一種H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’和包括該基因的干酪乳桿菌的制作方法

專利名稱：：一種H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’和包括該基因的干酪乳桿菌的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種H+-ATP酶耐酸基因atpA，(H+-ATP酶的a亞單位部分基因)和包括該基因的干酪乳桿菌。
背景技術：
：乳酸菌是人體腸道中正常菌群之一，當達到一定數量時，能夠調節宿主體內微生物菌群的平衡，對宿主的健康有一定促進作用。因此，能否在人體腸道中的低pH值，高膽汁酸中存活是有益菌群面對的首要挑戰，同時也是進行益生菌篩選的先決條件。另外，能否在不斷降低的酸性環境中保持較高的活性，也是篩選性質優良乳酸菌發酵劑的標準之一。人們對于乳酸菌耐酸機理進行了許多有益的探索和研究。其中，質子原動力透性轉移酶系統(PMF)認為，11+-八丁？酶作為胞膜結合蛋白酶，其作用為通過消耗胞體內的ATP，將胞內質子(H+)泵出胞外，以保持胞內pH值中性。與此同時，產生胞膜質子原動力，因此，稱其為質子移位膜ATP酶(protontranslocationgATPase)。11+-八丁？酶水平的提高通過膜上功能單元(Ff。復合體)的增加而獲得。pH值的調節是通過依靠于細胞質？11值的11+-八丁？酶的數量和活性的改變而調節。Ffo復合體具有氧化特性或光磷酸化作用。該系統主要在酸性環境中發生作用的低親和力系統，轉運物為葡萄糖。乳酸菌依靠該系統可將葡萄糖和其它溶質逆濃度梯度通過胞膜上的載體蛋白，即透性酶由胞外轉至胞內，同時還伴有氫離子向胞內的轉移。該復合體全長為7kb左右。由兩部分組成形成質子通道的胞膜結合部分(FQ)和包含ATP水解結合部位的胞漿部分(F,)。F,包含5個亞單元(S,a，y，卩，s)，Fo包含3個亞單元(c，a，b)(圖l)。其中，Fi高度保守，Fo是低度保守的。在所有這些亞單元中，F,中的a、Y、P是高度的同源性，而與膜連接的F()具有較低的同源性。Fi的一部分一5呈現出最低的同源性。F!Fo-ATP復合體的基因順序為atpE,atpB，atpF，atpH，atpA，atpG，atpD，atpC，這些基因分別編碼亞單元c，a，b,3，a，y，p，s。通過與其它乳酸菌的啟動子相比較，發現atp啟動子和rrnA啟動子(rRNA操縱子)有較高的同源性。因此，了解耐酸干酪乳桿菌H"-ATP酶與其耐酸性能間的關系，探索乳酸菌耐酸可能的分子機制，可為乳酸菌益生菌株的篩選、遺傳改造和應用提供基礎性的研究材料。
發明內容本發明人針對上述課題，以酸馬奶中的乳酸菌為目標菌群，采用特定的篩選方法，從內蒙古民族傳統乳制品——酸馬奶中篩選出耐酸菌株，并進一步研究了該耐酸菌株中H+-ATP酶與其耐酸性能之間的關系。本發明的目的之一是提供一種耐酸型干酪乳桿菌a""o&"7/"sa^/Zhang)及其篩選方法。本發明的目的之二是對耐酸型干酪乳桿菌(Z^cto6a"7/wccwe/Zhang)中H+-ATP酶保守編碼亞單位a亞單位——H+-ATP酶耐酸基因atpA，的克隆和測序。本發明的目的之三是通過RT-PCR確定H+-ATP酶與干酪乳桿菌耐酸性能之間的關系。本發明的干酪乳桿菌aflcto6a"7/wscase/Zhang)已于2006年4月21日，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址為中國北京市朝陽區大屯路，國家專利局指定專利微生物保藏中心)，保藏號CGMCCNo.1697。