一種鉤端螺旋體的檢測方法

專利名稱：一種鉤端螺旋體的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學和生物化學與分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鉤 端螺旋體的檢測方法。
技術(shù)背景鉤端螺旋體病是一種全球流行的嚴重自然疫源性急性傳染病，且是一種典 型的人畜共患傳染病。我國已有多個省市發(fā)現(xiàn)病人或病畜及帶菌動物，已査出的帶菌動物約有60多種。該病多發(fā)生在夏秋多雨季節(jié)，病勢急劇，感染方式和 臨床表現(xiàn)由于不同的血清型感染而具有復雜性。鉤體病臨床癥狀復雜。且缺乏特異的癥狀，不易診斷，尤其是患病初期。 由于誤診而耽誤治療引起重癥及死亡的病例時有報道，因此鉤體的病原學檢測 和快速診斷，對預(yù)防和控制疾病有十分重要的意義。目前鉤體診斷的方法主要 有直接暗視野顯微鏡檢查法、改良渡銀染色法、免疫熒光檢査法、間接血凝試 驗、反向被動血凝試驗、凝集試驗及凝集素吸收試驗、膨脹試驗、酶聯(lián)免疫吸 附試驗等。1985年聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù)的誕生 極大的推動了核酸檢測技術(shù)甚至整個分子生物學技術(shù)的發(fā)展，并日漸成為核酸 檢測技術(shù)中的重要手段。隨后又不斷的出現(xiàn)了諸如逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcriptase — PCR, RT-PCR)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time Fluorescent Quantified PCR)等一系列的核酸擴增檢測技術(shù)，可實現(xiàn)對核酸樣品 的擴增及定性定量檢測。但PCR方法在實際應(yīng)用中易引起非特異性擴增，實驗 前后也極易受環(huán)境中其它外源核酸的污染，因此常造成實驗結(jié)果的假陽性或假 陰性現(xiàn)象，從而極大的限制了該技術(shù)在臨床檢測中的應(yīng)用。實時熒光定量PCR 雖然在技術(shù)上有很大的改進，并能對檢測樣品進行定量，但其昂貴的設(shè)備及高 成本的檢測阻礙了該技術(shù)的大規(guī)模推廣使用。環(huán)介導的等溫擴增(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)技術(shù)是 一種可替代PCR的廉價、快速、簡便、準確的核酸檢測技術(shù)，其特點是對耙基 因的6個部位設(shè)定4條引物，利用鏈置換反應(yīng)在恒溫條件下使靶基因高效擴增。 LAMP技術(shù)與PCR技術(shù)有著相同的靈敏度，但其技術(shù)平臺卻比PCR更優(yōu)越。由 于其反應(yīng)是多種引物共同啟動，提高了反應(yīng)結(jié)果的特異性；由于實行的是等溫 擴增，使得反應(yīng)在恒溫水浴箱中便可完成，不僅節(jié)約了儀器成本，而且使核酸 檢測操作方法更簡便，適用于床邊診斷和大量樣品同時檢測。相對于PCR反應(yīng)的"變性一退火一延伸"溫度循環(huán)，本發(fā)明在整個擴增檢測過程中保持恒溫，減少了溫度變化引起的非特異性擴增幾率；同時由于擴增 過程為恒溫，不需要熱循環(huán)儀，降低了檢測成本。更為重要的是，LAMP擴增 反應(yīng)體系要求F3、 B3、 FIP和BIP 4條引物完全匹配才能進行擴增，因此反應(yīng) 體系中的其它外源污染核酸或引物對反應(yīng)的干擾很小。通過設(shè)計與2條引物艦 鈴狀結(jié)構(gòu)5'末端的單鏈莖環(huán)區(qū)域互補的環(huán)引物，可提高LAMP方法中DNA合 成的開始位點的數(shù)量，使得LAMP反應(yīng)可在30分鐘內(nèi)完成，從而提高了反應(yīng)的 速度。LAMP技術(shù)以其簡便、經(jīng)濟、快速、靈敏和特異的特點，結(jié)果判斷方法 靈活簡便，較其它技術(shù)更適合在臨床或?qū)嶒炇以\斷中的應(yīng)用，開發(fā)的LAMP鉤 體篩查檢測技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡便、經(jīng)濟的鉤端螺旋體的檢測方法。 