一種位點特異重組酶、其制備方法及應用的制作方法

專利名稱：一種位點特異重組酶、其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于遺傳工程領域，涉及一種位點特異重組酶、其制備方法及應用。
背景技術：
位點特異性重組是重組的一類，只發生在特異DNA區域，有短的同源順序， 重組的蛋白是int等，如噬菌體1的定點插入。在位點特異性重組 (site-specific recombination)中，DNA節段的相對位置發生了移動，從而 得到不同的結果一DNA序列發生重排。位點特異性重組不依賴于DNA順序的同源 性(雖然亦可有很短的同源序列)，而依賴于能與某些酶相結合的DNA序列的存 在。這些特異的酶能催化DNA鏈的斷裂和重新連接，它們能發動位點特異性重組 作用。利用位點特異性重組，可以方便的將外源基因定點重組到宿主基因組中， 大大提高了研究外源基因功能的效率。也有一些科學家利用利用位點特異性重組 研究基因治療問題，所以開發高效特異的位點特異性重組酶是本領域的熱點之

發明內容
本發明目的之一是提供一種高效特異的位點特異性重組酶。 本發明目的之二是提供上述位點特異性重組酶的制備方法。
本發明提供了一種位點特異重組酶，該位點特異重組酶特異性的識別下列 結構式所示脫氧核苷酸序列，在箭頭位置裂解所示脫氧核苷酸序列，并將 attB識別位點的序列與下列結構式所示序列在裂解位點重新連接，
其中，A、 T、 G和C分別代表腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。本發明中將
這種位點特異重組酶稱為ZHHZA蛋白。上述結構式所示脫氧核苷酸序列即小鼠 MpsLl序列(NCBI登錄號為AC079573,取其中的15361-15579)位點。
本發明中，"ZHHZA蛋白"除了SEQ ID NO 2所示序列外，還包括SEQ ID N02序列的變異形式。這些變異形式包括若干個(通常為l-50個，較佳地1-30 個，更佳地1-20個，最佳地1-IO個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C 末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為IO個以內，更佳 地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取 代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端或N末端添加一個或數個 氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。
本發明中，attB識別位點是指細菌基因組上由至少34個堿基組成 的特異性附著點。
本發明還提供了上述點特異重組酶Z冊ZA蛋白的制備方法，該方法包括以 下步驟
(1) 以MpsLl位點為耙點構建含有溫度敏感型的lac阻遏基因的篩選 載體pRES- MpsLl;
(2) 以序列如SEQ ID NO 1所示核酸序列為模板，利用易錯PCR技術， 獲得位點特異重組酶突變DNA產物；
(3) 將(2)所得DNA產物的核酸序列插入pINT載體多克隆位點，構 建重組質粒pINT-T;
(4) 在原核細胞上利用藍白斑實驗篩選位點特異重組酶；最終篩選出 克隆獲得的位點特異重組酶即進化的位點特異重組酶。
本發明中，還可以將步驟(4)所的位點特異重組酶在真核細胞上進一步篩 選，進行重組分析。
本發明中，進行重組分析可以是測定重組得到的序列，確定其是否是由 attB識別位點的序列小鼠MpsLl序列重組得到。
本發明還提供了上述位點特異重組酶的應用，即將該位點特異重組酶作為 工具酶應用于基因的定點導入重組。
本發明還提供了上述位點特異重組酶Z朋ZA蛋白的應用，即將該位點特異 重組酶突變體應用于基因定點特異性重組。
本發明中，ZHHZA蛋白應用的宿主細胞可以是非分裂細胞或者分裂細胞。其 中，非分裂細胞可以是神經元細胞、膠質細胞或者干細胞；非分裂細胞也可以是 原代細胞。
本發明的Z朋ZA蛋白，主要識別基因組MpsLl (NCBI登錄號為AC079573， 取其中的15361-15579)位點，重組活性顯著提高，因而，本發明的ZHHZA蛋白 將成為遺傳工程技術操作，尤其是基因定點插入重組的有效工具，而且為基因功 能分析和基因治療的研究開辟了新途徑。


圖l是位點特異重組酶ZHHZA蛋白活性檢測對照圖。即編碼①C31位點特 異重組酶質粒轉化攜帶有篩選載體pRES-mpsLl細菌經溫度誘導后4小時藍白斑 結果。
圖2是位點特異重組酶ZHHZA蛋白活性檢測結果圖。即Z冊ZA蛋白轉化攜 帶有篩選載體pRES- mpsLl細菌經溫度誘導后4小時藍白斑結果。與圖l相比， Z朋ZA蛋白具有較高活性。
具體實施例方式
