專利名稱：：一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法
技術領域：
：本發明涉及一種分析微生物群落結構組成的方法。技術背景微生物群落具有生物多樣性和群落演替現象，因此采用現有的生物檢測和分析方法難以分析微生物群落的生物組成結構。
發明內容本發明的目的是為了解決目前現有的生物檢測和分析方法難以分析微生物群落的生物組成結構的問題，而提供的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法。采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法按以下步驟進行一、采用周冀中等人的DNA提取方法(JIZHONGZHOU,MARYANNBRUNS，JAMESM.TIEDJE.DNARecoveryfromSoilsofDiverseComposition.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,1996,62:316—322)提取微生物群落DNA;二、PCR擴增PCR擴增正向引物序列為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，PCR擴增反向引物序列為TTACCGCGGCTGCTGGCA，反向引物5，端采用磷酸標記；三、酶切去除反意義鏈酶切反應體系為50|iL由5jiL10xbuffer緩沖溶液、40jiLPCR擴增產物和5mL濃度為5U&L的義核酸外切酶組成，酶切反應體系在37'C的環境中反應34h，然后純化酶切產物，再溶解于20pL重蒸餾水中；四、將溶解于重蒸餾水中的酶切產物與等體積的變性劑混合置于95"C的環境中熱變性處理10min，然后立即冰浴5min，之后凝膠電泳上樣、在4~20°C、電壓為250-300V的條件下電泳12~18h;五、將凝膠浸泡于重蒸餾水中10min，然后用滅菌的刀片將DNA條帶分別切下放入離心管中并研碎，再向每支離心管中加入50pL裂解液在37'C的環境中處理3h，然后離心、分離上清液，并向上清液中加入上清液體積2倍的無水乙醇，置于-20。C的環境中沉淀2h，再在24000g、4°C的條件下離心15min，沉淀物DNA在37°C的環境中干燥15min后加入TE溶液；六、對步驟五得到的沉淀物DNA分別進行分析，即得出微生物群落的組成結構；步驟四凝膠中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺占凝膠總重量的10%14%、甘油占凝膠總重量的5%~10%，其中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺的質量比為49~55:1;步驟四中變性劑由去離子甲酰胺和上樣緩沖液組成，其中上樣緩沖液由NaOH溶液、EDTA、溴酚藍、二甲苯氰FF和去離子水組成，上樣緩沖液中NaOH的濃度為10mM/L、EDTA的濃度為20mM/L、溴酚藍的濃度為0.02%(重焉)、二甲苯氰FF的濃度為0.02n/。(重量)，去離子甲酰胺與上樣緩沖液的體積比為l:3;步驟五中5(VL的裂解液含有0.5M/L的乙酸銨、10mM/L的乙酸鎂，lmM/L、pH值為8.0的EDTA、0.1%(重量)的SDS和余量的重蒸餾水。本發明可以對工程系統內復雜的微生物群落進行群落結構分析，具有快速、準確的優點，可以解析群落演替，同步掌握工程系統內微生物菌群變化情況，指導工藝、提高工程系統的運行效率。圖1是具體實施方式九對比實驗中步驟三中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺占凝膠總重量的8%的凝膠電泳圖，圖2是具體實施方式九對比實驗中步驟三中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺占凝膠總重量的12%的凝膠電泳圖，圖3是具體實施方式九對比實驗中步驟三中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺占凝膠總重量的16%的凝膠電泳圖，圖4是具體實施方式九對比實驗中步驟四中去離子甲酰胺與上樣緩沖液的體積比為1:1的凝膠電泳圖，圖5是具體實施方式九對比實驗中步驟四中去離子甲酰胺與上樣緩沖液的體積比為1:2的凝膠電泳圖，圖6是具體實施方式九對比實驗中步驟四中去離子甲酰胺與上樣緩沖液的體積比為1:3的凝膠電泳圖，圖7是具體實施方式九同步分析脫氮脫硫工藝系統微生物群落的SSCP圖譜。