專利名稱：木薯體細胞胚胎發生再生植株快繁方法
技術領域：
本發明涉及到一種植物的組織培養方法，具體地說是一種通過生物技術達到木薯良種快速繁 殖和規模化生產的方法。
二、 背景技術 技術實用性分析
木薯(MamTjof esra/e"to Crantz)是大戟科(丑wp/ oA/aceae)植物，染色體數為2n = 36, 多年生灌木，高l~5m。木薯是僅次于水稻、玉米、高粱的第四大熱帶作物，其塊根含有豐富 的淀粉，既可作糧食，也可作為工業原料或詞料，是熱帶、亞熱帶地區6億人的主要糧食來源。 木薯起源于南美，于16一8世紀傳入非洲、亞洲及大洋洲。現在木薯己廣泛地分布于全球的熱 帶及部分亞熱帶地區。木薯于1820年前由東南亞華僑引入我國，至今己有180多年的栽培歷 史。目前我國木薯產區包括海南、廣東、廣西、福建、云南等省區，四川、貴州、湖南、江西 等地也有種植，現有栽培面積50余萬公頃，鮮薯產量1000萬噸。木薯主要的優點是具有很高 的產量潛力。它是一種C3-C4中間型作物，在適宜的條件下具有很高的光合作用效率，而在干 旱和高溫的脅迫下，也能保持較高的光合效率。
木薯歷來采用莖段繁殖，繁殖率低，種莖運輸量大，種莖埋土過冬又常受寒害， 一些高產 或抗病品種材料的生產與供應，要在很短的時間內大規模發展是很困難的。由于木薯自身的特 性(如植株的高度雜合、花粉育性低、有性子代嚴重分離等)及種質資源的局限性(如抗性基 因資源貧乏、己知的品種均含有氰化物等)，傳統的育種方法在木薯上受到限制。組織培養是 木薯生物技術的基礎，木薯組織培養不僅在快速繁殖及種質保存方面具有重要意義，木薯基因 工程(如轉抗病、抗蟲基因，與產量、品質有關的基因等)也有賴于組織培養技術獲得突破。 木薯組培的早期工作主要是分生組織培養，即所謂的非不定芽再生途徑。再生植株來源于高度 聯系的多細胞團，如莖尖及側芽，該方法用于種質資源的保存和交換，品種的提純、復壯、脫 毒等。
自上世紀70年代以來，研究者們利用芽殖方法、木薯莖段誘導愈傷組織，或從木薯幼葉分 離出原生質體誘導愈傷組織并獲得再生植株1'3]，實驗結果一直沒有得到重復。1982年，Stamp 和Henshaw以木薯合子胚的子葉和胚軸為外植體成功誘導出胚狀體[4]。 1993年Raemakers從6 個木薯基因型的幼葉中誘導出初生體胚，并獲得再生植株。這是木薯體細胞發生的突破，但是 成熟胚狀體的成苗頻率很低，且根的發育不全5]; Li等在前人工作基礎上發展了體細胞胚子葉 切割，成功地誘導高頻率器官發生并獲得再生植株[6' 7' 9' ， Zhang Peng報道了 AgN03有促進 器官發生的作用，而麥芽糖與蔗糖是優先選擇的碳源[913]。但是有關如何利用體細胞胚胎發生 快速繁殖基因型的技術并無專門的論述，也未見相關國際專利。
在國內，馬國華等(1999)從木薯幼葉誘導體胚和形成器官，其植株再生頻率僅為 23.4-26.1%[8];李洪清等(2000)在研究木薯品種Co112胚狀體子葉器官發生和植株再生發現，
最佳的器官發生頻率達到64%，植株再生系數為5.7倍'1；杭玲(2001)等對木薯腋芽分生組 織培養產生叢生芽進行了嘗試，芽的切割增殖系數達到3.8[12];莫饒等(2003)以木薯莖段作 為外植體進行快速離體繁殖研究，木薯芽發生頻率達到85%以上，芽生根率100%,但試管苗 直接移栽成活率只有20%,而經過適度練苗的成活率可以達到80% [13]。朱文麗等(2006)利 用華南8號等7個木薯基因型對木薯莖稈芽殖和利用葉片、腋芽和頂芽為外植體通過體細胞胚 胎發生產生高頻率再生植株的技術進行了系統的比較篩選['4]，針對體細胞胚胎發生和離體快繁 兩個方面，完善了木薯體細胞胚胎發生體系和離體快繁體系①建立了木薯體細胞胚胎發生 再生植株的培養體系，同時證明該培養體系在多個基因型間具有通用性。②建立適合多個基因 型木薯快繁體系，利用基礎培養基在大多數基因型中獲得良好的離體繁殖效果，每個繼代周期 4-5周，擴繁系數5-7倍，每株試管苗在一年可以繁殖1.5萬株。③提高了木薯大田移栽成活 率，煉苗移栽成活率達到90%以上，為木薯新品種的快速推廣利用提供技術基礎。 本發明專利的新穎性可以歸納為-
