專利名稱：用于催化檸檬醛生成香茅醛的基因工程菌及其構建方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，具體地說，涉及一種基因工程菌及其構建方法，更具體 地說，涉及一種用于生物催化檸檬醛生成香茅醛的基因工程菌及其構建方法。
背景技術：
香茅醛是一種重要的單離香料，廣泛用于飲料、糖果、食品等的加香和其它香精的配 帝lj,還是合成其它香料的原料。工業上主要由香茅油、桉樹油等精油中分離得到。也可以 通過檸檬醛催化加氫或以e -香茅醇加氫制得。
微生物催化檸檬醛加氫生成香茅醛的反應式如下
其機理是利用微生物代謝中產生的氧化還原酶選擇性的催化加氫。反應過程中需要輔酶 NADH (還原型輔酶I )的參與，生成NAD+ (氧化型輔酶I )。利用生物轉化法催化檸 檬醛加氫生成香茅醛與其他方法相比具有專一性強、反應條件溫和、底物利用率高、轉化 率高、生產工藝簡單和副產物少等優點。
雖然國外有關于利用微生物催化檸檬醛加氫生成香茅醛的文獻，但國內沒有相關的文 獻和專利報道，而且現有的微生物催化檸檬醛加氫生成香茅醛中所使用的微生物均為野生 菌，尚無利用基因工程菌催化檸檬醛加氫生成香茅醛的報道，因此，有必要對此進行研究。
發明內容
本發明的第一個目的在于提供一種NADH氧化酶的重組表達質粒，能夠轉化基因工程 菌以表達NADH氧化酶。
本發明的第二個目的在于提供所述重組表達質粒的構建方法。
本發明的第三個目的在于提供一種基因工程菌，能夠表達NADH氧化酶。 本發明的第四個目的在于提供所述基因工程菌的構建方法。 本發明的第五個目的在于提供一種生物催化檸檬醛生成香茅醛的方法。 本發明的重組表達質粒是在合適的表達載體上克隆有NADH氧化酶基因gye。 根據本發明，所述NADH氧化酶基因gye可以來源于以下菌中的任一種大腸桿菌 (&c/2m,c/H'flfco/Z)、志賀菌(幼扭〃a)、沙門氏菌(S"/mowe〃a)、酉昔桿菌"c咖6a"er)、
克雷伯氏菌(G/wco朋6a"e。；優選的，所述NADH氧化酶基因gye來源于氧化葡萄糖酸
桿菌(G/wcowo^acte/- oxj^my)。
根據本發明，所述NADH氧化酶基因g^具有SEQ ID NO.l所示的序列。
根據本發明，所述表達載體為pET系列表達載體，優選的，所述表達載體為采用pET28。
本發明的重組表達質粒的構建方法包括以下步驟
A、 擴增編碼NADH氧化酶的基因g^的序列；
B、 將擴增獲得的NADH氧化酶基因gye序列經酶切后，連入經相同酶切的pET系列表 達載體中，獲得NADH氧化酶的重組表達載體。
本發明的基因工程菌株轉化有上述克隆有NADH氧化酶基因gye的重組表達質粒。 本發明的基因工程菌株的構建方法包括將上述克隆有NADH氧化酶基因gye的重組表 達質粒轉入宿主菌，獲得表達NADH氧化酶的基因工程菌。
根據本發明，所述基因工程菌為大腸桿菌，優選的，所述基因工程菌為大腸桿菌BL21。 本發明的生物催化檸檬醛生成香茅醛的方法，包括以下步驟
A、 發酵所述基因工程菌以表達NADH氧化酶；
B、 向發酵液中加入底物檸檬醛，通過NADH氧化酶催化加氫獲得香茅醛。 將獲得的基因工程菌進行發酵，向發酵液中加入底物檸檬醛，溶液，獲得香茅醛。 本發明開辟了利用基因工程菌生產香茅醛的先例，使得普通大腸桿菌具備了催化檸檬
醛生成香茅醛的功能，這為今后構建生產香茅醛的基因工程菌提供了新的思路，也為進一 步獲得更為優化的工程菌奠定了基礎。
圖1為基因工程菌BL21/gye的發酵表達產物經純化后的SDS-PAGE電泳圖，其中泳 道l為經過His-Tag柱純化后的GYE蛋白；泳道2為表達后沒有純化的破壁上清液；泳 道3為蛋白標準分子量；泳道4為沒有重組的BL21的破壁上清液。
圖2顯示了基因工程菌BL21/gye表達的NADH氧化酶催化檸檬醛后的產物質譜圖。
具體實施例方式
以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發 明而非用于限定本發明的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆實驗