具體實施方式具體實施方式一本實施方式采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法按以下步驟進行一、采用周冀中等人的DNA提取方法(JIZHONGZHOU,MARYANNBRUNS，JAMESM.TIEDJE.DNARecoveryfromSoilsofDiverseComposition.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,1996,62:316-322)提取微生物群落DNA;二、PCR擴增PCR擴增正向引物序列為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,PCR擴增反向引物序列為TTACCGCGGCTGCTGGCA，反向引物5'端采用磷酸標記；三、酶切去除反意義鏈酶切反應體系為50nL由5^L10xbuffer緩沖溶液、40^LPCR擴增產物和5nL濃度為5U/nL的義核酸外切酶組成，酶切反應體系在37°。的環境中反應34h,然后純化酶切產物，再溶解于20pL重蒸餾水中；四、將溶解于重蒸餾水中的酶切產物與等體積的變性劑混合置于95'C的環境中熱變性處理10min，然后立即冰浴5min，之后凝膠電泳上樣、在4~20°C、電壓為250300V的條件下電泳12~18h;五、將凝膠浸泡于重蒸餾水中10min，然后用滅菌的刀片將DNA條帶分別切下放入離心管中并研碎，再向每支離心管中加入50^iL裂解液在37。C的環境中處理3h，然后離心、分離上清液，并向上清液中加入上清液體積2倍的無水乙醇，置于-20"C的環境中沉淀2h，再在24000g、4"C的條件下離心15min，沉淀物DNA在37"C的環境中干燥15min后加入10(iLTE溶液；六、對步驟五得到的沉淀物DNA分別進行分析，即得出微生物群落的組成結構；步驟四凝膠中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺占凝膠總重量的10%14%、甘油占凝膠總重量的5%10%，其中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺的質量比為4955:1;步驟四中變性劑由去離子甲酰胺和上樣緩沖液組成，其中上樣緩沖液由NaOH溶液、EDTA、溴酚藍、二甲苯氰FF和去離子水組成，上樣緩沖液中NaOH的濃度為10mM/L、EDTA的濃度為20mM/L、溴酚藍的濃度為0.02%(重量)、二甲苯氰FF的濃度為0.02。/。(重量)，去離子甲酰胺與上樣緩沖液的體積比為1:3;步驟五中50mL的裂解液含有0.5m/l的乙酸銨、10mM/L的乙酸鎂，lmM/L、pH值為8.0的EDTA、0.1%(重量)的SDS和余量的重蒸餾水。核糖體小亞基RNA(SSUrRNA)基因因其進化上的保守性以及操作上的簡便性成為本實施方式的靶基因。本實施方式PCR擴增正向引物對應E.coli16SrRNA基因827bp，PCR擴增反向引物對應E.coli16SrRNA基因533~515bp，本實施方式以16SrRNA基因V1V3區(大約為500bp的序列)為耙序列，相對于己有的單鏈構象多態性技術(僅以V3區的200bp作為耙序列)本實施方式可減少雜帶的干擾，為系統發育分析提供更多的信息，分析結果更為準確。微生物群落結構復雜、再加之同源或異源鏈的相互作用，采用現有的單鏈構象多態性技術(SSCP)會產生大量的非特異性DNA條帶，給群落結構的分析造成很大困難；本實施方式步驟三酶切去除反意義鏈可以至少減少一半的dna條帶數，形成單鏈SSCP圖譜，為后續微生物分析提供很大方便、簡化操作。本實施方式方法中每一種微生物只有一條特征DNA條帶。本實施方式反向引物5'端采用磷酸標記由生物工程公司合成并標記。本實施方式步驟四凝膠中加入甘油可以增加單鏈構象多態性技術(SSCP)的靈敏度和分離更長片段的能力。本實施方式步驟五中放入離心管中的DNA條帶用微量移液槍的槍頭和管壁作用擠壓、研碎。本實施方式步驟六中分別以步驟五得到的沉淀物DNA為模板進行擴增、克隆、測序及系統發育學分析。