本發明技術方案的實現途徑如下本發明提供了一種干酪乳桿菌，所述干酪乳桿菌aa"0^"7/wc""/Zhang)是從酸馬奶中分離的耐酸型益生菌；該菌菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號CGMCCNo.1697。本發明還提供了從所述干酪乳桿菌中分離的耐酸基因atpA'，該基因是H+-ATP酶a亞單位的部分基因，并且對該基因進行了克隆和測序。本發明還提供了一種耐酸型干酪乳桿菌菌株的篩選方法，包括a.以天然酸馬奶為樣品，從中分離鑒定得到50株乳桿菌，經過分析鑒定后制成乳桿菌菌液；b.吸取所述乳桿菌懸浮液lOpl接種于5mLpH3.5的MRS液體培養基中，置于37。C條件下進行24小時培養，同時吸取乳桿菌懸浮液l.OmL與9.0mLpH3.0的人工胃液混合后，置于37。C條件下培養，分別在培養開始時間0小時和培養3小時后取樣。c.用BCP瓊脂培養基測定活菌數，篩選出具有高耐酸性生長能力的乳桿菌菌株，并進一步測定所述乳桿菌菌株在不同人工胃液和腸液中的存活能力，以及通過體外耐膽鹽試驗和降低膽固醇試驗，由此獲得耐酸型干酪乳桿菌。本發明還提供了H+-ATP酶基因a亞單位一一H+-ATP酶耐酸基因atpA'的克隆方法，包括a.查詢GeneBank，找到已公布的相關序列進行H+-ATP酶基因a亞單位的引物設計；b.對上述新鮮干酪乳桿菌進行PCR擴增，從而得到目的片段；c.對目的片段進行瓊脂糖凝膠回收以及基因克隆，并將克隆片段送往基因公司進行測序。本發明還提供了IT-ATP酶耐酸基因atpA'在不同酸度條件下的表達方法，包括a.將所述干酪乳桿菌的新鮮菌液分別于pH4.0，5.0，6.5的條件下培養；b.于對數生長期提取RNA，進行RT-PCR;c.擴增產物進行瓊脂糖電泳檢測，并根據擴增條帶繪制柱狀圖。本發明還研究了所述克隆基因在不同酸度條件下，在所述干酪乳桿菌中表達的差異。本發明還提供了人工胃液和人工腸液的制備方法人工胃液NaC10.2%、胃蛋白酶0.35%，用lmol/LHC1調整pH值為3.0后，過濾，除菌，備用。人工腸液將下述a液和b液以2:l混合即為人工腸液。a.胰腺液重碳酸鈉1.1%、NaC10.2%、胰蛋白酶(Trypsin,sigma)0."/。,調整pH為8.0后，過濾，除菌，備用。b.月旦汁液BileSalts(Difco)1.8%，調整pH為8.0后，過濾，除菌，備用。本發明的干酪乳桿菌aacfo^c///wsc^e/Zhang)具有較強的耐性和耐酸生長特性，能夠耐受人工胃腸消化液，尤其在脫脂乳液中能夠耐受pH2.0的人工胃液。因此，可將其用作食品，特別是乳制品的發酵劑。對所述干酪乳桿菌中11+-八丁？酶基因ot亞單位的克隆及表達表明，在所述干酪乳桿菌中H+-ATP酶耐酸基因atpA'的表達與該菌株的耐酸性能是有一定關系的。因此，可用于乳酸菌益生菌株的篩選、遺傳改造。圖l為ATP操縱子的基因結構和DNA片段；圖2為本發明干酪乳酸菌丄.M^/Zhang對人工胃腸液的耐受性圖；圖3為本發明發酵乳中丄.owe/Zhang對人工胃腸液的耐受性圖；圖4為本發明干酪乳酸菌丄.^化/Zhang總基因組DNA提取流程圖;圖5為本發明克隆所得目的基因片段的回收與鑒定流程圖；圖6為本發明目的片段克隆所需感受態細胞的制備流程圖；圖7為本發明目的片段質粒轉化流程圖；圖8為本發明轉化菌落的PCR鑒定與培養流程圖9為本發明編碼干酪乳桿菌Z.cwe/Zhang中H+-ATP酶耐酸基因atpA'的核苷酸和編碼蛋白序列；圖10為本發明干酪乳桿菌丄.case/Zhang，ZL3-1，ZL3-2總RNA提取流程圖11為本發明干酪乳桿菌丄.cwe/Zhang在不同酸度條件下的生長曲線圖12為本發明干酪乳桿菌丄.c"化/Zhang不同循環次數擴增H+-ATP酶基因，GAPDH產物電泳圖13為本發明干酪乳桿菌Z.c"化/Zhang在不同酸度條件下H、ATP酶耐酸基因atpA'RT-PCR電泳圖14為本發明干酪乳桿菌丄.c^e/Zhang在不同酸度條件下H+-ATP酶耐酸基因atpA'表達柱狀圖(n=3)。