實施例1篩選載體pRES- MpsLl制備方法 從小鼠組織中抽提基因組DNA,以MpsLl位點設計引物(上游 5' -TGAAGCCACTCTGGTCTAC-3'，下游5' -CAGCACACTGTGAATAAATG-3，)，經PCR方法， 獲得218bp MpsLl序列并測序鑒定。然后，將含有EcoRI酶切位點MpsLl產物克 隆于同樣經EcoRI酶切而除去WA位點的pRES-WA質粒，由此獲得篩選載體 pRES- MpsLl。
實施例2 OC31整合酶的突變體質粒庫制備方法
以野生型OC31整合酶(pCMVInt載體)為模板，合為帶有突變的引物(引 物Cl:5' -TAACTGTTAGGGTCGTGACCG-3，禾卩C2:5' —CTTGGCAAAGGTACGCCTCTA-3)， TaqDNA聚合酶進行致錯PCR;具體參數為94'C lmin，94'C 50 s, 72 。C lmin30s, 30個循環，72。C 3min。獲得隨機突變的OC31整合酶PCR產物(l. 9kb).
制備①C31整合酶的突變體質粒庫具體參數為將5—6Pg的0C31整合酶 突變DNA產物用O. 15單位的DNAasel在100W的反應體系中室溫下反應20分鐘。 整合酶基因的片段在1. 6%NuSieve的凝膠上進行電泳，將50 — 250bp的片段從 膠上切割下來，DNA片段通過0—Agarase與低熔點凝膠分離開來。在PCR儀上 進行了 50-60輪不帶引物的PCR擴增，獲得隨機重組產物。以隨機重組產物為模 板，C1和C2為引物進行進一步的PCR擴增，PCR產物中的1.9kb的片段通過凝 膠電泳分離出來。將。C31整合酶的突變重組基因經合適酶切后克隆到PINT-T 表達載體，其連接反應被Micropure—EZ柱清洗之后又通過Microcon YM_100 旋轉透析柱進行純化濃縮，獲得。C31整合酶的突變體質粒庫。
實施例3 Z朋ZA蛋白在原核細胞上活性驗證
將ZHHZA蛋白基因序列裝入pINT-T表達載體后，轉化已攜帶有pRES- MpsLl 載體的￡ 細胞，涂于X-gal平板上.經不同溫度誘導(先經3CTC后到37°C)， 觀察藍色克隆出現時間(3-12h)、顏色深淺以及數量。
結果如圖1和圖2所示，經溫度誘導后4小時后，表達有ZHHZA蛋白的平 板上克隆中幾乎都為藍色，而且藍色較深，而以。C31位點特異重組酶為對照的 平板上，藍色克隆較少，而且顏色偏淡。這說明，Z朋ZA蛋白具有較高活性。
實施例4 ZffiKA蛋白在真核細胞上活性驗證
將構建ZHHZA蛋白真核表達載體和攜帶有attB位點的真核表達載體，轉染 小鼠3T3細胞，48小時之后將200Pg/ml的潮霉素B作用于30%的轉染細胞，經 14天藥物篩選，克隆計數；單克隆擴增，利用DNEasy抽提DNA;利用PCR方法 檢測重組結果。PCR產物的測序結果如SEQ ID NO 3所示。經分析，前10bp是 attB位點序列，交換中心TTG (nt. 11-13)后為小鼠基因組卿sLl位點序列。這 說明，本發明的Z朋ZA蛋白可以特異性的介導mpsLl位點基因重組。
實施例5 ZHHZA蛋白在真核細胞上驗證整合效率
將50ng的質粒pHZ—attB和5Pg的表達突變體質粒共轉染小鼠3T3細胞， 4)C31整合酶的質粒pCmv—Int作對照，使用Lipofectamine方法來完成。在轉 染48小時后，將轉染細胞中的70%進行組織DNA抽提。基因組DNA通過DNEasy 組織試劑盒進行抽提。這些DNA被用來進行定量PCR檢測，來發現位于即sLl 位點的重組頻率。依據attB序列和mpsLl位點序列設計PCR正向引物和反向引 物，另在attB序列整合在mpsLl位點結合區設計一個探針，主要被使用探測在 mpsLl位點發生了位點特異性反應。PCR的定量檢測是通過SYBR Green試劑盒 (Finzymes， F-430S)來完成的，在一臺ABI7700儀器中進行擴增反應；通過 SDS v1.7軟件進行結果分析。每一個樣品進行三次檢測，而且每一次轉染至少 進行三次。重組連接的數量和使用DNA的量可通過來自于包含有單獨一個位于 mpsLl位點的整合事件的293細胞系的基因組DNA作為標準來計算的。
結果顯示，本發明的ZHHZA蛋白具有較高的整合效率。
實施例6 ZHHZA蛋白在真核細胞上驗證整合特異性
將構建Z朋ZA蛋白真核表達載體和攜帶有attB位點的真核表達載體，轉染 小鼠3T3細胞，48小時之后將200fxg/ml的潮霉素B作用于30%的轉染細胞，經 14天藥物篩選，克隆計數；單克隆擴增，利用DNEasy抽提DNA;利用PCR檢測 OC31整合酶突變體介導在小鼠細胞基因組MpsLl靶位點上的整合的克隆數，該 克隆數與總克隆數之比即整合特異性效率。用同樣的方法計算①C31整合酶的整 合特異性效率，作為對照。
結果顯示，本發明的ZHHZA蛋白在識別小鼠細胞基因組MpsLl靶位點后， 整合特異效率比現有的OC31整合酶更高。