因為生物素分子相對較大(MW-244.3Da)會影響PCR結果，所以反向引物5'端采用磷酸標記。本實施方式使用A核酸外切酶不需要事先對核酸純化。本實施方式步驟一采用周冀中等人的DNA提取方法(JIZHONGZHOU,MARYANNBRUNS，JAMESM.TIEDJE.DNARecoveryfromSoilsofDiverseComposition.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,1996,62:316-322)保證了微生物種群基因樣品的多樣性。本實施方式步驟六可將步驟五得到的DNA通過GenBank進行相似性檢索和比對，或者采用phylip或ClustalW軟件包對相似序列的對齊及系統進化樹的繪制，最后通過Treeview軟件將進化樹輸出，進行分析。具體實施方式二本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟二中PCR反應程序為94'C預熱5min，第一循環94。C變性40s、55""C退火40s、72"延伸60s，循環30次，每循環退火溫度依次降低O.rC，最后72匸延伸10min。其它步驟及參數與實施方式一相同。具體實施方式三本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟二中PCR反應體系為50(iL由5nL10xPCRbuffer、4j^LdNTP、1.5|iL濃度為20pmol/L的正向引物、1.5nL濃度為20pmol/L的反向引物、0.125UEXTaqDNA聚合酶、l~5ng微生物群落DNA和余量的去離子水組成；10xPCRbuffer中含有2.5mmol/LMg2+;dNTP中各種脫氧核苷三磷酸的濃度均為2.5|omol/L。其它步驟及參數與實施方式一相同。具體實施方式四本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟三中采用濃酚/氯仿核酸純化法提純核酸。其它步驟及參數與實施方式一相同。具體實施方式五本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟三中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺占凝膠總重量的12%。其它步驟及參數與實施方式一相同。具體實施方式六本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟四中上樣量為1520kiL。其它步驟及參數與實施方式一相同。具體實施方式七本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟四電泳后采用核酸電泳銀染技術顯示DNA條帶。其它步驟及參數與實施方式一相同。本實施方式可以提高單鏈構象多態性技術的靈敏度，可檢測到lpg(每條DNA條帶)的雙鏈DNA。現有技術SYBRGreenI(MolecularProbesInc.)只能檢測到20pg(每條DNA條帶)以上的雙鏈DNA，而EB技術的敏感性則更低。具體實k方式八本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟四中在4°C、電壓為300V的條件下電泳18h。其它步驟及參數與實施方式一相同。具體實施方式九本實施方式采用單鏈構象多態性技術分析脫氮脫硫工藝系統微生物群落結構，方法與具體實施方式一相同。本實施方式同步分析脫氮脫硫工藝系統微生物群落SSCP圖譜如圖7所示，圖7中"M"泳道標樣為Marker,"0d"泳道標樣為0天脫氮脫硫工藝系統微生物群落DNA樣品，"5d"泳道標樣為5天脫氮脫硫工藝系統微生物群落DNA樣品，"10d"泳道標樣為IO天脫氮脫硫工藝系統微生物群落DNA樣品，"15d"泳道標樣為15天脫氮脫硫工藝系統微生物群落DNA樣品，"20d"泳道標樣為'20天脫氮脫硫工藝系統微生物群落DNA樣品，"25d"泳道標樣為25天脫氮脫硫工藝系統微生物群落DNA樣品，"30d"泳道標樣為30天脫氮脫硫工藝系統微生物群落DNA樣品，"35d"泳道標樣為35天脫氮脫硫工藝系統微生物群落DNA樣品。