鉤端螺旋體的核酸檢測方法是通過使用特異性引物，利用LAMP技術(shù)平臺擴增靶基因的特定區(qū)域，在陽性和陰性質(zhì)控和內(nèi)參檢測體系的輔助下，從分子水平對鉤端螺旋體進行核酸篩査或檢測；具體步驟如下1) 根據(jù)鉤端螺旋體LipL41基因序列設(shè)計LAMP反應(yīng)特異性引物；2) 提取鉤端螺旋體基因組DNA;3) 擴增LipL41基因片段構(gòu)建重組質(zhì)粒載體用于該LAMP反應(yīng)的靈敏度分析；4) 分別以含LipL41基因的重組質(zhì)粒DNA或鉤端螺旋體基因組DNA為模 板進行LAMP反應(yīng)；5) 對LAMP反應(yīng)的結(jié)果進行判定；6) 取小量反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳出現(xiàn)梯形條帶所需模板 DNA的量而確定該LAMP反應(yīng)的靈敏度。所述的提取鉤端螺旋體基因組DNA的步驟為1) 10 000 rpm離心5 min收集培養(yǎng)的鉤端螺旋體后加入500 pi digestion buffer和3 ^的蛋白酶溶液，37 。C溫育30 min;2) 向上述溶液中加入300 ixlCTAB/NaCl混勻，65 。C作用10min;3) 加入等體積的平衡酚混勻后室溫放置5min;4) 4 °C 10 000rpm離心5min，取上清并加入等體積的氯仿混勻后室溫放 置5 min;5) 離心后取上清并加入1/3體積的NaAc和2倍體積的無水乙醇，-20 °C 放置1小時以上；6) 離心去除上清，將沉淀重懸于100 ^的TE緩沖液中。 所述的擴增LipL41基因片段構(gòu)建重組質(zhì)粒載體用于該LAMP反應(yīng)的靈敏度分析方法包括如下步驟1 )通過PCR方法獲得編碼鉤體主要外膜蛋白的LipL41的核苷酸序列片段;2) 將該片段與pGEM-T-easy載體連接，以構(gòu)建重組質(zhì)粒；3) 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B中，篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒DNA;4) 測定抽提質(zhì)粒DNA的濃度并進行梯度稀釋；5) 用稀釋的質(zhì)粒DNA作為模板，進行LAMP反應(yīng)；6) 取小量反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳出現(xiàn)梯形條帶所需模板 DNA的量而確定該LAMP反應(yīng)的靈敏度。所述的分別以含LipL41基因的重組質(zhì)粒DNA或鉤端螺旋體基因組DNA為 模板進行LAMP反應(yīng)為LipL41特異性引物混合液3 (il 、 Bst polymerase 2 pl 和LipL41重組質(zhì)粒或鉤端螺旋體DNA 1 ^d，加水至總體積為10 pl，反應(yīng)混合 液在60-65 。C反應(yīng)30-60 min，然后80 。C放置2 min以終止反應(yīng)，各反應(yīng)取2 pl 進行瓊脂糖凝膠電泳。所述的對LAMP反應(yīng)結(jié)果進行判定的方法包括1):肉眼直接觀察反應(yīng)濁 度，2): DNA電泳，3):實時濁度檢測；在加入熒光染料后還可以通過4):肉 眼觀察反應(yīng)液顏色變化，5):紫外照射下檢測熒光，6):實時檢測熒光等上述6 種方法中的一種或多種。所述的對LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進行酶切，根據(jù)酶切片段的大小確定反應(yīng)產(chǎn)物的 特異性的方法為在擴增目的片段的內(nèi)部均有Alul酶切位點，將梯帶狀的LAMP 擴增產(chǎn)物酶切為84 bp和110 bp的兩個片段，通過Alul酶切鑒定該LAMP反應(yīng) 產(chǎn)物是否為特異性擴增。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果1) 簡便的反應(yīng)體系在恒溫條件下實現(xiàn)了等溫擴增環(huán)節(jié)與定量檢測環(huán)節(jié)的 交互進行，在核酸等溫擴增的同時，實現(xiàn)了熒光信號的積累，整個反應(yīng)在一個 體系中完成；2) 等溫高效的擴增體系本發(fā)明是基于具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶 進行的等溫擴增技術(shù)，在提供相應(yīng)的反應(yīng)成分的條件下，實現(xiàn)了待檢耙基因的 指數(shù)增加。在提高擴增效率的同時降低了檢測儀器的成本，而且減少了反應(yīng)中不必要的非特異性擴增產(chǎn)物污染；3) 檢測速度快；本發(fā)明的核酸檢測技術(shù)，將擴增與檢測兩個反應(yīng)過程相融 合在一個反應(yīng)體系中完成，整個過程沒有升降溫循環(huán)，節(jié)省了時間；同時通過 設(shè)計與引物啞鈴結(jié)構(gòu)區(qū)域互補的滾環(huán)引物，可大大提高反應(yīng)的速度；4) 檢測靈敏度高本發(fā)明的核酸檢測技術(shù)，可在0.5-1小時的時間內(nèi)實現(xiàn) 對樣本的106-109倍的擴增，最小可對10 ng的核酸分子進行定量檢測，提高 了檢測的靈敏度；5) 檢測設(shè)備簡單相對于當然的核酸定量檢測技術(shù)，本發(fā)明不需要特定的 反應(yīng)和檢測儀器，只要普通的恒溫水浴箱和熒光檢測儀即可進行，便于應(yīng)用和 推廣。


