一種抗昆蟲血細胞免疫的線蟲表皮蛋白及基因序列的制作方法

專利名稱：一種抗昆蟲血細胞免疫的線蟲表皮蛋白及基因序列的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種具有抗昆蟲血細胞免疫功能的來自格式線蟲 (&e/"miema g/flsn')的表皮蛋白EN01p。本發明還涉及該蛋白的氨基酸序列及編碼此蛋白 的核苷酸序列。
背景技術：
昆蟲病原線蟲是一類自然存在于土壤中的昆蟲天敵，以感染期線蟲通過昆蟲的氣孔、口 腔和肛門等自然孔口或通過昆蟲表皮節間膜進入血腔，將腸道內攜帶的共生細菌釋放到昆蟲 血腔，共同抵抗寄主的免疫系統，快速殺死寄主。線蟲-共生菌雖然具有抵抗昆蟲免疫系統的 能力，但寄主血細胞的快速包被和免疫反應仍然能夠殺死線蟲和共生菌，特別是在線蟲釋放 其共生菌之前。因此線蟲能否抑制昆蟲的血細胞免疫并在昆蟲體腔中存活，是決定線蟲成功 致死昆蟲的關鍵。目前，國內外對線蟲抑制昆蟲血細胞免疫機制的研究很少，只有Wangand Gaugler從昆蟲病原線蟲S. g/oyw/表皮分離出一種蛋白，該蛋白能顯著提高線蟲抗昆蟲血細 胞的免疫力，但該研究小組沒有純化出該蛋白并克隆其基因。因此，對昆蟲病原線蟲表皮蛋 白純化及基因克隆的研究有助于搞清線蟲抗昆蟲血細胞免疫的機制，同時還有助于拓展該蛋 白在農業上的應用，為人類充分利用這一蛋白開展有益的嘗試
發明內容
:
本發明的目的是提供一種抗昆蟲血細胞免疫的線蟲表皮蛋白，從而拓展該蛋白在農業上 的應用。
本發明的主要技術方案是通過提取純化格式線蟲(S^'恥r加附flg/om')的表皮蛋白，測
定其肽段序列，再根據肽段序列克隆表皮蛋白的編碼基因。 本發明的線蟲表皮蛋白具有抗昆蟲血細胞免疫的作用。
具體技術方案如下
(1) 人工培育格式線蟲，收集線蟲；先后用0.5%次氯酸鈉和35%乙醇處理線蟲，提取線蟲 表皮蛋白的粗品；用8%制備型Native-PAGE和Mini Whole Gel Eluter (Bio-Rad)純化表皮蛋 白。
(2) 通過大蠟螟血細胞ROS水平檢測等方法確定表皮蛋白的生物活性。
(3) 采用液譜—電噴霧—質譜(LC-ESI-MS/MS)獲得表皮蛋白的肽段序列。
(4) 根據肽段序列設計簡并引物，PCR擴增獲得DNA片段，通過5'和3' -RACE獲得 表皮蛋白全長基因。
具體實施方式
:
下面通過具體實例進一步說明本發明特點。
實施例1線蟲的培養與收集
采用人工培養基(主要含豆粉、面粉、雞蛋、動物肝臟及高溫淀粉酶等)培養格氏線蟲， 培養時以體積約為1CMS海綿做載體，盛入500ml錐形瓶，于30。C溫室中培養30天。待線 蟲培養好后收集線蟲，取出培養瓶中的海綿，在通氣的自來水中浸洗海綿lh，粗紗布過濾掉 海綿，然后反復用自來水清洗濾液，徹底除去培養基殘留物。用終濃度0.5%次氯酸鈉處理收 集的線蟲15min，之后用自來水徹底洗去次氯酸鈉，然后換成蒸餾水通氣處理48h，最后用細 紗布過濾除凈蒸餾水，收集線蟲。
實施例2線蟲表皮蛋白的提取與純化
將線蟲在預冷的35%乙醇中浸泡30min，細紗布過濾掉線蟲，收集濾液，將濾液冷凍于 -80°C冰箱過夜，然后冷凍干燥處理至干粉狀態。取干粉溶于MilliQ水至總蛋白終濃度 2mg/ml，用8%制備型Native-PAGE分離(80V 20min,180V lh30min)，隨后在Mini Whole Gel Eluter(Bio-Rad)上進行電洗脫(100mA 25min)，分別收集洗脫組分，再將各組分用 12。/。SDS-PAGE分析純度，并用BCA assay kit(Pierce)測定各組分濃度，將各組分的蛋白濃 度用MilliQ水調整為20|jg/ml。
實施例3大蠟螟血細胞活性氧(ROS)水平檢測表皮蛋白活性
