具有提高產率及免疫原性的重組蛋白質表達系統(tǒng)的制作方法

專利名稱：：具有提高產率及免疫原性的重組蛋白質表達系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及具有提高產率及免疫原性重組蛋白質的表達系統(tǒng)。技術背景由于越來越多諸如重組蛋白質的產品核準或即將核準用于人類，對于高效率生產治療用生物制劑的需求在穩(wěn)定地增加中。細菌發(fā)酵工藝自過去到現(xiàn)在仍是生產此等類型分子的主要工具。將生產工藝最佳化的主要目的是要以最低的成本、高產率地獲得所需質量的產品，此通常由特異性表達構建體或系統(tǒng)的性質來決定。據(jù)報J結構域的結構特征決定Hsp40蛋白質與其配體Hsp70s間交互作用的特異性[Hemmessy"(2005)，14:1697-1709]。咸信J結構域為Hsp40及類Hsp-40蛋白質與其配體Hsp70s間的交互作用的主要結合部位且為所需的最小區(qū)域[Walshetal.,五MBO"poW(2004)，6:567-571]。據(jù)報通過DNA疫苗系統(tǒng)而與SV40病毒巨大T抗原的J結構域融合的肽可增強該肽的抗原性[ReimannandSchirmbeck，/附mw"o及ev.(2004),199:54-67]。已知J結構域將DnaK接合至結合有DnaJ的受質，DnaK然后以其C端肽-結合性結構域結合[Greene"a/.，尸rac.iVw/.5W.f/W(1998)，95:6108-6113]。另一方面，蛋白質轉導結構域(PTD)為小型肽，其可將比其大許多的分子運送至與典型胞飲作用無關的細胞中。該性質使得PTD成為將蛋白質及其它分子傳送至研究用活細胞的理想工具[Beerensef"/，Cwre"f，(2003),3(5):486-494]。然而，未曾暗示PTD或Hsp40J結構域的任一者可用于開發(fā)提高重組蛋白質產率及免疫原性的表達系統(tǒng)。
發(fā)明內容依據(jù)本發(fā)明，提供一種在宿主細胞中重組目的蛋白質的表達系統(tǒng)，其包含主要由SEQIDNO:1的蛋白質轉導結構域的核苷酸序列、編碼Hsp40-J結構域的核苷酸序列及編碼目的蛋白質的核苷酸序列所組成的核酸片段，其中該核酸片段可運作地連接在宿主細胞中表達重組目的蛋白質用的宿主-特異性轉錄及翻譯調控單元。依據(jù)本發(fā)明，亦提供一種使用上述表達系統(tǒng)表達重組目的蛋白質的方法。本發(fā)明的方法包含構建表達載體，該表達載體包含主要由SEQIDNO:l的蛋白質轉導結構域的核苷酸序列、編碼Hsp40-J結構域的核苷酸序列及編碼目的蛋白質的核苷酸序列所組成的核酸片段，其中該核酸片段可運作地連接在宿主細胞-特異性轉錄及翻譯調控單元；在該宿主細胞中轉入該表達載體；以及從該宿主細胞中收集及分離該重組目的蛋白質。因此，本發(fā)明亦提供通過使用上述表達系統(tǒng)所產生的重組蛋白質。結果，該重組蛋白質的免疫原性增加。本發(fā)明亦提供一種包含上述重組蛋白質的疫苗。本發(fā)明的其它目的及優(yōu)點一部分記載于下述說明中，一部分從該說明顯而易知，或者可通過實施本發(fā)明而知悉。本發(fā)明之目的及優(yōu)點可通過權利要求所列特定的單件元及組合而實施及達成。應了解前文的概述及下文的詳細說明二者僅為例示性及闡釋性的說明，而非如權利要求般限定本發(fā)明。為了說明本發(fā)明的目的，在附圖中顯示現(xiàn)階段較佳的具體實施例。不過，應了解本發(fā)明非限于所示的具體實施例。在附圖中圖1表示大腸桿菌的全細胞溶裂物的經(jīng)考馬斯藍(Coomassie⑧blue)染色的SDS-PAGE。羅塞塔(Rosetta)菌株含有于IPTG存在下生長的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽I構建體。第1行，標準分子量標記(示出對應于分子質量15kDa及20kDa的帶)。第二行(O),非被誘導的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽pET22b-PTD-J-HSPAlA肽pET22b-PTD-J-HSPAlA肽pET22b-PTD-J-HSPAlA肽pET22b-PTD-J-HSPAlA肽pET22b-PTD-J誦HSPAlA肽1小時后被誘導的2小時后被誘導的3小時后被誘導的4小時后被誘導的5小時后被誘導第3行(l)，第4行(2)，第5行(3)，第6行(4)，第7行(5)第8行(6),6小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽I;以及第9行(16)，16小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽I。