具體實施例方式下面將結合具體實施例對本發明做更詳細的說明。實施例l:干酪乳桿菌(La"o^cz7/wco^/Zhang)的耐酸性及其在人工胃腸液中的耐受性分析。從酸馬奶樣品中分離鑒定的50株乳桿菌中，經過pH3.5的MRS液體培養基中生長試驗及在pH3.0人工胃液中的存活率測定，篩選到1株耐酸性極強的乳桿菌，即干酪乳桿菌a""o6a"'〃w"a"/Zhang)。將丄""o6ac/〃wZhang進行pH3.5的MRS液體培養基中生長試驗及其在pH3.0人工胃液中的存活率測定實驗，其結果見表1。表l丄fl"o6oc/〃Mcfl"/Zhang在pH3.5及pH3.0人工胃液中生長情況<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注表中菌數均為兩次實驗的平均值。丄.cwe/Zhang，經過pH2.0、pH3.0和pH4.0的人工胃液作用3小時后，隨即分別接入pH8.0的人工腸液，作用0小時、3小時、6小時、24小時后的活菌數變化結果，如圖2所示。將本發明的丄.c^e/Zhang，接種到10。/。脫脂乳中，置37。C培養凝乳后，按比例與不同pH值的人工胃液混合，于37。C處理3小時，然后，轉接到pH8.0的人工腸液中，隨時間推移測定其活菌數變化，如圖3所示。結果顯示，Z.ca"/Zhang具有極強的耐酸特性和耐受人工胃腸液的能力，尤其在脫脂乳中時能夠耐受pH2.0的人工胃液而存活率未見降低。實施例2:丄.casez'Zhang中H+-ATP酶基因a亞單位的部分基因——}^-八丁？酶耐酸基因atpA，的克隆和測序。01亞單位在^1+-八丁？酶基因的構成結構中是高度保守的，可通過對于該目的片段的擴增得到所需基因。本發明測序得到的片段，經過同源性比較證實為H+-ATP酶基因ct亞單位的部分編碼片段。1、實驗方法1.1PCR引物設計與合成PCR引物根據GeneBank提供的相關序列(AccessionNo:NZAAGR01000077)采用PrimerPrimer5.0自行設計，由上海桑尼生物科技有限公司合成。F:5'-ATGGTGCGATGGATTAT-3';R:5'-AACACGGGAAACAGAAG-3'。1.2干酪乳桿菌DNA的提取。采用CTAB法提取菌株基因組DNA(圖4)。將冷凍保存的菌株丄.c^e/Zhang接種于MRS液體培養基中，置37°C培養24小時，經MRS培養液傳代培養23次后，取1.5ml對數生長末期的菌體培養物，5，000rpm離心1分鐘收集菌體，去盡培養液。在沉淀中加入500)il的TE緩沖液，用吸管反復吹打，使之重懸。然后加入50pl10%SDS(w/v)和lO)il10mg/ml蛋白酶K，混勻，于55。C搖床過夜消化。再加入lOOpl10mol/LCTAB溶液(4.1gNaCl溶于80ml水中緩慢加入CTAB10g)及100pl濃度為5mol/LNaCl溶液，混勻，65。C水浴保溫10分鐘，得到粗提取液。在此粗提取液中加入等體積(一般為700pl)的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1，v/v)，顛倒混勻，12，OOOrpm離心5分鐘；取上清，并加入等體積氯仿/異戊醇(24:1，v/v)，顛倒混勻，12，OOOrpm離心5分鐘，棄下層。在所得到的上清液中，加入50(Hd預冷異丙醇，輕輕混合，直到DNA沉淀下來，室溫下靜止10分鐘，12OOOrpm離心5分鐘，棄去上清，得到DNA沉淀。