一種重組植物病毒的物理滅活方法

專利名稱：一種重組植物病毒的物理滅活方法
技術領域：
本發明涉及一種重組植物病毒的物理滅活方法。
背景技術：
目前，重組植物病毒的滅活方法很多，包括加熱法、巴斯德滅菌法、輻射法、光 化學法和紫外光照射法等，除了這些物理方法外，還有很多化學試劑作用的方法，這 些化學試劑包括碘、臭氧、表面活性劑、氮丙啶、甲醛、e-丙內酯和光敏復合物等， 但都存在適用范圍的局限性，例如有些化學試劑屬于致癌物質，對人體有害。紫外 線也具有一定滅活作用，它能導致病毒多核苷酸形成二聚體，從而抑制其復制。但經 紫外線照射的病毒具有在可見光照射下重新復性的可能。光化學滅活方法中，不同的 光敏劑具有不同的耙目標。如亞甲基藍(methylene Wue,MB)和苯胺藍(toluidineblue) 既可與病毒核酸作用，同時也可與病毒包膜上的脂質和蛋白質結合。所以這種方法可 能對重組病毒的外源小肽產生影響。而6()0^射線被認為可以滅活所有類型的病毒， 所以，植物病毒也不例外。但到目前為止，6GQ)y射線用于植物病毒的滅活還未有相 關報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種重組植物病毒的物理滅活方法，在對外源小肽不破壞 或破壞很小的前提下，解決潛在生物安全性隱患。
為達到上述目的，本發明采用如下技術方案
一種重組植物病毒的物理滅活方法，其特征在于采用6()C0y射線對重組植物病毒
進行輻照滅活。
上述的重組植物病毒配制成濃度不大于20pg4d的病毒溶液，所用的6()0)丫射線的 輻照劑量范圍為14kGy 30kGy，溫度為4±0. 5°C。 上所述的重組植物病毒為重組煙草花葉病毒。
上述的重組煙草花葉病毒是采用外源展示法，將外源蛋白插入到煙草花葉病毒外 殼蛋白CP的羧基末端，與CP形成融合蛋白，而形成的重組煙草花葉病毒。
上述的重組煙草花葉病毒是在CP蛋白第152 158位氨基酸之間，插入外源小肽。 上述的滅活方法，在高效滅活重組病毒粒子的前提下，對重組病毒外源多肽的后
續利用無影響。


圖l.不同劑量率，OY射線滅活后的TMVS1241稀釋成lpg/nl的濃度，分別接種抗 性煙草，三天后接種葉片的癥狀。枯斑消失說明病毒已滅活。
圖2.不同劑量率MCoY射線滅活后的TMVS1241與未滅活的TMVS1241接種抗性煙草 后，枯斑比例分析圖。枯斑比值越小，說明病毒粒子的相對侵染力越小，病毒滅活效 果越好。
圖3.不同劑量率，OY射線滅活的TMVS1241稀釋成l pg爾l的濃度分別接種敏感煙
草，接種兩周后煙草新葉的癥狀。花葉癥狀消失說明病毒己滅活。
圖4.不同劑量率⑨CoY射線滅活的TMVS1241接種敏感煙草三周后，對新葉總RNA進
行RT-PCR檢測，弓l物分別為Pst(-)和Acc2(+)。若檢測不到重組病毒基因組條帶，說
明病毒己滅活。
M:lKb DNA marker
lanel:正對照(以pTMV為模板)
lane 2:正對照(以pTMVS1241為模板)
lane3:負對照(以1120為模板)
lane 4:MOCK(健康煙草新葉)
lane 5:0kGy劑量輻照后TMVS1241
lane 6:4kGy劑量輻照后TMVS1241
lane 7:6kGy劑量輻照后TMVS1241
lane 8:8kGy劑量輻照后TMVS1241
lane 9:10kGy劑量輻照后TMVS1241
lane 10:12kGy劑量輻照后TMVS1241
lane 11:14kGy劑量輻照后TMVS1241
lane 12:16kGy劑量輻照后TMVS1241
lane 13:18kGy劑量輻照后TMVS1241
lane 14:20kGy劑量輻照后TMVS1241
lane 15:30kGy劑量輻照后TMVS1241
圖5.不同劑量率^CoY射線滅活的TMVS1241接種敏感煙草三周后，對新葉總蛋白進 行SDS-PAGE檢測。若檢測不到病毒CP特征性條帶，說明病毒已滅活。