用75%的酒精對大蠟螟五齡幼蟲進行表面消毒，剪斷幼蟲前腿，用移液器從斷口處吸取 lOpl血淋巴(約含100000個血細胞)，迅速加入到含0.1%的DCFH-DA的格氏昆蟲培養基 (Grace insect culture medium,Sigma G-9771)中，室溫孵育30min。用格氏昆蟲培養基洗滌 孵育后得血細胞3次，以除去細胞外的DCFH-DA，隨后在含有10|Jg/mlLPS和20pg/ml表皮 蛋白組分的格氏昆蟲培養基中37°C孵育30min，并采用含有10|Jg/mlLPS和20|Jg/ml無內毒 素BSA (Merck—Calbiochem)的格氏昆蟲培養基作為對照。用移液槍輕柔洗打吹散細胞團， 取樣觀察。細胞熒光的定性觀察在01ympusBX51熒光顯微鏡(Olympus)下進行，定量檢測 則在FACS Vantage流式細胞儀(BeetonDickinson)中進行。熒光圖像和數據采集使用的激發 波長是488nm，發射波長是535nm。結果表明表皮蛋白的表觀分子量為43 kD的SCP2組分 其活性氧水平比BSA的明顯低，說明該組分具有生物活性。
實施例4大蠟螟體內吞噬分析檢測表皮蛋白活性
首先將表皮蛋白與熒光微球交聯，將純化的表皮蛋白(ENOlp)和無內毒素BSA分別溶 于MES緩沖液(50mM， pH6.0)中，調整終濃度為0.1mg/ml。取2|j1羧基修飾的微球珠(3.6 XlOVpl, F—8821， Invi加gen)加入20|jl的蛋白溶液中，混勻后室溫孵育15min。隨后加入 20|jl l-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)-碳化二亞胺(EDAC)，室溫孵育2h。向混合物中加入甘氨 酸至終濃度100mM，室溫孵育30min以終止反應。將微球在4000g離心30min，盡除上清， 然后用PBS清洗3次(每次5min)，最后重懸于PBS中調濃度為2.0乂105個/卩1。進行體內 吞噬分析時，向5齡的大蠟螟幼蟲體內注入5Ml交聯了蛋白的微球珠(每只幼蟲含1乂106個 微球珠)。注射12h后取幼蟲血淋巴5iJl與5(Hjl的格氏昆蟲培養基混合，滴加到凹面載玻片 的凹陷處，在37°C保濕靜置5min。用50(Hj1含2pg/ml DAPI (6-聯脒-2-苯基吲哚)的甲醇 清洗載玻片一次，再加入100|jl的2|Jg/mlDAPI,37°C孵育15min，棄去染色液，甲醇清洗一 次，滴加100plPBS保存。熒光觀察在01ympusBX51熒光顯微鏡(Olympus)下進行，激發 波長350nm。結果表明表皮蛋白的表觀分子量為43 kD的SCP2組分被大蠟螟吞噬吸附明顯 少于BSA，說明該組分具有抗吞噬作用。
實施例5采用液譜一電噴霧一質譜(LC-ESI-MS/MS)獲得表皮蛋白的肽段序列
純化的SCP2組分經SDS—PAGE檢測，切取單帶經胰蛋白酶、凝乳蛋白酶、V8酶分別酶 解后，采用液譜一電噴霧一質譜(LC-ESI-MS/MS)獲得表皮蛋白的5段肽段序列，其序列分 另U為GVVDSWQPHAVR ，SLGVFHEQSR ，YGLDATAVGDEGGFAPNIQDNK ， AAVPSGASTGIHEALELR和GLTSGVATLFK。
實施例6表皮蛋白基因克隆
根據生物信息學方法，尋找與上面5個肽段最為相近的物種及其蛋白，分別為秀麗隱桿 線蟲、單一異尖線蟲、旋毛線蟲、刺尾蝎水解酶、擬南芥烯醇化酶(enolase)、番茄烯醇化酶、 油菜烯醇化酶等，找到以上物種相應蛋白的保守區域，然后再根據這些保守序列設計引物5'-GAYTCMCGYGGMAAYCCAACYGTTGA-3，和5，- GTSACKGAWCCRATTTGRTT-3'， PCR (94。C3min; 94°C 60s， 50°C 30s， 72°C 70s, 35cycles; 72°C 10min; 4°C °0獲得1071bp 的陽性片段;然后再使用TaKaRa公司的試劑盒進行RACE實驗以獲得包括完整ORF的DNA 片段，3，RACE 設計的引物為 5'-TACCGGACTGGTGTCCATCGGCAT-3'和 5，-AGTCGTTCATCAAGGACTATCCCGT-3， ； 5'RACE設計兩對引物，分另U為 S1:5 ，-CGCCAAGAACTTCGATGTGACCGAC-3' 禾口 Al:5，陽GACTCCCTTTCCGTGGTGGACAGCC-3， ， 及
