專利名稱：大腸桿菌生產琥珀酸的方法
技術領域：
本發明涉及生產琥珀酸的方法，具體涉及一種利用大腸桿菌發酵生產琥珀酸的方法。
背景技術：
以琥珀酸為代表的四碳二元酸是一類重要的化工原料，廣泛地用于醫藥、農藥、染料、香料、油漆、食品、塑料和照相材料工業。近年來，由于不斷開拓新的應用領域，琥珀酸的需求猛增。以琥珀酸為原料可取代苯合成約250種化工產品。琥珀酸是直鏈飽和二元羧酸，可以合成1，4-丁二酯、四氫呋喃、γ-丁內酯、丁二醇、己二酸等。發酵法生產的琥珀酸是以可再生資源取代石油生產的一種綠色平臺化學品。
目前用于發酵法生產琥珀酸的主要有厭氧瘤胃細菌和大腸桿菌。厭氧瘤胃細菌包括Anaerobiospirillum succiniciproducens，Actinobacillussuccinogenes，都是嚴格厭氧的微生物，要求在嚴格的厭氧條件下培養和操作，發酵周期較長。最近S.Y.Lee實驗室從牛瘤胃中分離得到了細菌Mannheimia succiciproducens MBEL55E(Appl Microbiol Biotechnol58663～8，2002)，為兼性厭氧菌，具有較高的琥珀酸生產能力，琥珀酸的生產速率達到1.87g/L·h，比生產速率達到544mg/g(DCW)·h。
大腸桿菌(Escherichia coli)是兼性厭氧菌，它在有氧或無氧的情況下都能生長。在無氧條件下，大腸桿菌進行混合酸發酵，主要的發酵產物有乙酸、乙醇、乳酸、甲酸、琥珀酸等，但琥珀酸的產量很低。為了提高大腸桿菌生產琥珀酸的能力，許多研究人員進行了大腸桿菌的代謝工程，敲除副產物形成途徑的有關基因，過量表達有利于琥珀酸合成的基因。例如在大腸桿菌突變株AFP111(ptsG，pflAB，ldhA)中過量表達外源丙酮酸羧化酶(pyc)，在復合培養基中并且添加適量H2的情況下，琥珀酸對葡萄糖的摩爾得率達到了1.80mol/mol，生產速率為1.30g/L·h，比生產速率127mg/g(DCW)·h(J Ind Microbiol Biotechnol 28325～32，2002)。大腸桿菌突變株SBS550MG(adhE，ldhA，iclR，ack-pta)和SBS990MG(adhE，ldhA，ack-pta)過量表達外源丙酮酸羧化酶，在復合培養基中厭氧發酵，琥珀酸對葡萄糖的摩爾得率分別達到1.6和1.7mol/mol，生產速率分別達0.616和0.604g/L·h，比生產速率分別為176和173mg/g(DCW)·h(Metab Eng8209～226，2006)。以上兩種情況雖然達到了較高的琥珀酸關于葡萄糖的得率，但琥珀酸的生產率和比生產速率都不高。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是公開一種大腸桿菌生產琥珀酸的方法，以克服現有技術所存在的上述缺陷。
本發明主要包括兩個部分第一、利用特定的碳源在好氣條件下增殖大腸桿菌細胞，這些碳源包括三羧酸循環的中間代謝物或含二、三碳的有機酸，也可使用葡萄糖，葡萄糖消耗后添加上述有機酸作為碳源繼續好氧發酵增殖大腸桿菌細胞。第二、將上述大腸桿菌細胞在含有葡萄糖的培養基中厭氧發酵，生產琥珀酸。厭氧環境的建立可以通過兩種方式在密閉的反應器中不通空氣，細胞在短時間將反應器系統中存在的氧消耗即進行厭氧發酵；或在反應器中通入CO2、N2等氣體達到無氧狀態。
發明人發現好氣發酵增殖大腸桿菌采用特定的碳源可提高大腸桿菌在厭氧條件下發酵生產琥珀酸的生產速率，對其他培養條件(如溫度、pH、接種量等)沒有特殊的要求。
