中的葡萄糖產(chǎn)乙醇。該項(xiàng)技術(shù)在國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供東方伊薩酵母(/^"fc/ie"A^在木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物發(fā)酵中的應(yīng)用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，利用東方伊薩酵母對(duì)木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵可快速降解水解產(chǎn)物中的發(fā)酵抑制劑、高效代謝水解產(chǎn)物中的葡萄糖成乙醇。下面通過具體實(shí)驗(yàn)來說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。培養(yǎng)基酵母浸膏3g/L、KH2P043g/L、麥芽提取物3g/L、(NH4)2S04lg/L、MgS04.7H200.5g/L、胰蛋白胨3g/L,其余為木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物原液，PH5.0培養(yǎng)條件連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，30°C,80rpm,接種量為10%。結(jié)果表l乙醇發(fā)酵重復(fù)實(shí)驗(yàn)l<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由表1~3可以看出東方伊薩酵母具有降解葡萄糖生成乙醇的能力，并且能夠降解抑制劑糠醛以及5-羥甲基糠醛的能力。本發(fā)明經(jīng)過大量工作從環(huán)境中分離篩選得到了一株降解葡萄糖以及抑制劑綜合性能較好的東方伊薩酵母(/ss^c/ie"hflon'e"ta"s)新菌株，將其命名為Y4，該菌株已于2007年9月11日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCCNo.2159。本發(fā)明進(jìn)一步通過對(duì)菌種的馴化提高菌種的耐毒能力，下面是馴化的方法YPD培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，胰蛋白胨20,酵母浸膏10，pH5.0。水解產(chǎn)物馴化培養(yǎng)基(g/L):酵母浸膏3,KH2P043,麥芽提取物3,(NH4)2S041，MgSO4.7H2O0.5,胰蛋白胨3，水解產(chǎn)物原液，pH5.0。將Y4菌株在YPD培養(yǎng)基中富集，接種量1%,30°C，150rpm,培養(yǎng)48h。將富集好的菌液分別離心去上清，接種到水解產(chǎn)物的馴化培養(yǎng)基中，Y4搖床培養(yǎng)，30°C，80rpm。每24h取樣，測(cè)定葡萄糖、木糖殘量以及乙醇和木糖醇含量。同樣方法馴化培養(yǎng)三次，每次挑選優(yōu)秀菌株，表4是經(jīng)三次馴化培養(yǎng)后挑選得到的菌株生產(chǎn)性能。表4馴化培養(yǎng)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>經(jīng)過馴化培養(yǎng)后，馴化菌株對(duì)葡萄糖及木糖的轉(zhuǎn)化能力有所提高。本發(fā)明還給出了東方伊薩酵母(/^flfc/iewA^乙醇發(fā)酵的條件發(fā)酵培養(yǎng)基的成分(范圍值)酵母浸膏2-5g/L、KH2P042-5g/L、麥芽提取物2-5g/L、(NH4)2S040.5-2g/L、MgS04.7H200.5-1.5g/L、胰蛋白胨2-5g/L，其余為木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物原液，調(diào)節(jié)pH至4.5-6.0。優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基成分酵母浸膏3g/L、KH2P043g/L、麥芽提取物3g/L、(NH4)2S04lg/L、MgS04.7H200.5g/L、胰蛋白胨3g/L、其余為水解產(chǎn)物原液、pH5.0。發(fā)酵條件(范圍值):28-35。C，50-100rpm優(yōu)選發(fā)酵條件30°C，80rpm。利用Y4及其馴化菌株對(duì)木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵可快速降解發(fā)酵抑制劑、高效代謝葡萄糖產(chǎn)乙醇，為降低木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的成本，進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了可靠基礎(chǔ)。圖l是基于26SrDNADl/D2區(qū)域序列和Neighbor-Joining分析繪制的系統(tǒng)樹。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例lY4的分離鑒定Y4分離方法從某糠醛廠附近的土壤表層下深l-5厘米處釆集土樣，并將釆集到的土樣活化后加入到Y(jié)PD培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，然后取10mL富集后的菌液分別接入到含有90mL水解液培養(yǎng)基(酵母浸膏3g/L、KH2P043g/L、麥芽提取物3g/L、(NH4)2S04lg/L、MgS04.7H201g/L、胰蛋白胨3g/L,其余為木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物原液，調(diào)節(jié)pH至5.0-6.0)的250mL三角瓶中，80rpm,30。C培養(yǎng)48h,再將此培養(yǎng)液取10mL接入到90mL新鮮的相同培養(yǎng)基中，繼續(xù)在80rpm,3(TC條件下培養(yǎng)48h，如此反復(fù)，經(jīng)過4-5次轉(zhuǎn)接后，取10uL經(jīng)過一定梯度稀釋后的培養(yǎng)液涂布到相同培養(yǎng)基固體平板上，30°C條件下培養(yǎng)48h后，挑取典型酵母形態(tài)的單菌落，再在相同培養(yǎng)培養(yǎng)基固體平板上重復(fù)劃線純化三次后，4。C保存。然后通過水解液發(fā)酵實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)這些分離出來的菌株在發(fā)酵過程中的乙醇產(chǎn)率、發(fā)酵周期及對(duì)水解液中發(fā)酵抑制劑的降解情況，最后根據(jù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出效果較好的菌株。Y4的鑒定通過形態(tài)特征觀察、生理生化測(cè)定及26SrDNADl/D2區(qū)域基因序列分析結(jié)果對(duì)Y4進(jìn)行鑒定。一形態(tài)特征觀察菌落白色、形狀不規(guī)則、平坦、干燥，呈豆?fàn)罘植?，有菌絲體外延，培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間后，芽生孢子延長(zhǎng)呈樹狀交錯(cuò)，假菌絲分支分布，細(xì)胞呈臘腸形或長(zhǎng)橢圓形。