細菌表面展示新系統、方法及應用的制作方法

專利名稱：細菌表面展示新系統、方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，更具體地，涉及細菌表面展示技術領域，特別是指一種細菌表面展示新系統、方法及應用。

背景技術：
細胞表面定位分子在自然界中普遍存在，其表面定位過程由不同的細胞表面蛋白調控，并形成了很多生物學現象，比如細胞間的識別，信號轉導，表面吸附，定殖，免疫反應等等。研究人員利用這些表面蛋白作為錨定元件將外源的多肽和蛋白與其融合，將其展示到細菌或病毒的表面從而達到一定的研究和應用目的。將外源蛋白定位表達在細菌表面后，可以直接用重組微生物進行后續實驗操作，免去了目標蛋白的產物提取，純化等一系列操作，而且如果展示的是抗原蛋白，由于抗原暴露在細胞表面，所以更有利于免疫系統的識別，而且外膜上的脂多糖等因子可以增強免疫反應，還可能作為錨定在細胞表面的目標蛋白的輔助因子而發揮作用(Lee J.S.，Shin K.S.，PanJ.G.，and Kim C.J.2000.Surface-displayed viral antigens on Salmonella carrier vaccine.Nat.Biotechnol.18645-648)。第一篇關于將外源多肽或蛋白利用遺傳學方法融合到載體蛋白上，從而成功將它們展示的報道是在1986年分別由Freudl等(Freudl R.，MacIntyre S.，Degen M.，Henning U.，1986.Cell surface exposure of the outer membraneprotein OmpA of Escherichia coli K-12.J.Mol.Biol.188，491-494)以及Charbit等(Charbit A.，Boulain J.C.，Ryter A.，Hofnung M.1986.Probing the topology of abacterial membrane protein by genetic insertion of a foreign epitope；expression at the cellsurface.EMBO J.5，3029-3037)完成的。之后，許多不同的細菌表面展示系統被研究和開發出來，使得表面展示技術得到迅速的發展。
在所有被開發和研究的表面展示系統中，應用最廣泛的一個系統是Lpp-OmpA系統，它是Georgiou和他的合作者在1992年構建的，他們利用Lpp-OmpA融合子成功的將β-內酰胺酶展示到大腸桿菌表面(Francisco J.A.，Earhart C.F.，Georgiou G.1992.Transport and anchoring of beta-lactamase to the external surface of Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA 89(7)2713-7)，該系統由兩部分組成1)E.coli主要外膜脂蛋白Lpp信號肽以及N端的九個氨基酸；2)E.coli外膜蛋白OmpA的46-159位氨基酸(包含跨膜區B3-B7)，外源蛋白與此系統的C末端融合。之后，研究者利用該系統展示了許多外源蛋白，使得該系統在生物催化，抗體制備，固定化細胞，生物傳感器制備等方面都有應用。由于該系統避免了夾心法融合外源蛋白進行表面展示對外源蛋白的諸多限制，使得以E.coli為宿主用該系統進行展示的外源蛋白的大小達到了70kDa(Wan H.M.，Chang B.Y.，Lin S.C.2002.Anchorage of cyclodextringlucanotransferase on the outer membrane of Escherichia coli.Biotechnol Bioeng79(4)457-64)。利用該系統進行表面展示還有很多優點，比如，Lpp-OmpA系統具有高效的分泌信號肽和獨特的跨膜結構，并提供了適宜的目標蛋白融合位點，而且其堅固的錨定結構能夠準確的將外源蛋白定位在細胞表面。
鰻弧菌是一種重要的魚類細菌性病原，可以在全世界范圍內引起海水魚和淡水魚的流行性疾病，對魚類養殖造成很大的損失。在鰻弧菌強毒株MVM425基礎上通過DNA重組技術構建的鰻弧菌減毒株MVAV6203(保藏號為CCTCC NOM204066，保藏日為2004年9月15日，具體請參見中國專利ZL200410089496.0，申請日為2004年12月14日)，該減毒株毒力減弱了10000倍，對靶標和非靶標動物安全無毒，并對弧菌病具有較高的免疫保護力，是一株優秀的減毒活菌疫苗候選株。
因此，本發明人嘗試構建并開發高效的細菌表面展示系統，旨在將來源于其他病原微生物的保護性抗原因子展示于該鰻弧菌減毒株表面，構建安全高效的鰻弧菌的多效價載體疫苗。


發明內容
