專利名稱：棘皮動物活體取樣提取dna的方法
技術領域：
本發明涉及一種棘皮動物提取DNA的方法，尤其是一種棘皮動物活體取樣 提取DNA的方法。
背景技術：
目前，動物的DNA提取技術已在遺傳育種、實驗研究以及生產檢測中普 遍應用，基本方法是從動物體(活體、死體)上取下部分組織樣品，將樣品在 裂解液中充分剪碎或勻漿，并使樣品組織充分消化，然后再經過萃取、離心取 上清液、乙醇沉淀、離心分離、檢測等步驟，而其中的活體取樣更利于遺傳育 種、養殖狀況監測、基因篩選、家系鑒別等研究。海洋動物中有部分可以實現 活體取樣，例如魚類，可以抽血、剪鰭條等，但是，對于棘皮動物(海膽、海 參)卻很難實現。由于海膽表面有殼和棘覆蓋、海參表面主要是膠原蛋白和多 糖，都很難獲取到含有基因組DNA的細胞，因而傳統的棘皮動物DNA提取方 法需要將試驗動物殺死，而后選用齒間肌(海膽)、縱肌(海參)等組織取樣， 即在死體上取樣。這種取樣方法所獲得的遺傳信息在育種上沒有實際意義，對 棘皮動物遺傳育種工作的開展極為不利。
發明內容
本發明是為了解決現有技術所存在的上述問題，提供一種可以合理利用棘 皮動物資源，進行輔助育種、養殖狀況監測、基因篩選、家系鑒別等研究工作 的棘皮動物活體取樣提取DNA的方法。
本發明的技術解決方案是 一種棘皮動物活體取樣提取DNA的方法，其步 驟如下
a. 取棘皮動物活體組織至少0.01g，放入離心管中；
b. 在盛有棘皮動物樣品組織的離心管中，加入200 pl裂解液，然后將組 織在裂解液中充分剪碎，5(TC消化45 55min，期間每隔10min振蕩搖勻一次， 所述裂解液的組分及終濃度為0.2g/l蛋白酶K， 0.5%SDS， 10Ommol/1EDTA， 0.05g/lRNA酶；
c. 在離心管中加入200TES稀釋溶液稀釋；d. 加入200 ^的Tris-飽和平衡酚和200 pi氯仿-異戊醇混合液，萃取15~30
min;
e. 7500r/min離心10min，用粗口槍頭移液器抽取上清，將上清液置入另 一離心管中；
f. 重復d、 e步驟；
g. 將萃取之后的上清夜在10000r/min離心10min，使用粗口槍頭移液器 吸取溶液，放入另一離心管中；
h. 在離心管中，加入兩倍于離心管中體積的100%的-20"€乙醇，之后放入 -2(TC中靜置至少4h;
i. 12500 r/min離心15 min，除去溶液，將離心管倒置在濾紙上，吸干剩液； j.向離心管中加入70%乙醇800 pl，洗滌一次，12500 r/min離心5 min，
倒掉溶液，室溫晾干至少30min;
k.加入0.1XTE100nl，輕輕振蕩，然后4"C溶解至少4 h;
1.用1%的瓊脂糖凝膠電泳，取2 ^ DNA模板混合2 pl上樣緩沖液在瓊脂 糖膠上點樣進行檢測，電泳結果經凝膠成像顯示DNA的濃度與質量。
所述a步驟是將活海膽或活海參放在盛有海水的容器中，海水的深度剛沒 過海膽或海參，用剪刀剪取海膽管足或海參的觸手、管足，放在濾紙上吸千水 分。
為防止感染，最好在所述海水中以0.001 g/1的劑量加入青霉素。
所述a步驟是將促使活海參排出內臟；將海參吐出的腸剖開用雙蒸水沖洗
干凈，然后將洗凈的海參腸放在濾紙上吸干水分。
所述的促使活海參排出內臟是向海參體內注射淡水或注射0.35 mo1/1的
KC1 2~4ml。
所述f步驟后觀察中間層和下層，如有中間層或下層顏色深，加入400^iL 氯仿-異戊醇再萃取一次。
本發明可無需將棘皮動物殺死，而是在活體上取樣，繼而提取DNA，使分 子生物學技術能真正成為遺傳育種的輔助工具。利用本發明，可以合理利用棘 皮動物資源，進行輔助育種、養殖狀況監測、基因篩選、家系鑒別等工作。另 外，對于棘皮動物中很多瀕危種的保護和研究，意義也十分重大。