對圖7中顯著性條帶1~11(圖7中標注)進行回收，再擴增并克隆后，每個條帶隨機選取14個轉化子進行測序，長度約500bp，共測得32個轉化子，采用S叫uencher5.0比較32個測得的克隆子，設置最小匹配95%，最小重疊100bp，得到23個不同的操作分類單元(OTU);由于對圖譜中的主要條帶均進行了克隆測序分析，其多樣性能夠代表反應器的微生物種群結構。23個OTU通過B，LASTn比較結果如表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結合圖7和表1可以明顯發現同步脫氮脫硫反應器啟動過程中發生了微生物群落生態演替現象。第12天后反應器的硝酸鹽去除率已達到100%，比較前15天的電泳圖譜，發現第15天時群落生物多樣性已遠遠低于初始狀態(第0天)，而且群落結構也發生了很大變化，其中條帶l、2、4、10所指示的微生物類群^加^0//"^、5/z/om'a、Oc/w"0&"c/rww、Bra^rA&o6/ww、F/av/附o"os、及ose/vzVga、開始大量富集，條帶8所指示的微生物類群呈現出由無到有的變化過程。尤其是啟始污泥樣品中大量的種群消亡和一些特定功能微生物的大量富集，微生物群落由一個自然的穩定的群落開始向一個定向馴化的人工的群落進行演替'。從第10天開始，條帶5所指示的Z^w//om/craZ>/wm^.開始出現并逐漸富集，而硫酸扭的去除效率也開始提高，但去除率不夠穩定。第25天后，隨著硫酸鹽去除率達到100%,0^"http://0脂'^06/"附15/7.已經成為優勢菌群。第20天與第15天相比，條帶2(5iz/om'a、Oc/zra6ac/rwm、5ra辦r/w!zo6z'w/w)消亡，條帶3(尸aracocc"s)、出現并富集，克隆測序分析，得知其與尸aracoccwssp.序列最相似，相似性高達到97%，/^raco"^sp.是一類兼性自養硝酸鹽還原硫化物氧化細菌。硝酸鹽還原硫化物氧化細菌是以硝酸鹽為電子供體，以各種類型的含硫化合物，如硫化物，聚硫化物，元素硫，硫代硫酸鹽和亞硫酸鹽為電子受體的自養型反硝化菌(Nica^"/,2000)，分為幾種不同亞類群(1)嚴格化能自養型菌(Obligatelychemolithoautotrophicbacteria)，如77w'o6acz7/ws(iemVri/cam1，772/06ac/〃Msf/z/o/"/-ws禾口7Tz/o附/cras//ra(2)兼性自養型菌(acultativeautotrophicbacteria),如尸aracoccwsfifemVr訴cam1，7TH'o6ofc/〃ws必/ca加，7Tn》6ac/〃ws鄉os77^s禾口7T2/os//^era/朋tofro/to，這類微生物除了還原硫之外，還能利用有機酸(Sorokin"a/,2003;OhWa/,2001);(3)巨大絲狀菌(filamentousbacteria),如5egg/atoa禾口77w'o//<3ca中的成員，是存在于沉積物中的巨大絲狀菌，用液泡貯存大量的硝酸鹽，用于硫化物的自養氧化(Sorokin&a/，2003;SchulzandJorgensen,2001)。尸aracocciwsp.的生理特性如下，球狀細胞(直徑為0.50.9^m)或短桿菌(長度為0.91.2^im)，單個、成對或堆狀，形成聚-P-羥基丁酸鹽顆粒，革蘭氏陰性，不運動，好氧，呼吸代謝；當硝酸鹽、亞硝酸鹽或氧化氮存在時，能以它們為電子受體營厭氧生長；在厭氧條件下還原硝酸鹽到亞硝酸鹽到氧化氮和N2。據此認為尸aracocc"ssp.在脫氮脫硫工藝系統反應器中起到了關鍵的反硝化脫硫作用。此后，硫酸鹽的去除率一直穩定在100%,說明以Dew//ow/craZ>/Mmsp.和尸aracocc"ssp.為主要脫硫和脫氮功能菌群的微生物群落已經基本形成。從第26天起反應器的硫酸鹽和硝酸鹽的去除率均已達100%，此后，微生物群落結構基本不再發生變化，群落的演替已經完成，形成了具有同步脫氮脫硫功能的頂級群落。但是分析電泳圖譜(圖3中第30天和第35天)不難發現，微生物群落中不同微生物種群的相對數量仍存在一些因每天進水中的營養物濃度細微變化導致的和人工配水引起的細微變化，但不影響對微生物群落結構以及群落演替的分析。從35天的圖譜看，雖然群落演替規律明顯，但是也可以看出反應器啟動過程中，條帶l、6、7、9、10在活性污泥微生物群落中一直穩定存在，并且它們的相對，量基本不變，當pH和堿度變化時，這些條帶波動幅度較小，稱之為常駐種群。