序列表
<110〉 復旦大學
<120> —種位點特異重組酶、其制備方法及應用 〈160〉 3
<170> Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211> 1842
<212〉 DNA
<213〉 Homo sapiens
<220〉
<221> CDS
<222〉 (1)..(1842)
<223>
<400〉 1
tac 48 Tyr
atg aca caa ggg gtt gtg acc ggg gtg gac eicg tac gcg ggt get Met Thr Gin Gly Val Val Thr Gly Val Asp Thr Tyr Ala Gly Ala 15 10 15
gac cgt cag tcg cgc gag cgc gag aat tcg Asp Arg Gin Ser Arg Glu Arg Glu Asn Ser 20 25
age gca gca age cca gcg Ser Ala Ala Ser Pro Ala 30
96
aca cag cgt age gcc aac gaa gac aag gcg Thr Gin Arg Ser Ala Asn Glu Asp Lys Ala 35 40
gcc geic ctt cag cgc gaa Ala Asp Leu Gin Arg Glu 45
144
gtc gsg cgc gsc ggg ggc egg ttc sgg ttc Val Glu Arg Asp Gly Gly Arg Phe Arg Phe 50 55
gtc ggg cat ttc age gaa Val Gly His Phe Ser Glu 60
192
gcg ccg ggc acg tcg gcg ttc ggg acg gcg gag cgc ccg gag ttc g犯 240 Ala Pro Gly Thr Ser Ala Phe Gly Thr Ala Glu Arg Pro Glu Phe Glu 65 70 75 80
cgc ate ctg aac gaa tgc cgc gcc ggg egg Arg lie Leu Asn Glu Cys Arg Ala Gly Arg 85 90
etc aac atg ate att gtc Leu Asn Met lie lie Val 95
288
tat gac gtg tcg cgc ttc tcg cgc ctg aag gtc atg gac gcg att ccg 336 Tyr Asp Val Ser Arg Phe Ser Arg Leu Lys Val Met Asp Ala lie Pro 100 105 110
att gtc tcg gaa ttg etc gcc ctg ggc gtg acg att gtt tec act cag 384 lie Val Ser Glu Leu Leu Ala Leu Gly Val Thr lie Val Ser Thr Gin 115 120 125
gaa ggc gtc ttc egg cag gga aac gtc atg gac ctg att cac ctg att 432 Glu Gly Val Phe Arg Gin Gly Asn Val Met Asp Leu lie His Leu lie 130 135 140
atg egg etc gac gcg tcg cac aaa gaa tct tcg ctg aag tcg gcg aag 480 Met Arg Leu Asp Ala Ser His Lys Glu Ser Ser Leu Lys Ser Ala Lys 145 150 155 160
att etc gac acg aag aac ctt cag cgc gaa ttg ggc ggg tac gtc ggc 528 lie Leu Asp Thr Lys Asn Leu Gin Arg Glu Leu Gly Gly Tyr Val Gly 165 170 175
ggg aag gcg cct tac ggc ttc gag ctt gtt tcg gag acg aag gag ate 576 Gly Lys Ala Pro Tyr Gly Phe Glu Leu Val Ser Glu Thr Lys Glu lie 180 185 190
acg cgc aac ggc cga atg gtc aat gtc gtc ate aac aag ctt gcg cac 624 Thr Arg Asn Gly Arg Met Val Asn Val Val lie Asn Lys Leu Ala His 195 200 205