(1) 在非愈傷化莖稈芽殖快繁方面，通過改變激素組成，達到非基因型依賴性的通用快 繁方法，單株可年繁殖15， 000株以上的試管苗，繁殖系數達到年1-1.5萬倍，此前未見報道 和相關專利；
(2) 體細胞胚胎發生再生快繁植株方面，解決了適合于多個基因型的體細胞胚胎分化培 養基問題，以及初生胚子葉切割再生大量胚狀體的培養條件和胚芽生根條件，達到年度繁殖系 數2-2.5萬倍。所述技術要素組合未見報道和相關專利。
(3) 在試管苗煉苗移栽方面，掌握了試管苗環境適用馴化所需要的光照與溫度條件和所 需要時間，將移栽成活率提高到90%以上，除了作為本專利發明人的2個文獻外，未見國內報 道。
發明內容
本發明是以帶有頂芽或側芽的木薯莖段為外植體，利用組織培養技術的微繁方法來獲取 木薯組培苗；并以微繁產生的無菌苗嫩葉、莖尖及腋芽為外植體，誘導體細胞胚胎發生和植 株再生，建立木薯體細胞再生體系，以便短時間內進行木薯良種快繁，規模化生產，并為木 薯的轉基因和其它育種建立技術基礎。以下對本發明作進一步的描述，方法步驟如下
A.木薯的微體快繁體系
(1) 外植體的消毒處理將木薯桿切成約25 35cm長插條，豎插于河沙基質中培養。 待側芽萌發長大成新枝條后，將葉片去掉，用飽和肥皂水浸泡20min，接著用自來水沖洗20 min。晾干后，在超凈工作臺上先用70%酒精浸泡3 ~ 5 s，再放入0.2%氯化汞溶液中浸泡6 ~ 8min，無菌水沖洗4 5次。最后將其切成約1.5 ~ 2.0 cm長帶有側芽的莖段作為外植體；
(2) 初始培養將外植體接種于初始培養基MS + GA0.01 0.05mg/L + NAA0.01 0.04mg/L+蔗糖30g/L+卡拉膠5.6g/L (pH=5.8)上。然后置于溫度為25~28°C，每日光照培 養10 12h，光照強度為1500~20001x，培養5 6周；
(3) 繼代培養培養5 6周后，外植體上長出7 10cm的小苗，切取帶有側芽的莖段
按其生長極性接種于繼代培養培養基(與初始培養基同)上，每5 6周為一個循環，繁殖率 為5 7倍；
(4) 生根培養將帶有側芽的莖段接種于生根培養基MS + NAA0.02mg/L+蔗糖30 g/L 十卡拉膠5.6g/L (pH=5.8)上，培養溫度為25 28。C，每日光照培養12h，光照強度為1500 20001x。培養1周后長出不定根，生根率達100%。
(5) 試管苗移栽及管理室內培養5 6周后，移至遮蔭度60。/。的大棚進行煉苗。2周后， 將小苗取出試管，用清水洗凈附著在根系上的培養基，用0.2%多菌靈浸泡0.5 h后直接再栽 到裝滿營養土 (先裝營養土再覆蓋兩至三公分河沙)的營養杯中，澆透定根水，然后覆蓋上 塑料薄膜保水保濕。1周左右小苗恢復生長，以后按一般常規小苗管理方法管理。木薯試管 苗移栽成活率起伏大。因此在移栽后的10天內，管理非常重要。
B.木薯的體細胞胚胎發生再生體系
(1) 誘導愈傷組織與體細胞胚胎發生采用木薯微體快繁技術培養成試管苗的帶有側芽 的莖段或莖尖(長1.2 1.5cm)或嫩葉(長3 6mm)接種于誘導培養基(即MS + 2,4-D 3 5 mg/L或Picloram10 13 mg/L +蔗糖20 g/L +卡拉膠5.6g/L (pH=5.8))上進行暗培養。兩周后 可見從部分愈傷組織中長出球形胚狀體；