S2:5，-ACTTGGCCGATCTCGCCGGAGTGAG誦3， 和 A2:5，-CAGCAGCGCGGAACACACCTAAATC-3，。將上述實驗得到的核苷酸片段進行拼接后 獲得一個大小為1032bp的完整閱讀框的核苷酸序列，將其命名為ewo7基因(SEQ IDNOl)， 其推測的氨基酸序列(SEQIDNOl)中包含實施例5中獲得的5個肽段，確認獲得的ewo/ 基因正確。通過GenBank比對，獲知此種蛋白與多個物種的烯醇化酶具有較高的同源性，其 中和簡單異尖線蟲U"&flyfew'm/ /ex)烯醇化酶的相似性為83%。
提取格式線蟲的RNA，根據eno/基因設計引物進行RT-PCR,同樣獲得線蟲的ewo/基 因，進一步證明該基因編碼格式線蟲的表皮蛋白ENOlp。
序列表
<110>中國農業科學院植物保護研究所
〈120〉 一種抗昆蟲血細胞免疫的線蟲表皮蛋白及基因序列
<130〉 05-01
〈160〉 1
<170> Patentln version 3. 1 〈210〉 1 〈211〉 1032 〈212〉 DNA
〈213〉 格式線蟲(Steinememaglasri) 〈400〉 1
ATGATCGAGC TTGACGGMC CGAGMCMG TCGAGCCTCG GAGCCMCGC CATCCTCGGC 60
GTGTCGCTCG CCGTCGCCAA GGCCGGTGCC GTGCACMGG GAGTGCCCCT CTACAAGCAC 120
TTGGCCGATC TCGCCGGAGT GAGCMGGTT GTCCTCCCCG TTCCTGCCTT CAACGTCATC 180
MCGGAGGCT CGCACGCCGG AMCMGCTC GCCATGCAGG AGTTCATGAT CCTCCCCGTC 240
GGAGCCAAGA GCTTCMGGA GGCCATGCGC ATGGGATCCG AGATCTACCA CCACCTCMG 300
GCCGAGATCA AGAAGCGCTA CGGACTCGAC GCCACCGCCG TCGGAGATGA GGGAGGATTC 360
GCCCCCAACA TCCAGGACM CMGGAGGGT CTTGACCTCC TCMCACCGC TATCMGCTT 420
GCCGGATATA CCGGACTGGT GTCCATCGGC ATGGACGTCG CCGCCTCCGA GTTCTACMG 480
GAGMCGAGA AGMGTACGA CTTGGACTTC MGMCCCCA ACTCCGACCC CAGCAAGTGG 540
ATCMCGGAG ACGAGCTCGC CGCGCTCTAC CAGTCGTTCA TCAAGGACTA TCCCGTCGTC 600 TCCATCGAGG ACGCCTTCGA CCAGGACGAC TGGGCGMCT
ACCTCCATCC AGCTCGTCGG AGATGATCTC ACCGTCACCA
GCCGTCGACC AGMGGCGTG CMCTGCCTT CTCCTCAAGG
ACCGAGTCCA TCGAGGCCGC CMGCTGTCC CGCGCCAACG
CACCGTTCTG GAGAMCCGA AGACTGCTTC ATCGCTGATC
GGACAGATCA AGACCGGAGC CCCTTGCCGA TCTGAGCGTC
CTTCGCATCG AGGAGGAGCT CGGAGCCGAT GCCGTGTACG CCCCAGATCT M
說明書第5/6頁
GGAGCAAGCT GATGGGCAAC 660 ACCCCAAGCG CATCCAGATG 720 TCMCCAGAT CGGATCCATC 780 GATGGGGCGT CATGGTTTCC 840 TTGTTGTTGG CCTCGCTACT 900 TCGCCAAGTA CAACCAGCTT 960
CCGGAGAGAA CTTCCGCMC 1020
1032
Met lie Glu Leu Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Ser Leu Gly Ala Asn
15 10 15
Ala lie Leu Gly Val Ser Leu Ala Val Ala Lys Ala Gly Ala Val His
20 25 30