圖1是靶基因內(nèi)參質(zhì)控的LAMP反應(yīng)電泳圖譜；圖中M: DL2000 DNA ladder; 1-11分別為LipL41質(zhì)粒DNA梯度稀釋(10"、 l(T2、 l(T3、 10'4、 l(T5、 l(T6、 10—7、 10—8、 l(T9、 10—1Q、 1(TU)液為模板進行LAMP反應(yīng)的產(chǎn)物電泳圖譜。圖2是各型鉤端螺旋體LAMP反應(yīng)的電泳圖譜；圖中M: DNA ladder; 1-15 分別為各型鉤體(56601、 56602、 56603、 56604、 56605、 56606、 56607、 56608、 56609、 56610、 56612、 56615、 56635、 56655、 56671 )基因組DNA為模板進行 LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖譜。圖3: LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定圖譜；圖中M: DNA ladder; 1: LAMP反 應(yīng)產(chǎn)物；2: Alul酶切LAMP產(chǎn)物具體實施方式
鉤端螺旋體的核酸檢測方法是通過使用特異性引物，利用LAMP技術(shù)平臺 擴增靶基因的特定區(qū)域，在陽性和陰性質(zhì)控和內(nèi)參檢測體系的輔助下，從分子水 平對鉤端螺旋體進行核酸篩査或檢測； 具體步驟如下1)根據(jù)鉤端螺旋體LipL41基因序列設(shè)計LAMP反應(yīng)特異性引物如表所示；名稱序列長 度
F3ATTGGAGCGGAAGCAATT18
B3GGAATTAACATCATACGTACTCC23
FIPCCAGCTGCAACYGCATCGATGGTTACCAAAAACCTTATACAGAG44
BIPGCAGGTTTCGCCGCTTCTATAGGTTTAGATACTGGTTCGTTTC43
Loop BGGCAACTGGTAAAGACGTAAATACA25
F3GTAAATACAGGAAACGAACCA21
B3RCCCTTGATATAAGCAGCA19
FIPCGCTTTTTTTACTTCCCCAGTTTCTATCTAAACCTACTGGAGTACG46
BIPAGTCCTGCAAAAATTTTCAATAGCGATCCAAACCTTGTCCGAA43
Loop FACTTTAATGAGAGTAGCATCGAGAG25
Loop BAGGGAATTTAGAATGTCCTTCAA23
2) 提取鉤端螺旋體基因組DNA;
3) 擴增LipL41基因片段構(gòu)建重組質(zhì)粒載體用于該LAMP反應(yīng)的靈敏度分
析；
4) 分別以含LipL41基因的重組質(zhì)粒DNA或鉤端螺旋體基因組DNA為模 板進行LAMP反應(yīng)；LipL41特異性引物混合液3 pl 、 Bst polymerase 2 pl和 LipL41重組質(zhì)?；蜚^端螺旋體DNA1 (il，加水至總體積為10|il，反應(yīng)混合液在 60-65 r反應(yīng)30-60 min，然后80 'C放置2 min以終止反應(yīng)，各反應(yīng)取2 pl進行 瓊脂糖凝膠電泳(結(jié)果如圖1、 2)。
5) 對LAMP反應(yīng)的結(jié)果進行判定；
6) 對LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進行酶切，根據(jù)酶切片段的大小確定反應(yīng)產(chǎn)物的特異 性。在擴增目的片段的內(nèi)部均有Alul酶切位點，將梯帶狀的LAMP擴增產(chǎn)物 酶切為84 bp和110 bp的兩個片段，通過Alul酶切鑒定該LAMP反應(yīng)產(chǎn)物是否 為特異性擴增(電泳結(jié)果如圖3)。
所述的提取鉤端螺旋體基因組DNA的步驟為
1) 10 000 rpm離心5 min收集培養(yǎng)的鉤端螺旋體后加入500 (il digestion buffer和3 (il的蛋白酶溶液，37 。C溫育30min;
2) 向上述溶液中加入300 nlCTAB/NaCl混勻，65 。C作用10min;
3) 加入等體積的平衡酚混勻后室溫放置5 min;
4) 4 °C 10 000rpm離心5min，取上清并加入等體積的氯仿混勻后室溫放置5 min;
