透明質酸合酶基因及其應用的制作方法

專利名稱：：透明質酸合酶基因及其應用的制作方法透明質酸合酶基因及其應用本申請是申請日為1998.10.30，申請號為98812773.3，發明名稱為"透明質酸合酶基因及其應用"的中國專利申請的分案申請。本發明的領域本發明涉及具有編碼酶學活性的類馬鏈球菌(5Vre;^ocooccw^"/s^他)透明質酸合酶(seHAS)的編碼區區段的核酸區段，以及該核酸區段在制備產生透明質酸合酶和其透明質酸產物的重組細胞中的應用。透明質酸(hyaluronate)也稱為透明質酸(hyaluronicacid)或者透明質酸(hyaluronan)。相關技術的簡要描述鏈球菌感染是一個世界范圍的重要的健康和經濟問題，尤其是在發展中國家。其中一個原因是由于鏈球屬細菌能夠不被人體的吞噬細胞，如巨噬細胞和多形核細胞(PMNs)所察覺而生長。這些細胞負責識別并吞噬外源微生物。該細菌逃避監控的一種有效方法是利用多糖莢膜，如透明質酸(HA)莢膜將自己包被起來。HA的結構在原核生物和真核生物中是一樣的。由于HA通常是非免疫原性的，被包裹的細菌不會引起免疫應答，所以不會招致破環。而且，這種莢膜在體外對PMN發揮出抗吞噬作用并防止鏈球菌粘附到巨噬細胞上。正因為如此，鏈球菌屬的A組和C組中，HA莢膜在天然和實驗感染中都是主要的毒素因子。A組鏈球菌屬導致多種人類疾病，包括咽炎、膿皰病、深部組織感染、風濕熱、中毒性休克類綜合癥。C組鏈球菌屬類馬鏈球菌導致骨髓炎、咽炎、腦膿腫、和肺炎。在結構上，HA是一種由N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡萄糖醛酸(GlcA)組成的二糖重復單位分高分子量的線性多糖。HA分子中重復二糖的數量可以超過30000，Mr大于107。HA是唯一在哺乳動物和細菌細胞特別是A組和C組鏈球菌屬和A型出血敗血性巴斯德氏菌氏菌(尸aWwe〃aww/todda)中都可以合成的多糖。這些菌株以HA莢膜形式和分泌到培養基中的形式產生HA。這些細菌合成HA的機制具有廣泛的醫學意義，因為HA莢膜的產生是鏈球菌屬用于逃避免疫系統監控的一種非常有效和聰明的方法。哺乳動物和細菌細胞是通過定位在質膜上的透明質酸合酶合成HA。據信，在這些生物中HA的合成是多步驟的過程。起始涉及一個起始前體，UDP-GlcNAc或UDP-GlcA的結合。隨后的延伸涉及交替地在生長的寡糖鏈上添加兩種糖。生長的聚合物擠出細胞的質膜區并進入細胞外空間。雖然HA的生物合成系統是第一個被研究的膜雜多糖合成途徑，但是HA的合成仍然未能被非常清楚地了解。這可能是因為發展至今的體外系統仍然不足以完成HA的從頭生物合成。HA聚合物生長的方向在本領域的技術人員中仍有不同的爭議。單糖可以添加在生長的HA鏈的還原端或者非還原端。而且，其他問題集中在(i)新生鏈是否與一個蛋白、UDP或者脂類中間體共價相連，(ii)糖鏈是否需要一個引物起始，和(iii)成熟聚合物擠出鏈球菌的質膜的機制。了解HA合成的這些機制可以有利于發展出其他的策略，以通過干擾該過程來控制鏈球菌屬和巴斯德氏菌屬的感染。HA在脊椎動物的各種組織中都存在，并已經廣泛用于各種臨床應用，特別適于用作關節內基質的填充物和用于眼外科。科學文獻表明原有的認識己經發生了轉變，原來認為HA只是主要存在于少數結締組織中的被動結構成分以及存在于某些細菌菌株的莢膜中，現在認識到這種廣泛存在的大分子與許多生物過程密切相關從胚胎發生中細胞遷移和分化的調節到細胞外基質組織和代謝的調控，從而在轉移、創傷愈合和炎癥的復雜過程中發揮重要的作用。而且，已經清楚的是HA具有高度代謝活性并且細胞高度關注其合成和催化過程。例如，HA在組織中的半衰期范圍從軟骨中的1至3周到表皮中的不到1天。現已清楚的是一種單一的蛋白利用兩種糖底物來合成HA。HA合酶，簡寫為HAS,已經廣泛地用于此類酶的表述。Markovitz等成功地從化膿鏈球菌中鑒定出HAS活性并發現了該酶在膜上的位置以及它對糖核苷酸前體和Mg^的依賴。Prehm發現B6細胞產生的延長的HA，被加入在培養基中的透明質酸酶消化，從而推測在質膜上存在HAS。Philipson和Schwartz也發現在鼠的少突膠質細胞瘤細胞中HAS活性與質膜標記具有相同的分布。隨著粘多糖合成過程的進行，HAS組裝高Mr的HA，HA同時擠出膜進入細胞外空間(或者在細菌中產生細胞衣)。這種生物合成模式在各種大分子中是唯一的，而核酸、蛋白、和脂類是在核、內質網/高爾基體、細胞質、或線粒體中合成。生長鏈向細胞外空間的擠出可有利于聚合物不受束縛地生長，從而完成HA格外碩大的分子，而在高爾基體或高爾基前體中的合成是受限制的，形成的聚合物的總量或長度都有限。在內腔中高濃度的HA還會產生高粘度的環境而對其他的細胞器可能會造成損害。多項研究曾試圖從能夠產生HA莢膜的鏈球菌屬的菌株中以及從真核細胞中溶解、鑒定、和純化HAS。雖然鏈球菌和鼠的少突膠質細胞瘤中的酶被成功地用去污劑溶解并進行了研究，但是試圖純化活性的HAS以進行進一步研究的努力幾十年來卻沒有成功。Prehm和Mausolf利用高碘酸鹽氧化的UDP-GlcA或UDP-GlcNAc來親和標記鏈球菌屬成員中的一個約52kDa的蛋白以進行HAS的共同純化。結果報告宣稱C組鏈球菌的HAS得到了克隆，不幸的是這是錯誤的。該研究無法表明活性合酶的表達，實際上可能克隆的是一個肽轉運蛋白。Triscott和vandeRijn利用洋地黃皂苷以活性形式溶解鏈球菌屬成員中的HAS。VandeRijn和Drake選擇性放射標記了三個42、33、和27kDa的帶有5-疊氮鈉-UDP-GlcA的鏈球菌屬成員蛋白，并推測其中的33kDa蛋白是HAS。然而后來表明，HAS實際上是42kDa的蛋白。盡管有這些努力，對于HA合成的調控和機制的了解基本上還是停滯的，因為沒有HASmRNA或HAS蛋白的分子探針。主要的突破發生在1993年，DeAngelis等報道了對編碼蛋白HasA的A組鏈球菌基因的克隆和鑒定。該基因被認為某種程度上是細菌HA合成所需的一個操縱子，盡管該蛋白，現在被記作spHAS(化膿鏈球菌HAS),的功能當時并不清楚。SpHAS后來被證明負責HA的延伸，它是第一個被鑒定的粘多糖合酶，被克隆并后來被成功地表達。化膿鏈球菌HA合成操縱子編碼兩個其他蛋白。HasB是一個UDP-葡萄糖脫氫酶，用于轉化UDP-葡萄糖，形成HA合成的底物之一的UDP-GlcA。HasC是一個UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，用于轉化葡萄糖-l-磷酸和UTP形成UDP-葡萄糖。和Affi^基因的共轉染到無莢膜的鏈球菌屬菌株或者糞腸球菌可使它們具有合成HA并形成莢膜的能力。這提供了第一個強有力的證據表明HasA是一個HA合酶。難以捕捉的HA合酶基因最終通過轉座子誘變的方法被克隆，該方法中產生出無莢膜的A組菌株的突變體，其含有將HA合成操縱子打斷的轉座子。該轉座子的已知序列可以使得相鄰的鏈球菌DNA區域得到鑒定并隨后從野生型細胞中被克隆。編碼的spHAS與酵母殼多糖合酶家族具有5-10%的相同性，與非洲爪蟾屬Xenopuslaevis的，功能當時尚不知道的蛋白DG42(其在原腸形成期發育性表達)具有30%的相同性。DeAngelis和Weigel在大腸桿菌中表達了活性重組spHAS并使得該單一的純化基因產物在體外與UDP-GlcA和UDP-GlcNAc—起溫育，合成了高M,HA，因此表明對于HA合成所需的兩種糖基轉移酶活性都由同一個蛋白所催化，這是在1959年被首次提出的。這為后來的研究提供了基礎，1996年真核HAScDNA幾乎同時在4個實驗室中被鑒定，揭示HAS是一個多基因家族，編碼不同的同工酶。兩個基因(HAS1和HAS2)很快在哺乳動物(29-34)中發現，并且第三個基因HAS3后來也被發現。第二個鏈球菌seHAS或稱類馬鏈球菌透明質酸合酶也被找到，并在本文中予以公開并要求權利。正如所指出的，我們還鑒定了來自C組類馬鏈球菌的真HAS基因(seHAS);seHAS蛋白與spHAS酶具有高度的相同性(大約70%)。然而，這種相同性令人感興趣，因為seHAS基因并不與spHAS基因交叉雜交。從表達重組seHAS的大腸桿菌制備的膜在提供兩種底物的情況下可以合成HA。這一結果證實了早先Lansing等報道的已經克隆了C組HAS的宣稱是錯誤的。不幸的是，幾項研究中使用了這一未鑒定的52kDa的鏈球菌蛋白的抗體，用于探查所認為的真核HAS。Itano和Kimata在突變的不能合成HA的鼠乳腺癌細胞系中利用表達克隆，克隆了第一個推測的哺乳動物的HAScDNA(mmHASl)。HA合成缺陷的亞克隆被分為獨立的三類，在體細胞融合實驗中與HA合成相互補，結果提示至少有三種蛋白是所需的。三類中的兩類保持了一些HA活性，而另一類沒表現出活性。將后者細胞系與從平行細胞制備的cDNA—起用于瞬時轉染實驗，鑒定出單一的恢復了HA合成活性的蛋白。序列分析揭示約65kDa的蛋白的初級結構具有預期的與spHAS相似的膜拓撲學結構。mmHASl與spHAS具有30%的相同性，與DG42具有55%的相同性。該報道出版的同一個月，另外三個小組所提供的論文描述了編碼起先被認為是相同的鼠和人的酶的cDNA。但是，在各種特定的條件下，這四個實驗室分別發現出的是在兩個種中不同的同工酶。利用與Itano和Kimata相似的功能克隆方法，Shyjan等鑒定了人HAS1的同源物。利用腸系膜淋巴結cDNA文庫轉染鼠粘膜T淋巴細胞，然后在紅細胞玫瑰花結試驗中篩選其粘附能力。一個轉染子的粘附力被CD44的抗血清，一種已知的表面HA結合蛋白，所抑制，并可通過透明質酸酶進行的預實驗所直接消除。因此，該轉染子的紅細胞玫瑰花結需要HA的合成。對相應的cDNA的克隆和測序鑒定出hsHASl。Itano和Kimata還報道了從胎兒文庫中分離出人HAS1cDNA。但是，這兩個小組報道的hsHASlcDNA在長度上有差異；它們分別編碼578和543個氨基酸的蛋白。HAS的活性只在較長的結構中有所表現。根據對于spHAS作為可靠的HA合酶的鑒定以及DG42，spHAS和NodC(根瘤菌中一種3-GlcNAc轉移酶生瘤因子)之間相近的相同性，Spicer等利用簡并性RT-PCR方法克隆了鼠胚胎的編碼第二種不同的酶cDNA，記作mmHAS2。通過顆粒排除試驗，將mmHAS2cDNA轉染進入COS細胞，介導了HA細胞衣的從頭生產，因而提供了強有力的證據證明HAS2蛋白可以合成HA。利用相似的方法，Watanabe和Yamaguchi篩選人胎兒腦cDNA文庫鑒定了hsHAS2。Fulop等獨立地利用類似的策略也在從具有合成HA活性的卵丘細胞分離的RNA中鑒定了mmHAS2，合成HA是排卵期前卵泡中卵丘擴展的一個重要的過程。在排卵周期開始后，在HA合成開始之前，以及隨后HA剛剛開始(3小吋)，或者已經出現時(4小時)立即從小鼠分離卵丘細胞-卵母細胞復合體。RT-PCR表明HAS2mRNA在開始時沒有而在3-4小時后以高水平表達，這提示HAS2的轉錄在該過程中調控HA的合成。兩種hsHAS2都是552個氨基酸長并具有98%的相同性。mmHASl為583個氨基酸并與578個氨基酸的hsHASl具有95%的相同性。最近Spicer等利用PCR方法鑒定了哺乳動物中的第三個HAS基因。該mmHAS3蛋白長度為554個氨基酸并且與mmHASl，mmHAS2，DG42和spHAS分別具有71、56、禾n28%的相同性。Spicer等還將這三種人和鼠的基因分別定位在三條不同的染色體上(HAS在hsChrl9/醒Chrl7;HAS2在hsChr8/mmChrl5;HAS3在hsChrl6/mmChr8)。這三種基因在三條不同的染色體上的定位以及HA在整個脊椎動物綱中都存在的事實提示該基因是古老的且同工酶在脊椎動物進化的早期就已經復制出現。細菌和真核的HAS間的高度相同性(~30%)還提示它們兩者具有相同的祖先基因。可能原始細菌在真核基因產物變得更大和更復雜之前就從早期的脊椎動物祖先獲取了HAS基因。或者，細菌曾經獲取了較大的脊椎動物HAS基因而刪除了不是酶活性所必需的調控序列。Dawid和其同事對X.laevisDG42的發現在近來的發展中具有重要的地位，盡管該蛋白當時并不被認為是一個HA合酶。但是，DG42和spHAS具有30%的相同性，這對于設計寡核苷酸用于鑒定哺乳動物HAS2是極為重要的。具有諷刺意味地，DG42是一個真正的HA合酶的確切證據只是在哺乳動物同工酶被發現之后才被報道，DeAngelis和Achyuthan在酵母中(不能合成HA的生物)表達了重組蛋白并顯示分離的膜在提供了兩種底物時，它可以合成HA。Meyer和Kreil也表示DG42的cDNA轉染的細胞的溶解液可以合成更高水平的HA。如今功能已經知道，因而DG42可以記作X1HAS。所有的HAS蛋白都擁有相同的預期結構特征，包括一個較大的中心結構域和在蛋白的氨基端和羧基端都有的2-3個跨膜或膜相關的結構域簇。中心結構域占多達~88%的預期的細胞內HAS蛋白序列，它可能含有酶的催化區域。預期的中心結構域在spHAS中為264個氨基酸(占總蛋白的63%)，在真核HAS成員中為307-328個殘基(占總蛋白的54-56%)。所有的HAS的膜結構域的確切數目和方向以及細胞外和細胞內環的拓撲結構都還沒有在實驗上確定。spHAS是HAS家族中已經被純化和部分鑒定的一個成員。利用spHAS/堿性磷酸酶融合蛋白的初步研究表明spHAS的N末端，C末端和大的中心結構域實際上都在細胞內。spHAS有6個半胱氨酸，而HAS1,HAS2，和HAS3分別有13，14和14個Cys殘基。spHAS的6個Cys中的兩個是保守的并且與HAS1和HAS2中的相同。只有一個保守的Cys殘基在所有的HAS家族成員中存在于同一位點(spHAS的Cys225)。這可能是一個重要的Cys，它被巰基藥物修飾可能會抑制酶的活性。