本發明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種細菌表面展示新系統、方法及應用，該細菌表面展示新系統能在細菌細胞表面成功展示目標蛋白，可用于活疫苗開發，抗體制備，多肽文庫篩選，環境生物吸附劑開發和全細胞生物催化方面，特別用于在鰻弧菌減毒株的基礎上構建安全高效的鰻弧菌多效價載體疫苗。
在本發明的第一方面，提供了一種細菌表面展示新系統，包括編碼目標蛋白的基因序列，其特點是，還包括負責跨膜定位和轉運的鰻弧菌核苷酸序列，所述基因序列位于所述鰻弧菌核苷酸序列的C端，所述鰻弧菌核苷酸序列編碼的蛋白包括鰻弧菌外膜脂蛋白的信號肽和鰻弧菌外膜蛋白的跨膜錨定序列，所述跨膜錨定序列連接所述信號肽和所述目標蛋白。
所述鰻弧菌外膜脂蛋白為Wza蛋白，所述鰻弧菌外膜蛋白為Omporf1蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
所述鰻弧菌核苷酸序列為編碼所述Wza蛋白的信號肽及N端的前11個氨基酸的核苷酸序列和編碼所述Omporf1蛋白的6-50位氨基酸的核苷酸片段\編碼OmpU蛋白的180-238位氨基酸的核苷酸片段\編碼Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片段。
所述目標蛋白是遲鈍愛德華氏菌的EseB抗原蛋白。
在本發明的第二方面，提供了一種利用上述的細菌表面展示新系統在細菌的細胞表面展示目標蛋白的方法，其特點是，包括以下步驟 a.將所述細菌表面展示新系統構建入表達載體上，獲得重組表達載體； b.將所述重組表達載體導入宿主菌中進行表達，獲得融合蛋白，所述融合蛋白包括所述信號肽、所述跨膜錨定序列和所述目標蛋白。
所述鰻弧菌外膜脂蛋白為Wza蛋白，所述鰻弧菌外膜蛋白為Omporf1蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
所述鰻弧菌核苷酸序列為編碼所述Wza蛋白的信號肽及N端的前11個氨基酸的核苷酸序列和編碼所述Omporf1蛋白的6-50位氨基酸的核苷酸片段\編碼OmpU蛋白的180-238位氨基酸的核苷酸片段\編碼Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片段，所述宿主菌為大腸桿菌或鰻弧菌。
所述表達載體是pUC18，所述宿主菌為大腸桿菌Top10或鰻弧菌減毒株MVAV6203，所述目的蛋白是遲鈍愛德華氏菌的EseB抗原蛋白。
在本發明的第三方面，提供了上述細菌表面展示新系統在活疫苗開發，抗體制備，多肽文庫篩選，環境生物吸附劑開發和全細胞生物催化方面的應用。
所述活疫苗是鰻弧菌多效價載體疫苗。
本發明的有益效果如下 1)本發明屬于基于鰻弧菌自身元件的表面展示系統，采用鰻弧菌外膜脂蛋白Wza蛋白和鰻弧菌外膜蛋白Omporf1，OmpU或Omp26La的融合子為載體，利用Wza的N-端信號肽，Omporf1，OmpU或Omp26La的跨膜錨定序列，成功將遲鈍愛德華氏菌的EseB抗原蛋白展示到鰻弧菌減毒株MVAV6203的細胞表面，為進一步開發安全高效的鰻弧菌多效價載體疫苗打下了堅實的基礎。
2)利用本發明的細菌表面展示新系統，通過Wza的N-端信號肽，Omporf1，OmpU或Omp26La的跨膜錨定序列，可以將異源蛋白(特別是具有免疫保護力的抗原蛋白)成功地展示到細胞表面，以增強和優化目標蛋白的生物學功能，增加所用宿主菌株的生物學功能，本發明在抗體制備，多肽文庫篩選，環境生物吸附劑的開發和全細胞生物催化方面等其他眾多領域具有潛在的應用價值。



圖1是本發明的質粒pUC18ΔE的載體圖譜，是將pUC18載體多克隆位點中的EcoR I位點的第四位堿基通過無義點突變的方法從T變為C，從而使得EcoR I位點被去掉的產物。
圖2是本發明的質粒porf1G和pUG的載體圖譜，是將omporf1或ompU基因片段和目的基因gfp基因片段overlap后的片段選用Kpn I-BamH I酶切位點分別與圖1所示的質粒pUC18ΔE連接得到的產物，其中在omporf1或ompU基因片段與gfp基因片段中間引入了Nsi I和EcoR I的位點。
圖3是本發明的質粒pWorf1G和pWUG的載體圖譜，是將wza基因片段選用Sac I-Kpn I酶切位點分別與圖2所示的質粒porf1G或pUG連接得到的產物。
圖4是本發明的質粒pW26La的載體圖譜，是將wza基因片段和omp26La基因片段overlap后的片段選用Sac I-BamH I酶切位點與圖1所示的質粒pUC18ΔE連接得到的產物，其中在omp26La基因片段下游引物中引入了Nsi I，EcoR I和BamH I的位點。
圖5是本發明的質粒pWorf1B，pWUB和pW26LaB，是將目標基因eseB片段選用EcoR I-BamH I酶切位點分別與圖3所示的質粒pWorf1G，pWUG或圖4所示的質粒pW26La連接得到的產物。
圖6是本發明的重組質粒pWorf1G和pWUG的構建流程圖。
圖7是本發明的重組質粒pW26LaB的構建流程圖。