(2) 體細胞胚胎的伸長將胚狀體塊從愈傷組織中剝離，繼續培養于誘導培養基中進行 暗培養。兩周后，胚狀體進一步伸長長大；
(3) 體細胞胚胎的成熟將胚狀體接種于胚狀體成熟培養基(即MS + BAO. 1-0.3 mg/L + 蔗糖20 g/L+卡拉膠5.6g/L (pH=5.8))上培養，其培養條件為溫度為25 28。C，每日光照 培養10 12h，光照強度為1500~ 18001x。兩周后，胚狀體進一步長大成熟，子葉快速增大 并轉綠。此時，可將子葉切成幾小塊4mn^接種于誘導培養基或器官發生培養基上進行再生 循環培養，獲得更多的次生胚狀體或小苗；或者，將成熟的胚狀體直接進行再生植株培養。
(4) 再生植株培養將轉綠的胚狀體接種于再生培養基(即MS+BA0.01 0.03mg/L+GA 0.01 0.05mg/L + NAA0.01 0.04mg/L+蔗糖30g/L+卡拉膠5.6g/L (pH=5.8))上，培養1周 后長出不定根，生根率達100%， 4周后長成植株。此時，可將植株切成帶有腋芽的莖段接種 于快繁培養基進行擴繁，從而獲得更多的小苗；或者，在培養至5 6周后移至蔭棚進行煉苗。
(5) 移栽及管理室內培養5周后即可移至大棚煉苗。2周后，可將小苗取出試管，用清 水洗凈附著在根系上的培養基，用0.2%多菌靈浸泡半個小時直接栽到營養杯中，澆透定根 水，然后覆蓋上塑料薄膜保水保濕。1周左右小苗恢復生長，以后按一般常規小苗管理方法 管理。
具體實施例方式
實施例l:采用帶有側芽的莖段進行微體快繁 試驗品種為華南5號；
外植體的消毒處理將木薯桿切成30cm長插條，豎插于河沙基質中培養，待側芽萌發 長大成新枝條后，將葉片去掉，用飽和肥皂水浸泡20 min,接著用自來水沖洗20min。晾干 后，在超凈工作臺上先用70。/。酒精浸泡4s，再放入0.2。/。氯化汞溶液中浸泡6min，無菌水沖
洗5次。最后將其切成約2.0 cm長帶有側芽的莖段作為外植體；
初始培養將外植體接種于初始培養基MS + GA 0.02 mg/L + NAA 0.02 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠5.6g/L (pH=5.8)上。然后置于溫度為28'C，每日光照培養12 h，光照強度為 20001x，培養40天；
繼代培養培養40天后，外植體上長出8cm左右的小苗，切取帶有側芽的莖段按其生 長極性接種于繼代培養培養基(與初代培養基同)上，每40天為一個循環，繁殖率為7倍；
生根培養將帶有側芽的莖段接種于生根培養基MS + NAA 0.02 mg/L +蔗糖30 g/L + 卡拉膠5.6g/L (pH=5.8)上，培養溫度為28'C，每日光照培養12h，光照強度為2000k。培 養l周后長出不定根，生根率達100%;
試管苗移栽及管理室內培養5周后，移至遮蔭度60%的大棚進行煉苗。2周后，將小 苗取出試管，用清水洗凈附著在根系上的培養基，用0.2%多菌靈浸泡0.5 h后直接再栽到裝 滿營養土 (先裝營養土再覆蓋兩至三公分河沙)的營養杯中，澆透定根水，然后覆蓋上塑料 薄膜保水保濕。l周左右小苗恢復生長，以后按一般常規小苗管理方法管理。
實施例2木薯的體細胞發生再生體系
試驗品種為華南8號；
外植體的消毒處理將新枝條上長出的葉子去掉后，用飽和肥皂水浸泡20 min，接著用 自來水沖洗20min。晾干后，在超凈工作臺上先用70%酒精浸泡4 s，再放入0.2%氯化汞溶 液中浸泡8min,無菌水沖洗5次。最后將其切成約2.0 cm長帶有側芽的莖段作為外植體；
初始培養將外植體接種于初始培養基MS+ GA 0.02 mg/L +NAA 0.02 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠5.6g/L (pH=5.8)上。然后置于溫度為28'C，每日光照培養12h，光照強度為 20001x ，培養40天；