HAS家族中任何成員的可能存在的二硫鍵以及對于下文所提及的多種HAS的功能來說非常重要的Cys殘基還未被闡明。除了所推定的在質膜上獨特的合成方式，HAS酶家族在HA整體聚合所需的許多功能方面都具有不尋常之處。在HAS中存在至少6種獨立的活性對兩種不同的糖核苷酸前體(UDP-GlcNAc和UDP-GlcA)的每一種的結合位點，兩種不同的糖基轉移酶的活性，一個或多個將生長的HA聚合物與酶錨定的結合位點(可能涉及到B-X7-B基序)，以及將生長的聚合物每次向前移動一個糖的棘齒類的轉移反應。后一活性可能與聚合物穿膜的步進過程相配合。所有這些功能以及其他可能還不了解的功能都由一個大小為419個(spHAS)到588個(xHAS)氨基酸范圍內的相對較小的蛋白所提供。雖然各種已有的證據都支持spHAS蛋白是細菌或體外HA生物合成所需蛋白的結論，但是，較大的真核HAS家族成員可能是多成分的復合物。由于真核HAS比spHAS大~40%，它們多出的結構域可能與更為精巧的功能如細胞內的轉運和定位、酶學活性的調控、和與其他細胞組分的介導反應相關。對編碼不同合酶的多種脊椎動物HAS基因的意外發現明顯說明，HA是一個重要的細胞行為的調節因子而不僅是組織中的一個結構成分。因此，在不到6個月內，對HA的合成和生物學研究的領域從一個己知的克隆HAS(spHAS)發展到對一個多基因家族的識別，其預示著對HA的合成和生物學的快速大量的令人激動的研究進展。例如，本文下面公開了兩種HAS基因的序列來自出血敗血性巴斯德氏菌和Parameciumbursariachlorella病毒(PBCV-1)。這兩個系統中透明質酸合酶的存在，以及對這兩種不同系統的透明質酸合酶的純化和應用提示我們能夠從多種不同的原核和病毒來源中純化和分離編碼酶學活性的透明質酸合酶的核酸序列。C組類馬鏈球菌菌株D181能夠合成并分泌透明質酸(HA)。研究人員曾經利用該菌株和A組化膿鏈球菌菌株，諸如S43和Alll，來研究HA的生物合成并鑒定HA的合成活性對二價陽離子的需要、前體(UDP-GlcNAc和UDP-GlcA)的利用和優化的pH。傳統上，HA商業上從雞冠或鏈球菌培養物的細胞外培養基中制備。曾有一種改進的利用產生HA的鏈球菌制備HA的方法。美國專利4,517,295描述了這種方法，將產生HA的鏈球菌在富含C02的生長培養基中厭氧條件發酵。在此條件下HA產生并可從培養基中抽提出來。一般認為從雞冠中分離HA的方法是辛苦和困難的，因為是從低純度的HA狀態開始。從雞冠中分離HA的優點在于產生的HA是較高分子量的。但是，通過細菌發酵進行HA的制備較為容易，因為制備是從較高純度的HA狀態開始。然而通常以這種方法產生的HA的分子量小于來自雞冠的。因此，能夠使得細菌發酵產生高分子量HA的技術將是對現有方法的一大改進。高分子量HA具有廣泛的應用一從化妝品到眼外科的各種領域。根據它在高粘度和高度生物相容性上的潛力，HA在眼外科中具有特別的應用，可用以作為玻璃體的替代物。HA還可以通過關節內注射被用于治療賽馬的創傷性關節炎，還可用作剃須泡沫的潤滑劑，并根據其生理化學特性中的高粘度和可以長時間保濕的能力，將其用于各種化妝品。實際上，1997年8月食品藥物局批準了通過直接在受治的關節處注射高分子量HA來對嚴重的關節炎進行治療。通常，所使用的HA的分子量越高越好。這是因為HA溶液的粘度隨著溶液中各種HA聚合物分子的平均分子量的增大而增大。不幸地是，非常高分子量的HA，如達到107，很難通過現有的分離方法獲得。為了解決這些以及其他問題，有必要找到新的方法和構建體，從而在HA的生產上具有一種或多種改進特性，諸如更高的純度或者簡便的制備。尤其是有必要發展出新的方法，以生產大量的、比現有的商業產品分子量相對高并相對純的HA。另外還需要開發生產具有修飾的大小分布的HA(HAAsize)以及具有修飾的結構的HA(HAAm。d)的方法學。本發明解決了現有技術中的一種或幾種缺陷。本文公開了利用重組DNA技術得到的純化的具有編碼酶學活性seHAS編碼區的核酸區段，以及用于生產酶學活性的HA合酶的方法，和利用該核酸區段制備能產生HAS和它的透明質酸產物的重組細胞的方法。因此，本發明的一個目的在于提供一種具有編碼酶學活性HAS的編碼區的純化的核酸區段。本發明另一個目的在于提供一種包含具有編碼酶學活性HAS的編碼區的純化的核酸區段的重組載體。本發明再一個目的在于提供一種用包含具有編碼酶學活性HAS的編碼區的純化的核酸區段的重組載體轉化的重組宿主細胞。本發明的又一個目的在于提供一種檢測表達HAS的細菌細胞的方法。本發明的另一個目的在于提供一種用于由透明質酸合酶基因諸如seHAS產生高和/或低分子量透明質酸的方法，以及產生具有修飾的大小分布和/或修飾的結構的HA的方法。本發明的這些和其他目的通過說明書、權利要求書和附圖的描述而更加明了。本發明概述本發明涉及應用重組DNA技術解決透明質酸(HA)制備中的一個或幾個問題。這些問題通過分離或利用具有編碼酶學活性類馬鏈球菌透明質酸合酶(seHAS)基因的編碼區的核酸區段而得到解決。seHAS基因是負責HA鏈生物合成的基因，它從適當的微生物來源的DNA克隆得到并被操作進入有用的重組構建體中用于制備HA和用于制備大量的HAS酶本身。本發明包含一個新基因，seHAS。通過提供逃避吞噬作用和免疫監控的手段，這個基因的表達與鏈球菌A組和C組菌株的毒性相關。術語"透明質酸合酶(hyaluronatesynthase)"、"透明質酸合酶(hyaluronicacidsynthase)"、"透明質酸合酶(hyaluronansynthase)"、"HA合酶"可互換地用于描述能夠聚合粘多糖多糖鏈的酶，該粘多糖多糖鏈交替地由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺組成，通過e1,3鍵和ei,4鍵相連。術語"seHAS"描述了來自類馬鏈球菌的HAS酶。本發明涉及對透明質酸合酶基因、cDNA和基因產物(HAS)的分離與鑒定，其可以用于葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺的聚合反應而形成粘多糖透明質酸。本發明確定了seHAS的基因座并公開了編碼類馬鏈球菌的酶學活性的seHAS基因的核酸序列。該HAS基因還可提供新的探針，用以檢定細菌樣本是否具有產生透明質酸的能力。通過應用本文的技術和知識，本領域的熟練技術人員將能夠獲得編碼seHAS基因的核酸區段。本領域的熟練技術人員應能認識到的是，根據本發明，這些優點能夠在控制seHAS基因的表達和控制所產生的seHAS基因產物，seHAS酶，的特性上提供有效的應用。因此，本發明涉及分離具有編碼酶學活性的HAS的編碼區的純化的核酸區段，不論該片段是原核還是真核來源的。這是因為該酶，實際上就是該基因在原核與真核中都存在。真核生物也己經知道能夠產生HA，因而也具有HA合酶基因，可以與本發明相結合應用。本發明的HA合酶的編碼核酸區段是指不含有總染色體或基因組DNA的分離的核酸，因而可以容易地通過重組DNA技術進行操作。因此本文所用的短語"純化的核酸區段"是指，不含有無關的染色體或基因組DNA的DNA區段，并保持在可以用于重組技術操作的狀態下，諸如單獨的分離的DNA區段或含有該片段的載體(例如，質粒、噬菌體或病毒)的形式。本發明的一個優選的實施方案是具有編碼酶學活性的HAS的編碼區的純化的核酸區段。尤其是，該純化的核酸區段編碼SEQIDN0:2的seHAS或者是含有SEQIDNO:l所述的核苷酸序列的純化的核酸區段。本發明的另一個實施方案包含具有編碼酶學活性的HAS的編碼區的純化的核酸區段，且該純化的核酸區段能夠與SEQIDNO:l的核苷酸雜交。本發明還包括天然的或重組的載體，包括質粒、粘粒、噬菌體或病毒載體。該重組載體也可含有具有編碼酶學活性的HAS的編碼區的純化的核酸區段。尤其是，該純化的核酸區段編碼SEQIDN0:2的seHAS或者該純化的核酸區段含有SEQIDNO:l所述的核苷酸序列。如果重組載體是一個質粒，它還進一步包括表達載體。該表達載體還可包括與酶學活性HAS編碼區有效相連的啟動子。在另一個實施方案中，本發明包括一種重組宿主細胞，如轉化有重組載體的原核細胞。該重組載體含有具有編碼酶學活性的HAS的編碼區的純化的核酸區段。尤其是，該純化的核酸區段編碼SEQIDNO:2的seHAS或者該純化的核酸區段含有SEQIDNO:l所述的核苷酸序列。本發明還包括重組宿主細胞，如轉染有重組載體的真核細胞，該重組載體含有具有編碼酶學活性的HAS的編碼區的純化的核酸區段。尤其是，該純化的核酸區段編碼SEQIDNO:2的seHAS或者該純化的核酸區段含有SEQIDNO:l所述的核苷酸序列。該概念是產生編碼酶學活性的HAS的特異修飾的seHAS基因，它能夠產生具有修飾的結構或修飾的大小分布的透明質酸聚合物。本發明進一步包括通過電穿孔導入重組載體的重組宿主細胞。該重組載體可包括具有編碼酶學活性的HAS的編碼區的純化的核酸區段。尤其是，該純化的核酸區段編碼SEQIDNO:2的seHAS或者該純化的核酸區段含有SEQIDNO:l所述的核苷酸序列。該酶學活性的HAS還能夠產生具有修飾的結構或修飾的大小分布的透明質酸聚合物。在另一個實施方案中，本發明包括轉導有重組載體的重組宿主細胞，該重組載體包括具有編碼酶學活性的HAS的編碼區的純化的核酸區段。尤其是，該純化的核酸區段編碼SEQIDNO:2的seHAS或者該純化的核酸區段含有SEQIDNO:l所述的核苷酸序列。該酶學活性的HAS還能夠產生具有修飾的結構或修飾的大小分布的透明質酸聚合物。本發明還包括純化的組合物，其中該純化的組合物含有一個具有編碼酶學活性的HAS的編碼區以及進而具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽。在另一個實施方案中，本發明包括一種檢測DNA樣品的方法，包括的步驟有(l)獲取DNA樣品；(2)將該DNA樣品與SEQIDNO:l的純化的核酸區段相接觸；(3)將該DNA樣品與該純化的核酸區段雜交從而形成雜交復合物；以及(4)檢測該復合物。本發明還包括一種檢測表達編碼seHAS的mRNA的細菌細胞的方法，包括的步驟有(1)獲取細菌細胞樣品；(2)將該細菌細胞樣品中的至少一種核酸與SEQIDNO:l的純化的核酸區段相接觸；(3)將該至少一種核酸與該純化的核酸區段雜交，從而形成雜交復合物；以及(4)檢測該復合物，雜交復合物的存在則表明細菌菌株表達編碼seHAS的mRNA。本發明還包括檢測細胞中seHAS或者spHAS的存在的方法。尤其是，該方法包括利用SEQIDNO:3-8所述的寡核苷酸作為探針。這些寡核苷酸可使研究人員搜索和檢測細胞中seHAS或spHAS的存在。本發明進而還包括生產透明質酸的方法，包括的步驟有(1)將具有編碼酶學活性的HAS的編碼區的純化的核酸引入一個宿主生物中，其中該宿主生物含有編碼能夠產生UDP-GlcNAc和UDP-GlcA的酶的核酸區段；(2)在培養基中培養此宿主生物以分泌透明質酸；并(3)回收分泌的透明質酸。此方法還包括從培養基中抽提分泌的透明質酸的步驟，以及純化抽提的透明質酸的步驟。而且，該宿主生物可以分泌結構上修飾的透明質酸或者大小上修飾的透明質酸。本發明還包括一種藥物組合物，其包括一種預選的藥物和有效量的由重組HAS產生的透明質酸。該藥物組合物中的透明質酸的分子量被修飾從而產生的經修飾的分子量的藥物組合物能夠提高免疫應答。經修飾的分子量也可以產生一種藥物組合物，其能夠耙向具有對該經修飾的分子量的藥物組合物有親和力的患者體內特異的組織或細胞類型。本發明還包括純化的和分離的編碼酶學活性seHAS的核酸序列，該核酸序列是(a)SEQIDNO:l的核酸序列；(b)與SEQIDN0:1的核酸序列互補的核酸序列；(c)能夠與SEQIDNO:l的核酸雜交的核酸序列；和(d)能夠與SEQIDN0:1的互補核酸序列雜交的核酸序列。本發明進而還包括基本上由編碼酶學活性HAS的核酸區段組成的純化的和分離的核酸區段。本發明還包括基本上由編碼seHAS的核酸區段組成的分離的核酸區段，其具有充分復制于SEQIDN0:1的核酸區段的核酸區段從而擁有編碼酶學活性的HAS的生物學特性。該核酸區段也可以是cDNA序列。本發明還包括具有編碼酶學活性的HAS的編碼區的純化的核酸區段，其中純化的核酸區段能夠與SEQIDN0:1的核苷酸序列雜交。附圖的簡要描述圖1描述的是seHAS和spHAS基因之間不發生交叉雜交。圖2圖示了seHAS與細菌和真核HAS蛋白的相關性。圖3圖示了已知的一些透明質酸合酶之間的進化關系。圖4描述了經各種工程鏈球菌HAS酶所產生的HA的大小分布。圖5圖示了大腸桿菌中重組seHAS和spHAS的過表達。圖6描述了鏈球菌HA合酶的純化。圖7描述了在酵母膜中表達的重組鏈球菌HAS合成的HA的凝膠過濾分析。圖8是利用特異抗體進行的重組seHAS的Western印跡分析。圖9是重組seHAS和spHAS產生的HA大小分布的動力學分析。圖10圖示了seHAS和預計的膜相關區域的親水性圖。圖11是seHAS在膜中拓撲學組織的模型。圖12表示重組seHAS合成了真HA。圖13描述了利用特異的寡核苷酸和PCR對編碼seHAS、編碼spHAS、或編碼seHAS和spHAS的核酸序列的識別。圖14描述了特異PCR雜交所用的寡核苷酸。本發明的詳細描述在詳細解釋本發明的任何一個實施方案之前，應當了解的是，本發明的應用并不局限于下文和圖表詳細描述的細節和內容上的安排。本發明可以有其他的實施方案或者以其他的方式進行操作。而且，應當了解的是，本文所用的措辭和術語目的在于描述而不應被視作限制。本發明中所用的術語"核酸區段"和"DNA區段"可以相互替換，是指被分離的、不含某種生物總基因組DNA的DNA分子。因而本文所用的"純化的"DNA或核酸區段是指含有透明質酸合酶("HAS")編碼序列的DNA區段，它被分離或者說純化而不含有無關的基因組DNA，例如，類馬鏈球菌或者例如哺乳動物宿主的總的基因組DNA。