二生理生化實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果發(fā)酵實(shí)驗(yàn):葡萄糖D-半乳糖麥芽糖乳糖棉子糖纖維二糖淀粉+--一---同化生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)(1)以下列化合物作唯一碳源同化生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn):<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(2)以下列化合物作唯一氮源同化生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn):<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(3)好氧條件下以D-葡萄糖作為唯一碳源的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn):<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(4)其它實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>三26SrDNADl/D2區(qū)域基因序列分析用酵母基因組DNA提取試劑盒(由天根生化科技(北京)有限公司提供)提取Y4的全DNA，然后以提取出來的全DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向引物NL1:5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'反向引物NL4:5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。按以下的反應(yīng)條件共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)94°C,lmin;53°C，lmin;72°C，lmin20s。所得PCR產(chǎn)物由北京華大基因公司進(jìn)行純化及序列測(cè)定。將測(cè)定出來的Y4的26SrDNADl/D2區(qū)域序列與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)，采用ClustaIX軟件進(jìn)行匹配排列(align),用MEGA3.1軟件中的neighbor-joining分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1000次Bootstraps檢驗(yàn)，最后用TreeView軟件顯示系統(tǒng)樹。實(shí)驗(yàn)得到600bp左右的基因序列，在GeneBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索(RID:2V1HRAK015),Y4與Issatchenkiaorientalis(AB281299)的源性超過99%，符合Kuttzman&Robnett所定的同種內(nèi)不同菌株間差異不超過1%的標(biāo)準(zhǔn)。圖1是根據(jù)26SrDNA的Dl/D2區(qū)域序列所作的系統(tǒng)發(fā)育樹。實(shí)施例2Y4的乙醇發(fā)酵Y4菌株接種到含有酵母浸膏3g/L、KH2P043g/L、麥芽提取物3g/L、(NH4)2S04lg/L、MgS04.7H200.5g/L、胰蛋白胨3g/L、水解產(chǎn)物原液、pH5.0的培養(yǎng)基中，30°C,80rpm培養(yǎng)，24h內(nèi)利用完葡萄糖，并且在發(fā)酵過程中，木糖也逐漸減少，經(jīng)過72小時(shí)后，木糖被完全消耗。乙醇的最高產(chǎn)量達(dá)到理論值(理論產(chǎn)率為0.51g/g)的96.1%。權(quán)利要求1、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)在木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物發(fā)酵中的應(yīng)用。2、如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用東方伊薩酵母(/Mflfc/e"h'fl對(duì)木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵來生產(chǎn)乙醇。3、如權(quán)利要去l所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的東方伊薩酵母為東方伊薩酵母(/^flfc/^"h'aon'e"tofc)Y4及其馴化菌株。4、如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)條件為28-35°C,50陽100rpm。5、如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)條件為30。C，80rpm。6、如權(quán)利要求25任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母浸膏2-5g/L、KH2P042-5g/L、麥芽提取物2-5g/L、(NH4)2S040.5-2g/L、MgS04.7H200.5-1.5g/L、胰蛋白胨2-5g/L,其余為木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物原液，調(diào)節(jié)PH至4.5-6.0。7、東方伊薩酵母(/ssflfc/e打A^on'e"tofo)Y4CGMCCNo.2159。全文摘要本發(fā)明提供了東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)在木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物發(fā)酵中的應(yīng)用。利用東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)及其馴化菌株對(duì)木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵可快速降解發(fā)酵抑制劑、高效代謝葡萄糖產(chǎn)乙醇，為降低木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的成本，進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了可靠基礎(chǔ)。此外，本發(fā)明還提供了一株東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)高效發(fā)酵菌株Y4。文檔編號(hào)C12N1/16GK101165165SQ20071017571公開日2008年4月23日申請(qǐng)日期2007年10月10日優(yōu)先權(quán)日2007年10月10日發(fā)明者楊秀山申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)