繼代培養培養40天后，外植體上長出7cm左右的小苗，切取帶有側芽的莖段按其生 長極性接種于繼代培養培養基(與初代培養基同)上，每40天為一個循環，繁殖率為7倍； a.以嫩葉為外植體的體細胞發生培養體系
誘導愈傷組織與體細胞胚胎發生取5mm長的試管苗嫩葉,切成約4 mn^的片段接種于 誘導培養基(即MS + 2,4-D 4 mg/L +蔗糖20 g/L +卡拉膠5.6g/L (pH=5.8))上進行暗培養。 兩周后可見從部分愈傷組織中長出球形胚狀體；
體細胞胚胎的伸長將胚狀體塊從愈傷組織中剝離，繼續培養于誘導培養基中進行暗培 養。兩周后，胚狀體進一步伸長長大；
體細胞胚胎的成熟將胚狀體接種于胚狀體成熟培養基aPMS + BA0.1mg/L+蔗糖20 g/L+卡拉膠5.6g/L (pH=5.8))上培養，其培養條件為溫度為28'C，每日光照培養12h， 光照強度為18001x。兩周后，胚狀體進一步長大成熟，子葉快速增大并轉綠；
再生植株培養將轉綠的胚狀體接種于再生培養基(即MS +BA0.01 mg/L + GA 0.02 mg/L + NAA0.01 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠5.6§幾(pH=5.8))上，培養1周后長出不定根，生根 率達100%， 4周后長成植株；
移栽及管理室內培養5周后即可移至大棚煉苗。2周后，可將小苗取出試管，用清水
洗凈附著在根系上的培養基，用0.2 %多菌靈浸泡半個小時直接栽到營養杯中。l周左右小 苗恢復生長，以后按一般常規小苗管理方法管理。 'b.以莖尖和腋芽為外植體的體細胞發生培養體系 外植體預培養將試管苗切成帶有側芽的約1.2 1.5的莖段和莖尖平放于預處理培養基
(即MS + Cu0.128 mg/L + BA2.0 mg/L +蔗糖20 g/L +卡拉膠5.6g/L (pH=5.8))上進行培養1 周；
誘導培養用解剖針將莖尖和經預培養的腋芽挑出，接種于誘導培養基(即MS+2,4-D2 mg/L+蔗糖20g/L+卡拉膠5.6g/L (pH=5.8))上進行暗培養，培養溫度為26°C,1周后開始形 成胚性的愈傷組織；
體細胞胚胎的生長將胚狀體塊從愈傷組織中剝離，繼續培養于誘導培養基中進行暗培 養。兩周后，胚狀體進一步伸長長大；
體細胞胚胎的成熟將胚狀體接種于胚狀體成熟培養基(即MS + BAO.l mg/L+蔗糖20 g/L+卡拉膠5.6g/L (pH=5.8))上培養，其培養條件為溫度為28'C，每日光照培養12h， 光照強度為18001x。兩周后，胚狀體進一步長大成熟，子葉快速增大并轉綠；
再生植株培養將轉綠的胚狀體接種于再生培養基(即MS +BA0.01 mg/L + GA0.02 mg/L + NAA0.01 mg/L+蔗糖30g/L+卡拉膠5.6g/L (pH=5.8))上，培養l周后不定根長出，生根 率達100%， 2周后長成完整植株，5周后，植株有10cm左右高。
移栽及管理培養5周后即可移至遮蔭度60%的大棚煉苗。2周后，可將小苗取出試管， 用清水洗凈附著在根系上的培養基，用0.2 %多菌靈浸泡半個小時直接栽到營養杯中。l周 左右小苗恢復生長，以后按一般常規小苗管理方法管理。
參考文獻Kartha K K. Regeneration of cassava plants from apical meristems, Plant Sci Lett, 1974， 2: 107 113Tilquin J P. Plant regeneration from stem callus of cassava, Can J Bot, 1979， 57: 1761-1763 [3]Shahin E A， Shepard J F. Cassava mesophyll protoplasts: isolation, proliferation and shoot