包括在術語"DNA區段"之中的有DNA區段和該區段中的較小的片段，以及重組載體，包括，例如質粒、粘粒、噬菌體、病毒等等。類似地，含有分離的或純化的seHAS基因的DNA區段是指，與其他天然存在的基因或蛋白編碼序列基本上分離的包含有HAS編碼序列的DNA區段。在這一點上，使用的術語"基因"出于簡單化的考慮是指功能性蛋白、多肽或肽的編碼單位。正如本領域熟練技術人員所能理解的，此功能性術語包括基因組序列，cDNA序列或兩者的結合。"與其他編碼序列基本上分離的"是指所感興趣的基因，如seHAS，形成該DNA區段的編碼區的主要部分，而且該DNA區段不含有大部分的天然存在的編碼DNA，諸如大的染色體片段或其他功能性基因或DNA編碼區。當然，這是指最初分離的DNA區段，并不排除后來加入的或人為有意在該區段中放入的基因和編碼區。根據使用的原核來源所涉及的某些優越性，我們可以很容易地認識到從原核生物諸如化膿鏈球菌，類馬鏈球菌或出血敗血性巴斯德氏菌中分離HAS基因的最為有利之處。一個有利之處就是，通常地，真核生物的酶可能需要重要的轉錄后修飾，這只能在真核宿主內完成。這將會限制所獲得的真核HA合酶的應用。而且，本領域的普通技術人員可以很容易地認識到選擇使用原核酶的基因在時間和遺傳操作上其他的優越性。其他的優越性包括(a)原核基因分離的簡便性，因為基因組相對的小，因此降低了對其相應的基因組文庫篩選的數量；(b)操作的簡便性，因為原核基因編碼區的總體大小由于不存在內含子而明顯小得多。而且，如果seHAS基因產物(如，酶)需要翻譯后修飾，它可以在該基因所來自的較小的原核細胞環境(宿主)中完成。優選地，本發明的DNA序列進一步包括遺傳控制區域，以使得該序列在選擇的重組宿主中表達。當然，所用的控制區域的特性通常應當根據預想的特定應用(如克隆宿主)而變化。在特定的實施方案中，本發明涉及摻入編碼seHAS基因的DNA序列的分離的DNA區段和重組載體，該基因的氨基酸序列包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。而且，在另一個實施方案中，本發明涉及摻入編碼一個基因的DNA序列的分離的DNA區段和重組載體，該基因的氨基酸序列包括HAS基因或DNA尤其是指類馬鏈球菌的HAS基因或cDNA的氨基酸序列。例如，當DNA區段或載體編碼全長的HA蛋白，或者用于表達HAS蛋白時，優選的序列是基本上如SEQIDNO:2所列的序列。具有HA合酶活性的核酸區段可以通過本文所述的方法分離。術語"基本上如SEQIDNO:2所列的序列"是指該序列基本上與SEQIDN0:2的部分相符，而只有相對很少的氨基酸不與SEQIDNO:2的氨基酸相同，或者不是SEQIDNO:2的氨基酸的生物學功能等同物。術語"生物學功能等同物"是本領域中所熟知的，在本文中的進一步定義是指，具有基本上如SEQIDNO:2所列的序列的基因，并且與原核生物產生HA或透明質酸包被的能力相關。例如，seHAS和spHAS編碼序列大約70y。相同并富含腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)堿基。SeHAS堿基組成為A-26.71%,C-19.13%，G20.81°/。，T-33.33%(A/T=60%)。而spHAS則為A-31.34%，C-16.42%,G16.34%,T-35.8%(A/T=67%)。本領域的普通技術人員會驚異于seHAS編碼序列并不與spHAS基因雜交，反之亦然，盡管它們具有70%的相同性。這種意外的不能夠交叉雜交的情況可能是由于整個閱讀框上不匹配堿基的短小的中斷。seHAS與spHAS不能交叉雜交的情況如圖1所示。seHAS與spHAS編碼序列兩者間最長的相同核苷酸跨度只有20個核苷酸。此外，富含A-T的序列比富含G-C的序列形成較低的穩定性雜交復合物。另外的可能的解釋是兩個序列上都有多個A和T的延伸，因而可能形成偏離的和不穩定狀態的雜交。這使得seHAS和spHAS基因序列相互不在框內，因而降低了形成雜交的可能性。由于這一獨特的、兩個基因編碼的蛋白具有70%的相同性而不能交叉雜交的現象，因而有必要從其功能上考慮所要求的核酸區段；例如，一個編碼酶學活性的透明質酸合酶的核酸區段。本領域的普通的技術人員應當理解的是，編碼酶學活性的透明質酸合酶的核酸區段可以含有對SEQIDNO:l和2所述序列的保守的和半保守取代，并依然處于本發明的范圍之內。尤其是，研究人員能夠對核酸區段進行結構改變(例如，保守型或者半保守型氨基酸的取代)而依然保持它的酶學或者功能活性，這樣的實例在本領域有很多。例如可參見(1)Risler等，"結構相關蛋白的氨基酸取代，一種模式識別方法"，分子生物學雜志，204:1019-1029(1988)["…根據所觀察到的氨基酸側鏈的可取代性，只分成四組(i)lie和Val;(ii)Leu和Met;(iii)Lys,Arg，和Gln，以及(iv)Tyr和Phe。"];(2)Niefind等，"來自主鏈折疊變色龍的蛋白模型與序列比對的氨基酸相似性系數"，分子生物學雜志，219:481-497(1991)[相似性參數可用于設計氨基酸取代];和(3)Overigton等，"環境特異的氨基酸取代表三級模板和蛋白折疊的預測"，蛋白質科學，h216-226(1992)["根據局部環境功能對所觀察的取代類型進行的分析表明存在不同的類型…"可以進行相容性改變]。這些以及其他很多的參考文獻表明，對于一個核酸序列，本領域的普通技術人員可以進行取代和改變而不改變它的功能。而且，與原類型相比，取代的核酸區片段可以具有高度相同性并保持它的酶學活性，但不能與之雜交。本發明公開了編碼酶學活性的透明質酸合酶一seHAS和spHAS的核酸區段。雖然seHAS和spHAS具有70%的相同性并且都編碼酶學活性的透明質酸合酶，但是它們并不交叉雜交。因此，本領域的普通技術人員能夠理解的是，可以對SEQIDN0:1所列的seHAS核酸區段進行取代而并不偏離出本發明的范圍與權利要求之外。表I中列出了標準化的和可接受的功能相當的氨基酸取代。表I<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>本發明的另一個優選的實施方案是純化的、編碼基于SEQIDN0:2的蛋白的核酸區段，進而還包括重組載體。本文所用的術語"重組載體"是指一個經過修飾含有編碼HAS蛋白或其片段的核酸區段的載體。該重組載體可進而定義為含有與所說的HAS編碼核酸區段有效相連的啟動子的表達載體。本發明的進一步的優選的實施方案是一種宿主細胞，它用含HAS基因的重組載體重組。優選的重組宿主細胞可以是一個原核細胞。在另一個實施方案中，此重組宿主細胞是一個真核細胞。本文所用的"工程"或者"重組"細胞是指在一個細胞中被引入了重組基因，諸如編碼HAS的基因。因此工程細胞不同于天然存在的細胞，后者不含有重組引入的基因。工程細胞因而具有人為引入的一個或多個基因。重組引入的基因可以是cDNA基因的形式、基因組基因的拷貝形式、還可以包括定位于天然情況下與此特定的引入基因不相關的啟動子附近的基因。當需要利用鏈球菌屬以外的宿主來產生重組的HA合酶時，可以有利地利用原核系統，諸如大腸桿菌、枯草桿菌、乳球菌，或者甚至利用真核系統，諸如酵母或者中國倉鼠卵巢細胞，非洲綠猴腎細胞，VERO細胞等等。當然，在操作時，通常將HA合酶基因置于在所選擇的宿主中具有功能的序列的控制之下。合適的DNA控制序列，及其構建與使用，是本領域通常所知的，在下文中還將詳細討論。在優選的實施方案中，HA合酶編碼的DNA區段進而還包括為本領域所知的功能性復制起點或"復制子"的DNA序列，它可使特定的宿主進行連續序列的復制。該起點可使得制備位于染色體之外并復制的嵌合型區段或質粒，而HA合酶DNA序列與之相連。在更為優選的方案中，所用的起點是能夠在適于生物工程應用的細菌中進行復制的起點。然而，出于克隆的DNA區段的多功能性考慮，可以設計出其他的或甚至另外添加的起點，用于被其他的可相容應用的宿主系統所識別(例如在穿梭載體中)。本領域普通技術人員熟知對其他的復制起點諸如SV40,多瘤或牛乳突狀瘤病毒的起點的分離和應用，它們可以用于許多高等生物中的克隆或表達。在某些實施方案中，本發明因而可以是一種重組轉化載體，該載體上含有HA合酶編碼基因序列以及適當的復制起點并被選擇的控制區域所調控。因此，本領域的熟練技術人員應當理解的是，可以根據本發明的揭示，利用其他的方法來獲得HAS基因或cDNA。例如，可以獲得聚合酶鏈反應或RT-PCR產生的DNA區段，它可以含有來自多種來源的基因或cDNA的全長互補體，包括鏈球菌屬的其他菌株或來自真核來源的，如cDNA文庫。實際上任何分子克隆的方法都可以用于產生本發明的DNA片段。因此，唯一的對某種分離DNA的方法的一般限制就是分離的核酸應當編碼一個在生物學上功能相當的HA合酶。一旦將DNA分離出后，將其與一個選擇的載體相連接。實際上任何克隆載體都可以用以實現本發明優越性。典型的可用載體包括用于原核生物的質粒和噬菌體以及用于真核生物的病毒載體。實例包括pKK223-3，pSA3，重組入噬菌體，SV40，多瘤病毒，腺病毒，牛乳突狀瘤病毒和反轉錄病毒。然而，據信當利用在諸如乳球菌或者枯草桿菌屬菌株和大腸桿菌中都能復制的載體時，才能最終實現某些特定的優越性。這些載體，例如Dao和Ferrttti的pSA3載體或者Trieu-Cuot等的pAT19載體，能夠在易于操作的宿主如大腸桿菌中進行克隆菌落的篩選，然后轉移回食品級的乳球菌或者枯草桿菌屬菌株中生產HA。有許多剛開始和已有深入研究的微生物用于食品和生物工程產品的生產。其優越性在于可以通過基因劑量(即，通過擴增提供額外拷貝的HA合酶基因)和減加入其他基因以增加HA前體的數量來增強乳球菌或者枯草桿菌屬菌株生產HA的能力。細菌固有的合成HA的能力也可以通過形成額外的拷貝數或者擴增攜帶HA合酶基因的質粒來增強。這種擴增可以獲得多達10倍的質粒拷貝數，從而得到10倍的HA合酶基因的拷貝數。另一種可以進一步增加HA合酶基因拷貝數的方法是，在質粒中插入多拷貝的基因。其他的技術包括將HAS基因整合到染色體DNA上。這種額外擴增尤為可行，因為細菌HA合酶基因比較小。在某些情況下，使用連接染色體DNA的載體轉染出于克隆篩選的目的而選擇的宿主，如大腸桿菌，利用該載體從而能夠在所選擇的宿主中表達插入的DNA。當使用真核來源如真皮或滑液的纖維原細胞或者雞冠細胞時，可以以制備cDNA文庫作為開始。首先從上述細胞中分離出mRNA，然后利用具有反轉錄活性的酶制備雙鏈cDNA并將其連接到所選的載體上。制備雙鏈cDNA有許多種可行的方法并且是本領域所熟知的，所有這些技術據信都可以應用。一種優選的技術涉及反轉錄。一旦獲得了大量的雙鏈cDNA，在所選的宿主中將cDNA文庫通過可接受的技術制備，如與適當的載體相連接并在適當的宿主中擴增。由于通過本文所述技術可獲得大量的克隆，而且大量的克隆比較易于篩選，所以可使用噬菌體表達載體，如入gtll,入gtl2,和/或入ZAP來克隆和表達篩選cDNA克隆。在某些其他實施方案中，本發明涉及含有基本上如SEQIDNO:l所列的核酸序列分離的DNA區段和重組載體。所用的術語"基本上如SEQIDN0:1所列的核酸序列"與上文所述的意思相同，是指該序列基本上與SEQIDN0:1的一部分相符，而只有相對很少的密碼子不與SEQIDN0:1的密碼子相同，或者不與SEQIDN0:1的密碼子在功能上相當。術語"功能上相當的密碼子"是指編碼相同氨基酸的密碼子，如精氨酸或絲氨酸的6個密碼子，如表I中所列，也可以是指編碼生物學相當的氨基酸的密碼子。應當理解的是氨基酸和核酸序列可以包括添加的殘基，如添加在N-或C-末端的氨基酸或5'-或3'-核酸序列，而仍然基本上與本文所公開的序列相同，只要該序列符合上述的標準，包括對所研究的蛋白表達和酶學活性來說，保持了生物學蛋白活性。末端序列的添加特別適用于核酸序列，它可以包括，例如，在編碼區的5'和3'外側部分的各種非編碼區序列，或者可以是各種內部序列，這在基因中是存在的。尤其是，真核生物中的HAS基因的氨基酸序列比在原核生物中的要大40%。考慮到遺傳密碼的簡并性以及保守型和半保守型取代，如果序列所具有的約40%和80%之間；或者更為優選地在約80%至90%之間；或者更為優選地在約90%至99%之間的核苷酸與SEQIDN0:1的核苷酸相同，那么它就是"基本上如SEQIDN0:1所列的核酸序列"。基本上與SEQIDN0:1所列序列相同的核酸序列也可以在功能上來定義，它能夠與含有SEQIDN0:1的互補鏈的核酸區段在標準條件下或不很嚴格的雜交條件下雜交。適當的標準雜交條件是本領域熟練技術人員所熟知的，并在本文中有清楚的描述。本文所用的術語"標準雜交條件"是指在該條件下基本互補的核酸區段將形成標準的Watson-Crick堿基對。已知有許多因素決定結合或雜交的特異性，如pH，溫度，鹽濃度，存在的試劑諸如甲酰胺和二甲亞砜，雜交區段的長度，等等。當用較短的核酸區段進行雜交時，例如約14至100個核苷酸之間的片段，雜交的鹽和溫度的優選條件為1.2-1.8XHPB，40-50°C。當然，本發明還包括與SEQIDNO'.l所列序列互補，或基本互補的DNA區段。"互補的"核酸序列是指能夠按照標準的Watson-Crick互補原則形成互補堿基對的序列。本文所用的"互補序列"是指基本上互補的序列，可通過上述的相同核苷酸比較來確定，也可以通過能夠與SEQIDNO:l的核酸區段雜交來確定。本發明的核酸區段，不考慮編碼序列本身的長度，可以與其他的DNA序列聯合使用，如啟動子，多聚腺苷信號，添加的限制酶位點，多克隆位點，附加表位，多聚組氨酸區域，其他的編碼區，等等，因而其總體長度可以是非常可觀的。因此可以認為幾乎任何長度的核酸區段都可以使用，而其總長度應限制在易于制備和用于重組DNA操作的范圍內。當然，應當理解的是本發明并不限制于SEQIDN0:1和2的特定的核酸和氨基酸序列。