Lys Gly Val Pro Leu Tyr Lys His Leu Ala Asp Leu Ala Gly Val Ser
35 40 45
Lys Val Val Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val lie Asn Gly Gly Ser
50 55 60
His Ala Gly Asn Lys Leu Ala Met Gin Glu Phe Met lie Leu Pro Val 65 70 75 80
Gly Ala Lys Ser Phe Lys Glu Ala MET Arg MET Gly Ser Glu lie Tyr
85 90 95
His His Leu Lys Ala Glu lie Lys Lys Arg Tyr Gly Leu Asp Ala Thr
100 105 110
Ala Val Gly Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn lie Gin Asp Asn Lys
115 120 125
Glu Gly Leu Asp Leu Leu Asn Thr Ala lie Lys Leu Ala Gly Tyr Thr
130 135 140
Gly Leu Val Ser lie Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Lys 145 150 155 160
Glu Asn Glu Lys Lys Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Asn Pro Asn Ser Asp
165 170 175
Pro Ser Lys Trp lie Asn Gly Asp Glu Leu Ala Ala Leu Tyr Gin Ser
180 185 190
Phe lie Lys Asp Tyr Pro Val Val Ser lie Glu Asp Ala Phe Asp Gin
195 200 205
Asp Asp Trp Ala Asn Trp Ser Lys Leu Met Gly Asn Thr Ser lie Gin 210 215 220
Leu Val Gly Asp Asp Leu Thr Val Thr Asn Pro Lys Arg lie Gin Met 225 230 235 240
Ala Val Asp Gin Lys Ala Cys Asn Cys Leu Leu Leu Lys Val Asn Gin
245 250 255
lie Gly Ser lie Thr Glu Ser lie Glu Ala Ala Lys Leu Ser Arg Ala
260 265 270
Asn Gly Trp Gly Val Met Val Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp
275 280 285
Cys Phe lie Ala A印Leu Val Val Gly Leu Ala Thr Gly Gin lie Lys
290 295 300
Thr Gly Ala Pro Cys Arg Ser Glu Arg Leu Ala Lys Tyr Asn Gin Leu 305 310 315 320
Leu Arg lie Glu Glu Glu Leu Gly Ala Asp Ala Val Tyr Ala Gly Glu
325 330 335
Asn Phe Arg Asn Pro Gin lie 340
權利要求
