專利名稱：利用A3啟動(dòng)子缺陷piggyBac轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因家蠶方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用A3啟動(dòng)子缺陷p&gyBac轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因家蠶方法。
背景技術(shù)：
家蠶是重要的模式昆蟲，其基因組測(cè)序的完成為在基因水平開展研究提供 了基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因家蠶研究技術(shù)的日漸成熟更是為家蠶的 基因研究開辟了更為廣闊的研究空間。Tamum等構(gòu)建的帶有A3啟動(dòng)子并以 EGFP為標(biāo)記基因的p/^yBac轉(zhuǎn)座子已能成功的在家蠶轉(zhuǎn)入和表達(dá)。Zhong等的 研究表明對(duì)于不同品種的家蠶其轉(zhuǎn)入效率也有不同，Nistari品系具有較高的轉(zhuǎn) 導(dǎo)率。啟動(dòng)子缺陷轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)對(duì)于篩選組織特異性啟動(dòng)子和研究基因的表達(dá)調(diào) 控具有重要的意義，但在家蠶研究中還沒有啟動(dòng)子缺陷的轉(zhuǎn)座子，也沒有利用 啟動(dòng)子缺陷轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)篩選組織特異性啟動(dòng)子及研究基因功能的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用A3啟動(dòng)子缺陷/7/ggvBac轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因 家蠶方法，是先切除帶有熒光標(biāo)志基因的p/ggyBac轉(zhuǎn)座子中A3啟動(dòng)子，利用 轉(zhuǎn)基因技術(shù)將這種啟動(dòng)子缺陷轉(zhuǎn)座子插入家蠶功能基因的啟動(dòng)子后面，借助功 能基因啟動(dòng)子的作用表達(dá)熒光標(biāo)志基因，創(chuàng)制成一種轉(zhuǎn)基因家蠶，這種轉(zhuǎn)基因 家蠶能夠用于組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子的篩選和基因功能研究，達(dá)到育成具有特 異性功能家蠶新品種。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案的步驟如下
(1) 采用BglII和BamHI雙酶切，切去帶有熒光標(biāo)志基因的p'ggyBac質(zhì)粒 中長(zhǎng)度為853 bp的A3啟動(dòng)子，回收大片段7124bp，自連接得到A3啟動(dòng)子缺 陷的jw'ggyBac質(zhì)粒；
(2) 采用蠶卵顯微注射轉(zhuǎn)基因方法，導(dǎo)入A3啟動(dòng)子缺陷的戸'ggyBac質(zhì)粒 及其能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒，在G0代或G0以后代蟻蠶時(shí)期，通過(guò)選擇熒 光標(biāo)志基因獲得轉(zhuǎn)基因家蠶，詞養(yǎng)至成蟲交配續(xù)代；
(3) 育成能夠用于組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子的篩選和基因功能研究的轉(zhuǎn)基因家蠶。
所述的熒光標(biāo)志基因是指含有GFP、 EGFP、 RFP、 CFP或YFP熒光標(biāo)志基因。
所述的蠶卵顯微注射的時(shí)間是產(chǎn)卵后8小時(shí)以內(nèi)，^ggvBac質(zhì)粒及其能夠 提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒的比率在10:1 — 1:2之間，這2種質(zhì)粒的總濃度在0.1ng/pl 一2iig"l，質(zhì)粒溶解在0.1mM—2mM含有l(wèi)mM—8mM氯化鈉的磷酸緩沖液中。
本發(fā)明具有的有益效果是
可以借助熒光標(biāo)志基因篩選轉(zhuǎn)基因家蠶個(gè)體，這種轉(zhuǎn)基因家蠶能夠用于組 織特異性表達(dá)啟動(dòng)子的篩選和基因功能研究，達(dá)到育成具有特異性功能家蠶新 品種。
圖1是A3啟動(dòng)子缺陷轉(zhuǎn)座質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。 圖2是能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒。 圖3是A3啟動(dòng)子缺陷轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖。 圖4是Gl代近尾足部組織特異性表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因家蠶。 圖5是Gl代胸部組織特異性表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因家蠶。 圖6是Gl代尾部組織特異性表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因家蠶。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。 實(shí)施例l:
根據(jù)pPIGA3GFP (7977bp)質(zhì)粒圖譜，用BglII和BamHI雙酶切，切去長(zhǎng) 度為853 bp的A3啟動(dòng)子，回收大片段7124bp，自連接得到如圖1所示的A3 啟動(dòng)子缺陷的帶有GFP熒光標(biāo)志基因的j9&gyBac質(zhì)粒，圖中，A表示的是攜帶 A3啟動(dòng)子的質(zhì)粒；B表示的是去掉A3啟動(dòng)子的質(zhì)粒；完成后分別用Pstl ， EcoR I +Hpa I和BglII+BamH I酶切鑒定重組質(zhì)粒，A3啟動(dòng)子被完全切去，產(chǎn) 物與質(zhì)粒結(jié)構(gòu)相符合(如圖3所示)，且經(jīng)改造的質(zhì)粒缺失了 BglII+BamH I酶 切位點(diǎn)(如圖3所示，泳道3)。
圖3中，泳道l-3表示的是pPIGGFP質(zhì)粒其中，泳道l， Pstl酶切；泳 道2， EcoRl+Hpal酶切；泳道3， Bgl II十BamH I酶切。泳道4-6表示的是 pPIGA3GFP質(zhì)粒其中，泳道4， Pstl酶切；泳道5， EcoR I+Hpa I酶切；泳 道6， BglII+BamHl酶切。Marker為分子標(biāo)記，單位為bp，從上而下的條帶為: 10000, 7500， 5000, 2500, 1000, 250。
采用蠶卵顯微注射方法，將攜帶GFP標(biāo)志基因的A3啟動(dòng)子缺陷的p&gvBac 質(zhì)粒及其能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒(圖2)按1:1比率混合，2種質(zhì)粒的總濃 度在0.4(ig/pl，質(zhì)粒溶解在0.5mM含有5mM氯化鈉的磷酸緩沖液中，導(dǎo)入產(chǎn)卵
2小時(shí)內(nèi)的蠶卵。在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的第2代(Gl)家蠶的蟻蠶時(shí)期，通過(guò)熒光顯 微鏡(Olympus， SZX12，日本)篩選表達(dá)GFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，激發(fā)波 長(zhǎng)為460nm-490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm -550 nm。轉(zhuǎn)基因家蠶飼養(yǎng)至成蟲交配 產(chǎn)卵。
轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)一共注射了 2264粒卵，Gl代中有14蛾蠶為轉(zhuǎn)基因家蠶。在檢 出的G1代轉(zhuǎn)基因家蠶個(gè)體中，GFP有在近尾足部表達(dá)、呈斑塊狀不均勻性的個(gè) 體(如圖4所示)，而且經(jīng)比較表明，表達(dá)的亮度比A3啟動(dòng)子控制的熒光亮度弱。
采用PCR技術(shù)證實(shí)了 GFP標(biāo)記基因的成功轉(zhuǎn)入。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明利用A3啟 動(dòng)子缺陷^ggvBac轉(zhuǎn)座子己獲得能夠表達(dá)GFP熒光標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶。
實(shí)施例2:
A3啟動(dòng)子缺陷的p&gyBac質(zhì)粒的構(gòu)建方法與實(shí)施例1類似，用EGFP熒光 標(biāo)志基因替換GFP標(biāo)志基因。
采用蠶卵顯微注射方法，將攜帶EGFP標(biāo)志基因的A3啟動(dòng)子缺陷的 p/ggvBac質(zhì)粒及其能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒按2:l比率混合，2種質(zhì)粒的總濃 度在0.5Mg/jLd，質(zhì)粒溶解在0.3mM含有3mM氯化鈉的磷酸緩沖液中，導(dǎo)入產(chǎn)卵 6小時(shí)內(nèi)的蠶卵。在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的第2代(Gl)家蠶的蟻蠶時(shí)期，通過(guò)熒光顯 微鏡(Olympus， SZX12，日本)篩選表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，激發(fā) 波長(zhǎng)為460nm-490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm-550 nm。轉(zhuǎn)基因家蠶伺養(yǎng)至成蟲交 配產(chǎn)卵。
在檢出的G1代轉(zhuǎn)基因家蠶個(gè)體中，EGFP有在胸部表達(dá)，呈斑塊狀不均勻 性的個(gè)體(如圖5所示)，而且經(jīng)比較表明，表達(dá)的亮度比A3啟動(dòng)子控制的熒 光亮度弱。采用PCR技術(shù)證實(shí)了 EGFP標(biāo)記基因的成功轉(zhuǎn)入。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明利 用A3啟動(dòng)子缺陷p&gyBac轉(zhuǎn)座子已獲得能夠表達(dá)EGFP熒光標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基 因家蠶。
實(shí)施例3:
A3啟動(dòng)子缺陷的/7&gyBac質(zhì)粒的構(gòu)建方法與實(shí)施例1類似，用EGFP熒光 標(biāo)志基因替換GFP標(biāo)志基因。