室手冊》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件或者制造 商建議的條件進行或配置。
本發明的實施例中使用的大腸桿菌BL21及pET系列表達載體pET28均購自Novagen公司。
本發明的實施例中使用的細菌DNA抽提試劑盒購自北京博大泰克生物技術有限公司。
實施例1、基因工程菌的構建
1.1、 引物設計
根據NCBI Genbank中NADH氧化酶的基因gye的序列，設計擴增gye基因的PCR 引物Pgye-1和Pgye-2序列如下
Pgye-1: 5，- CGACATATGCCAACCCTGTTCGATC -3'; Pgye-2: 5，- TTAGAATTCTCAGTTGGGGCCGGAGGTG -3，。
為了便于與表達載體的酶切連接，弓l物Pgye-1上引入I酶切位點，弓l物Pgye-2 上引入5coRI酶切位點，所述酶切位點分別如序列中下劃線所示。
1.2、 基因gye的克隆
用細菌DNA抽提試劑盒獲得氧化葡萄糖酸桿菌(DSM2003)總DNA，并以其為模 板，Pgye-1和Pgye-2作為引物，PCR擴增^Z/ 基因，具體條件如下
反應體系氧化葡萄糖酸桿菌總DNA (0.02mg/nl) 1^1 ，引物Pgye-1 (20nmol/L) 和Pgye-2 (20pmol/L)各lpl， dNTP (1.6腿ol/L) 4pl,Taq酶l.Ounits， 10XTaq buffer (2.0mmol/L) 5pl,加雙蒸水至50pl。
反應條件95°C 5min; 95°C 45s， 55°C 45s， 72°C 80s完成30個循環；最后72。C延 伸10min。
PCR產物經1X的瓊脂糖電泳檢測，回收得到大小約為l.lkb的片斷，經測序，確定 為NADH氧化酶基因gye的DNA序列。 1.3、 表達載體的構建
將回收的片段以Mfc I、 ￡coR I酶切，然后與同樣經Msfe I、 ￡coR I酶切的pET28載體 連接，得到重組表達質粒，命名為pET-gye。
得到的重組表達質粒pET-gye經酶切鑒定，符合預期結果。
最后對鑒定為正確的重組表達質粒pET-gye進行測序，測序結果顯示，克隆入表達載 體的NADH氧化酶基因gye的序列如SEQ ID NO:l所示。
1.4、 基因工程菌的構建
使用常規方法將以上獲得的重組質粒pET-gye轉化大腸桿菌BL2I,獲得基因工程菌 BL21/gye，通過測序驗證該重組質粒構建正確。
實施例2、基因工程菌發酵表達及產物檢測
2.1、 基因工程菌BL21/gye的發酵表達與純化
將實施例1獲得的基因工程菌BL21/gye接種入LB培養基中，于37"C培養至對數 生長期，加入IPTG至終濃度lmmol/L，繼續培養6小時。
離心收集菌體，超聲破菌，離心收集上清，用His-Tag親和柱純化，得到的純化產物 進行SDS-PAGE電泳，結果如圖l所示，可見在40kDa處得到清晰條帶，與預期NADH 氧化酶條帶大小相符，證明構建的基因工程菌BL21/gye能夠發酵表達NADH氧化酶。
2.2、 發酵產物檢測
將以上獲得的純化的NADH氧化酶蛋白加入反應液(5Ommol/L磷酸緩沖液1.4mL、 乙腈0.3ml、 100mmol/LNADH溶液0.3ml、檸檬醛2.5nL)中催化反應，于37t:， 100rpm 下反應4h，產物經液質方法鑒定，結果如圖2所示，可見獲得的產物為香茅醛，表明本 發明的基因工程菌BL21/gye表達獲得的NADH氧化酶能夠催化檸檬醛加氫生成香茅醛。
實施例3、利用基因工程菌BL21/gye生產香茅醛 本實施例中使用的菌種為實施例1獲得的基因工程菌BL21/gye。 本實施例中使用的培養基配方為蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L，卡那
霉素0.05g/L, pH7.0。
將基因工程菌BL21/gye接入裝有200mL培養基的500mL搖瓶中，于37°C 、 250 rpm
培養，定時取樣檢測OD65o值，當0065()為0.4日寸，添加IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘
導培養14小時。
向搖瓶中加入檸檬醛至終濃度為重量體積比10%，加入乙腈至終濃度為10% (重量 體積比)，于35。C、 250rpm反應4h。
取反應液，用氯仿萃取分離純化獲得香茅醛，測定采用氣相色譜(GC)分析方法， 色譜儀的操作條件如下
色譜型號安捷倫6820
色譜柱DB-WAX (30mX0.53mmXl.0pm)
色譜工作站Sepu3000 (杭州普惠科學儀器有限公司)
載氣氮氣
流速1 ml/min 進樣量0.5 |ll 分流比10:1
檢測器氫火焰檢測器(FID)
柱溫100。C保持2分鐘，然后以2(TC/min梯度升溫至22(TC 進樣口溫度25CTC 檢測器溫度280°C
以l， 4-丁二醇為內標，用內標法定量。
根據GC圖譜峰面積法，計算得到擰檬醛轉化率達到75% 。
雖然以上實施例僅以來源于氧化葡萄糖酸桿菌(G/wco"o6ac^"o;c^tora)的NADH氧 化酶基因序列為例進行了說明，但本發明的重組表達質粒以及構建的基因工程菌 pET-gye中的NADH氧化酶基因gye并不局限于氧化葡萄糖酸桿菌(G/wco"o6ac敏 ox少6fam)來源的NADH氧化酶基因，根據本發明的教導，結合現有技術，本技術領域的 技術人員可以使用來源于其它菌種，如大腸桿菌(&c/^Wc/^co//)、志賀菌(幼/ge〃a)、 沙門氏菌(&/wo"e//a)、醋桿菌"cetoZ)a"w)、克雷伯氏菌(G/wco"oZ^"")等的NADH 氧化酶基因構建重組表達質粒，進而構建能夠表達具有NADH氧化酶活性的蛋白，這是 顯而易見的，因此同樣應當屬于本發明的范圍。
綜上所述，本發明提供了一種全新的基因工程菌用于生產香茅醛，利用NADH氧化 酶基因表達產物NADH氧化酶選擇性催化檸檬醛加氫生成香茅醛，不僅生產工藝簡 單，而且轉化率較高。同時，本發明也開辟了利用基因工程菌生產香茅醛的先例，使得普 通大腸桿菌具備了催化檸檬醛加氫生成香茅醛的功能，這為今后構建生產香茅醛的基因工 程菌提供了新的思路，也為進一步獲得更為優化的工程菌奠定了基礎。序列表
〈110〉華東理工大學
〈120〉用于催化檸檬醛生成香茅醛的基因工程菌及其構建方法
〈130〉 P5071094 〈160〉 1
〈170> Patentln version 3.1
〈210〉 1 〈211〉 1086 〈212〉 DNA
〈213〉 G/wcowZ a"w ox^am* 〈400〉 1
atgccaaccc tgttcgstcc cattgatttc ggtcccattc acgcg犯a^a ccggatcgtg 60
atgtccccgc tgacgcgcgg acgtgctgac aaggaggccg ttccgacccc catcatggcg 120
gaatactacg cccagcgcgc cagtgccggg ctgatcatca cggaagccac gggtatctcc 180
cgcgaaggtc tgggctggcc gttcgcaccg ggaatctggt ccgatgcgca ggtcgaagcc 240
tggaagccga tcgtggccgg tgtgcatgca aagggcggaa agatcgtctg ccagctctgg 300
cacatgggcc gcatggtcca ctcgtccgtg accggaacgc agcccgtctc gtcctccgcc 360
accacggccc ccggcgaggt ccatacctat gaaggcaaga agccgttcga gcaggcccgc 420
gcaatcgatg ccgcggatat cagccgtatt ctgaacgact atgagaacgc cgcccgcaat 480
gcgatccgcg ccggcttcga cggggtgcag atccacgccg ccaatggcta cctcatcgac 540
gagttcctgc gaaacggtac g幼tcaccgc acagatgaat acggcggcgt ccccgaaaac 600
cgcatccgtt tcctgaagga agtcaccgag cgcgtgatcg ctgccatcgg tgccgaccgc 660