圖8a是分別含有質粒pWorf1G和pWUG的重組菌Top10/pWorf1G和Top10/pWUG被展示到細胞表面的ELISA驗證結果。OM外膜蛋白組分；CP胞內蛋白組分；E/Worf1G菌株Top10/pWorf1G；E/WUG菌株Top10/pWUG；E/GGFP胞內表達菌株Top10/pG。
圖8b是分別含有質粒pWorf1G和pWUG的重組菌Top10/pWorf1G和Top10/pWUG被展示到細胞表面的Western-blot驗證結果。OM外膜蛋白組分；CP胞內蛋白組分；E/Worf1G菌株Top10/pWorf1G；E/WUG菌株Top10/pWUG；E/GGFP胞內表達菌株Top10/pG。
圖9a是分別含有質粒pWorf1B、pWUB和pW26LaB的重組菌Top10/pWorf1B、Top10/pWUB和Top10/pW26LaB被展示到細胞表面的ELISA驗證結果。OM外膜蛋白組分；CP胞內蛋白組分；E/Worf1B菌株Top10/pWorf1B；E/WUB菌株Top10/pWUB；E/W26LaB菌株Top10/pW26LaB；E/BEseB胞內表達菌株Top10/pB。
圖9b是分別含有質粒pWorf1B、pWUB和pW26LaB的重組菌Top10/pWorf1B、Top10/pWUB和Top10/pW26LaB被展示到細胞表面的Western-blot驗證結果。OM外膜蛋白組分；CP胞內蛋白組分；E/Worf1B菌株Top10/pWorf1B；E/WUB菌株Top10/pWUB；E/W26LaB菌株Top10/pW26LaB；E/BEseB胞內表達菌株Top10/pB。
圖10a是分別含有質粒pWorf1B、pWUB和pW26LaB的重組菌AV/pWorf1B，AV/pWUB或AV/pW26LaB被展示到細胞表面的ELISA驗證結果。OM外膜蛋白組分；CP胞內蛋白組分；A/Worf1B菌株AV/pWorf1B；A/WUB菌株AV/pWUB；A/W26LaB菌株AV/pW26LaB；A/BEseB胞內表達菌株AV/pB。
圖10b是分別含有質粒pWorf1B、pWUB和pW26LaB的重組菌AV/pWorf1B，AV/pWUB或AV/pW26LaB被展示到細胞表面的Western-blot驗證結果。OM外膜蛋白組分；CP胞內蛋白組分；A/Worf1B菌株AV/pWorf1B；A/WUB菌株AV/pWUB；A/W26LaB菌株AV/pW26LaB；A/BEseB胞內表達菌株AV/pB。

具體實施例方式 本發明首先構建細菌表面展示新系統首先獲得所需的鰻弧菌核苷酸序列以及目標蛋白基因序列，然后依次連接，獲得融合序列。
所述目標蛋白基因序列是指編碼所希望在細胞表面展示的蛋白的基因序列。
上述的鰻弧菌核苷酸序列以及目標蛋白基因序列的獲得可以采用PCR擴增、直接合成或其他合適方式獲得，可以采用酶切連接、over-lap PCR擴增或其他合適方式將上述序列連接獲得融合蛋白。
本發明的鰻弧菌外膜脂蛋白Wza蛋白、鰻弧菌外膜蛋白Omporf1、OmpU或Omp26La來源于鰻弧菌Vibrio anguillarum MVM425，該菌株具有以下特征 兼性厭氧，弧形狀，極生單鞭毛，革蘭氏陰性，最適生長溫度25～28℃，0％NaCl和高于6～7％NaCl不生長，過氧化氫酶和氧化酶陽性，可利用檸檬酸鹽，賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶陰性，葡萄糖不產氣，蔗糖發酵產酸，可產淀粉酶、脂酶和酪蛋白酶，脲酶陰性，青霉素抗性陽性，O1血清型。
本發明所用的Wza蛋白的分子量為42.8kDa，其信號肽和N端的前11個氨基酸如SEQ ID NO1所示，所用的Omporf1蛋白的分子量為7.4kDa，其6-50位氨基酸如SEQ IDNO2所示，OmpU蛋白的分子量為35.4kDa，其180-238位氨基酸如SEQ ID NO3所示，Omp26La蛋白的分子量為28.2kDa，其80-158位氨基酸如SEQ ID NO4所示。
利用上述的細菌表面展示新系統在宿主菌的細胞表面展示目標蛋白時，實現方式可以將其置于載體上，比如質粒pUC18；所用的宿主菌可以是大腸桿菌Escherichiacoli.(E.coli)、鰻弧菌或其它細菌宿主，比如大腸桿菌Top10或鰻弧菌減毒株MVAV6203。
本發明利用鰻弧菌外膜脂蛋白和鰻弧菌外膜蛋白構建的一系列表面展示新系統，能將目標蛋白成功展示到細菌表面，可增強和優化目標蛋白的生物學功能，或增加所用宿主菌株的生物學功能。本發明拓寬了鰻弧菌減毒株的應用范圍，為構建減毒活疫苗提供了技術支持，也拓展了細菌表面系統的開發研究，為其在眾多領域的廣泛應用打下了基礎。
為更好的理解本發明的內容，下面以鰻弧菌外膜脂蛋白Wza和鰻弧菌外膜蛋白Omporf1，OmpU或Omp26La為例，作進一步說明。