本發明的方法包括如下步驟(1)將活化后的大腸桿菌接種于含有特定碳源的培養基中，好氣培養增殖大腸桿菌，獲得好氣培養液或菌體；大腸桿菌好氣增殖的培養基為含有特定碳源的復合培養基(如LB)或基本培養基(如M9)；LB培養基和M9培養基的組分和配比在Joseph Sambrook主編的Molecular Cloning一書中有詳細的說明；所說的特定碳源選自三羧酸循環的中間代謝物以及C2～C3的有機酸；所說的三羧酸循環的中間代謝物為蘋果酸、延胡索酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、草酰乙酸或琥珀酸等及其可溶性鹽；所說的C2-C3的有機酸如乙酸、丙酮酸、乳酸、乙醛酸等及其可溶性鹽；所說的碳源也可使用葡萄糖作為好氣培養的初始碳源，葡萄糖完全消耗后補充上述有機酸或其可溶性鹽作為碳源，繼續增殖大腸桿菌細胞；大腸桿菌為野生菌或是缺失有關基因或過量表達有關基因的工程菌，例如在丙酮酸節點上，缺失與琥珀酸途徑相競爭的途徑的大腸桿菌；步驟(1)的好氣培養條件為大腸桿菌常用的好氣培養條件，如培養溫度37℃，搖瓶振蕩培養或發酵罐中通氣攪拌下培養，控制或不控制pH。
(2)將步驟(1)所得到的好氣培養液或菌體于含有葡萄糖及MgCO3或NaHCO3或Na2CO3的厭氧發酵培養基中，厭氧發酵生產琥珀酸。
所說的厭氧發酵培養基可以是滿足菌體生長的完全培養基，也可以是生長限制而能夠代謝葡萄糖的不完全培養基，如氮源限制生長的培養基。
厭氧發酵培養基中，葡萄糖的濃度為一般常用的范圍，如5～50g/l，MgCO3或NaHCO3或Na2CO3的的濃度與葡萄糖濃度有關，一般可為5～50g/l；所說的厭氧發酵是指在步驟(1)所得到的菌體分離后轉入新的含葡萄糖和MgCO3或NaHCO3或Na2CO3培養基厭氧培養。
也可以在步驟(1)所得到的大腸桿菌培養液中直接補充葡萄糖和MgCO3或NaHCO3或Na2CO3，進而進行厭氧發酵，生產琥珀酸。此時的培養基可以是已消耗某些營養的不完全培養基，在方法(1)中大量增殖細胞的好氣培養階段，若使用添加上述有機酸或其鹽為碳源的復合培養基，可提高細胞的密度，提高大腸桿菌琥珀酸的生產速率，特別是可以提高琥珀酸的比生產速率，即在同樣的菌體濃度下以更高速率生產琥珀酸。也可采用以上述有機酸或其鹽為碳源的基本培養基來增殖大腸桿菌。
在大腸桿菌好氣增殖階段，上述有機酸碳源可以有效地提高其固有的補給途徑相關酶的活性，包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、蘋果酸酶等等，有利于增加厭氧反應階段琥珀酸的生成，提高琥珀酸的生產速率。
采用上述好氣培養方法增殖的大腸桿菌細胞，在厭氧發酵階段可以使用支持生長的復合培養基或基本培養基，也可使用不支持生長或限制生長的基本培養基(如缺少氮源等成分)。
在將大腸桿菌好氣培養大量增殖的過程中使用含有上述特定碳源的復合培養基或基本培養基，可以誘導大腸桿菌具有高的合成琥珀酸的活性，其在隨后的厭氧發酵過程具有高葡萄糖消耗、琥珀酸合成速率。
本發明的方法，通過大腸桿菌代謝的控制，使得大腸桿菌高表達其本身固有的糖異生及補給途徑相關的酶，能夠在琥珀酸生產過程中實現高生產速率與高比生產速率的結合。
具體實施例方式
實施例1野生型大腸桿菌TG1為Pharmacia公司公開銷售的菌種，中國微生物保藏中心等菌株保藏機構均可提供；冷凍甘油管保藏的大腸桿菌TG1 1ml接入裝有30ml的LB(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提萃取物，0.5％氯化鈉)培養基的250ml三角燒瓶中，37℃，轉速為220rpm，過夜好氣培養活化。取2ml培養液接入裝有100ml培養基的500ml三角燒瓶中，培養基分別為加有40mM蘋果酸(將pH調到7.0)、80mM乙酸鈉、5g/L葡萄糖(作為對照)的LB，37℃好氣培養7小時。
無菌離心，收集菌體，重懸于裝有15g/L葡萄糖的M9(Na2HP4·12H2O15.12g/L、KH2PO43.0g/L、NaCl 0.5g/L、NH4Cl 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CaCl20.011g/L)中，菌體濃度(干重)為4g/L左右，發酵體系為100ml Schott瓶中加入50ml的上述懸浮液，補充MgCO320g/L，密閉瓶蓋于37℃水浴搖床，150rpm下厭氧發酵10h。
以蘋果酸或乙酸為碳源好氣增殖的TG1在厭氧發酵中，琥珀酸對葡萄糖的摩爾得率分別比以葡萄糖為碳源增殖的TG1增加了37.1％和67％(表1)。