1. 一種編碼線蟲表皮蛋白的基因enol，其特征在于它是由格式線蟲(Steinernemaglasri)產生的，其核苷酸序列為1 ATGATCGAGC TTGACGGAAC CGAGAACAAG TCGAGCCTCG GAGCCAACGC CATCCTCGGC61GTGTCGCTCG CCGTCGCCAA GGCCGGTGCC GTGCACAAGG GAGTGCCCCT CTACAAGCAC121 TTGGCCGATC TCGCCGGAGT GAGCAAGGTT GTCCTCCCCG TTCCTGCCTT CAACGTCATC181 AACGGAGGCT CGCACGCCGG AAACAAGCTC GCCATGCAGG AGTTCATGAT CCTCCCCGTC241 GGAGCCAAGA GCTTCAAGGA GGCCATGCGC ATGGGATCCG AGATCTACCA CCACCTCAAG301 GCCGAGATCA AGAAGCGCTA CGGACTCGAC GCCACCGCCG TCGGAGATGA GGGAGGATTC361 GCCCCCAACA TCCAGGACAA CAAGGAGGGT CTTGACCTCC TCAACACCGC TATCAAGCTT421 GCCGGATATA CCGGACTGGT GTCCATCGGC ATGGACGTCG CCGCCTCCGA GTTCTACAAG481 GAGAACGAGA AGAAGTACGA CTTGGACTTC AAGAACCCCA ACTCCGACCC CAGCAAGTGG541 ATCAACGGAG ACGAGCTCGC CGCGCTCTAC CAGTCGTTCA TCAAGGACTA TCCCGTCGTC601 TCCATCGAGG ACGCCTTCGA CCAGGACGAC TGGGCGAACT GGAGCAAGCT GATGGGCAAC661 ACCTCCATCC AGCTCGTCGG AGATGATCTC ACCGTCACCA ACCCCAAGCG CATCCAGATG721 GCCGTCGACC AGAAGGCGTG CAACTGCCTT CTCCTCAAGG TCAACCAGAT CGGATCCATC781 ACCGAGTCCA TCGAGGCCGC CAAGCTGTCC CGCGCCAACG GATGGGGCGT CATGGTTTCC841 CACCGTTCTG GAGAAACCGA AGACTGCTTC ATCGCTGATC TTGTTGTTGG CCTCGCTACT901 GGACAGATCA AGACCGGAGC CCCTTGCCGA TCTGAGCGTC TCGCCAAGTA CAACCAGCTT961 CTTCGCATCG AGGAGGAGCT CGGAGCCGAT GCCGTGTACG CCGGAGAGAA CTTCCGCAAC1021 CCCCAGATCT AA
2.根據權利要求l所述的基因enol編碼的線蟲表皮蛋白EN01p，其氨基酸序列為:1MIELDGTENKSSLGANAIIiGVSLAVAKAGAVHKGVPLYKH41LADLAGVSKVVLPVPAFNVINGGSHAGNKLAMGEFMILPV81GAKSFKEAMRMGSEIYHHLKAEIKKRYGLDATAVGDEGGF121APNIQDNKEGLDLIiNTAIKLAGYTGLVSIGMDVAASEFYK161enekkyd:ldfknpnsdpskwingdeiaalyqsfikdypvv201SIEDAFDGDDWANWSKLMGNTSIQIiVGDDIiTVTNPKRIGM241AVDQKACNCIiMiKVNQIGSITESIEAAKLSRANGWGVMVS281HRSGETEDCFIADLVVGLATGGIKTGAPCRSERLAKYNGIi321LRIEEEIiGADAVYAGENFRNPQI 。
3. 根據權利要求2所述的線蟲表皮蛋白ENOlp，用于制備抗昆蟲血細胞免疫的粗制品或精制品o
4. 根據權利要求3所述的抗昆蟲血細胞免疫的蛋白質粗制品或精制品，用于抑制昆蟲血 細胞免疫的用途。
全文摘要
本發明涉及一種蛋白，其特點是根據格式線蟲(Steinernema glasri)表皮蛋白ENO1p的肽段序列克隆到表皮蛋白基因enol，該蛋白具有抗昆蟲血細胞免疫的功能。本發明還涉及該蛋白及其多核苷酸的制備方法和用途。
文檔編號C12N15/12GK101386849SQ200710145429
公開日2009年3月18日 申請日期2007年9月12日 優先權日2007年9月12日
發明者華 劉, 慶 姚, 張雨良, 曾洪梅, 楊懷文, 楊秀芬, 袁京京, 邱德文 申請人:中國農業科學院植物保護研究所