專利名稱：一種淀粉酶催化合成烷基糖苷的方法
技術領域：
本發明屬于精細化工領域，涉及以淀粉為原料生產脂肪醇糖苷的方法，尤其涉及酶催 化生產脂肪醇糖苷的方法。
背景技術：
在多元醇型非離子表面活性劑中，糖類脂肪酸酯和烷基葡萄糖苷(APG)是兩類用途最 廣的非離子表面活性劑。它們無毒，對皮膚無刺激作用，生物降解性好，具有去污、乳化、 洗滌、分散、濕潤、滲透、擴散、起泡、抗氧、粘度調節、殺菌、防止老化、抗靜電和防 止晶析等多種功能，在日化，食品和醫藥行業得到了廣泛的應用。
烷基糖苷(APG)是由可再生資源(淀粉和油脂或它們的衍生物葡萄糖和脂肪醇)為原料而 制得的非離子表面活性劑。其典型的分子結構如下<formula>formula see original document page 3</formula>
結構式中，R為C^C!6的焼基，n為平均聚合度。當IKQ時，烷基糖苷的性能不佳，而 R=C8~C16時，其性能優良。
從結構上講，APG應屬于非離子型表面活性劑，它卻兼有非離子和陰離子兩種表面活性 劑的特點。APG具有能顯著降低溶液表面張力和油/水界面張力，起泡豐富、細膩而穩定， 去污能力強及配伍性好，對皮膚剌激性低及生物可降解性好等優良特點。可廣泛用作洗滌、 乳化、增溶、保濕等功能制品的主活性物，在洗滌劑、食品和化妝品等工業中具有廣闊的 應用煎景。
APG的研制已有100多年的歷史，早在1893年，德國的Emil Fischer就用乙醇和葡萄 糖在鹽酸催化下，合成出了乙基糖苷。而長碳鏈的APG是由Fischer和Helferich在1911 年用Koenigs Knorr法合成的.但由于此法過于繁雜.而一直未受到足夠的重視。到1934 年.APG作為表面活性劑的潛力開始在H. Th. BohmeA. G of Chemihz的美國專利中 得到重視。1938年，美國人Noller和Rockwen研究了 C5QC9CH)和d2垸基單苷的制備方 法和性質，但其合成方法的本質仍為Fischer法.不具任何工業意義。直到80年代后期， APG才實現工業化。
1978年，法國的Seppic公司建成了第一個工業裝置，首次使APG工業化后，Rohm &Hass公司等于20世紀80年代后期開始生產，但規模都不大，1993年，德國的Henkel公司的年多苷 2. 5萬噸的生產裝置投入運轉。此后，世界各國均加速了APG的產業化進程，同時也推動 了研究的發展。
近十多年來，國內對烷基糖普的研究日趨重視，如大連理工大學、天津輕工所、大連 油化廠等單位相繼展開工作。目前國內小規模生產己有數家工廠，如江蘇南京梅山化工總 廠、大連油化廠、鞍山化工一廠和金陵石化公司研究院等。但國內生產廠家大多是300 1000 噸/年的規模，且在產品的色澤、氣味等指標上與國外產品有較大差距，難以和國外廠商競 爭。我國是一個農業大國，其農副產品及碳水化合物和天然脂肪醇來源非常豐在大量生產 和開發利用APG方面有著明顯的地域優勢，具有極大的商業潛富力。
傳統化學方法大多采用一步催化[夏良樹,陳仲清，聶長明,新型表面活性劑烷基糖苷的 合成試驗，化學工業與工程,2004，21(1):21-24]與二步催化[鄧淑華,成曉玲,宋曉銳，十六垸 基糖苷的合成研究,化學工業與工程,1999，16(5):3.8-3U]， 一般產率較低。由于反應溫度較 高，容易產生焦糖而不能反應完全。化學方法一般釆用酸作催化劑，而且有些反應引入了 重金屬離子，如CN1775790，從環境和健康角度講不太令人滿意，對產品在食品、制藥等 領域的應用受到一定的限制。