實施例2大腸桿菌NZN111缺失了丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶(Microbiology 143187～95，1997)，厭氧條件下，即使添加了乙酸鈉，NZN111基本上不生長也不消耗葡萄糖。大腸桿菌NZN111可由CGSC(The ColiGenetic Stock Center，MCDB Department，Yale University)提供，CGSC號為7726。
甘油管保藏的NZN111取1ml接入裝有30ml LB培養基的250ml三角燒瓶中，37℃，轉速220rpm過夜好氣培養活化。取2ml培養液接入裝有100ml培養基的500ml三角燒瓶中，培養基為分別裝有40mM蘋果酸鈉、80mM乙酸鈉、60mM乳酸鈉、40mM檸檬酸鈉、40mM延胡索酸鈉、40mM琥珀酸鈉、40mM α-酮戊二酸鈉為唯一碳源的LB，以不加碳源的LB作為對照，37℃好氣培養7小時。此時不加碳源的LB培養的細胞其干重只有1.60g/L，而添加蘋果酸鈉、延胡索酸鈉、α-酮戊二酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸的LB所得細胞密度明顯提高，分別為2.34g/L、2.38g/L、2.20g/L、2.14g/L、2.21g/L、1.88g/L和2.2g/L。無菌離心，收集菌體，分別重懸于裝有15g/L葡萄糖的LB中，在100ml Schott瓶中加入50ml的上述重懸液(菌體干重為4.0g/L左右)并補充MgCO320g/L，于37℃水浴搖床，150rpm下密閉厭氧發酵10h，結果如表2。
實施例3同實施例2好氣培養NZN111，使用的培養基為含有40mM蘋果酸的100ml LB。培養結束后，無菌離心，收集菌體，重懸于裝有15g/L葡萄糖和20g/L MgCO3的50ml LB中，此時菌體濃度為8.68g/L，于37℃水浴搖床，150rpm下密閉100ml Schott瓶中厭氧發酵。厭氧發酵2.5h時葡萄糖消耗完畢，有丙酮酸積累，琥珀酸的濃度為9.7g/L。5h時，琥珀酸的濃度達到11.5g/L，沒有丙酮酸積累，琥珀酸的得率為1.15mol/mol，葡萄糖消耗平均速率達為3.04g/L·h，琥珀酸的平均生產速率為2.30g/L·h，平均比生產速率達到267mg/g(DCW)·h。
實施例4甘油管保藏的NZN111取1ml接入裝有30ml LB培養基的250ml三角燒瓶中，37℃，轉速為220rpm，過夜好氣培養活化。取2ml培養液接入裝有100ml M9的500ml三角燒瓶中，培養基分別以60mM丙酮酸鈉、80mM乙酸鈉、40mM乳酸鈉、40mM檸檬酸鈉、40mM琥珀酸鈉，40mM α-酮戊二酸鈉、40mM蘋果酸鈉作為唯一碳源，好氣培養9-12小時。無菌離心，收集菌體，重懸于裝有15g/L葡萄糖的50ml基本培養基M9中，菌體濃度為4g/L左右，并補充胰蛋白胨0.5g/L，酵母提取物0.25g/L，MgCO320g/L，于37℃水浴搖床，150rpm下于密閉100ml Schott瓶厭氧發酵10h。得到結果如表3。
實施例5大腸桿菌NZN111好氣培養同實施例4，使用的培養基為含有40mM蘋果酸的100ml M9。好氣培養結束后，無菌離心，收集菌體，重懸于裝有14.7g/L葡萄糖的基本培養基的M9中，菌體濃度為7.76g/L，補充微量元素混合液0.2ml/L(含FeSO4·7H2O 80g/L、MnSO4·nH2O 10g/L、AlCl3·6H2O10g/L、CoCl24g/L、ZnSO4·7H2O 2g/L、NaMoO4·2H2O 2g/L、CuCl2·2H2O1g/L、H3BO40.5g/L)， 補充MgCO320g/L，37℃水浴搖床，150rpm下于密閉100ml Schott瓶厭氧發酵6h，殘糖為0.294g/L，琥珀酸濃度為7.42g/L，葡萄糖的消耗速率和比消耗速率分別達到了2.4g/L·h和309mg/g(DCW)·h，琥珀酸的生產速率和比生產速率分別為1.24g/L·h和160mg/g(DCW)·h。