用lml70。/。的乙醇(v/v)洗滌DNA沉淀1次。清除酒精，吸干DNA,力Q100^1TE緩沖液溶解DNA，于55°C保溫助溶，20分鐘后取出冷卻。加入5pl4mg/mlRNase于37'C水浴30分鐘。而后加入400^ilTE緩沖液以及50(^l苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1，v/v)，顛倒混勻，12，OOOrpm離心5分鐘；取上清，并加入等體積氯仿/異戊醇(24:1，v/v)，顛倒混勻，12，OOOrpm離心5分鐘，棄下層。在所得到的上清液中，加入O.l倍體積3MNaAC，輕輕混勻后加入500|il預冷異丙醇，輕輕混合，直到DNA沉淀下來，室溫下靜止10分鐘，12000rpm離心5分鐘，棄去上清，得到DNA沉淀。用1ml70%的乙醇(v/v)洗滌DNA沉淀1次。清除酒精，吸干DNA。最后用305(^l滅菌去離子水溶解DNA，于55'C，保溫20分鐘，助溶后，置于-20"C保存。1.3目的片段的PCR擴增PCR擴增體系0.2plTaq聚合酶(5U/pl，TakaraTokyo,Japan)，10xPCR緩沖液(不含Mg2+)，2pldNTP(各2.5mM)，2^1MgCl2(25mM)，0.2pl正向引物(50pM)，0.2)il反向引物(50pM)，lplDNA產物(lOOng/pl)和17.4ji1ddH20。PCR擴增條件97°C變性5分鐘；95t:30秒—55。C30秒—72°Cl分鐘，如此進行35次循環；72。C延伸10分鐘，4'C保存。1.4瓊脂糖凝膠電泳檢測取PCR產物5^，與lpl上樣緩沖液混合均勻，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，在另一孔中加入5filDL2000Marker,5V/cm電壓下，電泳30分鐘。電泳結束后，在凝膠成像系統GDS-8000System(UVPBiomagingSystems)上留取照片。1.5目的基因片段回收與鑒定片段回收按上海華舜小量膠回收試劑盒說明進行(圖5)。在紫外燈下迅速將含目的片段條帶的瓊脂糖塊割下，放入1.5ml的離心管中。按每100mg瓊脂糖加入300-60(HdSl液的比例加入S1液，置55t:水浴中10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化，每2分鐘顛倒混勻一次。加入1/3S1體積的異丙醇，混勻，55"C溫浴1分鐘。將溶化后的瓊脂糖塊移入吸附柱，離心1分鐘。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。在吸附柱中加入450inlWl液，靜置1分鐘后，離心15秒。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。在吸附柱中加入450plWl液，離心15秒后倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。離心1分鐘。將吸附柱放入一個干凈的1.5ml的離心管中，在吸附柱的中央加30plTl液，靜置1分鐘后，離心1分鐘。最后吸取2-4)il溶液，在紫外分光光度計上測定比值和濃度后，將1.5離心管中DNA貯存于畫20。C下。1.6目的基因片段的克隆與鑒定1.6.1感受態細胞的制備挑取JM109大腸桿菌原種，LB瓊脂板上劃線。過夜培養后挑取新鮮單菌落，接種到100mlLB培養基中，37"C搖菌培養2-3小時(160轉/分鐘)，至OD6oo達到0.4-0.5時將菌液移至滅菌預冷的100ml離心管中，冰浴10-15分鐘。