重組載體和分離的DNA區段因而不同的情況下可以包括HAS編碼區本身、在基本的編碼區中帶有所需要的改變和修飾的編碼區，或者它也可以編碼較大的多肽而其中含有HAS編碼區，或可以編碼具有不同的氨基酸序列而在生物學上功能相當的蛋白或肽。例如，我們在兩個系統中發現、鑒定并純化了透明質酸合酶(a)格蘭氏陰性菌出血敗血性巴斯德氏菌(SEQIDN0:19);和(2)綠藻病毒PBCV-1(SEQIDNO:7和8)。透明質酸合酶在這兩個系統中的存在以及我們能夠從這兩個系統中純化并利用它的透明質酸合酶表明，我們能夠純化并分離編碼酶學活性的透明質酸合酶的核酸序列。CarterA型的出血敗血性巴斯德氏菌(SEQIDNO:19)的莢膜中長期以來一直被懷疑含有透明質酸HA。對出血敗血性巴斯德氏菌的HA合酶的鑒定發現了在它與seHAS和spHAS蛋白之間的有趣的酶學差巳升°出血敗血性巴斯德氏菌(細胞產生一個易于觀察到的細胞外HA莢膜，而且由于那兩個鏈球菌HAS是膜蛋白，因而對禽類霍亂病原體的膜制備物進行了檢測。在早期的試驗中，超聲破碎獲得的粗的膜組分只含有很低水平的UDP-GlcNAc依賴的UDP-[14C]Glc摻入HA中[~0.2pmol的GlcA轉移(ug蛋白)"h-1]，試驗條件與測試鏈球菌HAS活性的條件相似。帶有重組hasA質粒的大腸桿菌中的酶起先也不容易分離。與這些結果相反的是以相類似的方法從鏈球菌屬中很容易獲得可檢測數量的酶。另一種制備方法是在蛋白酶抑制劑存在下，利用冰冷的溶菌酶處理，并結合使用超聲處理，可以從兩種格蘭氏陰性菌中基本回收HAS活性。用這種新方法從野生型出血敗血性巴斯德氏菌的粗膜中常規可獲得的HAS的比活性為5-10pmol的GlcA轉移(ug蛋白)"h"。在不存在UDP-GlcNAc的情況下，實際上沒有來自UDP-[14C]GlcA的放射性摻入高分子量物質(<1%以兩種糖前體所作的相同實驗)。從無莢膜的突變體TnA制備的膜，在提供了兩種糖前體情況下，不具有可檢測到的HAS活性(數據未給出)。利用SephacrylS-200柱子進行的凝膠過濾分析表明主要的14C標記的體外合成的產物的分子量為〉8X10"Da，因為該物質在外水體積中被洗脫，這樣的分子量相當于由至少400個單體組成的HA分子。該產物對鏈霉菌透明質酸酶消化敏感而對蛋白酶處理具有抗性。可改變HAS試驗的參數以通過出血敗血性巴斯德氏菌膜使摻入多糖中的UDP-糖的量最大。鏈球菌spHAS需要Mg2+，因而在起始的出血敗血性巴斯德氏菌試驗中含有此金屬離子。出血敗血性巴斯德氏菌的HAS(pmHAS)在pH6.5至8.6的Tris型緩沖鹽中相對具有活性，最佳為pH7。HAS活性在中性pH下與溫育時間至少在l小時內呈線性關系，。pmHAS在高離子強度下活性較低，因為在含有50mMTris，pH7,和20mMMgCl2的反應中加入lOOmMNaCl，糖的摻入降低了50%。pmHAS的離子特異性在pH7進行了測試。在存在EDTA而無金屬離子的條件下，沒有放射性前體摻入到多糖中(<0.5%的最大信號)。在最低濃度下所有測試的離子(Mg，Mn，Co，Cu,和Ni)中，Mn2+獲得了最高的摻入率。Mg^在高10倍的濃度下獲得了Mi^+效果的50%。0)2+或^2+在lOmM只提供了很低水平的活性(分別相當于ImMMn、式驗的20%或9%)，而提供有10mM012+時膜沒有活性。實際上將10mM012+和20mMMg^與膜制備物混合，其結果是幾乎沒有標記物摻入多糖(<0.8%的單獨使用Mg的值)。起先對pmHAS的鑒定是在Mg2+存在的條件下進行。酶對糖核苷酸前體的結合親和力通過測量表觀KM值來測定。["C]GlcA或[3H]GlcNAc在多糖中的摻入在不同濃度的UDP-GlcNAc或UDP-GlcA下進行監測。在含有Mg^的緩沖液中，利用滴定數據的Hanes-Woolf作圖([S]/v對[S])確定出UDP-GlcA的表觀km值為20PM，UDP-GlcNAc的表觀km值為75uM。兩種糖的V脆值相同，因為Hanes-Woolf作圖中相應于1/Vmax的斜率是相同的。與用Mg^作的試驗相比較，UDP-G1cNAc的Km信増加了25-50%,達105uM，而在Mi^+存在下V皿增加了2-3倍。來自出血敗血性巴斯德氏菌，類馬鏈球菌或化膿鏈球菌的HA合酶都利用UDP-糖，但對于pH和依賴的金屬離子擁有不同的動力學參數和Km僮。該酶在pH7最具活性；但是pmHAS據報道在略酸的pH時更具活性并且在pH7.4時失活。在體外試驗條件下，pmHAS利用Mi^+比利用Mg"更為有效，但在細菌細胞內的生理學金屬輔因子未被鑒定。相比之下，以前利用鏈球菌的酶的研究中，M^+比Mn"更好，但是M一+在比最佳Mg^的濃度低10倍時具有最高效果。pmHAS表現出的與UDP-糖的結合力比spHAS要強。在粗膜中測量的pmHAS各種底物的km值大約比鏈球菌膜中的HAS獲得的數值低2-3倍分別為UDP-GlcA的50或39uM，UDP-GlcNAc的500或150uM。經動力學分析，pmHAS的V皿在Mn"存在下比Mg^存在時高2-3倍，但UDP-GlcNAc的km值在用前一種離子進行的試驗中增長緩慢。顯現出的較低的親和力表明聚合反應率的提高不是由于Mt^+離子/糖核苷酸復合物與酶活性位點更強的結合。因此，MW+可能增強了某些其他反應步驟，改變了酶的另一位點/結構，或者修飾了磷脂膜的環境。pmHAS的基因序列和蛋白序列在SEQIDNO:19中給出。綠藻病毒PBCV-1編碼一種功能性糖基轉移酶，可以合成多糖、透明質酸(透明質酸，HA)。這一發現與通常的觀察相反，通常病毒要么(a)利用宿主細胞的糖基轉移酶產生新的碳水化合物結構，要么(b)在病毒顆粒成熟的過程中積累宿主細胞的糖綴合物。而且，HA以前通常被認為只限于動物及其少數的致病菌病原體中。雖然許多植物的碳水化合物已經被鑒定，但是不論是HA還是相關的類似物以前都未曾在植物細胞中或原生生物中被檢測到。脊椎動物的HAS酶(DG42,HAS1,HAS2,HAS3)和鏈球菌HasA酶(spHAS和spHAS)具有幾個序列相似的區域。測序病毒PBCV-l[草履蟲parawea'Mm6wmzn'a綠藻病毒]的雙鏈DNA基因組時，一個ORF[開放閱讀框]，A98R(登錄號442580)編碼一個567個殘基的蛋白，其中28-33。/。的氨基酸與各種已發現的HAS相同。該蛋白被記作cvHAS(綠藻病毒HA合酶)。編碼PBCV-1的基因序列和它的蛋白序列如SEQIDNO:7和8所示。PBCV-1是藻DNA病毒科的原形，該科是大的(175-190nm直徑)多面體，形成噬斑的病毒科，在某些單細胞真核藻類如綠藻中復制，。PBCV-1在外層糖蛋白衣殼中含有至少50個不同的蛋白和脂類成分。PBCV-1的基因組是線性的非變序的330kb雙鏈DNA分子，具有共價閉合的發卡結構末端。根據其推導的氨基酸序列，A98R基因產物應當是一個完整的膜蛋白。為了驗證此假說，在大腸桿菌中生產重組A98R并對膜組分進行HAS活性的試驗。UDP-GlcA和UDP-GlcNAc被來自在質粒pCVHAS上含有A98R基因的細胞的膜組分摻入到多糖中(平均比活性為2.5pmolesGlcA轉移/ug蛋白/分鐘)，而不被來自對照細胞的樣品慘入(O.OOlpmolesGlcA轉移/"g蛋白/分鐘)。在轉化了pCVHAS的細胞的可溶性組分中未檢測到活性。UDP-GlcA和UDP-GlcNAc對于聚合反應是同時需要的。活性在pH7.2的Hepes緩沖液，含有lOmMMnCL的條件下最佳，而當缺少此金屬離子時則檢測不到活性。在同一濃度下JV^+和Co"為Mn"效力的20y。。PmHAS具有相似的金屬依賴性，而其他的HAS則更依賴于Mg2+。重組的A98R酶合成平均分子量為3-6X106Da的多糖，比重組的spHAS或DG42xlHAS體外合成的HA小(分別為107Da和~5-8X106Da;",")。多糖被鏈霉菌StreptomyceshyaluroniticusHA裂解酶完全降解，該酶可以解聚HA，但不降解結構相關的粘多糖，如肝素和軟骨素。將PBCV-1感染的綠藻細胞進行A98R基因表達測驗。在感染后的15分鐘出現一個1,700個核苷酸的A98R的轉錄物，并在感染后60分鐘消失，這表明A98R是一個早期基因。然后，對來自未感染和被PBCV-1感染的綠藻細胞的膜組分在感染后50和90分鐘進行HAS的活性試驗。感染的細胞具有活性，而未感染的細胞沒有。如同細菌衍生的重組的A98R酶，從UDP-["C]GlcA到多糖的放射性摻入同時依賴于Mn2lnUDP-GlcNAc。該放射性產物也可以被HA裂解酶降解。被破壞的PBCV-1病毒顆粒沒有HAS活性。利用高度特異的1251-標記的HA結合蛋白對PBCV-1感染的綠藻細胞的HA多糖進行分析。感染后50和90分鐘的細胞抽提物中含有大量的HA，但未感染的綠藻或被破壞了PBCV-1病毒顆粒的細胞抽提物中卻沒有。標記的HA結合蛋白也在感染后50和90分鐘與被完全感染的細胞相互作用，而不與健康的細胞作用。因此，相當大部分的新合成的HA多糖固定在被感染的綠藻的外層細胞表面。細胞外HA并不對病毒與綠藻宿主間的相互作用起顯著的作用，因為噬斑的大小和噬斑的數量都不隨在PBCV-1噬斑試驗的頂層瓊脂中加入睪丸透明質酸酶(465單位/ml)或者游離的HA多糖(100yg/ml)而變化。PBCV-1基因組還具有其他的基因編碼UDP-Glc脫氫酶(UDP-GlcDH)和谷氨酰胺果糖-6-磷酸轉氨酶(GFAT)。UDP-GlcDH將UDP-Glc轉化為UDP-GlcA，后者是HA生物合成所需的前體。GFAT將果糖-6-磷酸轉化成葡糖胺-6-磷酸，它是UDP-GlcNAc代謝途徑中的中間體。這兩個PBCV-1的基因，同A98RHAS—樣，都在感染的早期表達并編碼酶學活性的蛋白。HA生物合成中多種酶的存在表明HA的產生一定在綠藻病毒的生命周期中具有重要的功能。鏈球菌屬，脊椎動物和PBCV-1的HA合酶具有許多以相同的相對順序排列的2-4個殘基的基序。這些保守的基序可能反映了如圖2所示的對于HA生物合成至關重要的一些結構域。C組seHAS，A組spHAS，鼠HAS1,HAS2，HAS3和蛙HAS的蛋白序列的對比如圖2所示。圖2中的對比是利用DNAsis多重對比程序完成的。seHAS中與其他已知的家族成員(包括人HAS1和2，未顯示)相同的殘基用陰影和星號標出。用點標出的氨基酸在較大的P-糖基轉移酶家族的所有成員中保守。鉆石符號表示高度保守的對酶活性至關重要的半胱氨酸殘基。在預計的膜結構域MD1到MD7的大約中點處用箭頭標出。XI表示Jfeo/^/aeWs，而MM表示Mw51wMsa/fc。HAS與其他催化UDP-糖前體合成P-連接的多糖的酶之間具有相似性的區域也隨著更多的糖基轉移酶被測序而被發現。實例包括細菌的纖維素合酶，真菌和細菌的殼多糖合酶，和各種HAS。這些相似的結構性基序的意義將隨著糖基轉移酶的三維結構的積累而變得越來越清楚。圖3描述了已知的透明質酸合酶之間的進化關系。圖3的系統發育樹是利用DNA多重對比程序按照Higgins-Sharp算法得出的。計算出的匹配百分比標記在系統發育圖的各個分支上。本發明的DNA區段包括生物學上功能相當的HAS蛋白和肽。這種序列可以由于密碼子冗余而功能相當而產生，已知這是在核酸序列和其編碼的蛋白序列中可以天然發生的。另外，功能相當的蛋白和肽可以通過重組DNA技術產生，其中根據對替換的氨基酸特性的考慮，在蛋白結構中產生改變。人為所需的變化可以通過應用定點誘變技術來誘導，例如，為了改進HAS蛋白或酶活性或抗原性，或者測試HAS突變體以在分子水平上檢測HA合酶的活性。另外，HAS編碼序列的特定的改變可以導致產生具有修飾的大小分布或結構的HA。本領域的普通技術人員應當理解的是，HAS編碼序列可以以某種方式進行操作從而產生變化的透明質酸合酶，它因而能夠產生具有不同的聚合物大小和/或功能的透明質酸。例如，可以改變HAS編碼序列，從而透明質酸合酶具有改變了的糖底物特異性，使得該透明質酸合酶產生出新的透明質酸類聚合物，它摻入不同的結構，如先前不被摻入的糖或糖的衍生物。這種新摻入的糖導致具有不同的功能特性的修飾的透明質酸，具有更小或更大的聚合物大小/分子量的透明質酸，或包括兩者的透明質酸。正如本領域的普通技術人員所能理解的，給出了HAS編碼序列，就可以對此HAS編碼序列進行改變和/或取代，從而就可以完成所需的對特性和/或大小的修飾。表II列出了重組seHAS糖核苷酸的特異性和對鎂離子的需要。表II重組seHAS糖核苷酸的特異性和對鎂離子的需要提供的第二種HA合成f糖核苷酸(UM)UDP-[14C]GlcAUDP-[14C]GlcNAcdpm(%)dpm(%)無90(2.1%)8(1.2%)UDP-GlcNAc(300)4134(100%)—UDP-GlcA(120)—635(100%)UDP-Glc(160)81(1.9%)10(1.5%)UDP-GalNAc(280)74(1.7%)19(2.9%)UDP-GalA(150)58(1.4%)19(2.9%)UDP-GlcNAc+EDTA31(0.7%)—UDP-GlcA+EDTA—22(3.4%)*將膜(324ng蛋白質)與120uMUDP-[14C]GlcA(2.8Xl()4dpm)或者300uMUDP-[3H]GlcNAc(2X104dpm)在37'C溫育1小時。放射性標記的糖核苷酸在所示的第二種未標記的糖核苷酸存在下使用。HA合酶活性按照本發明中所描述的方法確定。本文所用的術語"修飾的結構"是指透明質酸聚合物含有正常情況下在天然存在的HA多糖中未被發現的糖或衍生物。術語"修飾的大小分布"是指合成的透明質酸分子的大小分布在用天然酶的合成中未曾發現；經過操作的大小可以比正常的大小小得多或大得多。各種不同大小的透明質酸產物可應用于藥物輸送領域，而且改變了結構的酶的產生可以與不同大小的透明質酸聯合。