采用蠶卵顯微注射方法，將攜帶EGFP標(biāo)志基因的A3啟動(dòng)子缺陷的 p^gyBac質(zhì)粒及其能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒按3d比率混合，2種質(zhì)粒的總濃 度在0.3jag"l，質(zhì)粒溶解在0.8mM含有5mM氯化鈉的磷酸緩沖液中，導(dǎo)入產(chǎn)卵 8小時(shí)內(nèi)的蠶卵。在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的第2代(Gl)家蠶的蟻蠶時(shí)期，通過(guò)熒光顯
微鏡(Olympus, SZX9，日本)篩選表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶， 激發(fā)波長(zhǎng)為460nm-490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm-550 nm。轉(zhuǎn)基因家蠶飼養(yǎng)至成 蟲交配產(chǎn)卵。
在檢出的G1代轉(zhuǎn)基因家蠶個(gè)體中，EGFP有在尾部表達(dá)的個(gè)體(如圖6所 示)，而且經(jīng)比較表明，表達(dá)的亮度比A3啟動(dòng)子控制的熒光亮度弱。采用PCR 技術(shù)證實(shí)了 GFP標(biāo)記基因的成功轉(zhuǎn)入。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明利用A3啟動(dòng)子缺陷 /7&gyBac轉(zhuǎn)座子已獲得能夠表達(dá)EGFP熒光標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶。
權(quán)利要求
1.一種利用A3啟動(dòng)子缺陷piggyBac轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因家蠶方法，其特征在于該方法的步驟如下(1)采用BglII和BamHI雙酶切，切去帶有熒光標(biāo)志基因的piggyBac質(zhì)粒中長(zhǎng)度為853bp的A3啟動(dòng)子，回收大片段7124bp，自連接得到A3啟動(dòng)子缺陷的piggyBac質(zhì)粒；(2)采用蠶卵顯微注射轉(zhuǎn)基因方法，導(dǎo)入A3啟動(dòng)子缺陷的piggyBac質(zhì)粒及其能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒，在G0代或G0以后代蟻蠶時(shí)期，通過(guò)選擇熒光標(biāo)志基因獲得轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲交配續(xù)代；(3)育成能夠用于組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子的篩選和基因功能研究的轉(zhuǎn)基因家蠶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用A3啟動(dòng)子缺陷/ /ggyBac轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制轉(zhuǎn)基 因家蠶方法，其特征在于所述的熒光標(biāo)志基因是指含有GFP、 EGFP、 RFP、 CFP或YFP熒光標(biāo)志基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用A3啟動(dòng)子缺陷p/ggyBac轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制轉(zhuǎn)基 因家蠶方法，其特征在于所述的蠶卵顯微注射的時(shí)間是產(chǎn)卵后8小時(shí)以內(nèi)， p/ggyBac質(zhì)粒及其能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒的比率在10:1 — 1:2之間，這2種 質(zhì)粒的總濃度在0.1叫/|^1一2嗎/^11，質(zhì)粒溶解在0.1mM—2mM含有l(wèi)mM—8mM 氯化鈉的磷酸緩沖液中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用A3啟動(dòng)子缺陷piggyBac轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因家蠶方法。是先切除帶有熒光標(biāo)志基因的piggyBac轉(zhuǎn)座子中A3啟動(dòng)子，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將這種啟動(dòng)子缺陷轉(zhuǎn)座子插入家蠶功能基因的啟動(dòng)子后面，借助功能基因啟動(dòng)子的作用表達(dá)熒光標(biāo)志基因，創(chuàng)制成一種轉(zhuǎn)基因家蠶，這種轉(zhuǎn)基因家蠶能夠用于組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子的篩選和基因功能研究，達(dá)到育成具有特異性功能家蠶新品種。
文檔編號(hào)C12N15/87GK101177692SQ20071016447
公開日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2007年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者農(nóng) 丁, 蘭天云, 莊蘭芳, 楊惠娟, 偉 范, 鐘伯雄, 陸長(zhǎng)德 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)