tcg acc act ccc ctt acc gga ccc ttc gag ttc gag ccc gac gta ate 672 Ser Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Phe Glu Phe Glu Pro Asp Val lie 210 215 220
egg tgg tgg tgg cgt gag ate aag acg cac aaa cac ctt ccc ttc aag 720 Arg Trp Trp Trp Arg Glu lie Lys Thr His Lys His Leu Pro Phe Lys 225 230 235 240
ccg ggc agt caa gcc gcc att cac ccg ggc age ate acg ggg ctt tgt 768 Pro Gly Ser Gin Ala Ala lie His Pro Gly Ser lie Thr Gly Leu Cys 245 250 255
aag cgc a/tg gac get gac gcc gtg ccg acc egg ggc gag acg att ggg 816 Lys Arg Met Asp Ala Asp Ala Val Pro Thr Arg Gly Glu Thr lie Gly
260 265 270
aag a_ag acc get tea age gcc tgg gac ccg gca acc gtt atg cga ate 864 Lys Lys Thr Ala Ser Ser Ala Trp Asp Pro Ala Thr Val Met Arg lie 275 280 285
ctt egg gac ccg cgt att gcg ggc ttc gcc get gag gtg ate tac aag 912 Leu Arg Asp Pro Arg lie Ala Gly Phe Ala Ala Glu Val lie Tyr Lys 290 295 300
a_ag aag ccg gac ggc acg ccg acc a_cg aag att gag ggt tac cgc att 960 Lys Lys Pro Asp Gly Thr Pro Thr Thr Lys lie Glu Gly Tyr Arg lie 305 310 315 320
cag cgc gac ccg ate acg etc egg ccg gtc gag ctt gat tgc gga ccg 1008 Gin Arg Asp Pro lie Thr Leu Arg Pro Val Glu Leu Asp Cys Gly Pro 325 330 335
ate ate gag ccc get gag tgg tat gag ctt cag gcg tgg ttg gac ggc 1056 lie lie Glu Pro Ala Glu Trp Tyr Glu Leu Gin Ala Trp Leu Asp Gly 340 345 350
agg ggg cgc ggc aag ggg ctt tec egg ggg caa gcc att ctg tec gcc 1104 Arg Gly Arg Gly Lys Gly Leu Ser Arg Gly Gin Ala lie Leu Ser Ala 355 360 365
atg gac犯g ctg tac tgc gag tgt ggc gcc gtc atg act tcg aag cgc 1152 Met Asp Lys Leu Tyr Cys Glu Cys Gly Ala Val Met Thr Ser Lys Arg 370 375 380
ggg gaa gaa tcg ate aag gac tct tac cgc tgc cgt cgc egg aag gtg 1200 Gly Glu Glu Ser lie Lys Asp Ser Tyr Arg Cys Arg Arg Arg Lys Val 385 390 395 柳
gtc gac ccg tec gca cct ggg cag cac gaa ggc acg tgc犯c gtc age 1248 Val Asp Pro Ser Ala Pro Gly Gin His Glu Gly Thr Cys Asn Val Ser 405 410 415
atg gcg gca etc gac aag ttc gtt gcg gaa cgc ate ttc犯c aag ate 12% Met Ala Ala Leu Asp Lys Phe Val Ala Glu Arg lie Phe Asn Lys lie 420 425 430
agg cac gcc gaa ggc gac g犯gag acg ttg gcg ctt ctg tgg gaa gcc 1344