4，OOOrpm，4。C離心10分鐘，回收細菌沉淀。加入20ml經過過濾除菌并經預冷的0.1MCaCl2，懸浮細菌沉淀。冰浴10-15分鐘后于4,OOOrpm，4。C離心10分鐘，回收細菌沉淀。加入4ml0.1MCaCl2懸浮細菌沉淀。該細胞可直接用于轉化實驗。加甘油至終濃度為15%-20%，混勻，每份分裝成100pl于1.5mlEP管中，凍存于-70。C冰箱中(圖6)。1.6.2回收片段與T載體的連接連接用TaKaRapMD18-TVector試劑盒。操作過程如下首先在EP管中制備下列連接反應液pMD18-TVector(5Ong/pl)0.5^1DNA20畫40ng溶液15^1加dH20至10^1總計10pl將上述反應液在16"C反應過夜，產物用于轉化感受態細胞。1.6.3質粒的轉化從-7(TC冰箱中取出保存的感受態細胞，冰浴助溶。將10(^1感受態細胞加入l(HU連接產物，冰浴30分鐘后于42t:水浴熱應激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。加入40(V1液體LB培養基，37"C復活50分鐘后取lOOpl鋪于LB平板上，平板含0.1(V/V)的氨芐青霉Amp(100mg/ml)、X-gal(lOO^g/ml)禾卩IPTG(lmM)。最后于37。C恒溫培養10-15小時。白色菌斑應含重組質粒(圖7)。1.6.4轉化菌落的PCR鑒定與培養用記號筆標記轉化培養的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取白色單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應液(不含模板)的EP管中晃動，進行PCR擴增。將PCR產物同標記物(Marker)—起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段。得到目的片段后，用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應的單菌落，放入40ml含0.1%(V/V)青霉素鈉(100mg/ml)的LB液體培養基中，37'C過夜搖菌培養，用于質粒回收和測序(圖8)。2、實驗結果經過測序得到圖9所示編碼H+-ATP酶基因a亞單位的部分DNA和核苷酸序列，該序列與GeneBank中所公布的基因序列的同源性為88.61%。3、結論克隆測序得到的基因片段為H+-ATP酶基因的a亞單位。實施例3:酸脅迫對干酪乳桿菌11+-八丁？酶耐酸基因31八，表達的影響1、實驗方法酸脅迫是益生菌群面臨的首要挑戰，同時也是進行益生菌篩選的首要條件。因此，找到與益生菌酸耐受力(acidtolerance)相關的基因，在今后進行益生菌改造方面具有積極的作用。本發明利用RT-PCR技術，發現^1+-八丁？酶基因表達與干酪乳桿菌的耐酸性能是有一定關系的。1.1PCR引物設計與合成PCR引物根據GeneBank提供的相關序列(AccessionNo:NZ—AAGR01000077)采用PrimerPrimer5.0自行設計，由上海桑尼生物科技有限公司合成。11+-八丁？酶基因PCR引物F:5'-ATGGTGCGATGGATTAT-3z;R:5'-AACACGGGAAACAGAAG-3'。GAPDH基因PCR引物F:5'-CTTTCCCTGGTGAAGTTAG-3';R:5'-GTTCAGGAAGTAAGCCATT-3'。1.2干酪乳桿菌(丄.c"^'Zhang)生長曲線的確定將在液體MRS培養基中37"C培養過夜的干酪乳桿菌懸液3，000g離心10分鐘，棄去上清液。用滅菌生理鹽水(0.8%)洗滌菌體，3，000g離心10分鐘，重復3次，收集菌體。