M:MOCK (健康煙草) lane 1:野生型TMV lane 2:0kGy劑量輻照后TMVS1241 lane 3:4kGy劑量輻照后TMVS1241 lane 4:6kGy劑量輻照后TMVS1241 lane 5:8kGy劑量輻照后TMVS1241 lane 6:10kGy劑量輻照后TMVS1241 lane 7:12kGy劑量輻照后TMVS1241 lane 8:14kGy劑量輻照后TMVS1241 lane 9:16kGy劑量輻照后TMVS1241 lane 10:18kGy劑量輻照后TMVS1241 lane 11:20kGy劑量輻照后TMVS1241 lane 12:30kGy劑量輻照后TMVS1241 lane 13:TMVS1241
圖6.盲傳三代結果14、 16、 18、 20和30kGy五個劑量率滅活后的TMVS1241盲傳三 代后，敏感煙草癥狀圖。若無花葉癥狀，說明病毒已徹底滅活。 圖7.重組病毒粒子滅活后，外源小肽穩定性及抗原性分析。
A:滅活后的病毒粒子SDS-PAGE分析。融合CP未出現降解條帶，說明重組TMV 病毒表達的外源小肽的完整性未受影響。
B:滅活后的病毒粒子Western blot分析結果。融合CP未出現降解條帶，說明重組
TMV病毒表達的外源小肽抗原性未受影響。
lanel: TMV-S1241感染敏感煙草后，新葉總蛋白
lane 2:未經任何輻照處理的TMVS1241
lane 3: 14kGy劑量輻照后的TMVS1241
lane 4: 16kGy劑量輻照后的TMVS1241
lane 5: 18kGy劑量輻照后的TMVS1241
lane 6: 20kGy劑量輻照后的TMVS1241
lane 7: 30kGy劑量輻照后的TMVS1241
同現有技術相比，本發明方法具有如下顯而易見的優點①本發明方法滅活效果 明顯，滅活效率高。②本發明使用的滅活方法對目的蛋白破壞作用很小，在對融合蛋
白不破壞或破壞很小，不影響目的蛋白抗原活性的前提下，可高效滅活重組粒子。③ 對重組病毒外源小肽的后續利用無影響。④本發明方法具有快捷、有效、低成本的特 點。⑤本發明方法操作簡單，無后續殘留及污染，對人體及環境均無害。
具體實施例方式
本發明中所說的敏感煙草為野生型TMV可系統感染的煙草品種7WcoZ/a"" to6acww cv. Samsunnn。抗性煙草為野生型TMV接種后引起枯斑的煙草品種iV/co"a"a totocwwcv. SamsunNN。下面實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規條 件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例一
本實施例采用的外源蛋白S1241是一段長為12個氨基酸的小肽，來自于SARS 病毒S蛋白中一段預測可能的抗原決定簇，即1241至1252位的12個氨基酸。將其 插入到TMV CP蛋白的第152 153位氨基酸之間，之后加入一個終止密碼子TAG, 與CP形成融合蛋白，而形成重組煙草花葉病毒TMVS1241。插入的氨基酸序列及對其 進行編碼的核苷酸序列具體如下
氨基酸序列DDSEPVLKGVKL 核苷酸序列5,-GACGACTCTGAGCCTGTTCTAAAGGGTGTTAAATTA-3，。
一、 重組病毒TMVS1241粒子的制備
1. 重組病毒TMVS1241的構建按李巧麗等所述方法構建(TMV recombinants encoding fused foreign transmembrane domains to the CP subunit caused local necrotic response on susceptible tobacco, Qiaoli Li, Mangmang Li, Lubin Jiang, Qingqi Zhang, Rentao Song, Zhengkai Xu(2006)， Virology 348:253 - 259
2. 重組煙草花葉病毒TMVS1241粒子的提取
重組病毒TMVS1241感染煙草2—4周后，收取葉片后低溫研磨，低速離心去除 雜質，以PEG沉淀。沉淀溶解后再經低速離心，去除沉淀雜質，上清再以PEG重復 沉淀，即可獲得高純度的重組病毒粒子(參照D. NOORDAM(1973) Identification of plant virus.的方法)。
二、 ^CoY射線輻照處理TMVS1241病毒溶液
1.將提取的TMVS1241病毒溶液用水或病毒儲存液(lOmM磷酸緩沖液，pH 7.0)