實施例1 細菌表面展示新系統的構建和目標蛋白表面展示的檢測 1.細菌表面展示型系統的構建 1.1選取要構建展示系統的各基因片段并通過PCR克隆； 1.2回收各基因片段 從所要研究的對象上回收目標基因片段，采用TIANGEN公司的膠回收試劑盒進行回收。瓊脂糖凝膠電泳結束后，EB染色，在長波紫外燈上迅速切下目的條帶，裝入Eppendorf管并稱取重量，加入3倍體積的溶膠液PN，50℃水浴放置10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解；將得到的溶液加入吸附柱中離心(12,000rpm離心30sec)，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入700μl漂洗液PW，12,000rpm離心30sec，倒掉廢液，再用500μl漂洗液PW12,000rpm離心30sec，倒掉廢液。將離心吸附柱放回收集管中，12,000rpm離心2min，盡量出去漂洗液，再將吸附柱置于室溫或50℃溫箱數分鐘，徹底地晾干后，將其放到一個干凈地離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加不少于30μl的洗脫緩沖液EB buffer，室溫放置2min，12,000rpm離心1min收集含目的片段的DNA溶液，電泳檢測回收DNA濃度。
1.3將pUC18載體多克隆位點中的EcoR I位點的第四位堿基通過無義點突變的方法從T變為C。擴增AflIII-Sac I位點中的pUC18片段，并在PCR擴增的下游引物中將EcoR I位點處的第四位堿基從T變為C，再將此片段通過AflIII-Sac I雙酶切，將pUC18也通過這兩個酶切，回收純化大片段和含有AflIII-Sac I位點的目的片段，將目的片段與切割后的質粒用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，CaCl2轉化法轉化Top10，得到質粒載體pUC18ΔE。
1.4將omporf1或ompU基因和gfp基因同時正向與pUC18ΔE質粒連接。將ompof1和gfp基因或ompU和gfp基因通過overlap PCR的方法連接到一起，再將此連接片段通過Kpn I和BamH I酶切，將pUC18ΔE也通過這兩個酶切，回收純化大片段和含有Kpn I-BamH I位點的目的片段，將目的片段與切割后的質粒用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，CaCl2轉化法轉化Top10，得到質粒porf1G或pUG，將質粒porf1G和pUG分別用Sac I-Kpn I雙酶切，將wza也經此兩個酶切后，回收純化得到含有Sac I-Kpn I位點的目的片段，將目的片段與切割后的質粒用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，CaCl2轉化法轉化Top10，得到大腸桿菌重組菌。
1.5將wza基因和omp26La基因同時正向與pUC18ΔE質粒連接。將wza和omp26La基因通過overlap PCR的方法連接到一起，再將此連接片段通過Sac I和BamH I酶切，將pUC18ΔE也通過這兩個酶切，回收純化大片段和含有Sac I-BamH I位點的目的片段，將目的片段與切割后的質粒用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，CaCl2轉化法轉化Top10，得到質粒pW26La，將質粒pW26La用EcoR I和BamH I酶切，將也用這兩個酶切并回收純化后的目的基因片段與切割后的質粒用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，CaCl2轉化法轉化Top10，得到大腸桿菌重組菌。
1.6鰻弧菌重組菌的構建 接種鰻弧菌MVAV6203于5ml高鹽LB培養液中過夜培養，再按1∶100轉接100ml高鹽LB培養液，于30℃以200rpm振蕩培養至OD600的值為0.6時，離心收集菌體，將菌體在冰浴中放置一段時間，使細胞盡可能接近0℃，并用272mM的蔗糖緩沖液洗滌菌體三次，再用適量蔗糖緩沖液(1ml)懸浮菌體，使其菌液濃度為1×109/ml，得到電轉化感受態細胞。取100μl感受態菌懸液于一個0.2cm的電轉化杯(Bio-Rad公司產品)中，加入一定濃度的供體質粒DNA10μl，混勻后在冰浴上放置10min，用GenepulserTM型電脈沖儀(Bio-Rad公司產品)進行電脈沖。電脈沖參數選定為脈沖場強V＝2kV/cm，脈沖時間為3ms。電脈沖完畢后，加入800μl LB培養液于電轉杯中，并轉入1.5ml的離心管中在30℃200rpm恢復培養3h后，涂布于LB瓊脂抗性平板，置于30℃培養。氨芐為200μg/ml。