5) 離心后取上清并加入1/3體積的NaAc和2倍體積的無水乙醇，-20 °C 放置1小時以上；
6) 離心去除上清，將沉淀重懸于100pl的TE緩沖液中。
所述的擴增LipL41基因片段構(gòu)建重組質(zhì)粒載體用于該LAMP反應(yīng)的靈敏度 分析方法包括如下步驟-
1 )通過PCR方法獲得編碼鉤體主要外膜蛋白的LipL41的核苷酸序列片段;
2) 將該片段與pGEM-T-easy載體連接，以構(gòu)建重組質(zhì)粒；
3) 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B中，篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒DNA;
4) 測定抽提質(zhì)粒DNA的濃度并進行梯度稀釋；
5) 用稀釋的質(zhì)粒DNA作為模板，進行LAMP反應(yīng)；
6) 取小量反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳出現(xiàn)梯形條帶所需模板 DNA的量而確定該LAMP反應(yīng)的靈敏度。
所述的對LAMP反應(yīng)結(jié)果進行判定的方法包括l)肉眼直接觀察反應(yīng)濁度， 2)DNA電泳，3)實時濁度檢測；在加入熒光染料后還可以通過4)肉眼觀察反應(yīng) 液顏色變化，5)紫外照射下檢測熒光，6)實時檢測熒光上述6種方法中的一種或 多種。其中
1) :肉眼直接觀察反應(yīng)濁度在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根 離子與反應(yīng)液中的Mg^的結(jié)合，產(chǎn)生焦磷酸鎂沉淀，且沉淀的量隨擴增產(chǎn)物的 增加而增加。定性觀察在反應(yīng)結(jié)束后，實驗結(jié)果可通過肉眼觀察直接判讀，
反應(yīng)體系中未加入內(nèi)參質(zhì)控品時可用此法。
2) : DNA電泳取少量反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下，EB
染色的凝膠中出現(xiàn)典型的梯狀條帶，則說明該管擴增反應(yīng)陽性。
3) :實時濁度檢測通過濁度儀及配套軟件，實時反映混合液中濁度的變 化并進行圖形處理，判定結(jié)果。
4) 、 5 )和6)均是根據(jù)在在加入熒光染料SYBR Green I后如果含有擴增產(chǎn)物， 反應(yīng)混合液變?yōu)榫G色，否則則保持SYBR Green I的橙色不變的現(xiàn)象進行的反應(yīng) 結(jié)果判定。
本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中的試劑包括
1) 菌株鉤端螺旋體菌株及各對照菌株、載體大腸桿菌菌株DH10B由浙 江大學醫(yī)學院病原生物學系保存；pGEM-T-easy載體購自Promega公司。
2) 酶與試劑連接酶、Ex-TaqDNA聚合酶、dNTP購自TaKaRa公司；BstDNA聚合酶(大片段)購自NEB公司。
3) 生化試劑IPTG、 X-Gal、細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海博彩生
物科技有限公司。
4) 培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為LB，鉤端螺旋體為EMJH或柯氏培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1.一種鉤端螺旋體的核酸檢測方法，其特征在于通過使用特異性引物，利用LAMP技術(shù)平臺擴增靶基因的特定區(qū)域，在陽性和陰性質(zhì)控和內(nèi)參檢測體系的輔助下，從分子水平對鉤端螺旋體進行核酸篩查或檢測；具體步驟如下1)根據(jù)鉤端螺旋體LipL41基因序列設(shè)計LAMP反應(yīng)特異性引物；2)提取鉤端螺旋體基因組DNA；3)擴增LipL41基因片段構(gòu)建重組質(zhì)粒載體用于該LAMP反應(yīng)的靈敏度分析；4)分別以含LipL41基因的重組質(zhì)粒DNA或鉤端螺旋體基因組DNA為模板進行LAMP反應(yīng)；5)對LAMP反應(yīng)的結(jié)果進行判定；6)對LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進行酶切，根據(jù)酶切片段的大小確定反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鉤端螺旋體的核酸檢測方法，其特征在于所述 的提取鉤端螺旋體基因組DNA的步驟為 1) 10 000 rpm離心5 min收集培養(yǎng)的鉤端螺旋體后加入500 pi digestion buffer和3 |il的蛋白酶溶液，37 。