根據表1，常駐菌群與下列各屬菌株的相似較大^wera//"^、jB/zfow/a、7Vo/^om7j"cten'mw、柳co;/awa、Sywerg/sfes、5W^^ovmw。這些屬多為厭氧微生物，存在于各種厭氧環境中，部分種屬能夠利用廣泛的底物發酵產酸，它們在反應器中具有發酵產酸功能，為硫酸鹽還原菌提供有機底物。對比實驗1、在4。C條件下進行凝膠電泳(其它條件均相同)，圖l是步驟三中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺占凝膠總重量的8%的凝膠電泳圖，圖2是步驟三中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺占凝膠總重量的12%的凝膠電泳圖，圖3是步驟三中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺占凝膠總重量的16%的凝膠電泳圖。根據圖l、2和3可以看出丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺濃度低(8%)條帶模糊、無可讀性；丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺濃度高(16%)雖然能夠分離一定數量的微生物類群，但由于膠濃度過大，導致很多條帶無法分開，導致微生物群落多樣性沒有表達出來；丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺濃度為12%效果最佳。2、在20。C、步驟三中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺占凝膠總重量的12%條件下進行凝膠電泳(其它條件均相同)，圖4是步驟四中去離子甲酰胺與上樣緩沖液的體積比為1:1的凝膠電泳圖，圖5是步驟四中去離子甲酰胺與上樣緩沖液的體積比為1:2的凝膠電泳圖，圖6是步驟四中去離子甲酰胺與上樣緩沖液的體積比為1:3的凝膠電泳圖。去離子甲酰胺有助于提高凝膠電泳的敏感性，去離子甲酰胺可以防止單鏈之間形成無效的退火，增強SSCP圖譜的可讀性。但根據本實驗結果表明去離子甲酰胺濃度過高不但不能增強SSCP的分辨率，還會導致分析的失敗；其主要原因是因為過高濃度的去離子甲酰胺會導致單鏈內部無法形成鏈內的氫鍵，不能形成穩定的三維結構，進而導致SSCP圖譜無法完成。3、通過圖2和圖6的比較可以看出4。C條件下凝膠電泳的結果優于20°C條件下凝膠電泳的結果，4。C條件下凝膠電泳條帶整齊，分辨率高，可讀性強。序列表<110>哈爾濱工業大學<120>—種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據E.eoli16SrRNA基因8~27bp設計PCR擴增正向引物序列。<400>1agagtttgatcctggctcag20<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據E.coli16SrRNA基因533~515bp設計PCR擴增反向引物序列。<400>2ttaccgcggctgctggca18權利要求1、一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法按以下步驟進行一、采用周冀中等人的DNA提取方法提取微生物群落DNA；二、PCR擴增PCR擴增正向引物序列為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，PCR擴增反向引物序列為TTACCGCGGCTGCTGGCA，反向引物5’端采用磷酸標記；三、酶切去除反意義鏈酶切反應體系為50μL由5μL10×buffer緩沖溶液、40μLPCR擴增產物和5μL濃度為5U/μL的λ核酸外切酶組成，酶切反應體系在37℃的環境中反應3～4h，然后純化酶切產物，再溶解于20μL重蒸餾水中；四、將溶解于重蒸餾水中的酶切產物與等體積的變性劑混合置于95℃的環境中熱變性處理10min，然后立即冰浴5min，之后凝膠電泳上樣、在4～20℃、電壓為250～300V的條件下電泳12～18h；五、將凝膠浸泡于重蒸餾水中10min，然后用滅菌的刀片