2目標蛋白表面展示的檢測 2.1將上述得到的鰻弧菌重組菌進行外膜蛋白組分的抽提 菌體蛋白由以下方法制備將含有質粒的大腸桿菌Top10菌株接種在含100μg/ml氨芐青霉素的LB低鹽液體培養基，200rpm 37℃培養過夜，作為一級種，第二天將一級種按1∶100(v/v)接種于含有50ml工作濃度的LB低鹽(Amp)培養基的250ml三角瓶中，作為二級種，37℃200rpm搖床培養至OD600＝0.6，加入誘導劑IPTG至終濃度0.5mmol/l，于37℃誘導表達12h，收獲菌體。對含有質粒的鰻弧菌MVAV6203菌株接種在含200μg/ml氨芐青霉素的LB高鹽液體培養基，200rpm 30℃培養過夜，作為一級種，第二天將一級種按1∶100(v/v)接種于含有50ml工作濃度的LB高鹽(Amp)培養基的250ml三角瓶中，作為二級種，30℃200rpm搖床培養24h，收獲菌體。對收獲的菌體10000g離心2min，PBS洗滌三次以后，重懸在1.5ml Tris-HCl-NaCl(50mM，pH8.0，containing 0.3％NaCl)緩沖液中，將此重懸液在冰浴中超聲破菌5min至菌體完全破碎，將得到的菌體裂解液在4℃10000g離心5min以去除未裂解的細胞和細胞碎片。為得到全部的膜蛋白，將上清液在4℃20000g超速離心1h(Sigma，Osterode，Germany)，則得到的上清為可溶的胞內蛋白成分，沉淀為全部的膜蛋白。為了得到外膜成分，將沉淀重懸在0.4ml HEPES(10mM，pH7.4)緩沖液中，再和0.4ml含有2％SLS的HEPES緩沖液(10mM，pH7.4)混勻以溶解內膜，將此混合液在室溫下放置30min后再在4℃20000g超速離心1h，從而得到外膜蛋白顆粒，上清中為內膜蛋白，再重復一次外膜成分的提取步驟將得到較純的外膜蛋白。
2.2 ELISA檢測外膜、胞內蛋白組分 胞內蛋白組分和外膜蛋白組分都先稀釋到相同的OD(OD280＝1.0)。然后在每個ELISA板孔中加入50μl各組分溶液，4℃包被過夜，次日，棄去孔內溶液，用PBST緩沖液洗3次，每孔加入200μl含有3％BSA的PBST于37℃封閉1h，后棄去孔內溶液，用PBST緩沖液洗3次，加入稀釋到適當倍數的兔抗一抗，37℃孵育1.5h，用PBST緩沖液洗3次以后細胞抗體復合物再與1∶5000(v/v)稀釋的辣根過氧化氫酶結合的羊抗兔二抗(Jackson公司產品)37℃孵育1h，PBST洗3次以后，每孔加入100μl單組分可溶型TMB底物顯色液(天根公司產品)37℃作用10-30min，每孔再加入100μl 1MH2SO4終止反應，每孔的吸光值用酶標儀(Bio-Red公司產品)于450am的波長下檢測。其中以胞內表達該蛋白的菌為陰性對照。
2.3 SDS-PAGE凝膠的制備 取30％凝膠母液(29.2％丙烯酰胺，0.8％甲叉雙丙烯酰胺)2ml，1.5M Tris-HCl，pH8.8，1.3ml，10％SDS 50μl，超純水1.6ml，10％過硫酸銨50μl，TEMED 2μl，混勻后注入垂直板電泳制膠器中，加封一層水，于室溫下聚合1h左右即為12％的分離膠。傾去上層的水，取30％凝膠母液330μl，1M Tris-HCl，pH6.8，250μl，10％SDS20μl，超純水1.4ml，10％過硫酸銨20μl，TEMED 2μl，混勻后注入分離膠上層，插入電泳梳板，于室溫下聚合1h。
2.4 Western-blot檢測各蛋白組分 將稀釋到相同的OD(OD280＝1.0)的胞內和外膜蛋白組分取等體積和上樣緩沖液(10％SDS，10％2-硫醇，pH6.8 0.3M Tris-HCl，0.05％溴苯酚藍，50％甘油)混勻，在12％的SDS-PAGE膠中進行電泳，之后將切除濃縮膠的分離膠用電轉儀(Bio-Red公司產品)在90V電壓下的電轉緩沖液(25mmol/l Tris-HCl，192mmol/l甘氨酸，20％甲醇)中電轉移3h到PVDF膜上，將電轉好的膜取出，在37℃PBS-T-BSA溶液(含0.05％土溫和1％BSA的PBS緩沖液)中封閉1h之后進行免疫檢測將PVDF膜在37℃與稀釋到適當倍數的兔抗一抗孵育1.5h，然后用1∶5000(v/v)稀釋的辣根過氧化氫酶結合的羊抗兔二抗標記，37℃孵育1h，用PBS-T溶液洗過之后，加入100μl單組分沉淀型TMB底物顯色液，37℃作用15min進行顯色，再用1M H2SO4終止反應，觀察結果。其中以胞內表達該蛋白的菌為陰性對照。
實施例2綠色熒光蛋白的細菌表面展示新系統的構建、展示與檢測 根據所需要展示的目標蛋白和其它所需的核苷酸序列設計引物，并在引物兩端引入合適的酶切位點。以質粒pUC18為模板，引物pUCF和pUCR擴增得到pCU18質粒上的一段序列，并在下游引物中將EcoR I位點的第四位堿基進行突變，利用兩端的AflII和Sac I位點將它連到經過同樣酶切的pCU18片段中，得到突變了EcoR I位點的pCU18ΔE(圖1)；以鰻弧菌MVM425基因組為模板，利用引物omporf1F和omporf1R擴增得到所需的Omporf1蛋白的一段編碼序列，利用引物ompUF和ompUR擴增得到所需要的OmpU蛋白的一段編碼序列，以mTn5gusA-pgfp12質粒為模板，gfpF和gfpR為引物擴增得到gfp序列，再通過overlap PCR的方法將ompof1片段和gfp片段或ompU片段和gfp片段融合到一起，Kpn I和BamH I位點被用來將這兩個融合片段分別連到pCU18ΔE的相應位點內，得到重組質粒porf1G和pUG(圖2)；以鰻弧菌MVM425基因組為模板，利用引物wzaF和wzaR擴增得到所需的Wza蛋白的一段編碼序列，利用Sac I和Kpn I位點，將它連到質粒porf1G或pUG上，得到重組表達質粒pWorf1G和pWUG(圖3)。