專利名稱：一種提取雜交酸模超氧化物歧化酶的方法
技術領域：
本發明涉及提取植物超氧化物歧化酶(SOD)的方法，特別是涉及一種提取雜交 酸模S0D的方法。
背景技術：
超氧化物歧化酶(SOD)是生物重要保護酶之一，能增強機體抗逆能力，防衰老。 雜交酸模是采用不同地區野生酸模通過基因工程培育而成的多年生物種。它具有優 質、高產、速生、耐寒、耐旱、'耐鹽堿等生物學特性，適于鹽漬、風沙、荒漠化土地 生長，在我國南北方大部分地區都有種植。雜交酸模的莖葉在抽莖期所含葉蛋白高達 30%以上，僅次于大豆籽粒，還含有豐富的氨基酸、維生素和微量元素。經過測定， 雜交酸模中含有較高的SOD。
現有的雜交酸模SOD提取技術一般是將雜交酸模處理后離心得到的粗提液，經 25—35%硫酸銨沉淀、85—95%硫酸銨沉淀、Sephadex G-25脫鹽和Sephadex G-100 柱層析等步驟，可以得到SOD粗酶。
發明內容
本發明的目的是提供一種簡單方便的提取雜交酸模SOD的方法。 本發明所提供的提取雜交酸模SOD的方法，是以截留分子量為6萬道爾頓的超濾
膜翹濾處理雜交酸模粗提液得到超濾液，再以截留分子量為1萬道爾頓的超濾膜濃縮
超濾液，濃縮液脫水得到雜交酸模S0D;所述雜交酸模粗提液是將雜交酸模搗碎、勻
漿離心得到的上清液。
所述將雜交酸模搗碎、勻漿離心是將雜交酸模用組織搗碎機搗碎，搗碎組織經勻
漿后，離心的條件是8000/分鐘。
在生產中， 一般使濃縮液脫水的方^;是冷凍干燥。
在本發明中，應用截留分子量為6萬道爾頓的超濾膜超濾處理粗提液，超濾時工 作壓力為0.l5MPa,得到超濾液，超濾膜的截留分子量選擇6萬道爾頓。超濾膜的組 件形式可以有各種形式，常用的有中空纖維膜。
應用截留分子量為1萬道爾頓的超濾膜對超濾液進行處理時，工作壓力為 0.15MPa，得到濃縮。液超濾膜的截留分子量一般選擇1萬道爾頓，其組件形式可以 為中空纖維膜。
提取雜交酸模S0D的工藝流程如圖1所示，本發明巧妙地采用超濾技術來分離、
濃縮雜交酸模SOD粗提液，不僅可以節約現有提取雜交酸模SOD工藝中所用的硫酸銨, 而且提取過程無相變，有利于保持SOD酶活的穩定，得到的產品酶活性較高。同時本 發明的工藝不需經過柱層析分離過程，具有操作過程簡單，對環境無污染等優點。
圖1為本發明的提取工藝流程圖。
具體實施例方式
實施例l、 SOD的酶活測定
SOD的酶活測定方法采用NBT光化學法，具體如下
(1) 設備752型分光光度計；臺式離心機；光照培養箱；冰箱；10ml小燒杯等。
(2) 試劑氯化硝基氮藍四唑(NBT)，上海前進制劑廠
L-甲硫氨酸(L-Met)，上海康達氨基酸廠 乙二胺四乙酸(EDTA)，北京化工廠 核黃素(VB2),北京西中化工廠
(3) 反應液的配制
NBT反應液的制備配制pH7.8，50mmol/L的磷酸緩沖液1000ml，加入L933mg 的L-Met,待完全溶解后，放入45.8mgNBT, 0.47mg核黃素(配成0.47mg/ml溶液， 吸取lml加入)和29.0mgEDTA，溶液終濃度Met為13mmol/L; NBT為6.3 X l(T3mmoI/L;核黃素為1.3X l(T3mmol/L; EDTA為0.1 mmol/L，置于棕色試劑瓶中，
用黑布罩遮光，于4t:冰箱中可保存i個月。
(4) 材料的預處理
雜交酸模鮮體用研缽研碎，按照雜交酸模50mM磷酸緩沖液-l: 2的比例加入 緩沖液，10000rpm離心10分鐘，取上清液進行SOD酶活測定。
(5) 測定方法
吸取3(Htl樣品，放入10ml透明玻璃小燒杯中，加入3mlNBT反應液，混勻，在 28°CSOD光化反應室中,2X 15W日光燈光照20分鐘(光照為4000勒克司)，在560mn 處測定吸光度，以NBT反應液作空白對照，每組設3次重復，整個測定過程除光化反 應外，均在避光或弱光條件下進行。同時測試過程中以美國"Sigma"公司、上海寶安公 司的標準酶和貴州老來福藥業公司生產的SOD 口服液作為測試對照。
(6) 計算
CK—A 60 1000 SOD酶活性-- X -X -X
CK/2 30 30
式中CK——空白對照透光度
n—樣品稀釋倍數 A—樣品透光度 -酶活單位IU/g實施例l、提取雜交酸模SOD 實施例2、提取雜交酸模SOD