稀釋為20 Ug/Ul;
2.用^CoY射線對上述TMVS1241病毒溶液進行輻照滅活實驗，劑量率為2.7kGy/hr， 溫度4'C。
(1) 6()0/射線分別設定不同的劑量點0、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20和 30kGy。
(2) 提取的病毒粒子TMVS1241濃度稀釋成20ng^1。準備三組，每組11管。與相 應劑量點一一對應。
(3) 重組病毒TMVS1241每個劑量點輻照滅活。 實施例二重組病毒TMVS1241安全檢測試驗
1.在抗性煙草上檢測重組病毒TMVS1241的浸染性
將上述不同劑量率MCoY射線滅活的TMVS1241稀釋成l pg/W的濃度，混以少 量金剛砂，采用機械磨擦法接種抗性煙草，觀察接種葉片出現枯斑癥狀的情況。實驗 結果顯示，當^CoY射線劑量率大于14kGy (包括14kGy)輻照的TMVS1241接種的 抗性煙草接種葉未出現枯斑，說明重組病毒不能夠感染煙草，已成功滅活，見圖l。
2. 通過枯斑法檢驗重組病毒TMVS1241滅活前后的相對侵染力
將滅活前后的病毒粒子稀釋至相同濃度lpg4U。同一張抗性煙草葉片，半張接種 未滅活病毒粒子，另半張接種滅活后病毒粒子。等接種葉片出現枯斑后，統計滅活前 后重組TMV引起的枯斑數比值，枯斑比值越小，說明病毒粒子的相對侵染力越小， 病毒滅活效果越好。實驗結果顯示，當^CoY射線劑量大于14kGy (包括14kGy)，枯 斑數比值為0，說明重組病毒TMVS1241已經成功滅活，見圖2及表1。
表l.不同劑量6()0) Y射線滅活的TMVS1241與未滅活的TMVS1241半葉法接種 抗性煙草后，枯斑比例數據分析表
不同劑量滅活后重1號2號3號4號5號6號枯斑比枯斑比
組TMV引起的枯斑植株植株植株植株植株植株例平均例標準
數/未滅活重組值差
TMV引起的枯斑數
4k/0k0.670.260.650.310.740.430.510.20
6k/0k0.360.400330.350.230.080.290.12
8k/0k0.270.310.200.140.250.200.230.06
10k/0k0.020.070.010.060.210.100.080.07
12k/0k0.010.020.020.010.030.030.020.01
14k/0k00000000
16k/0k00000000
18k/0k00000000
20k/0k00000000
30k/0k00000000
3. 在敏感煙草上檢測重組病毒TMVS1241的浸染性
將上述不同劑量^Coy射線滅活的TMVS1241稀釋成l pg"l的濃度，接種敏感煙 草。接種兩周后，觀察煙草新葉癥狀。實驗結果顯示，當^CoY射線劑量大于14kGy (包括14kGy)，滅活的TMVS1241接種的敏感煙草，兩周后未出現任何癥狀，說明重 組病毒已滅活，不能夠感染煙草，見圖3。 4.利用反轉錄PCR(RT-PCR)檢測重組病毒TMVS1241基因組。
滅活后TMVS1241接種敏感煙草兩到三周后，提取新生葉總RNA。以引物Pst(-): 5' ACGTCTGC AGACTGGGCCCCTACCGGGGGTAA3 '反轉錄。以反轉錄產物為模板， 以引物Pst(-)和弓I物Acc2(+): 5 ，TAGAGTAGACGACGCAACGGTGGCCATAA3'進行 PCR擴增，退火溫度55'C， 25個循環。產物應為517bp大小的片段。
實驗結果顯示，當6QCoY射線劑量點大于14kGy(包括14kGy)輻照的TMVS1241 接種的敏感煙草新葉未檢測到重組病毒基因組的存在，說明重組病毒未感染煙草，己 成功滅活，見圖4。
5. 利用SDS-PAGE方法，檢測重組病毒的融合CP蛋白。
滅活后TMVS1241接種敏感煙草兩到三周后，提取新生葉片總蛋白，進行變性蛋 白電泳(SDS-PAGE)，經考馬斯亮藍染色后檢測。實驗結果如圖5所示，當^CoY射線 劑量率大于14kGy (包括14kGy)滅活的TMVS1241接種的敏感煙草新葉，未檢測到 病毒CP蛋白的存在，說明重組病毒未感染煙草，已成功滅活。
6. 盲傳三代實驗