每管加入生理鹽水，將菌體稀釋到適當濁度(A5Wwn=0.80.9)。將供試菌液以2%的量加入不同酸度條件的三角瓶中，以每管5mL的量分裝試管。置于37。C恒溫培養箱中培養29小時。每隔1小時取出3支試管用分光光度計測量其600nm處的吸光值，以不含菌液的空白培養基管為空白，平行實驗重復3次，取平均值。以吸光度為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制生長曲線。1.3總RNA提取對照菌株JLcwdZL3-1，ZL3-2(在pH3.5條件時均可生長)。將丄.cose/Zhang，Z.case/ZL3-1，ZL3-2分另U同時生長于pH4.0，pH5.0，pH6.5的MRS培養基中，在37匸條件下培養到其對數生長期。取上述處于對數生長期的乳酸菌細胞，在2%溶菌酶中作用20分鐘后，收取約50mg菌體沉淀。總RNA提取采用Trizol法(Invetrogen，USA)，具體操作按照TRIzol試劑盒說明書進行(圖10)。在生物分光光度計(Biophotomater,Eppendorf)上測OD值，調整各組織樣總RNA濃度至100ng/pl。備用總RNA于-7(TC保存。1.4確定RT-PCR反應循環次數取同一樣本cDNA分別作目的基因H+-ATP酶22，25，28，31，34個循環擴增，1%瓊脂糖電泳產物，紫外成像分析條帶灰度確定擴增平臺期前的循環次數為反轉錄實驗循環參數。反應體系為25pl。擴增條件97。C預變性5分鐘，95。C變性30秒，55。C退火30秒，72。C延伸1分鐘，循環34次，最后一個循環結束后72'C延伸10分鐘。1.5RT-PCR擴增按反轉錄試劑盒TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0要求進行反轉錄。反轉錄反應液組成1^1IOXRT緩沖液，2nl25mmol/LMgCl2，l|ildNTP混合物，0.25plRNase抑制劑(40U/)ul)，0.5^1AMV反轉錄酶XL(5U/|al)，0.5^1OligodT-AdaptorPrimer(2.5pmol/pl)，3filRNA模板，1.75|il無RNase的dH20，總體系為lOfil。反轉錄反應條件3(TC10分鐘，42。C30分鐘，99X:5分鐘，5°C5分鐘。PCR擴增條件97'C變性5分鐘；95"C30秒—55-C30秒—72°C1分鐘，如此進行30次循環；72'C延伸10分鐘，4"C保存。1.6瓊脂糖凝膠電泳檢測取每個組織樣品的目的基因RT-PCR產物5|iL，對照GAPDH基因RT-PCR產物2pL，同lpL上樣緩沖液混合均勻，分別點樣于瓊脂糖凝膠孔中，在另一孔中加入5pLDL2000Marker,5V/cm電壓下電泳30分鐘。電泳結束后，在凝膠成像系統GDS-8000System(UVPBiomagingSystems)上留取照片。應用系統軟件(GelproAnalyzer)進行吸光值比較分析，確定目的基因在組織樣品中表達量的相對值。2、實驗結果通過對丄.^^'Zhang生長曲線的繪制發現，所述干酪乳桿菌在pH5.0和pH6.5條件下于3小時進入對數生長期，在10小時進入平臺期；在pH4.0條件下于3小時進入一個遲滯期后，在6小時左右進入對數生長期，在17小時左右進入平臺期。測定結果顯示，隨著培養基酸度增加，干酪乳桿菌的生長受到抑制，pH5.0和pH6.5條件下己表現出這種趨勢，到pH4.0條件時，干酪乳桿菌的生長受到強烈的抑制(圖ll)。為了準確反映不同酸度條件下H+-ATP酶基因表達，在進行半定量PCR時，要求PCR擴增不進入平臺期。實驗結果顯示，當H+-ATP酶基因和GAPDH基因達到31循環時，條帶的吸光值基本達到恒定。