酶法合成糖苷類化合物不僅可以避免繁瑣的保護/去保護步驟，而且反應條件溫和、 對環境友好，因而引起了人們的廣泛關注。國外學者已經開始了利用酶催化反應，而國內 對用酶作催化劑合成糖苷的研究還比較少,大多利用糖苷水解酶催化其逆反應來合成糖苷 [吳穎，于九皋，糖苷酶催化制備烷基糖苷，化學通報,2005，168(136):1-7]，但糖苷水解酶價 格昂貴，而且糖苷酶對長鏈脂肪醇的轉化率也很低，對其在工業化方面的發展產生阻礙。
發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種淀粉酶催化合成烷基糖苷的方法。淀粉酶價格 低廉，主要用于催化淀粉的水解。由于淀粉酶廉價易得，極大的降低了生產成本，為酶催 化生產垸基糖苷的工業化提供了新的思路。
本發明提供一種淀粉酶催化合成垸基糖苷的方法，包括下列步驟
1) 淀粉和脂肪醇，按每克淀粉加入0.001 0.010mol脂肪醇的比例，置于錐形瓶中；
2) 按照每克淀粉5~30ml有機溶劑的比例加入有機溶劑或有機溶劑與水的混合溶劑；
3) 將加入上述混合物的錐形瓶置于油浴恒溫震蕩器中，恒溫40 80'C，震蕩10分鐘； 加入淀粉酶，淀粉酶的用量是淀粉質量的0.01 0.2倍；
4) 轉速120 200r/min,恒溫40 80'C，反應0.5 24小時后，減壓抽濾，濾餅用10ml 氯仿洗滌2次，合并濾液，然后向濾液中加入20 40mL氯仿，充分搖勻，轉移到分液漏斗 中，靜置分層后分離出下層提取液，上層用氯仿萃取，將下層提取液和氯仿萃取液合并， 蒸去溶劑，真空干燥，結晶得到垸基糖苷。
以上所述的淀粉無限制；可以是變性淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉及其他 各種淀粉。上述步驟a)中每克淀粉加入0.001 ~0.010mol脂肪醇，優選每克淀粉加入0.002 0.008mol脂肪醇；更優選每克淀粉加入0.003~0.006mol脂肪醇。
以上所述的有機溶劑是C2 do烷烴、烯烴、醇、酮或其混合物。優選的，有機溶劑為 丙酮、2—丁酮、乙醇、丙醇、異丙醇、叔丁醇、戊烷、己烷、庚烷、辛垸、石油醚、丙二 醇、和/或水中的一種或幾種；更優選的，有機溶劑為丙酮、2—丁酮、乙醇、叔丁醇、戊烷、 己烷、庚烷、石油醚、和/或丙二醇中的一種或幾種。有機溶劑的最佳加入量為每克淀粉5 15ml溶劑。
優選的，步驟b)中有機溶劑與水的比例為0.5: 1 5: 1。
上述步驟c)所述的油浴恒溫震蕩器為HZ-9613Y型油浴恒溫震蕩器，江蘇太倉市科教 儀器廠出品。
以上所述的脂肪醇為飽和的或非飽和的、直鏈的或支鏈的、含6至22個碳原子的脂肪 醇；優選的，所述的脂肪醇為飽和的或非飽和的、直鏈的或支鏈的、含8至20個碳原子的 脂肪醇；更優選的，所述的脂肪醇為飽和的或非飽和的、直鏈的或支鏈的、含10至18個 碳原子的脂肪醇；更優選的，所述的脂肪醇為癸醇、月桂醇、十四醇、十六醇、或十八 醇；最優選的，所述的脂肪酸為月桂醇、十四醇、十六醇、或十八醇。
上述步驟c)和e)中，反應溫度為40 80。C，優選50 70。C，更優選60'C。
上述步驟e)中的反應時間為0.5 24小時，優選0.5 18小時，更優選0.5 10小時， 更優選1 8小時；更優選1 6小時。