將pWorf1G和pWUG分別轉入Top10中。通過對表達的Top10/pWorf1G和Top10/pWUG菌抽提外膜蛋白組分并分別做ELISA(圖8a)和Western-blot(圖8b)驗證知GFP蛋白被成功展示到外膜上。證明了系統Wza-Omporf1和Wza-OmpU都可以在大腸桿菌宿主中將外源胞內蛋白展示到外膜上，在抗體制備，多肽文庫篩選，環境生物吸附劑的發展和全細胞生物催化的發展等領域有潛在的應用價值。
設計合成的引物 pUCF5’-CCACATGTTCTTTCCTGCGT-3’ pUCR5’-TCCGAGCTCGAGTTCGTAATCATGGTC-3’ 反應條件為94℃30s，55℃30s，72℃55s，共30個循環，72℃7min。
wzaF5’-GGTGAGCTCAATGTCAAAAAAGTAT-3’ wzaR5’-CGGGGTACCTGCGGCATTTTTTTCGCCTGTA-3’ 反應條件為94℃30s，50℃30s，72℃20s，共30個循環，72℃7min。
omporf1F5’-CAGCGGGGTACCCCGATCGCACTATTAGCATCTT-3’ omporf1R5’-AGCCATGAATTCCGGATGCATTGCCGTTACTGTACCTACT-3’ 反應條件為94℃30s，51℃30s，72℃20s，共30個循環，72℃7min。
ompUF5’-CAGCGGGGTACCCCGAATGCAGATGGCTACTCT-3’ ompUR5’-AGCCATGAATTCCGGATGCATTTGACCATCAACAAAAGTACC-3’ 反應條件為94℃30s，50℃30s，72℃20s，共30個循環，72℃7min。
gfpF5’-CCGGAATTCATGGCTAGCAAAGGAG-3’ gfpR5’-CGCGGATCCTTATTTGTACAGTTCATCCATGCCATG-3’ 反應條件為94℃30s，51℃30s，72℃55s，共30個循環，72℃7min。
實施例3 EseB抗原蛋白的細菌表面展示新系統的構建、展示與檢測 遲鈍愛德華氏菌是一種在淡水魚類和海洋魚類中可以引起出血性敗血病的病原菌，它在水環境中有一個很廣泛的感染宿主范圍，而且對于許多動物甚至人都有一定的感染性。EseB蛋白來自于致病性的遲鈍愛德華氏菌，為細菌III型分泌系統中的膜元件蛋白，有報道稱EseB蛋白的缺失可以使遲鈍愛德華氏菌的毒性降低，證明其與細菌致病性相關(Srinivasa Rao P.S.，Yamada Y.，Tan Y.P.，Leung K.Y.2004.Use ofproteomics to identify novel virulence determinants that are required for Edwardsiellatarda pathogenesis.Mol Microbiol 53(2)，573-586)。
以鰻弧菌MVM425基因組為模板，利用引物omp26LaF和omp26LaR擴增得到所需要的Omp26La蛋白的一段編碼序列，利用前面得到的所需的Wza蛋白的一段編碼序列，再通過overlap PCR的方法將wza片段和omp26La片段融合到一起，Sac I和BamH I位點被用來將此融合片段連到pCU18ΔE的相應位點內，得到重組質粒pW26La(圖4)；以克隆有遲鈍愛德華氏菌EseB蛋白編碼基因eseB的質粒pPRoD為模板，PCR擴增eseB的基因，獲得符合預期大小(600bp)的特異性擴增產物，回收該產物，利用其兩端的EcoR I和BamH I位點直接分別克隆到也經過相同酶切的pWorf1G，pWUG或pW26La質粒上，得到含有融合基因wza/omporf1/eseB，wza/ompU/eseB或wza/omp26La/eseB的重組質粒pWorf1B，pWUB或pW26LaB(如圖5所示)。將pWorf1B，pWUB或pW26LaB分別轉入Top10和鰻弧菌MVAV6203中。通過對表達的Top10/pWorf1B，Top10/pWUB，Top10/pW26LaB以及AV/pWorf1B，AV/pWUB，AV/pW26LaB菌抽提外膜蛋白組分并分別做ELISA(圖9a和圖10a)和Western-blot(圖9b和圖10b)驗證知EseB蛋白不管是在大腸桿菌Top10宿主中還是鰻弧菌MVAV6203宿主中都被成功展示到外膜上，證明了Wza-Omp26La系統在大腸桿菌和鰻弧菌宿主中都可以將外源蛋白展示到外膜上，同時證明了Wza-Omporf1和Wza-OmpU系統還可以在鰻弧菌宿主中將外源胞內蛋白展示到外膜上。本研究將EseB作為一個潛在的具有保護力的抗原蛋白，將其與Wza-Omporf1/OmpU/Omp26La展示系統相融合，并展示于鰻弧菌減毒株的細胞表面，有望研制并開發出同時針對鰻弧菌和遲鈍愛德華氏菌感染的的多效價載體活疫苗。