圖2表示大腸桿菌的全細胞溶裂物的經(jīng)考馬斯藍(Coomassie⑧blue)染色的SDS-PAGE。羅塞塔(Rosetta)菌株含有于IPTG存在下生長的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽II構建體。第1行，標準分子量標記(示出對應于分子質量15kDa及20kDa的帶)。第二行(O)，非被誘導之pET22b-PTD-J-HSPAlA肽II;第3行(1),1小時后被誘導的第4行(2)，2小時后被誘導第5行(3),3小時后被誘導第6行(4)，4小時后被誘導的第7行(5)，5小時后被誘導的第8行(6)，6小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽II;以及第9行(16)，16小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽II。圖3表示大腸桿菌的全細胞溶裂物的經(jīng)考馬斯藍(Coomassie⑧blue)染色的SDS-PAGE。羅塞塔(Rosetta)菌株含有于IPTG存在下生長的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽III構建體。第1行，標準分子量標記(示出對應于分子質量15kDa及20kDa的帶)。第二行(O)，非被誘導的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽III;第3行(1)，1小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽IIpET22b-PTD-J-HSPAlA肽IIpET22b-PTD-J-HSPAlA肽IIpET22b-PTD-J-HSPAlA肽IIpET22b-PTD-J-HSPAlA肽IIpET22b-PTD-J-HSPAlA肽III;第4行(2)，2小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽III;第5行(3)，3小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽III;第6行(4)，4小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽III;第7行(5)，5小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽III;第8行(6)，6小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽III;以及第9行(16),16小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HSPAlA肽III。圖4表示大腸桿菌的全細胞溶裂物的經(jīng)考馬斯藍(Coomassie⑧blue)染色的SDS-PAGE。羅塞塔(Rosetta)菌株含有于IPTG存在下生長的pET22b-PTD-J-雞IGF-I構建體。第1行，標準分子量標記(示出對應于分子質量15kDa及20kDa的帶)。第2行(O)，非被誘導的pET22b-PTD-J-雞IGF-I;第3行(1)，1小時后被誘導的pET22b-PTD-J-雞IGF-I;第4行(2)，2小時后被誘導之pET22b-PTD-J-雞IGF-I;第5行(3)，3小時后被誘導的pET22b-PTD-J-雞IGF-I;第6行(4)，4小時后被誘導的pET22b-PTD-J-雞IGF-I;第7行(5),5小時后被誘導的pET22b-PTD-J-雞IGF-I;以及第8行(6)，6小時后被誘導的pET22b-PTD-J-雞IGF-I。圖5表示大腸桿菌的全細胞溶裂物的經(jīng)考馬斯藍(Coomassie⑧blue)染色的SDS-PAGE。羅塞塔(Rosetta)菌株含有于IPTG存在下生長的pET22b-PTD-J-HARBD構建體。第1行，標準分子量標記(示出對應于分子質量25kDa及37kDa的帶)。