具體實施例方式
實施例1 : a. 將活海膽放在盛有少量海水的容器中，海水的深度以剛沒過海膽為宜， 這樣，可讓海膽管足在水中呈放射狀向外伸出，方便取樣；用剪刀剪取少量海 膽管足(根據實際情況大約能夠獲得約l 3mm長的管足不等)，放在濾紙上吸 干水分；稱量所取海膽管足質量，取樣量最少不得少于0.01g，放入1.5 ml離 心管中；
b. 在盛有海膽管足的離心管中，加入200 pl裂解液，然后將管足在裂解 液中充分剪碎或勻漿，5(TC消化45 55min，期間每隔10 min振蕩搖勻一次， 以保證樣品組織充分消化;所述裂解液的組分及終濃度為0.2g/l蛋白酶K， 0.5% SDS， 100 mmol/1 EDTA， 0.05g/lRNA酶；因為活體棘皮動物的DNA中RNA 的含量較多，裂解液中加入RNA酶可降解掉多余的RNA;
c. 由于活體海膽管足消化后的溶液過于粘稠，在萃取時無法順利進行水相 轉移，因此必須在萃取之前在離心管中加入200 ^tl TES稀釋溶液稀釋；
d. 加入200 ^的Tris-飽和平衡酚和200 pl氯仿-異戊醇混合液(24: 1 )， 萃取15 30min;
e. 7500 r/min離心10 min，用粗口槍頭移液器抽取上清，將上清液置入另 一離心管中；粗口槍頭移液器是將20(Hil移液器的槍頭前端切掉至少lcm，避 免使用普通細口槍頭所存在的不易抽提且會使DNA鏈發生斷裂的現象；
f. 重復d、 e步驟；
g. 將d、 e步驟萃取之后的上清夜合并，在10000 r/min離心10 min,將海 膽管足中含有的骨片沉淀于離心管底部，使用粗口槍頭移液器慢慢從上至下小 心吸取溶液，放入新的離心管中，即棄去骨片，防止骨片影響所提取DNA的 質量；
h. 在離心管中，加入兩倍于離心管中體積的100。/。的-2(TC預先冷卻乙醇， 之后放入-2(TC冰箱中靜置至少4 h;
i. 12500 r/min離心15 min，除去溶液，基因組DNA會留在離心管中，將 離心管倒置在濾紙上，吸干剩液；
j.向離心管中加入70%乙醇800 pl，洗滌一次，12500 r/min離心5 min， 倒掉溶液，室溫晾干至少30min;
k.加入0.1XTE100nl，輕輕振蕩，然后放入4-C冰箱中溶解至少4 h;
1.用1%的瓊脂糖凝膠電泳，取2 DNA模板混合2 ^上樣緩沖液在瓊脂 糖膠上點樣進行檢測。分光光度計測量DNA的濃度(260 nm)， 260/280 nm
的光密度比值在1.8以上，則可以滿足正常實驗要求。
電泳結果經凝膠成像顯示本發明實施例DNA的濃度與質量，與棘皮動物 傳統的(死體)取樣組織提取的DNA—致。
實施例2:
a.將活海參放在盛有少量海水的容器中，海水的深度以剛沒過海參為宜， 用剪刀剪取海參的觸手1~3條(根據海參的大小)或管足少許，放在濾紙上吸 干水分備用；稱量所取海參管足或觸手質量，取樣量最少不得少于0.01g，放入 1.5ml離心管中；為防止海參因觸手或管足受傷而感染，以0.001 g/L的劑量在 海水中加入青霉素消炎；
按實施例1的b~l步驟提取DNA。
電泳結果經凝膠成像顯示本發明實施例DNA的濃度與質量，與棘皮動物 傳統的(死體)取樣組織提取的DNA—致。 實施例3:
a.向海參體內注射淡水而刺激海參，在注射的同時海參就會發生排臟現 象，也可注射0.35 mol/L的KC1 2~4 mL， 1~2 min后排出內臟；將海參吐出的 腸剖開用雙蒸水沖洗干凈，然后將洗凈的海參腸放在濾紙上吸干水分；稱量所 取海參腸質量，取樣量最少不得少于0.01g，放入1.5ml離心管中；