設計合成的引物 omp26LaF5’-GCCGCAGGTACCCCGTTCTTTGGTAACACA-3’ omp26LaR5’-CGGGATCCAGCCATGAATTCCGGATGCATGACATGGAAGTAGTTAACG-3’ 反應條件為94℃30s，50℃30s，72℃25s，共30個循環，72℃7min。
eseBF5’-CCGGAATTCATGACTGTCAATAC-3’ eseRR5’-CGGGATCCTTAGCGGATATTCTGGG-3’ 反應條件為94℃30s，57℃30s，72℃45s，共30個循環，72℃7min。
所以，利用Wza-Omporf1、Wza-OmpU或Wza-Omp26La的融合子作為載體，可以將目標蛋白定位表達于細菌表面，既可增強和優化目標蛋白的生物學功能，也可增加所用宿主菌株的生物學功能，在活疫苗發展，抗體制備，多肽文庫篩選，環境生物吸附劑的發展和全細胞生物催化的發展等眾多領域都具有潛在的應用價值。
綜上所述，本發明的細菌表面展示新系統能在細菌細胞表面成功展示目標蛋白，可用于活疫苗開發，抗體制備，多肽文庫篩選，環境生物吸附劑開發和全細胞生物催化方面，特別用于在鰻弧菌減毒株的基礎上構建安全高效的鰻弧菌多效價載體疫苗。
需要說明的是，在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，以上所述的是本發明的具體實施例及所運用的技術原理，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改而不背離本發明的精神與范圍，這些等價形式同樣落在本發明的范圍內。
序列表
<110>華東理工大學
<120>細菌表面展示新系統、方法及應用
<160>4
<210>1
<211>44
<212>PRT
<213>鰻弧菌(Vibrio anguillarum)
<220>
<221>SIGNAL
<222>(1)..(44)
<223>外膜脂蛋白Wza蛋白的信號肽和N端前11個氨基酸序列
<400>1
Met Thr Met Ile Thr Asn Ser Ser Ser Met Ser Lys Lys Tyr Leu Pro
1 510 15
Leu Ile Ile Ala Ser Val Val Leu Thr Gly Cys Thr Ile Pro Gly Ser
20 25 30
His Leu Pro Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Gly Thr
35 40
<210>2
<211>45
<212>PRT
<213>鰻弧菌(Vibrio anguillarum)
<220>
<221>TRANSMEM
<222>(1)..(45)
<223>外膜蛋白Omporf1蛋白的6-50位氨基酸序列
<400>2
Ile Ala Leu Leu Ala Ser Phe Ala Phe Gly Gly Val Ala Met Ala Ala
15 10 15
Val Glu Glu Thr Thr Thr Ala Ser Thr Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly
20 25 30
Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Val Gly Thr Val Thr Ala
35 40 45
<210>3
<211>59
<212>PRT
<213>鰻弧菌(Vibrio anguillarum)
<220>
<221>TRANSMEM
<222>(1)..(59)
<223>外膜蛋白OmpU蛋白的180-238位氨基酸序列
<400>3
Asn Ala Asp Gly Tyr Ser Leu Ser Ala Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Thr
15 10 15
Gly Val Lys Leu Gly Ala Gly Tyr Ala Asp Gln Asp Thr Ala Ala Asn
20 25 30
Ala Ser Ser Asp Gln Tyr Met Leu Ala Ala Ser Tyr Ala Ile Ser Asp
35 40 45
Phe Tyr Phe Ala Gly Thr Phe Val Asp Gly Gln
50 55
<210>4
<211>79
<212>PRT
<213>鰻弧菌(Vibrio anguillarum)
<220>
<221>TRANSMEM