淀粉酶選自a—淀粉酶或卜淀粉酶；以上所述的淀粉酶可以是是固定在載體上的淀粉 酶，載體為硅藻土、活性炭、樹脂或紡織品膜。可通過載體結合技術，實現載體上酶的固 定化，也可以直接購買固定化的酶。纖維固定化酶的制備是以棉纖維作為固定化材料，將 棉纖維剪成小塊，并浸在酶液中，浸泡12h,取出后用水沖洗2次，40'C真空干燥。化學修 飾酶的制備是將游離酶和非離子表面活性劑溶于一定體積的正己烷，然后在4'C下攪拌24 小時，離心獲得濾餅，真空干燥并粉碎。
淀粉酶的用量是淀粉質量的0.01 0.2倍，優選0.02 0.2倍，更優選0.02 0.1倍。
可以用薄層色譜法分離產物。將反應物與產物溶于乙醇并分別滴樣于自制的薄層色譜 板(5cmX10cm)上，用展開劑展開15分鐘，取出晾干后在紫外燈下顯色，并記錄相應的 Rf值。用薄層色譜法在展開劑正丁醇乙醇水=3: 5: 2 (體積比)。
也可以用液相色譜分析法分析產物組成。樣品用叔丁醇溶解，抽濾，并用濾膜過濾。 分別對反應樣品和反應物進行HPLC檢測。HPLC檢測條件:采用島津HPLC2SCL，色譜柱為C18 反相柱，流動相為甲醇水=95 : 5 (K/^，檢測溫度為40'C,220nm紫外光檢測。流速lmL/min， 進樣量為10"。
本發明的方法在常壓下進行反應，生產工藝簡單；反應溫度為40 80'C，反應溫度低； 采用了低毒性的溶劑，可以用于食品和藥品，而且產品提純簡便，可以得到高純度的垸基 糖苷。
具體實施例方式
淀粉和脂肪醇，按每克淀粉加入0.001 0.010mol脂肪醇的比例，置于錐形瓶中；淀粉 可以是變性淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉及其他各種淀粉。優選每克淀粉加入 0.002 0.008mol脂肪醇；更優選每克淀粉加入0.003 0.006mol脂肪醇。所述的脂肪醇為 癸醇、月桂醇、十四醇、十六醇、十八醇的一種或幾種；最優選的，所述的脂肪酸為月桂 醇、十四醇、十六醇、或十八醇。
按照每克淀粉5~30ml有機溶劑的比例加入有機溶劑或有機溶劑與水的混合溶劑；有 機溶劑為丙酮、2—丁酮、乙醇、丙醇、異丙醇、叔丁醇、戊垸、己垸、庚烷、辛垸、石油 醚、丙二醇、和/或水中的一種或幾種；更優選的，有機溶劑為丙酮、2—丁酮、乙醇、叔丁 醇、戊烷、己垸、庚垸、石油醚、和/或丙二醇中的一種或幾種。有機溶劑與水的比例為l: 1 5: 1。
將加入上述混合物的錐形瓶置于HZ-9613Y型油浴恒溫震蕩器中，恒溫40 80'C，震蕩 IO分鐘；優選50 70'C,更優選60'C。
加入淀粉酶，淀粉酶的用量是淀粉質量的0.01 0.2倍；淀粉酶選自a—淀粉酶或p~ 淀粉酶；淀粉酶的用量是淀粉質量的0.02 0,2倍，優選0.02 0.1倍。
轉速120 200r/min,恒溫40 80。C，優選50 70。C，更優選60。C。反應0.5 24小 時后，優選0.5 18小時，更優選0.5 10小時，更優選1 8小時；更優選1 6小時。減 壓抽濾，濾餅用10ml氯仿洗滌2次，合并濾液，然后向濾液中加入20 40mL氯仿，、充分 搖勻，轉移到分液漏斗中，靜置分層后分離出下層提取液，上層用氯仿萃取，將下層提取 液和氯仿萃取液合并，蒸去溶劑，真空干燥，結晶得到烷基糖苷。