因此30循環被共同RT-PCR擴增所采用(如圖12所示，其中l-5泳道分別為PT-ATP酶擴增22、25、28、31、34循環，6-10泳道分別為GAPDH擴增22、25、28、31、34循環)。在菌體進入對數生長末期，即培養8小時，回收菌體并提取總RNA。進行RT-PCR擴增(如圖13所示，其中1-6泳道為Lc"^/ZL3-1;7-12泳道為丄.ca"/ZL3-2;13-18泳道為丄.cwez'Zhang;奇數泳道為H+-ATP酶；偶數泳道為GAPDH;1、2、7、8、13、14泳道為pH4.0;3、4、9、10、11、12泳道為pH5.0;5、6、11、12、17、18泳道為pH6.5)，并根據各電泳條帶的吸光值比較繪制柱狀圖(圖14)。隨著干酪乳桿菌培養基酸度的增加，11+-八1酶的表達呈上升趨勢，其中，pH4.0禾flpH5.0時的表達量分別是pH6.5時的3.3倍和2.8倍。對丄a"o^"7/wcose/Zhang作了三次平行實驗，根據其電泳條帶吸光值繪制柱狀圖。3、結論表明干酪乳桿菌aactoZ^c/〃wsc"M/Zhang)的H+-ATP酶耐酸基因atpA'同菌體細胞酸調節間有一定關系。權利要求1.一種干酪乳桿菌(LactobacilluscaseiZhang)，其特征在于所述干酪乳桿菌菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心的保藏號為CGMCCNo.1697。2.如權利要求1所述的干酪乳桿菌，其特征在于它是從酸馬奶中分離的耐酸型益生菌。3.如權利要求1所述的干酪乳桿菌，其特征在于它包括耐酸基因。4.如權利要求l、2或3所述的干酪乳桿菌用作食品發酵劑的用途。5.—種耐酸型干酪乳桿菌菌株的篩選方法，包括a.以天然酸馬奶為樣品，從中分離鑒定得到50株乳桿菌，經過分析鑒定后制成乳桿菌菌液；b.吸取所述乳桿菌懸浮液lOpl接種于5mLpH3.5的MRS液體培養基中，置于37。C條件下進行24小時培養，同時吸取乳桿菌懸浮液l.OmL與9.0mLpH3.0的人工胃液混合后，置于37。C條件下培養，分別在培養開始時間0小時和培養3小時后取樣。c.用BCP瓊脂培養基測定活菌數，篩選出具有高耐酸性生長能力的乳桿菌菌株，并進一步測定所述乳桿菌菌株在不同人工胃液和腸液中的存活能力，以及通過體外耐膽鹽試驗和降低膽固醇試驗，由此獲得耐酸型干酪乳桿菌。6.—種11+-八丁？酶耐酸基因atpA，，其特征在于所述基因的序列如下iYTIVLTAGPSEPAPMLYIAP<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>1081CGCTTAACGGATACTGTCCACTTTTCTCCCTTCGGGATAC7.如權利要求6的11+4丁？酶耐酸基因^八'用于篩選和改造益生菌的用途。全文摘要本發明涉及一種H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’和包括該基因的干酪乳桿菌。所述干酪乳桿菌是從酸馬奶中分離的耐酸型干酪乳桿菌(LactobacilluscaseiZhang)，該菌菌株的保藏號為CGMCCNo.1697。所述基因是從所述干酪乳桿菌中分離的，是H⁺-ATP酶α亞單位的部分基因；并且對該基因進行了克隆和測序。本發明的干酪乳桿菌可用作食品，特別是乳制品發酵用的生產菌株。本發明的耐酸基因可用于乳酸菌益生菌株的篩選和遺傳改造。文檔編號C12N15/31GK101348769SQ200710129939公開日2009年1月21日申請日期2007年7月20日優先權日2007年7月20日發明者和孟,孟和畢力格,張和平,霞陳申請人:內蒙古農業大學