如果能夠大量產生大約含有20個單糖的透明質酸聚合物，那么在血管生成和創傷愈合中的應用有很大的潛力。小分子透明質酸寡糖的另一種特別應用是在醫用重組人蛋白的穩定性方面。這類蛋白的主要問題是它們在血液中被清除以及較短的半衰期。現在對此問題的一種解決方法是結合一種小分子護罩以防止蛋白被快速地從循環系統中清除。非常小的分子量的透明質酸很適于此角色并且沒有免疫原性并具有生物相容性。附著于藥物或蛋白的較大分子量的透明質酸可以用于網狀內皮組織細胞系統的定位，該系統具有透明質酸的內吞受體。根據本發明，本領域的普通技術人員應當理解的是，有幾種方式可對透明質酸合酶產生的透明質酸聚合物的大小分布進行控制以產生不同的大小。首先，產物大小的動力學控制可以通過降低溫度、降低酶作用時間和降低一種或兩種糖核苷酸底物的濃度來改變。降低任何一種或所有這些參數將得到較少數量的和較小的透明質酸產物。這種方法的不利之處在于產物的產量也會被降低而且很難在天與天之間或批與批之間獲得重復性。第二，改變酶固有的合成較大透明質酸的能力。可以通過重組DNA技術對蛋白進行操作，包括取代、缺失和添加特定的氨基酸(或者甚至通過代謝過程引入非氨基酸基團)，這種改變產生固有的慢反應酶，從而在動力學方法上可以獲得更具重復性的對透明質酸大小的控制。最終的透明質酸的大小分布由該酶的某些基于序列上特定的氨基酸的特性確定。在鏈球菌的酶與其它真核的透明質酸合酶之間有20%的殘基是絕對保守的，在這其中有一系列的特定位點上的氨基酸控制或極大影響著該酶所產生的透明質酸聚合物的大小。在這些殘基上任何一處的特異改變都可以產生修飾的HAS，它產生的HA產物具有修飾的大小分布。對seHAS，spHAS,pmHAS,或cvHAS進行的改變，降低了該酶產生的透明質酸的固有的大小，這將可以提供強有力的方法用以產生比天然的酶所產生的更小的或者更大的透明質酸產物。最后，較大分子量的透明質酸可以用特異的透明質酸酶降解產生較低分子量的透明質酸。但是此方法非常難以獲得重復性，而且必須細致地重新純化以去除透明質酸酶和不需要的消化產物。如圖4所示，可操作透明質酸合酶以產生不同大小的透明質酸聚合物，尤其是比正常的野生型酶更小的。該圖顯示了一系列spHAS酶的HA大小的分布(分子量標為百萬道爾頓)，每一種通過定點誘變在天然的酶上獲得單個氨基酸的變化。每個都有不同的半胱氨酸殘基被丙氨酸所取代。五個空心符號標記的曲線代表下列spHAS蛋白野生型，C124A，C261A,C366A，和C402A。實心圓代表的是表達較差的C225蛋白，它只有部分活性。實心三角是C280AspHAS蛋白，發現它所合成的HA聚合物比正常的酶或給出的其他變異體要小。實驗中的這種減小表明可以通過改變透明質酸合酶而使合成的HA產物大小在所需范圍內。編碼透明質酸合酶的seHAS,pmHAS,和cvHAS基因也可以通過定點誘變的操作來產生一個酶，使其合成的HA產物大小在所需范圍內。結構上修飾的透明質酸在概念上與通過在所需的HAS或者spHAS上改變特定的氨基酸來改變透明質酸產物的大小分布沒有什么不同。UDP-GlcNAc的衍生物，其中N-乙酰基團缺失了UDP-GlcN或者被另一種化學有用的基團所替代，它可以用于特定的用途。強底物特異性要求必須依賴于20%的保守型氨基酸中特定的一些氨基酸。對這些殘基的特定的改變產生的功能性酶，它比天然的酶對一種或幾種底物的作用具有較低的特異性。這種變化了的酶將可以利用其他的天然的或特定的糖核苷酸將所需的糖衍生物摻入，從而獲得不同的化學性質，它可用于(i)使特定的藥物、蛋白、或者毒素與結構上修飾的透明質酸共價結合，用于一般的或導向藥物的輸送、放射療法等等。(ii)使透明質酸本身或者與其他支持物共價交聯，形成凝膠或者其他具有較強的物理特性的三維生物材料，和(iii)使透明質酸與一個表面共價相連，產生一種具有生物相容性的薄膜或單層。可以操作細菌來生產透明質酸。例如，我們制備了含有spHAS基因以及一種糖核苷酸前體的基因的枯草桿菌菌株。我們選擇這種細菌是因為它經常被用于生物技術工業來生產人類使用的產品。應使用第一代原形細菌，因為第一代細菌比現有的利用野生型天然菌株產生更多量的透明質酸。我們在其中放入了多拷貝的基因。例如，構建了三種枯草桿菌菌株，含有編碼透明質酸合酶以及UDP-葡萄糖脫氫酶中的一種或者同時兩種的化膿鏈球菌的基因，其結果如表II-B所示。根據敏感的商業化的放射性測量試驗來檢測并定量HA，確定出帶有兩個基因的菌株(3號菌株)產生并向培養基中分泌HA。父本菌株和只帶有脫氫酶基因的菌株(1號菌株)不產生HA。2號菌株只含有spHAS基因，產生HA，但只有3號菌株產量的10%。瓊脂糖凝膠電泳表明3號菌株分泌到培養基中的HA具有很高的分子量。表ii-b<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>(*)大多數HA是在培養基中，但是有一些是細胞結合的；利用Pharmacia的HATest50試劑盒來確定HA。這些實驗利用通常與這些基因相連的鏈球菌啟動子操縱蛋白的表達。我們構建了帶有在啟動子調控下的spHAS或seHAS閱讀框的菌株，期望能夠獲得更好的效果。所用的載體為格蘭氏陽性/大腸桿菌穿梭載體，它在及^to'fc中具有中等的拷貝數，并帶有紅霉素抗性基因(能夠在枯草芽孢桿菌中具有8ug/ml的抗性或在大腸桿菌中具有175"g/ml的抗性)。所用的5.犯6"to的宿主菌株是來自BGSC的1A1，它需要色氨酸，其它為野生型特征，并能夠形成孢子。在添加有色氨酸、葡萄糖、微量元素和紅霉素(8ug/ml)的Spizizens最低培養基中培養細胞并生產HA。在32"C劇烈搖蕩培養直到培養基被耗盡(~36小時)。這表明這些經過生物工程操作的細胞，原來通常不生產透明質酸，當它們被用spHAS基因轉化后變得能夠生產了。SeHAS也能夠被引入到非透明質酸生產細菌中，產生出經過生物工程操作的能夠生產透明質酸的細菌菌株。本發明的一個優選的實施方案是包括具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的純化的組合物。本文所用的術語"純化的"是指一種HAS蛋白組合物中HAS蛋白或適當修飾的HAS蛋白(例如，含有[HIS^結尾)被純化至相對其天然獲取狀態的任何純度。例如，在該情況下，相對于它在原核細胞抽提物中的純度。HAS蛋白可以從鏈球菌屬，巴斯德氏菌屬，綠藻病毒，病人樣本，重組細胞，被感染的組織，在細胞外基質中含有高水平的透明質酸的分離的組織亞群等等本領域熟練技術人員所知的來源中分離。例如，重組的seHAS和spHAS蛋白構成了大腸桿菌10%的膜蛋白。經純化的HAS蛋白組合物因而也指具有基于SEQIDNO:2的氨基酸序列的、從其天然環境分離的多肽(圖5)。對于seHAS的表達，從基因組DNA和cDNA都可以制備出表達系統，用于HAS蛋白的重組制備。對于在原核或真核系統中表達的DNA區段的操作，可以通過本領域熟練技術人員通常所知道的重組表達的技術來進行。HAS可以在真核系統中成功地表達，但是，本發明人認為細菌表達系統可用來制備任何目的所需的HAS。據信，細菌表達從易于使用、生產消耗、和從中所獲得的物質的量幾方面來看，從根本上來說優于真核系統的表達。鏈球菌透明質酸合酶(seHAS和spHAS)的純化如表III和圖6所示。純化步驟各階段的組份通過12.5%的凝膠上的SDS-PAGE來分析，凝膠用考馬斯亮藍染色。泳道分子量標準；1，含有重組seHAS-H6的大腸桿菌的膜；2，去污劑溶解膜之后的不溶組分；3，去污劑溶解的組分；4,Ni-NTA樹脂的穿過組分；5-9，5次對柱子的連續洗滌(每次2個柱體積)；10，洗脫的純的HA合酶，它是一條單帶。表m<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>值得推薦的是，利用轉化有編碼HAS的DNA區段的宿主細胞便于獲取HAS蛋白。另外還值得推薦的是，cDNA，基因組序列和兩者相結合，很適于真核表達，因為宿主細胞將當然地加工基因組轉錄物以產生功能性的mRNA用來翻譯出蛋白。本發明的另一個實施方案是制備一種蛋白的方法，其中包括培養含有重組載體的宿主細胞，該載體編碼一個包括SEQIDN0:2的氨基酸序列或者帶有保守型或半保守型氨基酸變化的功能相似的氨基酸序列的蛋白。將該宿主細胞在允許核酸表達和蛋白產生并隨后回收所產生的蛋白的條件下培養。HAS和最終的HA的生產，包括允許核酸表達和蛋白生產并隨后回收所產生的蛋白的條件，對于本領域的熟練技術人員來說，根據本發明所公開的seHAS基因、和seHAS基因的產物HAS、以及本文所述的方法，將會知道。優選的表達透明質酸的宿主是原核生物，如類馬鏈球菌，和其他適當的鏈球菌屬的成員。但是，已經知道的是，HA可以由表達重組HA合酶的異源宿主合成，如芽孢桿菌屬，腸球菌屬或者甚至埃希氏桿菌屬的成員。最為優選的表達本發明的HA合酶的宿主是轉化有本發明的HAS基因的細菌，如乳球菌的菌種，枯草桿菌或大腸桿菌。類似地，據信，幾乎任何真核表達系統都可以用于HAS的表達，例如基于桿狀病毒的、基于谷氨酰胺合酶的、基于二氫葉酸還原酶的系統、基于SV40的、基于腺病毒的、基于細胞巨化病毒的、基于酵母的，等等，都可以使用。為了以這種方法表達，應當將編碼序列置于啟動子的附近并受其調控。本領域所理解的是，要將一個編碼序列置于這樣的啟動子之下，該蛋白轉錄閱讀框的轉錄起始位點的5'端的位置應位于所選啟動子"下游"的大約1至50個核苷酸處。另外，啤酒糖酵母表達載體系統，如pYES2，在GAL啟動子控制下也可產生HAS，如圖7所示。圖7顯示出利用pYES2質粒在重組酵母中產生了spHAS酶。當提供UDP-GlcA和UDP-GlcNAc時，該酶產生出高分子量的HA。在考慮真核表達時，通常還應在包括HAS基因或DNA的轉錄單位中加入一個適當的多聚腺苷化位點(例如，5，-AATAAA-3')，如果它不包含在起初的克隆片段中的話。通常，polyA的加入位點位于該蛋白終止位點"下游"約30-2000個核苷酸處，在轉錄終止前的位置。應當理解的是，實際上任何通常所用的宿主都可以照此用于HAS的表達。表達本發明的HAScDNA的優選的細胞系的實例包括通常用于真核表達的細胞系，如239，AtT-20,HepG2，VERO,HeLa，CHO，WI38,BHK，COS-7,RIN和MDCK細胞系。通常應包括的步驟有提供帶有編碼HAS酶的重組DNA區段并能表達該酶的重組宿主；于培養基中在能使克隆的HAS基因或cDNA轉錄并適于透明質酸生產的條件下培養該重組宿主；以及從重組宿主中分離和純化HAS酶或分泌的透明質酸。通常，適于表達克隆的HAS基因或cDNA的條件取決于所使用的啟動子、載體、和宿主系統。例如，在使用lac啟動子時，應需要通過會刺激lac轉錄的物質，如異丙基硫代半乳糖苷，的誘導來誘導轉錄。例如，本發明的克隆的seHAS基因以含有HIS6的蛋白在大腸桿菌中表達，如圖5所示。當使用其他的啟動子時，需要不同的物質來誘導或上調轉錄。圖5描述了在大腸桿菌中重組seHAS和spHAS的過表達。將膜蛋白(每道5mg)通過10%的凝膠的SDS-PAGE在還原條件下組分分離。將膠用考馬斯亮藍R-250染色、照相、掃描并通過分子動態密度測量儀(PDSIP60型)定量。HA合酶的位置如箭頭所指。泳道A為天然的spHAS(A組)；泳道C為為天然的seHAS;泳道E為重組seHAS;泳道P為重組spHAS;泳道V為單獨的載體。所用的標準為Bio-rad低分子量標準并標出了kDa值。除了獲得該合酶的表達，優選地還應當需要提供一個有利于HA合成的環境，包括適當的編碼糖核苷酸前體生物合成所需酶的基因，或者利用含有提供前體的酶所需的底物的培養基，如N-乙酰葡糖胺或葡糖胺(GlcNAc或GlcNH2)和葡萄糖。進一步希望的是將基因摻入透明質酸酶缺損的宿主，從而酶合成的產物不會在培養基中被降解。而且，應當選擇HA生產優化的宿主。例如，適當的宿主應當是可以產生大量的糖核苷酸前體以供應HAS酶并使之產生大量的HA。這種宿主可以在自然界中尋找或者通過各種技術包括誘變或重組DNA技術來制造。糖核苷酸合成酶的基因，尤其是生產UDP-GlcA所需的UDP-Glc脫氫酶，也可以與HAS基因或cDNA—起加入到載體中。本發明優選的實施方案為含有這些輔助性的重組基因或cDNA的宿主并在其中擴增這些基因產物從而增加HA的生產。培養宿主細胞所用的方法并不認為是至關重要的。詳細資料可參考美國專利4,517,295;4,801,539;4784,990;或4,780,414;各文獻在此提及可供參考。在使用原核宿主時，如類馬鏈球菌，應需要在無氧條件下在(302富集的肉湯培養基中進行細菌發酵。這樣可以比在有氧條件下獲得更多的HA產物。另一個需要考慮的是厭氧培養的鏈球菌細胞不會產生熱原性外毒素。適當的培養條件可以根據本發明為其他原核宿主進行調整，正如本領域熟練技術人員所知道的。構建了合適的宿主，并在適于HA生產的條件下培養之后，需要分離所生產的HA。通常，HA應由重組生物分泌或以其它方式釋放到周圍的培養基中，因而易于從培養基中通過所熟知的方法分離HA。例如，HA可以通過過濾從細胞h碎片中被分離出，并可以結合用醇如乙醇沉淀從培養基中分離。其他的沉淀試劑包括有機溶劑如丙酮或有機季銨鹽如十六基吡啶氯化物(CPC)。優選的分離HA的技術在美國專利4，517，295中有所描述，在此提及可供參考，在發酵末期在細菌懸浮液中加入有機羧酸，三氯乙酸。三氯乙酸導致細菌凝塊并死亡，利于將細胞和相關的碎片與所需產物HA分離開。將澄清的上清濃縮并透析以去除低分子量雜質包括該有機酸。隨后通過含有0.22um孔徑大小的濾膜的過濾盒進行過濾。繼續透濾直到溶液的電導降至大約0.5兆歐。加入過量乙醇試劑或其他有機溶劑沉淀濃縮的HA，用乙醇洗HA沉淀并真空凍干除去乙醇。HA可用pH8的硼酸鹽緩沖液重懸，再用CPC或其他有機銨鹽例如一種混合三甲基銨溴化物溶液CETAB在4"C沉淀。