可以用薄層色譜法分離產物。將反應物與產物溶于乙醇并分別滴樣于自制的薄層色譜 板(5cmX10cm)上，用展開劑展開15分鐘，取出晾干后在紫外燈下顯色，并記錄相應的 Rf值。用薄層色譜法在展開劑正丁醇乙醇水=3: 5: 2 (體積比)。
殘糖分析
在垸基糖苷合成的過程中，未反應糖和醇對產品質量具有嚴重影響，因此，尋找一種簡
捷、準確的分析方法，對烷基糖苷產品走向工業化具有重要意義.這里的方法是樣品經過 出去蛋白質后，在加熱條件下，直接滴定標定過的堿性酒石酸銅液，以次甲基藍作指示劑， 根據樣品溶液消耗的體積，計算還原糖量，方法簡單易行。
(1) 葡萄糖標準溶液
精密稱取1.0000克葡萄糖，經過98-100'C的干燥至恒量的葡萄糖，加水溶解，定容至 250ml。每毫升中含葡萄糖0.004克。
(2) 標定堿性酒石酸銅溶液 吸取5.0ml酒石酸銅甲液和5.0ml酒石酸銅乙液，置于150ml的錐形瓶中，加水10ml
及玻璃珠2粒，控制在兩分鐘之內加熱至沸，有先快后慢的速度滴加，至淺藍色時，以每 秒1滴的速度繼續滴加葡萄糖的標準溶液，直至藍色剛好退去為終點，滴三次取平均值。
滴定量為2,lml。其中含葡萄糖0.0084g。
酒石酸銅甲液，稱取15g硫酸銅及0. 05g次甲基藍溶于水并稀釋至lOOOmL;酒石酸銅乙 液,稱取50g酒石酸鉀鈉及75g氫氧化鈉，溶于水中，加入4g亞鐵氰化鈉，完全溶解后， 稀釋至1000mL (甲乙液均儲存于橡膠塞容量瓶中)。 (3)樣品溶液的標定
吸取5.0ml酒石酸銅甲液及5.0ml酒石酸銅乙液，置于150ml錐形瓶中，加水10ml及 玻璃珠2粒，控制在2min內加熱至沸，趁熱以先快后慢的速度滴加樣品溶液，并保持溶液 沸騰狀態，待溶液顏色變淺時，以每兩秒l滴的速度滴定，直至溶液藍色剛好退去為終點， 記錄消耗樣品的體積V。
以下實施例是對本發明的進一步說明，但本發明并不局限于此。 實施例l
淀粉lg，月桂醇0.1864g，置于錐形瓶中；加入10ml丙酮，將加入上述混合物的錐形 瓶置于HZ-9613Y型油浴恒溫震蕩器中，恒溫40。C震蕩10分鐘；加入a—淀粉酶0.2000g,; 轉速120r/min，恒溫40'C,反應24小時后減壓抽濾，濾餅用10ml氯仿洗滌2次，合并濾 液，然后向濾液中加入20 40mL氯仿，充分搖勻，轉移到分液漏斗中，靜置分層后分離出 下層提取液，上層用氯仿萃取，將下層提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶劑，真空干燥， 結晶得到垸基糖苷。得提純產物0.480g。
殘糖分析發現 實施例2
淀粉lg，月桂醇(U724g，置于錐形瓶中；加入10ml丙酮，將加入上述混合物的錐形 瓶置于HZ-9613Y型油浴恒溫震蕩器中，恒溫50'C震蕩10分鐘；加入卜淀粉酶0.2000g; 轉速180r/min,恒溫50'C，反應0.5小時后減壓抽濾，濾餅用10ml氯仿洗搽2次，合并濾 液，然后向濾液中加入20 40mL氯仿，充分搖勻，轉移到分液漏斗中，靜置分層后分離出 下層提取液，上層用氯仿萃取，將下層提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶劑，真空干燥， 結晶得到烷基糖苷。得提純產物0.3808。殘糖分析發現體系中有15%未反應的葡萄糖。 實施例3