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1.一種非基因型依賴的木薯組織培養再生植株快速成苗的方法。其特征如下a.用任意基因型植株帶有側芽的莖段進行培養誘導不定芽，利用不定芽分化再生小植株并生根成苗。其中采用的基本培養基是MS培養基，以及附加適度濃度的GA，NAA激素；b.用大多數基因型無菌苗的嫩葉、莖尖和腋芽進行分化培養誘導愈傷化組織，并挑取胚性愈傷組織誘導胚狀體發生及植株再生。其中采用的基本培養基是MS培養基，并附加適度濃度的激素2，4-D或Picloram，BA等。
2. 如權利要求l.a所述，用帶有側芽的莖段進行離體培養和快速繁殖的方法，其特征在于不 定芽誘導及分化再生小植株所需附加的激素GA濃度0.01 0. 05 mg/L，NAA的濃度是0.01 0.04 mg/L。
3. 如權利要求l.a所述，用帶有側芽的莖段進行離體培養和快速繁殖的方法，其特征在于植 株生根所需附加激素NAA的濃度為0.02 mg/L。
4. 如權利要求l.b所述，用無菌苗的嫩葉、莖尖和腋芽進行愈傷組織誘導和體細胞胚胎發生及 植株再生的方法，其特征在于誘導愈傷組織及體細胞胚所需附加激素2， 4-D濃度為3 5 mg/L 或Picloram為10 13 mg/L。
5. 如權利要求l.b所述，用無菌苗的嫩葉、莖尖和腋芽進行愈傷組織誘導和體細胞胚胎發生及 植株再生的方法，其特征在于體細胞胚胎成熟培養階段所需附加激素BA濃度0.1~0.3 mg/L。
6. 如權利要求l.b所述，用無菌苗的嫩葉、莖尖和腋芽誘導愈傷組織和體細胞胚胎發生及植株 再生的方法，其特征在于體細胞胚胎誘導及成熟階段需要附加蔗糖的濃度為20g/L。
7. 如權利要求l.b所述，用無菌苗的嫩葉、莖尖和腋芽進行愈傷組織誘導和體細胞胚胎發生 及植株再生的方法，其特征在于再生植株培養階段需附加激素組合及濃度值為BA0.01~0.03 mg/L + GA 0.01 0.05 mg/L + NAA 0.01~0.04 mg/L。
8. —種木薯試管苗溫室二步煉苗的方法，步驟如下室內培養生根試管苗5~6周后，移至遮 蔭度60%的大棚進行煉苗。2周后，將小苗取出試管，用清水洗凈附著在根系上的培養基， 用0.2%多菌靈浸泡0.5 h后直接再栽到裝滿營養土 (先裝營養土再覆蓋兩至三公分河沙)的 營養杯中，澆透定根水，然后覆蓋上塑料薄膜保水保濕。1周左右小苗恢復生長，以后按一 般常規小苗管理方法管理。
全文摘要
本發明涉及木薯的組織培養繁殖方法。木薯(Manihot esculenta Crantz)是全球三大薯類作物之一，非洲第一大糧食作物，目前被列為我國重要的生物能源作物。通常采用莖段無性扦插進行繁殖，其繁殖率低是新品種推廣和縮短育種周期的限制性因素。本方法包括以帶有莖尖或側芽的木薯莖段為外植體，通過微繁方法快速獲取木薯組培苗；以微繁得到的無菌苗的嫩葉、莖尖及腋芽為外植體，誘導體細胞胚胎發生和植株再生，建立木薯體細胞再生體系。具有繁殖率高，無基因型依賴等特點，對于短時間內進行木薯良種快繁，規模化生產具有重要的價值，并為木薯的轉基因和其它育種建立技術基礎。
文檔編號C12N5/04GK101347097SQ20071013891
公開日2009年1月21日 申請日期2007年7月17日 優先權日2007年7月17日
發明者鵬 張, 朱文麗, 王文泉, 王海燕, 饒 莫 申請人:朱文麗;張 鵬;莫 饒;王海燕;王文泉