Arg His Ala Glu Gly Asp Glu Glu Thr Leu Ala Leu Leu Trp Glu Ala 435 440 445
gcc cga cgc ttc ggc aag etc act gag gcg cct gag aag age ggc gaa 1392 Ala Arg Arg Phe Gly Lys Leu Thr Glu Ala Pro Glu Lys Ser Gly Glu 450 455 460
egg gcg aac ctt gtt gcg gag cgc gcc gac gcc ctg aac gcc ctt gaa 1440 Arg Ala Asn Leu Val Ala Glu Arg Ala Asp Ala Leu Asn Ala Leu Glu 465 470 475 480
gag ctg tac gaa gac cgc gcg gca ggc gcg tac gac gga ccc gtt ggc 1488 Glu Leu Tyr Glu Asp Arg Ala Ala Gly Ala Tyr Asp Gly Pro Val Gly 485 490 495
agg aag cac ttc egg aag caa cag gca gcg ctg acg etc egg cag caa 1536 Arg Lys His Phe Arg Lys Gin Gin Ala Ala Leu Thr Leu Arg Gin Gin 500 505 510
ggg gcg g肪gag egg ctt gCC g33 ctt g33 gcc gcc g33 gcc ccg朋g 1584 Gly Ala Glu Glu Arg Leu Ala Glu Leu Glu Ala Ala Glu Ala Pro Lys 515 520 525
ctt ccc ctt gac caa tgg ttc ccc gaa gac gcc gac get gac ccg acc 1632 Leu Pro Leu Asp Gin Trp Phe Pro Glu Asp Ala Asp Ala Asp Pro Thr 530 535 540
ggc cct aag tcg tgg tgg ggg cgc gcg tea gta gac gac aag cgc gtg 1680 Gly Pro Lys Ser Trp Trp Gly Arg Ala Ser Val Asp Asp Lys Arg Val 545 550 555 560
ttc gtc ggg etc ttc gta gac aag ate gtt gtc acg aag tcg act acg 1728 Phe Val Gly Leu Phe Val Asp Lys lie Val Val Thr Lys Ser Thr Thr 565 570 575
ggc agg ggg cag gga acg ccc ate gag卿cgc get tcg ate acg tgg 1776 Gly Arg Gly Gin Gly Thr Pro lie Glu Lys Arg Ala Ser lie Thr Trp 580 585 590
gcg aag ccg ccg acc gac gac gac gaa gac gac gcc cag gac ggc acg 1824 Ala Lys Pro Pro Thr Asp Asp Asp Glu Asp Asp Ala Gin Asp Gly Thr 595 600 605
gaa gac gta gcg gcg tag 1842 Glu Asp Val Ala Ala 610
<210〉2
<211〉613
<212>PRT
<213>Homo
<400>2
Met Thr Gin Gly Val Val Thr Gly Val Asp Thr Tyr Ala Gly Ala Tyr 15 10 15
Asp Arg Gin Ser Arg Glu Arg Glu Asn Ser Ser Ala Ala Ser Pro Ala 20 25 30
Thr Gin Arg Ser Ala Asn Glu Asp Lys Ala Ala Asp Leu Gin Arg Glu 35 40 45
Val Glu Arg Asp Gly Gly Arg Phe Arg Phe Val Gly His Phe Ser Glu 50 55 60
Ala Pro Gly Thr Ser Ala Phe Gly Thr Ala Glu Arg Pro Glu Phe Glu 65 70 75 80
Arg lie Leu Asn Glu Cys Arg Ala Gly Arg Leu Asn Met lie lie Val 85 90 95