C溫育30 min; 2) 向上述溶液中加入300(ilCTAB/NaCl混勻，65 。C作用10min; 3) 加入等體積的平衡酚混勻后室溫放置5min; 4) 4 °C 10 000rpm離心5min，取上清并加入等體積的氯仿混勻后室溫放 置5 min; 5) 離心后取上清并加入1/3體積的NaAc和2倍體積的無水乙醇，-20 °C 放置1小時以上； 6) 離心去除上清，將沉淀重懸于100的TE緩沖液中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鉤端螺旋體的核酸檢測方法，其特征在于所述 的擴增LipL41基因片段構(gòu)建重組質(zhì)粒載體用于該LAMP反應(yīng)的靈敏度分析方法 包括如下步驟 1)通過PCR方法獲得編碼鉤體主要外膜蛋白的LipL41的核苷酸序列片段; 2) 將該片段與pGEM-T-easy載體連接，以構(gòu)建重組質(zhì)粒； 3) 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B中，篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒DNA;4) 測定抽提質(zhì)粒DNA的濃度并進行梯度稀釋；5) 用稀釋的質(zhì)粒DNA作為模板，進行LAMP反應(yīng)；6) 取小量反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳出現(xiàn)梯形條帶所需模板 DNA的量而確定該LAMP反應(yīng)的靈敏度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鉤端螺旋體的核酸檢測方法，其特征在于所述 的分別以含LipL41基因的重組質(zhì)粒DNA或鉤端螺旋體基因組DNA為模板進行 LAMP反應(yīng)為LipL41特異性引物混合液3 (il 、 Bst polymerase 2 pl和LipL41 重組質(zhì)?；蜚^端螺旋體DNA 1 pl，加水至總體積為10 ^d，反應(yīng)混合液在60-65 °C 反應(yīng)30-60 min，然后80 。C放置2 min以終止反應(yīng)，各反應(yīng)取2 pl進行瓊脂糖 凝膠電泳。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鉤端螺旋體的核酸檢測方法，其特征在于所 述的對LAMP反應(yīng)結(jié)果進行判定的方法包括1):肉眼直接觀察反應(yīng)濁度，2): DNA電泳，3):實時濁度檢測；在加入熒光染料后還可以通過4):肉眼觀察反 應(yīng)液顏色變化，5):紫外照射下檢測熒光，6):實時檢測熒光等上述6種方法中 的一種或多種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鉤端螺旋體的核酸檢測方法，其特征在于所述的對LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進行酶切，根據(jù)酶切片段的大小確定反應(yīng)產(chǎn)物的特異性的 方法為在擴增目的片段的內(nèi)部均有AluI酶切位點，將梯帶狀的LAMP擴增產(chǎn) 物酶切為84 bp和110 bp的兩個片段，通過Alul酶切鑒定該LAMP反應(yīng)產(chǎn)物是 否為特異性擴增。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鉤端螺旋體的檢測方法。即基于核酸等溫擴增定量檢測技術(shù)。本發(fā)明通過使用特異性引物，利用LAMP技術(shù)平臺擴增靶基因的特定區(qū)域，在一系列質(zhì)控和內(nèi)對照檢測體系的輔助下，從分子水平對鉤端螺旋體進行檢測，可實現(xiàn)對微量樣本的定性定量檢測。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果(1)等溫擴增降低非特異性擴增幾率，特異性好；(2)檢測速度快、靈敏度高；(3)不需要特殊的設(shè)備，成本低；(4)操作簡便，易于推廣。本發(fā)明適用于試驗研究、臨床檢測、環(huán)境檢測等，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101225440SQ200710164460
公開日2008年7月23日 申請日期2007年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月3日
發(fā)明者杰 嚴, 嚴菊英, 盧亦愚, 林旭璦, 寅 陳 申請人:浙江大學