沉淀的HA經上文專利中詳細敘述的粗濾，1MNaCl重懸，完全過濾和濃縮等步可回收。根據所需的最終用途，最終形成的HA過濾除菌后可制成一種合適的鹽，干粉或無菌溶液。A.可應用的典型的基因工程方法以無難通透的胞膜屏障的細胞為受體細胞，可以通過為本領域技術人員熟知的磷酸鈣共沉淀法進行轉染。然而，其它方法也可用于介導DNA進入細胞，例如核注射，陽離子脂類，電穿孔，原生質體融合或Biolistic(tm)。生物顆粒轉運系統是DuPont(1989)開發的。選用DiiPont系統的優點是轉化效率高。如果是原核細胞或其它有堅固的細胞壁結構的細胞，優選的轉染方法是用氯化鈣進行鈣離子處理以產生感受態或電穿孔法。應用標準的連接技術構建含有目的編碼和調控序列的適當載體。分離的質粒或DNA區段經切割，目的性修飾后，以既定的方式再連接以構建所需的質粒。在合適的緩沖體系中用一種或多種限制性內切酶進行切割。一般來說，在20ul緩沖體系中，lug質粒或DNA片段約用1單位的酶。對于特定的限制性內切酶適當的緩沖液和底物量制造商有詳細說明。37。C溫育一小時有效。溫育完畢酚氯仿抽提去除蛋白，水中的核酸組份通過乙醇沉淀回收。如需要平端，用十個單位的聚合酶I(Klenow)于15。C處理15分鐘，再酚氯仿抽提，乙醇沉淀。末端經適當修飾可提供正確配對的等摩爾量目的組份的連接反應中，每0.5克DNA加10個單位的T4DNA連接酶。當經切割的載體是連接組份時，用細菌的堿性磷酸酶預處理以防止載體自連可能是有用的。要分析鑒定構建質粒的功能序列時，第一步是通過30-32"C的轉化反應將質粒DNA克隆到特定的SURE大腸桿菌感受態細胞(Stratagene)中進行擴增。第二步用重組質粒轉化大腸桿菌K5株Bi8337-41,這樣可以產生UDP-GlcA前體并可用適當的抗生素抗性篩選成功的轉化子。從轉化子文庫提取的質粒然后用于篩選可表達HA的細菌克隆。挑取這些克隆，擴增后純化質粒進行限制性酶切圖譜分析。再用本領域一般技術人員共知的一些序列分析技術進一步分析含有功能性HAS基因的質粒的特征。B.來源和宿主細胞培養及載體總的來講，在本發明中原核細胞用于有用的載體構建和DNA序列的初始克隆中。據信革蘭氏陽性細菌尤其是來自C組鏈球菌株的細菌是適當的宿主細胞來源。如葡萄球菌和鏈球菌一樣有單層細胞膜和厚的細胞壁的細菌是革蘭氏陽性菌。革蘭氏陰性菌如大腸桿菌有兩層不連續的細胞膜，而非由一層膜包裹細胞。革蘭氏陰性細菌有較薄的細胞壁。革蘭氏陽性細菌的單層膜與革蘭氏陰性菌的內層質膜。優選的宿主細胞是突變為透明質酸酶缺陷或抑制的鏈球菌株(EP144019,EP266578，EP244757)。特別有用的鏈球菌株包括類馬鏈球菌和獸疫鏈球菌。原核細胞亦可用于表達。為獲得更能適于高分子量HA合成的HA合酶，可優選鏈球菌種，如類馬鏈球菌或獸疫鏈球菌。上述菌株及大腸桿菌W3110(F-,lambda-，原養型的，ATCCNo.273325)，芽孢桿菌如枯草桿菌，或其它腸桿菌科如粘質沙雷氏菌，都可用于產生一種含"超級"HAS的宿主。一般來講，含有復制起點和與宿主細胞相容的調控序列的質粒載體可與這些宿主一起使用。載體一般帶有復制起點和能給轉化細胞提供表型篩選標記的序列。例如典型的pBR322轉化大腸桿菌，該質粒來自大腸桿菌菌種。pBR322含有氨芐和四環素抗性基因便于鑒別轉化的細胞。pBR質粒或pUC質粒，或其它微生物的質粒或噬菌體必須含有或經修飾后含有可用于表達該微生物自身蛋白的啟動子。通常用于重組DNA構建的啟動子包括lacZ啟動子，tac啟動子，T7噬菌體啟動子，色氨酸啟動子系統。這些是最常用的啟動子，其它微生物的啟動子也已被發現和應用，有關其核酸序列的詳細資料已出版，熟練的技術人員能夠將它們與質粒載體進行有功能的連接。本發明也可應用整合載體。除原核細胞外，也可選用真核微生物如酵母培養物。盡管一些其它菌株通常也可獲得，但釀酒酵母，或普通面包酵母是真核微生物中最常使用的。如質粒YRp7常用在釀酒酵母中表達。這種質粒已含有trpl基因，該基因為無色氨酸不能生長的突變酵母菌株如ATCCNo.44076或PEP4-1提供了篩選標記。有trpl缺失特性的酵母宿主細胞基因組為檢測無色氨酸生長轉化提供了有效的環境。酵母載體中合適的啟動序列包括半乳糖利用基因的啟動子，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸異構酶，3-磷酸甘油酸歧化酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構酶，磷酸葡萄糖異構酶和葡萄糖激酶。構建合適的表達質粒時，與這些基因相關的終止序列也連于表達載體上待表達序列的3'端，以提供mRNA多腺苷酸化位點和終止位點。具有由生長條件調控轉錄的優點的另一些啟動子是醇脫氫酶2，細胞色素C，酸性磷酸酶，與氮代謝相關的降解酶，和上述的甘油醛-3-磷酸脫氫酶，及負責麥芽糖和葡萄糖代謝的酶。任何含有酵母相容啟動子，復制起點和終止序列的質粒載體都適用。除微生物外，培養的源自多細胞生物的細胞也可以用作宿主。原則上，無論是來自脊椎動物或無脊椎動物的培養細胞都可用。然而脊椎動物細胞引起了更大的興趣，而且近年來脊椎動物細胞的繁殖培養形成了固定的程序。有用的宿主細胞系包括VERO和Hela細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，和WI38,BHK,COS及MDCK細胞系。用于哺乳動物細胞的表達載體的調控功能通常來自病毒。例如，通常使用的啟動子來自多形瘤，腺病毒2，牛乳突狀瘤病毒，和最常使用的猿猴空泡病毒(SV40)。SV40病毒的早期啟動子和晚期啟動子尤其常用，因為它們易于從病毒中獲得，且該片段中還含有SV40病毒的復制起點。也可用含有從病毒復制起點內的HindIII位點到Bgll位點約250bp的序列的稍大或稍小的SV40片段。此外，可行且通常更愿意使用的是與目的基因序列正常相關并與宿主細胞系統相容的啟動子或調控序列。含外源基因起點的載體構建，例如可能是SV40或其它病毒(如，多形瘤，腺病毒，BPV)來源或宿主細胞染色體復制機制都可提供一個復制起點。如果載體整合到宿主細胞染色體，后者的機制通常是足夠的。C.從有大量莢膜包裹的C組類馬鏈球菌株中分離可信的HA合酶基因編碼的長417個氨基酸名為seHAS的蛋白(計算的分子量為47，778，等電點9.1)，是HAS家族中至今所鑒定的最小成員(圖2)。seHAS在SDS-PAGE中遷移率異常快(M廣42kDa)(圖5，8)。圖8代表重組seHAS與特異抗體反應的WesternBlot分析結果。含有重組seHAS(E;泳道2，7，9)或spHAS(P;泳道3，6,8和10)的C組(C;泳道l)或A組(A;泳道4)鏈球菌胞膜和大腸桿菌胞膜(9mg/道)通過還原性SDS-PAGE離散，電轉于硝酸纖維素膜上。按應用程序用純化的IgG組分探測并顯色硝酸纖維素膜條帶，所述IgG組分針對spHAS的下列區域產生中心結構域肽EI47-T161(l-4道);C端肽(5-6道)；完整蛋白(7，8道)；重組中心結構域(9，10道)。非免疫IgG或僅用載體轉化的細胞的膜如5道中所示無顯色。seHAS和spHAS蛋白(曾在U.S.申請08/899,940中被鑒定)有72%的編碼序列相同。推導的seHAS蛋白序列通過與一種合成肽抗體反應得到確證(圖8)。在大腸桿菌中表達的重組seHAS作為一種主要的膜蛋白得到回收(圖5)，其在體外在UDP-GlcNAc和UDP-GlcA存在的條件下合成的HA分子量很大(圖9)。圖9顯示的是seHAS和spHAS產生的HA的大小分布動力學分析。根據應用程序將含有等量seHAS或spHAS蛋白的大腸桿菌胞膜與1.35mMUDP-[14C]GlcA(1.3xl03dpm/nmol)禾卩3.0mMUDP-GlcNAc于37'C溫育。這些底物的濃度是相應Km閾值的15倍以上。將分別于0.5,1.0和60分鐘取的樣品進行SDS處理后，在SephacrylS400HR柱上進行層析。將在該柱的分級分離范圍(組分12-24)內的HA曲線圖校正到每一組分中HA總量的百分數。圖頂箭頭上方的值是HA的分子量(以一百萬為單位)，該值是用Dawn多角激光散射儀(Wyatt技術公司)獨立試驗測得的。0.5分鐘(〇，參)，1.0分鐘(口，睡)和60分鐘(一，A)取樣的seHAS(參，■，▲)和spHAS(O，□，J)合成的HA大小分布如圖所示。分析說明seHAS和spHAS在它們合成的HA鏈的大小分布上基本相同(圖9)。SeHAS生成HA的能力是spHAS的兩倍。C.l細菌菌株和載體粘液樣C組菌株D181(類馬鏈球菌)來自洛克菲勒大學收藏。大腸桿菌宿主菌株Sure和XL1-BlueMRF來自Stratagene,菌株ToplOF來自Invitrogen。除非特別說明，鏈球菌培養于THY，大腸桿菌菌株培養于LB培養基中。pKK223表達載體來自Pharmacia,PCR2.1克隆載體來自Invitrogen,預消化的人ZapExpressTMBamHI/CIAP載體來自Stratagene。C.2重組DNA和克隆用Sau3Al部分消化通過Caparon和Scott法(為本領一般技術人員所熟知)分離的高分子量類馬鏈球菌基因組DNA，形成平均大小為2-12kb的片段。乙醇沉淀消化的DNA，洗后連接于BamHI/CIAPAZap表達質粒。用購自Promega的Packagene抽提物將連接的DNA包裹到噬菌體中。用XLl-BlueMRF大腸桿菌作宿主檢測包裝噬菌體文庫的滴度。C.3簡并PCR擴增簡并寡核苷酸序列根據spHAS(化膿鏈球菌)，DGr2(Ze"印w/^v"HAS;19)和nodC(草木犀根瘤菌成節瘤因子;20)的保守序列設計，用于以D181基因組DNA為模板的PCR擴增。擴增條件是94°C1分鐘，44'C1分鐘，72'C1.5分鐘進行34個循環，最后于72"C延伸10分鐘。寡核苷酸HADRF1，5，-GAYMGAYRTYTXACXAATTAYGCTATHGAYTTRGG-3，(SEQIDNO:20;有義鏈)與序列D259RCLTNYAIDL(SEQIDNO:9;spHAS)相應。寡核苷酸HACTRl，5，-ACGWGTWCCCCANTCXGYATTTTTNADXGTRCA-3，(SEQIDN0:21;反義鏈)與區域C4。4TIKNTEWGTR(SEQIDNO:10;spHAS)相應。某些位置堿基的簡并性由IUPAC采用的命名法用表IV中簡并性堿基的密碼子代表。表ivIUPAC密碼子-簡并性堿基國際理論應用化學聯合會建立了一套標準的簡并性堿基的單字母命名法。如下<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>X-次要堿基(別處說明)Y=C+T這兩種寡核苷酸產生一條459bp的PCR產物，用瓊脂糖凝膠分離并用BIO-lOlGeneclean試劑盒純化該產物。根據廠商說明以TOP10F為宿主細胞，將該片段克隆到PCR2.1載體上。用QIAfilterPlasmidMidi試劑盒從大腸桿菌(Top10F')中純化雙鏈質粒DNA。另外還合成了兩條簡并性有義引物HAVAF1，5'-GTNGCTGCTGTWRTXCCWWSXTWTAAYGARGA-3'(SEQIDNO:22,與spHAS的V66-AAVIPSYNE(SEQIDNO:ll)區域相關)和HAVDFl，5'-GTXRWTGAYGGNWSXWSNRAXGAXGC-3'(SEQIDNO:23，根據spHAS的V，DDGSSNTD(SEQIDNO:12))。兩個獨特的反義引物是根據459bp的PCR產物合成的。它們是:D18L2,5'-GAAGGACTTGTTCCAGCGGT-3'(SEQIDNO:13)和D181.4，5'-TGAATGTTCCGACACAGGGC-3'(SEQIDNO:14)。用任一簡并有義引物和D181.2或D181.4擴增D181基因組DNA都可得到預期大小的PCR產物。用與上文相同的策略克隆并測序四個PCR產物。比較來自六個不同克隆的PCR產物中的每一個序列以找出其保守序列。這樣我們獲得了一條與spHAS高度同源，長1042bp，有連續ORF的序列。C.4文庫篩選用兩個分子探針篩選文庫；所述探針為克隆的459bpPCR產物和寡核苷酸D181.5(5'-GCTTGATAGGTCACCAGTGTCACG-3'(SEQIDN0:15);來自1042bp序列)。根據廠商說明用Prime-It11隨機引物標記試劑盒標記459bp的PCR產物。用[Y32P]ATP，Kinace-ItKinasing試劑盒標記寡核苷酸。通過NucTrapPush柱(Stratagene)分離標記的產物和未標記的產物。寡探針與Southern印記上的D181基因組消化物特異性雜交。篩選i噬菌體文庫時，XLBLUEMRF作為吸附有噬菌體的硝酸纖維素膜上的宿主(3000個噬菌斑/板)，在6(TC預雜交后，根據說明在QuikHyb雜交溶液中與5'-末端標記的寡核苷酸D181.5在80'C雜交。室溫下用2xSSC緩沖液和0.1%(w/v)SDS洗膜15分鐘，60°C用O.lxSSC緩沖液和0.1。/oSDS(w/v)洗30分鐘，烘干后于-7(TC用Bio-MaxMs膠巻曝光過夜。陽性噬菌斑重新鋪板再篩選兩次。將純陽性噬菌斑保存于含氯仿的SM緩沖液中。用載體引物PCR這些噬菌斑可發現3種不同的插入大小。用重組載體引物和來自1042bp序列不同區域的引物PCR發現三種不同的噬菌體中只有一種有完整的HAS基因。這種噬菌體的插入片段有6.5kb。當試圖通過從挑選的噬菌體文庫克隆中自動切除的方法將插入片段亞克隆到質粒的形式中時失敗了。因此又用PCR策略從純陽性噬菌體DNA中擴增得到5'和3'ORF末端。