取新鮮雜交酸模的根、莖和葉100kg，用組織搗碎機搗碎，均漿，8000rpm冷凍 離心10min，去除雜質得上清液70L (粗提液)，酶活為180IU/ml。將粗提液通過截 留分子量為6萬道爾頓的中空纖維超濾膜。膜材料聚砜，膜面積0.12m2，直徑 10cm,高100cm，內壓式。粗提液經0.15MPa超濾50分鐘，獲得超濾液63L,酶活 173IU/ml;然后，將超濾液通過截留分子量為1萬道爾頓的中空纖維超濾膜，膜材料: 聚砜。膜面積0.12m2，直徑10cm，高100cm，內壓式，超濾液經0.15MPa超濾 l小時，得到濃縮液3L，酶活3584IU/ml。濃縮液冷凍干燥獲得360克干粉，酶活 28186IU/g SOD，回收率約80.2%。
實施例3、提取雜交酸模SOD
取新鮮雜交酸模的根、莖和葉100kg，用組織搗碎機搗碎，均漿，8000rpm冷凍 離心10min，去除雜質得上清液70L (粗提液)，酶活為180IU/ml。將粗提液通過截 留分子量為6萬道爾頓的平板超濾膜。膜材料聚砜，膜面積0.15m2，長30cm, 寬15cm，高5cm。粗提液經(U7MPa超濾45分鐘，獲得超濾液67L,酶活為163IU/ml; 然后，將超濾液通過截留分子量為1萬道爾頓的平板超濾膜。膜材料聚砜，膜面積 0.15m2。長30cm，寬15cm,高5cm。超濾液經0.17MPa超濾50分鐘，得到濃 縮液2.8L，酶活為3682IU/ml。濃縮液冷凍干燥，獲得330克SOD干粉，酶活為 32253IU/g，回收率約84. 5%。
實施例4、提取雜交酸模SOD
取新鮮雜交酸模的根、莖和葉100kg，用組織搗碎機搗碎，均漿，6000rpm冷凍 離心10min，去除雜質得上清液70L (粗提液)，酶活為180IU/ml。將粗提液通過截 留分子量為6萬道爾頓的巻式超濾膜。膜材料:聚丙烯腈，膜面積:側面積3200cm2， 橫截面積:2. 4 cm、粗提液經0.17MPa超濾48分鐘,獲得超濾液66L,酶活為1621U/ml; 然后，用截留分子量為1萬道爾頓的巻式超濾膜。膜材料:聚丙烯腈，膜面積:側面積 3200cm 橫截面積2. 4 cm2,超濾液經0.17MPa超濾55分鐘，得到濃縮液2. 5L,酶 活為4124IU/ml。濃縮液冷凍干燥，獲得310克SOD干粉，酶活為34874IU/g,回收 率約85. 8%。
權利要求
1、一種提取雜交酸模SOD的方法，是以截留分子量為6萬道爾頓的超濾膜超濾處理雜交酸模粗提液得到超濾液，再以截留分子量為1萬道爾頓的超濾膜濃縮超濾液得到濃縮液，濃縮液脫水得到雜交酸模SOD；所述雜交酸模粗提液是將雜交酸模搗碎、勻漿離心得到的上清液。
2、 根據權利要求1所述的提取雜交酸模S0D的方法，其特征在于所述將雜交酸模搗碎、勻漿離心是將雜交酸模用組織搗碎機搗碎，搗碎組織經勻漿后，離心的條 件是8000轉/分鐘。
3、 根據權利要求1或2所述的提取雜交酸模SOD的方法,'其特征在于所述濃縮液脫水的方式是冷凍干燥。
4、 根據權利要求1或2所述的提取雜交酸模S0D的方法，其特征在于所述截留分子量為6萬道爾頓的超濾膜的組件形式為中空纖維膜、平板膜或巻式膜。
5、 根據權利要求1或2所述的提取雜交酸模S0D的方法，其特征在于所述截 留分子量為1萬道爾頓的超濾膜的組件形式為中空纖維膜、平板膜或巻式膜。
全文摘要
本發明公開了一種雜交酸模SOD的提取方法。本發明提供的雜交酸模SOD的提取方法，包括將雜交酸模經預處理得到粗提液，以截留分子量為6萬道爾頓的超濾膜超濾處理粗提液得到超濾液，和以截留分子量為1萬道爾頓的超濾膜濃縮超濾液得到濃縮液；所述將雜交酸模經預處理得到粗提液是將雜交酸模用組織搗碎機搗碎，搗碎組織經勻漿離心，棄去沉淀殘渣，保留上清液作為粗提液。本發明引入超濾技術，應用兩種不同截留分子量大小的超濾膜來分離、收集粗提液，可以節約硫酸銨，而且提取過程無相變，有利于保持SOD酶活的穩定；不需經過柱層析分離過程，具有操作過程簡單，對環境無污染等方面的優點。
文檔編號C12N9/08GK101353648SQ20071011936
公開日2009年1月28日 申請日期2007年7月23日 優先權日2007年7月23日
發明者孫元樞, 寧 梅, 梅汝鴻, 琦 王, 王嘉猷, 晉 靳 申請人:北京綠壽康科技發展有限公司