將DNA條帶分別切下放入離心管中并研碎，再向每支離心管中加入50μL裂解液在37℃的環境中處理3h，然后離心、分離上清液，并向上清液中加入上清液體積2倍的無水乙醇，置于-20℃的環境中沉淀2h，再在24000g、4℃的條件下離心15min，沉淀物DNA在37℃的環境中干燥15min后加入10μLTE溶液；六、對步驟五得到的沉淀物DNA分別進行分析，即得出微生物群落的組成結構；步驟四凝膠中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺占凝膠總重量的10％～14％、甘油占凝膠總重量的5％～10％，其中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺的質量比為49～55∶1；步驟四中變性劑由去離子甲酰胺和上樣緩沖液組成，其中上樣緩沖液由NaOH溶液、EDTA、溴酚藍、二甲苯氰FF和去離子水組成，上樣緩沖液中NaOH的濃度為10mM/L、EDTA的濃度為20mM/L、溴酚藍的濃度為0.02％(重量)、二甲苯氰FF的濃度為0.02％(重量)，去離子甲酰胺與上樣緩沖液的體積比為1∶3；步驟五中50μL的裂解液含有0.5M/L的乙酸銨、10mM/L的乙酸鎂，1mM/L、pH值為8.0的EDTA、0.1％(重量)的SDS和余量的重蒸餾水。2、根據權利要求1所述的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于步驟二中PCR反應程序為94。C預熱5min，第一循環94-C,變性40s、55。C退火40s、72。C延伸60s，循環30次，每循環退火溫度依次降低O.rC,最后72。C延伸10min。3、根據權利要求1所述的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于步驟二中PCR反應體系為50nL由5^L10xPCRbuffer、4|xLdNTP、1.5|xL濃度為20pmol/L的正向引物、1.5joL濃度為2(Himol/L的反向引物、0.125UEXTaqDNA聚合酶、15ng微生物群落DNA和余量的去離子水組成；10xPCRbuffer中含有2.5mmol/LMg2、dNTP中各種脫氧核苷三磷酸的濃度均為2.5nmol/L。4、根據權利要求1所述的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于步驟三中采用濃酚/氯仿核酸純化法提純核酸。5、根據權利要求1所述的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于步驟三中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺占凝膠總重量的12%。6、根據權利要求1所述的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于步驟四中上樣量為1520jiL。7、根據權利要求1所述的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于步驟四電泳后采用核酸電泳銀染技術顯示DNA條帶。8、根據權利要求1所述的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于步驟四中在4t:、電壓為300V的條件下電泳18h。全文摘要一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，它涉及一種分析微生物群落結構組成的方法。它解決了目前現有的生物檢測和分析方法難以分析微生物群落的生物組成結構的問題。方法一、提取微生物群落DNA；二、PCR擴增；三、酶切去除反意義鏈；四、凝膠電泳；五、純化DNA；六、微生物群落的組成結構分析。本發明可以對工程系統內復雜的微生物群落進行群落結構分析，具有快速、準確的優點，可以解析群落演替，同步掌握工藝系統內微生物菌群變化情況，指導工藝、提高工程系統的運行效率。文檔編號C12Q1/04GK101210262SQ20071014491公開日2008年7月2日申請日期2007年12月24日優先權日2007年12月24日發明者于振國,任南琪,劉春爽,張運晴,王愛杰,趙陽國,闞洪晶申請人:哈爾濱工業大學