寡核苷酸引物D181.3(5'-GCCCTGTGTCGGAACATTCA-3'(SEQIDNO:16》和T3(載體引物)擴增出一條3kb的產物，而寡核苷酸D181.5和T7(載體引物)擴出一條2.5kb的產物。測序上述兩個產物得到該ORF的5'和3'末端序列。分析所有PCR產物序列，我們重新構建了1254bpseHAS基因的ORF。C.5seHAS的表達克隆設計的引物在seHAS的起始和終止密碼子區域，有義寡核苷酸(5'-AGGATCCGAATTCATGAGAACATTAAAAAACCTC畫3'(SEQIDNO:17))包含一個EcoRI限制性位點，反義寡核苷酸(5'-AGAATTCTGCAGTTATAATAATTTTTTACGTGT-3'(SEQIDNO:18))包含一個Pstl位點。從D181基因組DNA和純雜交陽性噬菌體用這些引物擴增出一條1.2kb的PCR產物。此1.2kb的產物經瓊脂糖凝膠電泳純化，Pstl和EcoRl消化后，直接克隆到Pstl和EcoRl消化的pKK223載體。用連好的載體轉化生長于30'C的大腸桿菌SURE細胞。由于其它宿主細胞或較高的溫度會導致克隆的插入片段丟失，所以這一步尤其重要。分離菌落并純化其DNA。六個菌落中(名為a，b，c,d,e，f)五個有正確大小的插入，一個沒有。C.6HA合酶的活性用從上述五個克隆制備的膜分析HA合酶的活性。以3000g收集新鮮的對數生長期的細胞，PBS4t洗后用為本領域一般技術人員熟知的改良原生質法分離胞膜。從化膿鏈球菌和類馬鏈球菌中制備的胞膜是用一種不同的改良原生質法獲得的。將膜于含20mMMgCl2,lmMDTE，120uMUDP-GlcA禾Q300uMUDP-GlcNAc的50mM磷酸鈉和磷酸鉀，pH7.0中，37。C溫育。用UDP-["C]GlcA(318mCi/mmol;ICN)和/或UDP-[3H]GlcNAc(29.2Ci/mmolNEN)檢測糖的摻入。加入終濃度為2%的SDS終止反應。用下行紙層析法分離前體分子形成的HA產物，并通過測定開始摻入的放射活性來檢測。C.7凝膠過濾分析用SephacrylS500HR(Pharmacia生物技術公司)柱(0.9x40cm)層析分析由含重組seHAS或spHAS的膜在體外生成的放射標記的HA.。樣品(0.4ml于200mMNaCl，5mMTris-HCl，pH8.0，加5%SDS中)用pH8.0的200rnMNaCl,5mMTris-HCl溶解，取0.5ml組分測定"C和/或3H的放射活性。用鏈霉菌&^ptow2_yc"/^a/wra/Wc^的HA特異性透明質酸裂解酶(EC4.2.2.1)于37t處理另份同樣的樣品3小時以評價HA多糖的真實性。然后凝膠過濾消化物。C.8SDS-PAGE和Western印跡根據Laemmli法進行SDS-PAGE。用Bio-RadminiTransblot裝置在加有20%甲醇的標準印跡緩沖液中電轉到硝酸纖維素膜上。在TBS緩沖液中用2%BSA封閉膜。用蛋白A/G堿性磷酸酶綴合物(Pierce)和p-氮藍四唑/5-溴-4-氯-3吲哚磷酸p-甲苯胺鹽顯色。C.9DNA測序和分析用熒光標記的載體引物測序質粒的兩條鏈。測序反應在熒光標記引物(有7-deazaG)用的試劑盒中進行。在PharmaciaALF表達DNA測序儀中電泳樣品，用ALF管理軟件v3.02分析數據。根據內部引物用ABIPrism377(軟件版本2丄1)測序插入片段的內部區域。不確定的區域用Sequenase7-deaza-DNA聚合酶，7-deazaGTPmastermix(USB)和[a-35S]dATP(Amersham生命科學)手工測序。獲得的序列用DNASISv2.1(Hitachi軟件工程公司，有限公司)編輯分析。核苷酸和氨基酸序列與Genbank和其它數據庫進行了比較。C.10鑒定seHAS根據spHAS,DG42(現已知是一種發育調節的HAS，命名為xlHAS)和Nodc(—種根瘤菌P-GlcNAc轉移酶)的幾個高度同源區合成的引物用PCR的方法完成seHAS的鑒定。xlHAS和NodC蛋白分別與spHAS有約50%和約10%的相同性。由此策略產生的459bpPCR產物與spHAS有66.4%相同，這說明A組(spHAS)HA合酶基因的一種C組同系物已被檢測出來。再用相同的PCR策略重新構建該基因完整的編碼區。最后一套PCR引物用于從基因組DNA中擴增完整的ORF。將此1.2kb的PCR片段連到表達載體pKK223上并轉化到大腸桿菌SURE細胞后，從5個被檢測的菌落中分離出的胞膜中都顯示有HA合成活性。重構建的基因的ORF編碼一種預計為417個氨基酸的新蛋白，它不存在于數據庫中且比spHAS少兩個氨基酸。這兩種細菌蛋白有72%的相同性，核酸序列有70%的相同性。預測seHAS蛋白分子量是47，778，等電點是pH9.1。最近鑒定的三個哺乳動物HASs(muHAS1，muHAS2，muHAS3,圖2)與該細菌蛋白相似。兩組的總體相同性為約28-31%，而且seHAS的許多氨基酸與真核HASs(如K/R或D/E取代)高度保守。A98R是PBCY-lHAS,與哺乳動物的HASs有28-33%的相同性，預測其在脂膜中有相似的拓撲結構。在哺乳類中相同的家族成員幾乎完全相同(如muHASl和huHASl有95%相同；muHAS和huHAS2有98%相同)。然而如圖3所示即使是在同物種中不同的HAS家族成員也有較大的離異度(如muHASl和muHAS2有53%相同；muHASl和muHAS3有57%相同；muHAS2和muHAS3有71%相同)。圖10顯示了seHAS親水性圖和預測的膜拓撲結構。C組鏈球菌HAS的親水性圖是根據Kyte和Doolittle法(J.Mol.BioU57，105,1982)用DNAsis制作的。預測該蛋白是整合膜蛋白。圖11顯示了膜中seHAS拓撲結構構成的模型。預測的蛋白拓撲結構符合電荷在內原則，將大的中心結構域包在內部。這個結構域可能含有酶的大部分底物結合位點和催化功能區。seHAS的在所有的HAS家族成員中是保守的Cys226和其它三個半胱氨酸出現在中心結構域。Cys281很關鍵，它的改變會極大的改變該酶合成的HA產物的大小分布。預測的seHAS總的膜拓撲結構與spHAS及迄今所報道的真核HASs相似。該蛋白在氨基末端有兩個推測的跨膜區，在羧基端有2-3個膜相關或跨膜結構域。兩個鏈球菌酶的親水圖基本相同，同時也說明在預測seHASK313-R4Q6(spHAS的K化-K,約90個殘基的極度親水性區域的拓撲結構方面的困難性。seHAS在大腸桿菌細胞中得到有效表達。通過SDS-PAGE凝膠染色估算大約總膜蛋白的10%是seHAS(圖5)。在僅有載體的對照泳道中無明顯的42KDseHAS條帶。膜蛋白這種不同尋常的高水平表達在用相同的載體于SURE細胞中表達spHAS時也體現出來。在大腸桿菌SURE細胞中，約8。/。的膜蛋白是spHAS。相反的，C組膜中的seHAS的表達量不到總膜蛋白的1%。A組膜中的spHAS幾乎檢測不到。由于大腸桿菌SURE細胞缺少合成HA所需的底物UDP-GlcA，在該細胞中重組seHAS不合成HA。當提供有底物UDP-GlcNAc和UDP-GlcA時，含有重組seHAS蛋白的膜可以合成HA(圖12)。圖12說明重組seHAS合成HA的真實性。取含重組seHAS或空載體的大腸桿菌的細胞膜(69ug)與終體積200ul的700uMUDP-[3H]GlcNAc(2.78x.103dpm/腦ol;口,10和300uMUDP-[14C]GlcA(3,83x103dpm/nmol;0，參)在37。C溫育一小時。加入終濃度25mM的EDTA終止酶反應。在37。C用鏈霉菌透明質酸酶處理一半的反應混合物3小時。在透明質酸酶處理的(〇，□)和未處理的(參，■)的樣品中加入SDS(2Q/。，w/v)并于9(TC加熱一分鐘。樣品用500ul柱緩沖液(5mMTris,0.2mMNaCl,pH8.0)溶解，離心澄清，將200ul注入SephacrylS-500HR柱中。收集過柱組份(lml),測放射活性。BD是峰洗脫溶液位置，即藍色右旋糖的位置(約2x106DA;Pharmacia)。Vc5代表柱空隙體積，Vi代表填料微孔體積。摻入柱中分級分離的HA總量的["C]GlcA^H]GlcNAc的比率是1.4，此值與兩底物比活性的比率相同。因此，結合到真實HA產物中的糖的摩爾比正如預測值是1:1。空載體轉化的細胞的膜不能合成HA。加入120uMUDP-GlcA和300uMUDP-GlcNAc，HA的合成在至少一小時內與膜蛋白(幼.微克)呈線性關系。同樣的，用非轉化細胞或空質粒轉化的細胞制備的膜不能檢測到HAS活性。如果Mgw被EDTA螯和(<對照的5%)或缺失任一種底物(對照的約2%)，HA不能合成。重組seHAS也顯示出預期的糖核苷酸底物特異性，在任何一種底物存在條件下不能聚合UDP-GalA,UDP-Glc或UDP-GalNAc的任何一個(表II)。根據凝膠過濾分析，分離的膜中的seHAS合成的HA平均分子量是5-10x106Da。根據與糖的等摩爾結合和其對特異的鏈霉菌透明質酸酶的降解敏感性，判斷重組seHAS的產物確是HA(圖12)。盡管總HA合成的條件并不優化(既約90%的一種底物結合到產物上)，但此酶產生的HA鏈長有較寬的分布。峰組分與含有約36，000個單糖的7.5x106Da的HA分子量相關。由柱分辨的HA大小分布范圍是2-20x106Da。推導的seHAS蛋白序列被能與C組蛋白交叉反應的spHAS蛋白抗體確證(圖8)。整個spHAS蛋白或spHAS的中心結構域的多克隆抗體也可與seHAS蛋白反應。spHASC端的抗肽抗體不能與seHAS蛋白的稍有變異的區域交叉反應。然而，抗spHAS序列E147-T161的抗肽抗體可識別seHAS中相同的預測序列。抗肽抗體同樣可與鏈球菌膜中的天然seHAS和spHAS反應，并確證了來自同物種的天然和重組酶大小相同。與spHAS蛋白相同，seHAS在SDS-PAGE遷移的異常快。盡管計算出的分子量是47，778Da,SDS-PAGE推出的Mr—直為約42kDa。由于預測的兩種細菌的酶的中心結構域區域的序列相同及總體結構相同，抗E147-T161區域的肽的特異性抗體可用于校正從兩種不同酶基因轉化的細胞制備的膜中的HAS蛋白表達。用這種方法可以比較含有基本相同量的重組spHAS或seHAS的膜各自的HA起始合成速率及HA產物的大小分布。如spHAS所示，seHAS合成HA鏈是逐步的。直到HA形成最終產物釋放來，酶似乎一直與延伸的HA鏈相聯系。因此，在HA鏈合成的第一輪過程中，通過檢測初始形成的HA鏈的大小分布，可以比較seHAS和spHAS的HA延伸速率。根據不同時間HA大小的凝膠過濾分析，我們估算seHAS的平均延伸速率約是37°C9000個單糖/分鐘(圖9)。5分鐘內，此酶能聚合一條5-10x106Da的HA鏈。在60分鐘的溫育過程中，每個酶分子都具有依次起始，完成，釋放5-8個如此大的HA分子的潛能。在反映第一個HA鏈的延伸的早期(例如，《l分鐘)，seHAS生成的HA的大小分布與spHAS相比偏向較大的HA。60分鐘時兩個HA大小的分布無明顯差異。克隆的seHAS代表了正確的C組HA合酶。因此以前報道的或揭示的"C組"蛋白并非真正的C組HAS。seHAS蛋白與現在已知的九種來自細菌，脊椎動物和病毒的HA合酶同源，這些組成了快速增加的HA合酶家族。這種同源性在圖2中特別說明。在哺乳動物中三個命名為HAS1,HAS2，HAS3的基因已被鑒定，在人和鼠中被繪圖于三個不同的染色體上。在兩棲類中迄今唯一被鑒定的HAS蛋白是發育調控的DG42，它于1988年被克隆，并在最近通過酵母膜中重組蛋白的分析顯示出編碼HA合酶的活性。可能其它X.laevusHAS基因會很快鑒定出來。一種變異進化模型表明一種遠古的細菌HAS前體可能在脊椎底物發育時期被強占或如果遠古的細菌被包在原始的HAS中，逐漸形成了細菌產生HA莢膜的致病機理。細菌和真核的HAS酶有同一的進化方向形成同樣結構的結果似乎是不可能的，但卻發生了。哺乳動物三種HAS同工酶還未通過各自的HA產物大小進行酶的定性。至少十種己鑒定的HAS蛋白預測是有相似拓撲結構的膜蛋白。HA在質膜中合成，然后HA或進入培養基或與細胞保持聯系形成細菌莢膜或是真核細胞細胞衣。細胞質中的糖核苷酸底物用于合成HA伸出到膜外空間的鏈。HA蛋白極端疏水的羧基部分的蛋白拓撲結構在說明這些酶如何延伸HA鏈的同時使鏈伸出膜外時似乎很關鍵。例如，極大的酶活力可能需要特別的和復雜的蛋白與脂雙層的相互作用。堿性磷酸酶融合蛋白的初步分析結果說明氨基和羧基末端及大的中心結構域均在胞內，如圖lO和ll。seHAS蛋白也有一個包含兩個底物結合位點和兩個HA合成所需的糖基轉移酶活力的大中心結構域(總蛋白的約63%)。盡管現行軟件程序不能可信的預測C末端疏水區的膜相關結構域的本質或數量。推測的拓撲結構符合現在的證據，并可應用于真核生物的酶，由于該酶C端多兩個推測的跨膜結構域，故約大40%。spHAS的四個Cys殘基與seHAS同樣保守。僅Cys225在所有HAS家族成員的兩種酶中都是保守的。由于巰基反應試劑如p-mercurobenzoate或NEM可極大程度地抑制酶活，因此這個保守的Cys對酶活很必要或重要。然而，定點突變研究的初步結果表明spHAS的C225S突變仍有5-10%的野生型活力。用特異的寡核苷酸測得的僅編碼seHAS，spHAS或編碼seHAS和spHAS的核酸序列如圖13所示。三對有義-反義寡核苷酸是根據IDSEQNO.l的序列和spHAS編碼序列設計的。seHAS的核酸區段(sel-se2和sespl-sesp2)如圖14所示。這三對寡核苷酸在典型PCR反應中與C組鏈球菌(seHAS)基因組(2，4，6泳道)或A組(spHAS)基因組G，5，7泳道)DNA雜交。用TaqDNA聚合酶(來自Promega)進行25個循環的PCR:94°C1分鐘使DNA變性，48°C(較小的普通sesp引物42。C進行)雜交1分鐘，72。