淀粉lg，月桂醇0.5585g，置于錐形瓶中；加入5ml丙酮和10ml水，將加入上述混合 物的錐形瓶置于HZ-9613Y型油浴恒溫震蕩器中，恒溫60'C震蕩10分鐘；加入a—淀粉酶 0.1004g，；轉速160r/min,恒溫60°C，反應4小時后減壓抽濾，濾餅用10ml氯仿洗滌2 次，合并濾液，然后向濾液中加入20 40mL氯仿，充分搖勻，轉移到分液漏斗中，靜置分 層后分離出下層提取液，上層用氯仿萃取，將下層提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶劑， 真空干燥，結晶得到垸基糖苷。得提純產物0.541g。殘糖分析發現體系中有6%未反應的葡 萄糖。 實施例4
淀粉lg，月桂醇0.9350g，置于錐形瓶中；加入20ml丙醇，將加入上述混合物的錐形
瓶置于HZ-%13Y型油浴恒溫震蕩器中，恒溫7(TC震蕩10分鐘；加入a—淀粉酶0.0800g，-， 轉速180r/min，恒溫70°C，反應1小時后減壓抽濾，濾餅用10ml氯仿洗滌2次，合并濾 液，然后向濾液中加入20 40mL氯仿，充分搖勻，轉移到分液漏斗中，靜置分層后分離出 下層提取液，上層用氯仿萃取，將下層提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶劑，真空干燥， 結晶得到烷基糖苷。得提純產物0.396g。殘糖分析發現體系中有12%未反應的葡萄糖。 實施例5
淀粉lg，月桂醇1.1214 g，置于錐形瓶中；加入25ml戊垸，將加入上述混合物的錐形 瓶置于HZ-9613Y型油浴恒溫震蕩器中，恒溫8(TC震蕩10分鐘；加入a—淀粉酶0.0200g，； 轉速150r/min，恒溫80°C，反應2小時后減壓抽濾，濾餅用10ml氯仿洗滌2次，合并濾 液，然后向濾液中加入20 40mL氯仿，充分搖勻，轉移到分液漏斗中，靜置分層后分離出 下層提取液，上層用氯仿萃取，將下層提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶劑，真空干燥， 結晶得到垸基糖苷。得提純產物0.454g。殘糖分析發現體系中有10%未反應的葡萄糖。 實施例6
淀粉lg，十八醇O. 5413g，置于錐形瓶中；加入20ml叔丁醇和10ml水，將加入上述 混合物的錐形瓶置于HZ-9613Y型油浴恒溫震蕩器中，恒溫6(TC震蕩10分鐘；加入ot—淀 粉酶0.1420g，； 轉速200r/min,恒溫60'C，反應8小時后減壓抽濾，濾餅用10ml氯仿洗 滌2次，合并濾液，然后向濾液中加入20 40mL氯仿，充分搖勻，轉移到分液漏斗中，靜 置分層后分離出下層提取液，上層用氯仿萃取，將下層提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶 劑，真空干燥，結晶得到垸基糖苷。得提純產物0.472g。殘糖分析發現體系中有8%未反應 的葡萄糖。 實施例6
淀粉lg，十六醇1.2121g，置于錐形瓶中；加入20ml石油醚和5ml水，將加入上述混 合物的錐形瓶置于HZ-9613Y型油浴恒溫震蕩器中，恒溫60。C震蕩10分鐘；加入a—淀粉 酶0.1007g，； 轉速180r/min，恒溫60°C ，反應6小時后減壓抽濾，濾餅用10ml氯仿洗滌 2次，合并濾液，然后向濾液中加入20 40mL氯仿，充分搖勻，轉移到分液漏斗中，靜置 分層后分離出下層提取液，上層用氯仿萃取，將下層提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶劑， 真空干燥，結晶得到垸基糖苷。得提純產物0.528g。殘糖分析發現體系中有6%未反應的葡 萄糖。