對第一代(劑量為14、 16、 18、 20和30kGy)滅活病毒接種后，未出現癥狀的敏 感煙草頂端新生葉，取出部分組織研磨成汁，汁液經105 — 106倍稀釋后用于感染第二 組健康煙草。兩周后，均未出現癥狀，與健康煙草無異。繼傳第三代，同樣未出現花 葉癥狀，見圖6。通過RT-PCR，未檢測到病毒基因組的存在；同時蛋白水平上 SDS-PAGE的檢測，也未發現重組病毒融合CP蛋白的存在。說明重組病毒已徹底滅活。
實施例三重組病毒SDS-PAGE及Western blot分析
滅活后TMVS1241的總蛋白進行SDS-PAGE電泳。結果如圖7A所示，6QCoy射 線滅活后，重組病毒的融合CP未出現降解條帶，說明重組TMV病毒表達的外源小 肽的穩定性與完整性未受影響，有利于外源多肽的后期利用。。
以抗外源小肽S1241的兔血清為一抗，堿性磷酸酯酶偶聯的羊抗兔IgG為二抗， 進行蛋白免疫雜交(Westernblot)。結果如圖7B所示，融合CP仍然可以雜交成功， 且未出現降解條帶，說明重組TMV病毒表達的外源小肽不但結構完整，同時仍具有 很好的抗原活性，這對用作疫苗生產之用的一些重組病毒來說尤為重要。
從安全檢測試驗結果可以得出，重組病毒TMVS1241在經過^CoY射線輻照時，輻 照劑量越大，滅活效率越高。濃度為20pg^1的TMVS1241在輻照劑量為14kGy時， 就已得到了高效滅活，不再具有侵染能力。盲傳結果進一步證明，在該輻照劑量照射 下，病毒已完全滅活。同時Westernblot雜交實驗結果也顯示，以外源小肽S1241特異 性抗體與經滅活處理的TMVS1241粒子進行免疫雜交后，外源小肽S1241不但結構完 整，而且仍具有抗原活性，所以滅活后的重組病毒TMVS1241不僅可以安全的應用于 外源小肽的生產，同時這使得利用外源小肽進一步制備的疫苗，在生物工程方面能得 到更為安全的應用。
這種方法可以廣泛應用到以植物病毒TMV為載體生產外源小肽，以及疫苗安全 性生產中，有效解決其潛在的生物安全性隱患。
序列表
<110>上海大學
<120>—種重組植物病毒的物理滅活方法 <160> 2 <210> 1
<211> 29 <212> DNA
<213>人工序列(artificial) <220>
<221 > misc一feature <223> 引物 <400> 1
TAGAGTAGAC GACGCAACGG TGGCCATAA 29
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213>人工序列(artificial) <220>
<221> misc一feature <223> 引物
<400> 2
ACGTCTGCAG ACTGGGCCCC TACCGGGGGT AA 3權利要求
1.一種重組植物病毒的物理滅活方法，其特征在于采用60Coγ射線對重組植物病毒進行輻照滅活。
2. 根據權利要求1所述的一種重組植物病毒的物理滅活方法，其特征在于所述的重組植物病毒配制成濃度不大于20嗎4U的病毒溶液，所用的6QCoy射線的輻照劑量 范圍為14kGy 30kGy，溫度為4±0. 5°C。
3. 根據權利要求1或2所述的一種重組植物病毒的物理滅活方法，其特征在于所述 的重組植物病毒為重組煙草花葉病毒。
4. 根據權利要求3所述的一種重組植物病毒的物理滅活方法，其特征在于所述的重組煙草花葉病毒是采用外源展示法，將外源蛋白插入到煙草花葉病毒外殼蛋白 CP的羧基末端，與CP形成融合蛋白，而形成的重組煙草花葉病毒。
5. 根據權利要求4所述的一種重組植物病毒的物理滅活方法，其特征在于所述的重 組煙草花葉病毒是在CP蛋白第152 158位氨基酸之間，插入外源小肽。
6. 根據權利要求1所述的滅活方法，在高效滅活重組病毒粒子的前提下，對重組病 毒外源多肽的后續利用無影響。
全文摘要
本發明涉及一種重組植物病毒的高效物理滅活方法。本發明采用⁶⁰Coγ射線輻照處理重組病毒粒子。本發明的方法操作簡單，經濟快捷，重復性好，滅活病毒的范圍廣，在高效滅活重組病毒粒子的前提下，對重組病毒外源多肽的后續利用無影響。
文檔編號C12N13/00GK101104846SQ20071010931
公開日2008年1月16日 申請日期2007年5月24日 優先權日2006年5月26日
發明者宋任濤, 慈云青, 朱廣文, 平 李, 許政暟 申請人:上海大學