CDNA合成一分鐘。再通過1%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR反應混合物。sel-se2引物對是特別為C組HAS(seHAS)設計的。spl-sp2引物對是特別為A組HAS(spHAS)設計的。sespl-sesp2引物對是為雜交A組和C組核酸序列設計的。三對引物如預期的表現出交叉雜交的活力，有利于產生特異的或單一的PCR產物。特異性PCR或雜交的寡核苷酸如圖14所示。合成的SEQIDNOS:3,4，5,6寡核苷酸出現在SEQIDNO.l的相關區域。#1表示有義方向的引物，而#2表示反義方向的引物。四個寡核苷酸中任一個都可與seHAS序列特異雜交，適當的有義/反義引物對都適用于聚和酶鏈反應，如圖13所示。酵母膜中表達的重組HAS所合成的透明質酸的凝膠過濾分析如圖7所示。將編碼與spHAS(將原來的Val密碼子換為Met)相關的，長419個氨基酸殘基的開放閱讀框架的DNA區段亞克隆到酵母表達載體pYES2(來自Invitrogen)形成pYES/HA。用玻璃珠攪動法制備含此結構的細胞的膜。來自pYES/HA結構的樣品含有充分的HA合酶活性，用特異抗體通過Western分析檢測"42kDa"HAS蛋白;空質粒轉化的細胞的膜既無活性也無免疫反應的條帶(無圖例)。膜(315ug蛋白)先與無載體UDP-[14C]GlcA(luCi"C)和溶于pH750mMTris的900uM未標記的UDP-GlcNAc，20mMMgCr2，lmMDTT及0.05MNaCl(450ul的反應體積)30'C溫育1.5分鐘。脈沖標記后加入終濃度900uM的未標記的UDP-GlcA。"追蹤"后分別于脈沖1.5分鐘(黑圈)，15分鐘(黑正方形)，45分鐘(黑三角形)時取樣。加入終濃度2%的SDS并于95°C1分鐘終止反應。離心(10，OOOxg)澄清樣品后再注入一半的樣品于0.2MNaCl,pH8的5mMTris平衡的SephacrylS-500HR凝膠過濾柱(Pharmacia;1x50)。以0.5ml/分的速度洗脫柱子，加入BioSafeIIcocktail(4.5ml,ResearchProductsIntl.)用液閃計數法定量每組分(1ml)的放射性。洗脫體積中的柱空隙體積和總填料微孔體積各為14ml和35.5ml。藍色右旋糖的峰洗脫體積在25-27ml之間。真核酵母細胞表達的重組HAS在體外產生高分子量的透明質酸。因此很顯然，依照本發明提供的含有酶學活性的HAS的編碼區的核酸區段，由seHAS基因產生透明質酸的方法及seHAS基因編碼的HAS所產生的透明質酸的用途，會充分滿足多種目標，實現上文所述的優點。盡管本發明結合了實施方案來描述，但是顯然對本領域的熟練技術人員而言，選擇，修飾和改變是顯而可行的。因而，在下文權利要求的本質與廣泛的范圍之內涵蓋了所有這些選擇、修飾和改變。atgagaacatraaaaaacctcataactgttgtggcctttagtatttrttgggtactgttgjmtacgtcaat72gtttatctctttggtgctaaaggaagcttgtcaatttatggctttttgctgatagcttacctattagtcaAa"4atgtccttatcctttttttacaagccatrtaagggaagggctgggcaatataaggttgcagccattmtccc2i6tcttataacgargmgctgagtcattgctagagaccttaa^aagt6ttcagcagcaaacctatcccctagca288gaaatttatgtrgttcacgatggaagtgctgatgagacaggtattaagcgcattgragact7vtgtgcgtgac360actggtgacctatca^gcaatgtcattgttcatcggtcagagaaaamcaaggaaagcgtcatgcacaggcc432tgggcctttgaragatcagacgctgatgtctttttgaccgttgactcagatacttmatctaccctgatgct5d4ttagaggagttgttaaaaacctttaatgacccractgtttttgctgcgacgggtcaccttaatgtcagaaat5"7gagacaaaccaatctcttaacacgcttgacagatattcgctatgataatgcttttggcgttgwvcgagctgcc648caatccgttacaggtaatatccttgtttgctcaggtccgcttagcgtttacagacgcgaggtggttgttcct720aacatagmagatacatcaaccagaccttcctgggtattcctgtaa(jtattggtgatgacaggtgcttgacc792wvctatgcaactgatitaggaaagactgtttatcaatccactgctaaatgtattacagatgttcctgacarg864atgtctacttacttgaagcagcaaaaccgctggaacaagtccttctttagagagtccattatttctgttaag93"6aarrtcatgaacaatccttttgtagccctatggaccatacttgaggtgtctatgtttmgatg'cttgtttat1008tctgtggtggatttctttgtaggcartgtcagagwvtttgattggctcagggttttagcctttctggtgatt1080atcttcattgttgccctgtgtcggaacattcattacatgcttaagcacccgctgtccttcttgttatctccg115.2ttttatggggtgctgcatttgtttgtcctacagcccttgramtatattctctttttactattagaaatgct1224gactggggarcacgtaaaaaattattataa1254序列號lMRTKWITVVAfsIWIVVYFGAKGSs工YGF工AYV48PFKGRAG0KVAAIIP72SYNEDAES!<￡TKSV00TYPl>A96EIVVDDGSADETGIKRIEDYVRD120TGDSSNVIVHRSEKNQGKRHA0A1"WAFERSDADVTVDSDTyYPDA168LEEKTNDPVAATGHVR192RQT1'RTDRYDNAGVERAA2160sV丁GNI1>VCGPSVYRREVVVP240NINYDAY1NGQTFGIPVS1GDDRCLT264TDCITDVPDVK288312MSTKQQNWWKSFRES衛工SKKIHPFVAWTILEVSMV3365VVDfFVGNVP.￡FWRVFV360IFIVCK、'LKHPLSLsP384FYGV1>HFVPN308DWGTR"，序列號2序列號35'-GCTGATGAGACAGGTATTAAGC引物sel(有義，核苷酸G3"-C337)序列號45,-ATCAAATTCTCTGACATTGC引物se2.(反義，相應于有義鏈核苷酸g1mi-T1M0)序列號55,-GACTCAGATACTTATATCTA引物sespl(有義，核苷酸G475-A4M)序列號65'-TTTTTACGTGTTCCCCA引物sesp2(反義，相應于有義鏈核苷酸T12M—A1244)A98R的蛋白質序列，pbcv-1ha合酶1MGKNIIIMVSWYTIITSNIiIAVGGASLILAPAITGYVL冊WIALSTIWGVSAYGIFVFGE*61EXAQVLFSELHRKRLRKWISLRPKGHNDVRLAVIIAGYREDPYMFQKCLESVRDSDYGNV121ARLICVIDGDEDDDMRMAAVYKAIYN隠KKPEFVLCESDDKEGERIDSDFSRDICVLQP181HRGKRECIiYTGFQIAKMDPSVNAWLIDSDTVLEKDRILEWYMACDPEIQAVAGECKI241WNTDTLLSLLVAWRYYSAFCVERSAQSETRTVQCVGGPLGAY咖IKEIKDPWISORFLG301QKCTYGDDRRLTHEILMRGKKWFTPFAVGWSDSPTNVFRYIVQQT服SKSWCREIWVTL361FAAWKHGLSGIWLAFECLY。rSRIAVEADPRAQTATVIVSTTVALIKCGY421rSFRAKDIRAFyFVLYTFVYETCMIPARITAMMTLWDIGWDTRGGNEKPSVGTRVALWAK481QYLIAYMWWAAWGAGVYSIVHNWMFDWMSLSYRFALVGICSYIVFIVIVliWYFTGKIT541TWNFTKLQKELIEDRVLYDATT肌QSV567序列號7PBCV—1病毒基因組中A98R基因的核苷酸序列起始ATG50901終止TGA526(H50881aagacttcttgaaagttacaATGggtaaaaatataatcataatggtttcgtggtacacca509"tcataacttcaaatctaatcgcggttggaggagcctctctaatcttggctccggcaatta51001ctg^gtatgttctacattggaatattgctctctcgacaatctggggagtatcagcttatg51061gtattttcgttttt卿tttttccttgcacaagttttattttcagaactgaacaggaaac51121gtcttcgcaagtgg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GTGRATACMCATTTTTGIVTAATCATGACRGCCTATTCGTtRRRAATGACAGC823.YAYMKKYDVGMNFSALTHDWIEK2467TftTGCTTATATGAAAAAATATGATGTCGGCATGAATTTCTCAGCATTAAC^CATGATTGGATCGAGAAR846INAHPPFKKLIKTVFND.ND丄KSM2536ATCAATGCGCaTCCACCATTTAAAAAGCTCMTAAfiACTTATTTTAATGACAATGACTTMAAAGTATG869NVKGASQGMFMTYALAHELLTII2605AATGTGAAAGGGGCRTCACAAGGTATGTTTATGACGTATGCGCTAGCGCATGAGCTTCTGACGATTATT892KEV.ITSCQSIDSVPEVWTEDIWF2674AAAGAAGTCATCACATCTTGCCAGTCAATTGATAGTGTGCCAGAATATAACACTGAGGATAmGGTTC915QFALIilliEKKTGHVFNKTSTLTY2743CARTTTGCACTTTTAATCTTAGMAAGAAAACCGGCCATGTATTTRATAAARCATCGACCCTGACTTAT938MPWERKLQWTHEQIESAKRGENI2812ATGCCTTGGGMCGAAAATTACMTGGACARATGARCAAATTGAAAGTGCAAAAAGAGGAGAMATATA961PVHKFIINSITL*.2881CCTGTTAACAAGTTCATTATTAATAGTATAACtpTATAA序列號19(3/3)權利要求1.一種產生透明質酸的重組方法，其包括以下步驟提供具有至少一種包含編碼酶學活性的透明質酸合酶的核酸區段的表達構建體的重組宿主細胞，其中所述核酸區段選自(a)編碼SEQIDNO2的類馬鏈球菌透明質酸合酶的核酸區段；(b)SEQIDNO1的核苷酸序列；(c)編碼一種蛋白質的核酸區段，所述蛋白質是通過在SEQIDNO2的氨基酸序列中進行一個或幾個氨基酸的替換、缺失或添加而衍生自SEQIDNO2的蛋白質、并具有SEQIDNO2的透明質酸合酶活性的蛋白質；和(d)能夠與SEQIDNO1的互補序列在1.2-1.8×HPB、溫度為約40℃至約50℃的標準雜交條件下雜交的核酸區段，且所述核酸區段編碼的蛋白質具有由SEQIDNO1編碼的蛋白質的透明質酸合酶活性；和在適于產生透明質酸的條件下培養所述重組宿主細胞。2.權利要求l的方法，還包括分離來自所述重組宿主細胞的透明質酸的步驟。3.—種產生透明質酸的重組方法，其包括以下步驟將具有編碼酶學活性的透明質酸合酶的編碼區的純化核酸區段導入宿主細胞中，其中所述核酸區段選自(a)編碼SEQIDNO:2的類馬鏈球菌透明質酸合酶的核酸區段；(b)SEQIDNO:1的核苷酸序列；(c)編碼一種蛋白質的核酸區段，所述蛋白質是通過在SEQIDNO:2的氨基酸序列中進行一個或幾個氨基酸的替換、缺失或添加而衍生自SEQIDNO:2的蛋白質、并具有SEQIDNO:2的透明質酸合酶活性的蛋白質；和(d)能夠與SEQIDNO:l的互補序列在1.2-1.8XHPB、溫度為約4(TC至約5(TC的標準雜交條件下雜交的核酸區段，且所述核酸區段編碼的蛋白質具有由SEQIDNO:l編碼的蛋白質的透明質酸合酶活性；使所述宿主細胞在培養基中生長以分泌透明質酸；和回收所分泌的透明質酸。4.權利要求3的方法，其中回收透明質酸的步驟包括自培養基中提取所分泌的透明質酸。5.權利要求4的方法，還包括純化所提取的透明質酸的步驟。全文摘要本發明涉及具有編碼酶學活性的類馬鏈球菌透明質酸合酶(seHAS)的編碼區區段的核酸區段，以及該核酸區段在制備產生透明質酸合酶和其透明質酸產物的重組細胞中的應用。透明質酸(hyaluronate)也稱為透明質酸(hyaluronicacid)或者透明質酸(hyaluronan)。文檔編號C12N1/21GK101113436SQ200710108770公開日2008年1月30日申請日期1998年10月30日優先權日1997年10月31日發明者保羅·H·韋格爾,保羅·迪安吉利斯,卡沙瑪·庫馬里申請人:俄克拉何馬大學董事會