Tyr Asp Val Ser Arg Phe Ser Arg Leu Lys Val Met Asp Ala lie Pro 100 105 110
lie Val Ser Glu Leu Leu Ala Leu Gly Val Thr lie Val Ser Thr Gin 115 120 125
Glu Gly Val Phe Arg Gin Gly Asn Val Met Asp Leu lie His Leu lie 130 135 140
Met Arg Leu Asp Ala Ser His Lys Glu Ser Ser Leu Lys Ser Ala Lys 145 150 155 160
lie Leu Asp Thr Lys Asn Leu Gin Arg Glu Leu Gly Gly Tyr Val Gly 165 170 175
Gly Lys Ala Pro Tyr Gly Phe Glu Leu Val Ser Glu Thr Lys Glu lie 180 185 190
Thr Arg Asn Gly Arg Met Val Asn Val Val lie Asn Lys Leu Ala His 195 200 205
Ser Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Phe Glu Phe Glu Pro Asp Val lie 210 215 220
Arg Trp Trp Trp Arg Glu lie Lys Thr His Lys His Leu Pro Phe Lys 225 230 235 240
Pro Gly Ser Gin Ala Ala lie His Pro Gly Ser lie Thr Gly Leu Cys 245 250 255
Lys Arg Met Asp Ala Asp Ala Val Pro Thr Arg Gly Glu Thr lie Gly 260 265 270
Lys Lys Thr Ala Ser Ser Ala Trp Asp Pro Ala Thr Val Met Arg lie 275 280 285
Leu Arg Asp Pro Arg lie Ala Gly Phe Ala Ala Glu Val lie Tyr Lys 290 295 300
Lys Lys Pro Asp Gly Thr Pro Thr Thr Lys lie Glu Gly Tyr Arg lie 305 310 315 320
Gin Arg Asp Pro lie Thr Leu Arg Pro Val Glu Leu Asp Cys Gly Pro 325 330 335
lie lie Glu Pro Ala Glu Trp Tyr Glu Leu Gin Ala Trp Leu Asp Gly 340 345 350
Arg Gly Arg Gly Lys Gly Leu Ser Arg Gly Gin Ala lie Leu Ser Ala 355 360 365
Met Asp Lys Leu Tyr Cys Glu Cys Gly Ala Val Met Thr Ser Lys Arg 370 375 380
Gly Glu Glu Ser lie Lys Asp Ser Tyr Arg Cys Arg Arg Arg Lys Val 385 390 395 400
Val Asp Pro Ser Ala Pro Gly Gin His Glu Gly Thr Cys Asn Val Ser405 410 415
Met Ala Ala Leu Asp Lys Phe Val Ala Glu Arg lie Phe Asn Lys lie 420 425 430
Arg His Ala Glu Gly Asp Glu Glu Thr Leu Ala Leu Leu Trp Glu Ala 435 440 445
Ala Arg Arg Phe Gly Lys Leu Thr Glu Ala Pro Glu Lys Ser Gly Glu 450 455 460
Arg Ala Asn匕eu Val Ala Glu Arg Ala Asp Ala Leu Asn Ala Leu Glu 465 470 475 480
Glu Leu Tyr Glu Asp Arg Ala Ala Gly Ala Tyr Asp Gly Pro Val Gly 485 490 495
Arg Lys His Phe Arg Lys Gin Gin Ala Ala Leu Thr Leu Arg Gin Gin 500 505 510
Gly Ala Glu Glu Arg Leu Ala Glu Leu Glu Ala Ala Glu Ala Pro Lys 515 520 525