<222>(1)..(79)
<223>外膜蛋白Omp26La蛋白的80-158位氨基酸序列
<400>4
Phe Phe Gly Asn Thr Gly Asp Val Val Asn Leu Gly Thr Tyr Leu Thr
15 10 15
Gly Ser Gly Val Thr Tyr Asp Gln Asp Ser Ala Asn Ser Val Lys Gly
20 25 30
Met Asp Lys Arg Lys Ala Thr Ile Asp Leu Gly Leu Asn Ala Asp Ile
35 40 45
Ala Leu Gly Asp Gly Thr Val Ser Thr Tyr Phe Gln His Asp Ile Leu
50 55 60
Asn Glu Asn Lys Gly Tyr Lys Thr Gly Val Asn Tyr Phe His Val
65 70 7權利要求
1.一種細菌表面展示新系統，包括編碼目標蛋白的基因序列，其特征在于，還包括負責跨膜定位和轉運的鰻弧菌核苷酸序列，所述編碼目標蛋白的基因序列位于所述鰻弧菌核苷酸序列的C端，所述鰻弧菌核苷酸序列編碼的蛋白包括鰻弧菌外膜脂蛋白的信號肽和鰻弧菌外膜蛋白的跨膜錨定序列，所述跨膜錨定序列連接所述信號肽和所述目標蛋白。
2.如權利要求1所述的細菌表面展示新系統，其特征在于，所述鰻弧菌外膜脂蛋白為Wza蛋白，所述鰻弧菌外膜蛋白為Omporf1蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
3.如權利要求2所述的細菌表面展示新系統，其特征在于，所述鰻弧菌核苷酸序列為編碼所述Wza蛋白的信號肽及N端的前11個氨基酸的核苷酸序列和編碼所述Omporf1蛋白的6-50位氨基酸的核苷酸片段\編碼OmpU蛋白的180-238位氨基酸的核苷酸片段\編碼Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片段。
4.如權利要求3所述的細菌表面展示新系統，其特征在于，所述目標蛋白是遲鈍愛德華氏菌的EseB抗原蛋白。
5.一種利用權利要求1所述的細菌表面展示新系統在細菌的細胞表面展示目標蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟
a.將所述細菌表面展示新系統構建入表達載體上，獲得重組表達載體；
b.將所述重組表達載體導入宿主菌中進行表達，獲得融合蛋白，所述融合蛋白包括所述信號肽、所述跨膜錨定序列和所述目標蛋白。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述鰻弧菌外膜脂蛋白為Wza蛋白，所述鰻弧菌外膜蛋白為Omporf1蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述鰻弧菌核苷酸序列為編碼所述Wza蛋白的信號肽及N端的前11個氨基酸的核苷酸序列和編碼所述Omporf1蛋白的6-50位氨基酸的核苷酸片段\編碼OmpU蛋白的180-238位氨基酸的核苷酸片段\編碼Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片段，所述宿主菌為大腸桿菌或鰻弧菌。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述表達載體是pUC18，所述宿主菌為大腸桿菌Top10或鰻弧菌減毒株MVAV6203，所述目標蛋白是遲鈍愛德華氏菌的EseB抗原蛋白。
9.如權利要求1所述的細菌表面展示新系統在活疫苗開發，抗體制備，多肽文庫篩選，環境生物吸附劑開發和全細胞生物催化方面的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述活疫苗是鰻弧菌多效價載體疫苗。
全文摘要
本發明提供了一種細菌表面展示新系統，包括編碼目標蛋白的基因序列和負責跨膜定位和轉運的鰻弧菌核苷酸序列，目標蛋白的基因序列位于鰻弧菌核苷酸序列的C端，鰻弧菌核苷酸序列編碼的蛋白包括鰻弧菌外膜脂蛋白的信號肽和鰻弧菌外膜蛋白的跨膜錨定序列，跨膜錨定序列連接信號肽和目標蛋白，鰻弧菌外膜脂蛋白為Wza蛋白，鰻弧菌外膜蛋白為Omporf1蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白，本發明的細菌表面展示新系統能在細菌細胞表面成功展示目標蛋白，可用于活疫苗開發，抗體制備，多肽文庫篩選，環境生物吸附劑開發和全細胞生物催化方面，特別用于在鰻弧菌減毒株的基礎上構建安全高效的鰻弧菌多效價載體疫苗。
文檔編號C12N15/09GK101182516SQ20071017063
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月20日 優先權日2007年11月20日
發明者琴 劉, 張元興, 朝 楊, 王啟要 申請人:華東理工大學