把實施例l一6得到的糖苷進行紅外分析，發現在U00 1250cm—工存在Yas C—O—C 的特征吸收峰。各特征吸收如下2960、 2925、 2870、 2850、 1460、 1380、 1200、 1170、 1130、 1070;表明得到的產物確實是烷基糖苷。
權利要求
1.一種淀粉酶催化合成烷基糖苷的方法，包括下列步驟1)淀粉和脂肪醇，按每克淀粉加入0.001～0.010mol脂肪醇的比例，置于錐形瓶中；2)按照每克淀粉5～25ml有機溶劑的比例加入有機溶劑或有機溶劑與水的混合溶劑；3)將加入上述混合物的錐形瓶置于油浴恒溫震蕩器中，恒溫40～80℃，震蕩10分鐘；加入淀粉酶，淀粉酶的用量是淀粉質量的0.01～0.2倍；4)轉速120～200r/min，恒溫40～80℃，反應0.5～24小時后，減壓抽濾，濾餅用10ml氯仿洗滌2次，合并濾液，然后向濾液中加入20～40mL氯仿，充分搖勻，轉移到分液漏斗中，靜置分層后分離出下層提取液，上層用氯仿萃取，將下層提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶劑，真空干燥，結晶得到烷基糖苷。
2. 如權利要求1所述的淀粉酶催化合成垸基糖苷的方法，其特征是，歩驟a)屮每克淀粉加 入0.001 0.010mol脂肪醇。
3. 如權利要求1所述的淀粉酶催化合成垸基糖苷的方法，其特征是，所述的有機溶劑為丙 酮、2—丁酮、乙醇、丙醇、異丙醇、叔丁醇、戊烷、己垸、庚垸、辛垸、石油醚、丙二醇、 和/或水中的一種或幾種。加入量為每克淀粉5 15ml溶劑。
4. 如權利要求1所述的淀粉酶催化合成烷基糖苷的方法，其特征是，歩驟b)中有機溶劑與 水的比例為0.5: 1 5: 1。
5. 如權利要求1所述的淀粉酶催化合成垸基糖苷的方法，其特征是，所述的脂肪醇為癸醇、月桂醇、十四醇、十六醇、或十八醇。
6. 如權利要求1所述的淀粉酶催化合成烷基糖苷的方法，其特征是，上述步驟c)和e)中， 反應溫度為50 7(TC。
7. 如權利要求1所述的淀粉酶催化合成垸基糖苷的方法，其特征是，上述步驟e)中的反應 時間為0.5 18小吋。
8. 如權利要求6所述的淀粉酶催化合成烷基糖苷的方法，其特征是，上述步驟e)中的反應 時間為1 8小時。
9. 如權利要求l所述的淀粉酶催化合成烷基糖苷的方法，其特征是，淀粉酶選自(x—淀粉酶 或(3—淀粉酶。
10. 如權利要求1所述的淀粉酶催化合成垸基糖苷的方法，其特征是，淀粉酶的用量是淀粉 質量的0.02 0.2倍。
全文摘要
本發明公開了一種淀粉酶催化合成烷基糖苷的方法淀粉和脂肪醇，在有機溶劑或有機溶劑與水的混合溶劑中，在淀粉酶催化下40～80℃，反應0.5～24小時后，減壓抽濾，真空干燥，結晶得到烷基糖苷。本發明的方法在常壓下進行反應，生產工藝簡單；反應溫度為40～80℃，反應溫度低；采用了低毒性的溶劑，可以用于食品和藥品，而且產品提純簡便，可以得到高純度的烷基糖苷。
文檔編號C12P19/00GK101168761SQ200710113908
公開日2008年4月30日 申請日期2007年10月17日 優先權日2007年10月17日
發明者吳建國, 青 班, 馬萬勇 申請人:山東輕工業學院