Leu Pro Leu Asp Gin Trp Phe Pro Glu Asp Ala Asp Ala Asp Pro Thr 530 535 540
Gly Pro Lys Ser Trp Trp Gly Arg Ala Ser Val Asp Asp Lys Arg Val 545 550 555 560
Phe Val Gly Leu Phe Val Asp Lys lie Val Val Thr Lys Ser Thr Thr 565 570 575
Gly Arg Gly Gin Gly Thr Pro lie Glu Lys Arg Ala Ser lie Thr Trp 580 585 590
Ala Lys Pro Pro Thr Asp Asp Asp Glu Asp Asp Ala Gin Asp Gly Thr 595 600 605
Glu Asp Val Ala Ala 610
<210〉 3 <211〉 399
〈212〉 廳
〈213〉 Homo sapiens
〈220〉
<221〉 misc_feature <222> (1).. (399) 〈223〉
<400〉 3
gggcgtgccc ttgacaccca taatgcaaag ttttgtttta tcttttcagt tatgaacttt taagtctcct cctcaatcac cttagttggg tgtccattgt ggc柳attt atttgggtgt aagagagcat gccagcattc
aagccctatt aatttaggga gcctctattt acttacaaag 60
gttttgcacc ttcccattta ttcacagtgt gctgcatggc 120
tttgcttcat tttattaaag gcttattttg catttgttgc 180
cgatgtgtaa tagttccaca gattcaatat aaaaggcagt 240
tgtgaagggg ggctccatga tacaaggcaa ctttgataaa 300
ct犯tcggtt cagaggggtt c犯ttcaata tcatcattgc 360
aagcagacat gatgctaga 399
權利要求
1.一種位點特異重組酶，其特征在于，該位點特異重組酶特異性的識別下列結構式所示脫氧核苷酸序列，在箭頭位置裂解所示脫氧核苷酸序列，并將attB識別位點的序列與下列結構式所示序列在裂解位點重新連接， ↓5’-accatctgagtagtaccctggctttcctaTTGacacccaaaggccctattaatttaggga-3’其中，A、T、G和C分別代表腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。
2. 生產如權利要求1所述位點特異重組酶的方法，其特征在于，該方 法包括以下步驟-(1) 以MpsLl位點為耙點構建含有溫度敏感型的lac阻遏基因的篩選 載體pRES- MpsLl;(2) 以序列如SEQIDNOl所示核酸序列為模板，利用易錯PCR技術， 獲得位點特異重組酶突變DNA產物；(3) 將(2)所得DNA產物的核酸序列插入pINT載體多克隆位點，構 建重組質粒pINT-T;(4) 在原核細胞上利用藍白斑實驗篩選位點特異重組酶；最終篩選出 克隆獲得的位點特異重組酶即進化的位點特異重組酶。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，將步驟(4)所得位點特異重組酶在真核細胞水平進一步篩選，進行重組分析。
4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，進行重組分析是測定重組 得到的序列，確定其是否是由attB識別位點的序列與權利要求1中化學 式所示序列重組得到。
5. 如權利要求1所述位點特異重組酶的應用，其特征在于，將該位點 特異重組酶作為工具酶應用于基因的定點導入重組。
全文摘要
本發明屬于遺傳工程領域，具體涉及一種位點特異重組酶、其制備方法及應用。本發明提供了一種新的位點特異重組酶，該位點特異重組酶特異性的識別下列結構式所示脫氧核苷酸序列，在箭頭位置裂解所示脫氧核苷酸序列，并將attB識別位點的序列與下列結構式所示序列在裂解位點重新連接，(見圖)。本發明的位點特異重組酶能夠特異性的識別基因組MpsL1位點，具有較高活性，因而，本發明的位點特異重組酶將成為遺傳工程技術操作，尤其是基因定點插入重組的有效工具。
文檔編號C12N9/22GK101186906SQ200710172188
公開日2008年5月28日 申請日期2007年12月13日 優先權日2007年12月13日
發明者龍 余, 劉韶輝, 唐麗莎, 彭斯曼, 朱煥章, 辛清婷, 馬金芳 申請人:復旦大學