acaggcgtgc gcctgtcccc caacggcgat acgcagggct gcatcgacag cgcacctgag 720
acggtctttg tcccggcggc aaagctgctt caggatctgg gcgtggcctg gctcgaactg 780
cgcgaacccg gcccg已已cgg caccttcggc
aagscgg3cc 8
agcccaaact gtccccgcag 840
atccgcaagg tgttcctgcg cccgctggtg c卿ccgcgc tggc卿agg g卿gctgat aaccccgacc tgccggagcg cttcgcccgc acctggtaca gtcagggccc cgaaggatac aactga
ctc犯tcagg actatacgtt cgaggcagca 900 gcgatcgcct tcggtcgcaa gttcatctcg 960 ggcatcgccc tgcagccgga tgatatgaaa 1020 acggactacc cgtccgccac ctccggcccc 1080
108權利要求
1、一種NADH氧化酶的重組表達質粒，其特征在于，所述重組表達質粒是在一合適的載體上克隆有NADH氧化酶基因gye。
2、 如權利要求1所述的重組表達質粒，其特征在于，所述NADH氧化酶基因gye來 源于以下菌中的任一種氧化葡萄糖酸桿菌(G/wco"oZ)""er ox>Y/mw)、大腸桿菌(Esc/zen.c/z/a co//)、志賀菌(5%/ge〃a0、沙門氏菌(Sa/mcwe〃a)、醋桿菌(^ceto6fl"er)、 克雷伯氏菌(G7wco"o6""er)。
3、 如權利要求2所述的重組表達質粒，其特征在于，所述NADH氧化酶基因g^具 有SEQ ID NO:l所示的序列。
4、 如權利要求1所述的重組表達質粒，其特征在于，所述載體為pET系列表達載體。
5、 如權利要求1一4中任一項所述的重組表達質粒的構建方法，其特征在于包括以下 步驟A、 擴增編碼NADH氧化酶的基因gye的序列；B、 將擴增獲得的NADH氧化酶基因gye序列經酶切后，連入經相同酶切的pET系列 表達載體中，獲得NADH氧化酶的重組表達載體。
6、 一種基因工程菌，其特征在于，該基因工程菌轉化有權利要求1一5中任一項所述 的重組表達質粒。
7、 如權利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌為大腸桿菌BL21。
8、 如權利要求6—7中任一項所述的基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括將權 利要求l一5中任一項所述的重組表達質粒轉入宿主菌，獲得表達NADH氧化酶的基因工 程菌。
9、 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述宿主菌為大腸桿菌BL21。
10、 一種生物催化檸檬醛生成香茅醛的方法，其特征在于包括以下步驟A、 對權利要求12—14中任一項所述的基因工程菌進行發酵以表達NADH氧化酶；B、 向發酵液中加入底物檸檬醛，通過NADH氧化酶催化加氫獲得香茅醛。
全文摘要
本發明提供了一種用于催化檸檬醛生成香茅醛的基因工程菌及其構建方法。本發明提供的重組表達質粒是在一合適的載體上克隆有NADH氧化酶基因gye，本發明提供的基因工程菌是在大腸桿菌中轉化有該重組表達質粒。本發明提供了一種全新的基因工程菌用于生產香茅醛，利用NADH氧化酶基因gye表達產物NADH氧化酶選擇性催化檸檬醛加氫生成香茅醛，簡化了生產工藝，提高了生產效率。本發明開辟了利用基因工程菌生產香茅醛的先例，使得普通大腸桿菌具備了催化檸檬醛生成香茅醛的功能，這為今后構建生產香茅醛的基因工程菌提供了新的思路，也為進一步獲得更為優化的工程菌奠定了基礎。
文檔編號C12N15/63GK101186924SQ200710171560
公開日2008年5月28日 申請日期2007年11月30日 優先權日2007年11月30日
發明者楊雪鵬, 波 殷, 馬昱澍, 魏東芝, 魏國棟 申請人:華東理工大學