按b f步驟操作；
f步驟后觀察中間層和下層，如有中間層或下層顏色深(不澄清)，加入400 kil氯仿-異戊醇(24: 1)再萃取一次。 再按g l步驟操作，提取DNA。
電泳結果經凝膠成像顯示本發明實施例DNA的濃度與質量，與棘皮動物 傳統的(死體)取樣組織提取的DNA—致。
權利要求
1.一種棘皮動物活體取樣提取DNA的方法，其步驟如下a.取棘皮動物活體組織至少0.01g，放入離心管中；b.在盛有棘皮動物樣品組織的離心管中，加入200μl裂解液，然后將組織在裂解液中充分剪碎，50℃消化45～55min，期間每隔10min振蕩搖勻一次，所述裂解液的組分及終濃度為0.2g/l蛋白酶K，0.5％SDS，100mmol/l EDTA，0.05g/lRNA酶；c.在離心管中加入200μl TES稀釋溶液稀釋；d.加入200μl的Tris-飽和平衡酚和200μl氯仿-異戊醇混合液，萃取15～30min；e.7500r/min離心10min，用粗口槍頭移液器抽取上清，將上清液置入另一離心管中；f.重復d、e步驟；g.將萃取之后的上清夜在10000r/min離心10min，使用粗口槍頭移液器吸取溶液，放入另一離心管中；h.在離心管中，加入兩倍于離心管中體積的100％的-20℃乙醇，之后放入-20℃中靜置至少4h；i.12500r/min離心15min，除去溶液，將離心管倒置在濾紙上，吸干剩液；j.向離心管中加入70％乙醇800μl，洗滌一次，12500r/min離心5min，倒掉溶液，室溫晾干至少30min；k.加入0.1×TE 100μl，輕輕振蕩，然后4℃溶解至少4h；l.用1％的瓊脂糖凝膠電泳，取2μl DNA模板混合2μl上樣緩沖液在瓊脂糖膠上點樣進行檢測。
2. 根據權利要求1所述的棘皮動物活體取樣提取DNA的方法，其特征在于: 所述a步驟是將活海膽或活海參放在盛有海水的容器中，海水的深度剛沒過海 膽或海參，用剪刀剪取海膽管足或海參的觸手、管足，放在濾紙上吸干水分。
3. 根據權利要求2所述的棘皮動物活體取樣提取DNA的方法，其特征在于: 在所述海水中以0.001 g/1的劑量加入青霉素。
4. 根據權利要求1所述的棘皮動物活體取樣提取DNA的方法，其特征在于: 所述a步驟是促使活海參排出內臟；將海參吐出的腸剖開用雙蒸水沖洗干凈， 然后將洗凈的海參腸放在濾紙上吸干水分。
5. 根據權利要求4所述的棘皮動物活體取樣提取DNA的方法，其特征在于 所述的促使活海參排出內臟是向海參體內注射淡水或注射0.35 mol/l的KCl 2~4 ml。
6. 根據權利要求1或2或3或4或5所述的棘皮動物活體取樣提取DNA 的方法，其特征在于所述f步驟后觀察中間層和下層，如有中間層或下層顏 色深，加入400pl氯仿-異戊醇再萃取一次。
全文摘要
本發明公開一種棘皮動物活體取樣提取DNA的方法，是取活體海膽的管足或取活體海參的管足、觸手或腸，用加有DNA酶的裂解液裂解消化，經過萃取、離心取上清液、離心除渣(骨片)、乙醇沉淀、離心分離、檢測等步驟，使所提取的DNA的濃度與質量，與棘皮動物傳統的(死體)取樣組織提取的DNA一致。無需將棘皮動物殺死，而是在活體上取樣，繼而提取DNA，使分子生物學技術能真正成為遺傳育種的輔助工具。利用本發明，可以合理利用棘皮動物資源，進行輔助育種、養殖狀況監測、基因篩選、家系鑒別等工作。另外，對于棘皮動物中很多瀕危種的保護和研究，意義也十分重大。
文檔編號C12P19/34GK101168760SQ200710157999
公開日2008年4月30日 申請日期2007年11月8日 優先權日2007年11月8日
發明者君 丁, 于佳平, 馮志綱, 常亞青, 燚 田 申請人:大連水產學院