實施例6同實施例4好氣培養NZN111，在500ml三角燒瓶中，分別以40mM蘋果酸和80mM乙酸鈉為唯一碳源的M9培養基好氣培養NZN1119和12小時，同時用6g/L的葡萄糖作為碳源培養7小時作為對照。無菌離心，收集菌體，重懸于裝有約15g/L葡萄糖的無氮源M9培養基(含微量元素混合液0.2ml/L)中，菌體濃度為4g/L左右，并加入10g/L NaHCO3或20g/LNaHCO3，37℃水浴搖床，150rpm下于密閉100ml Schott瓶厭氧發酵10h。得到結果如表4。
實施例7一級種子大腸桿菌NZN111冷凍甘油管1ml接入裝有30ml LB的250ml三角搖瓶中。37℃，220rpm，過夜培養活化。
二級種子接1ml一級種子培養液到兩瓶裝有75ml M9(裝有葡萄糖10g/L)的500ml三角搖瓶中，37℃，220rpm，好氣培養9h。
發酵5L發酵罐加入3.5L M9培養基，其中NH4Cl為6.0g/L，碳源為15g/L葡萄糖。37℃好氣培養增殖細胞，菌體濃度達到5.9g/L，葡萄糖耗完，開始流加400g/L的乙酸鈉繼續大腸桿菌NZN111的增殖，再經6小時好氣培養(共加入乙酸鈉154.4g)，菌體濃度達到9.52g/L。轉為厭氧發酵，通入CO2的速率為2.0L/min，全程使用1.5mol/L的H2SO4和8.0mol/L的NaOH來控制pH為7.0。
厭氧發酵階段分別在21.45h和33.15h各添加葡萄糖17.62g/L和17.49g/L，最終琥珀酸的濃度(厭氧發酵41.0h)為25.3g/L。
厭氧發酵階段共消耗葡萄糖140.0g，產生琥珀酸103.7g，琥珀酸關于葡萄糖的得率為1.13mol/mol，琥珀酸的總生產速率為0.617g/L·h，比生產速率為92.1mg/g(DCW)·h。
表1
表2
表3
表4
權利要求
1.一種大腸桿菌生產琥珀酸的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將活化的大腸桿菌接種于含有特定碳源的培養基中，好氣培養，獲得好氣培養液或菌體；所說的特定碳源為三羧酸循環中間代謝物或C2～C3的有機酸或其可溶性鹽；(2)將所說的菌體或好氣培養液于含有葡萄糖及MgCO3或NaHCO3或Na2CO3的培養基中厭氧發酵，生產琥珀酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所說的特定碳源為蘋果酸、延胡索酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、草酰乙酸或琥珀酸等三羧酸循環中間代謝物，或乙酸、丙酮酸、乳酸或乙醛酸等C2～C3的有機酸，或以上有機酸的可溶性鹽。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，也可先以葡萄糖為碳源好氣增殖大腸桿菌，葡萄糖消耗后繼續以權利要求2所述的有機酸或其可溶性鹽進一步好氣增殖大腸桿菌。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所得到的好氣培養液中直接補充葡萄糖和MgCO3或NaHCO3、Na2CO3，進行厭氧培養，或將菌體分離后轉入新的含有葡萄糖和MgCO3或NaHCO3、Na2CO3的培養基厭氧培養。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中使用的厭氧培養基可以是可以滿足菌體生長的完全培養基，也可以是生長限制而能夠代謝葡萄糖的不完全培養基，如氮源限制生長的培養基。
6.根據權利要求1～5任一項所述的方法，其特征在于，大腸桿菌為野生菌或是缺失有關基因或過量表達有關基因的工程菌。
全文摘要
本發明公開了一種大腸桿菌發酵生產琥珀酸的方法，包括如下步驟(1)將活化的大腸桿菌接種于含有特定碳源的培養基中，好氣培養，擴增菌體，也可使用葡萄糖為初始碳源，消耗后繼續以特定碳源培養；(2)將所說的菌體于含有葡萄糖及MgCO
文檔編號C12R1/19GK101029316SQ20071013568
公開日2007年9月5日 申請日期2007年3月13日 優先權日2006年12月13日
發明者吳輝, 李志敏, 葉勤 申請人:華東理工大學