第2行(0)，非被誘導的pET22b-PTD-J-HARBD;第3行(1)，1小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HARBD;第4行(2)，2小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HARBD;第5行(3)，3小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HARBD;第6行(4)，4小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HARBD;第7行(5)，5小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HARBD;第8行(6)，6小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HARBD;第9行(7)，7小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HARBD以及第10行(O/N),16小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HARBD。圖6表示大腸桿菌的全細胞溶裂物的經(jīng)考馬斯藍(Coomassie⑧blue)染色的SDS-PAGE。羅塞塔(Rosetta)菌株含有于IPTG存在下生長的pET22b-PTD-J-HCV核心構建體。第1行，標準分子量標記(示出對應于分子質量25kDa及37kDa的帶)。第2行(0)，非被誘導的pET22b-PTD-J-HCV核心；第3行(1)，1小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HCV核心；第4行(2)，2小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HCV核心；第5行(3),3小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HCV核心；第6行(5),5小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HCV核心；第7行(6)，6小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HCV核心；以及第8行(16)，16小時后被誘導的pET22b-PTD-J-HCV核心。圖7a及圖7b是檢測血清中不同濃度的重組蛋白質PTD-Jl-嗜中性肽-l(NP-l)、PTD-J1-核心及PTD-J1的印跡雜交圖(dotblot)。具體實施方式總體言之，本發(fā)明涉及一種表達系統(tǒng)，其被引進宿主細胞以穩(wěn)定且有效率地生產具有提高產率及免疫原性的重組目的蛋白質。在本文中所用的術語「重組蛋白質」意指重組分子且通常為通過重組、化學或其它適當方法與蛋白質轉導結構域及J結構域共價連接(即融合)的蛋白質或肽序列。該重組分子可視需要通過肽連接子(peptidelinker)序列在1個或數(shù)個部位進行融合。該肽序列可包括1個或多個由宿主細胞所誘導的蛋白酶斷裂的部位。「多肽」指較佳主要由任何20個天然氨基酸組成不論其大小的任何聚合物。雖然術語「蛋白質」常被用于指稱相對大型的蛋白質以及「肽」常被用于指稱小型多肽，但在本領域這些術語的使用常重疊。根據(jù)本發(fā)明，術語「免疫原性」指重組蛋白質諸如重組抗原性蛋白質激發(fā)免疫反應的能力。根據(jù)本發(fā)明，提供一種在宿主細胞中重組目的蛋白質的表達系統(tǒng)，其包含主要由SEQIDNO:1的蛋白質轉導結構域(PTD)的核苷酸序列、編碼Hsp40-J結構域的核苷酸序列及編碼目的蛋白質的核苷酸序列所組成的核酸片段，其中該核酸片段可運作地連接在宿主細胞中表達異源蛋白質用的宿主特異性轉錄及翻譯調控單元。舉例來說，編碼PTD的核苷酸序列包含SEQIDNO:2的核苷酸序列。SEQIDNO:2的核苷酸序列可通過使用SEQIDNO:5及SEQIDNO:6的寡核苷酸而合成。SEQIDNO:5及SEQIDNO:6的寡核苷酸可在其5'端磷酰基化，以助該雙股寡核苷酸插入由磷酸酯酶處理過的載體。依照另一實施例，HSP40J結構域可選自亞型A、B及C的HSP40J結構域所組成的族群。舉例來說，該亞型A、B及C的HSP40J結構域可為人類基因組中41種DnaJ/HSP40蛋白質所含的J結構域或J-類似性結構域(Qiuetal.，CW/.Mo/,h/e5W.63:2560-2570(2006))。依照本發(fā)明的一個特定實施例，該HSP40J結構域包含SEQIDNO:4的核苷酸序列所編碼的SEQIDNO:3的肽。SEQIDNO:4的核苷酸序列可通過使用SEQIDNO:7至SEQIDNO:16的寡核苷酸而合成。目的蛋白質可包括，但不限于，HSP肽、生長因子、病毒受體結合性結構域及病毒核心蛋白質。在本發(fā)明的實施例中，該重組蛋白質為在經(jīng)免疫的宿主中顯示免疫原性的抗原性多肽。在另一實施例中，本發(fā)明亦提供一種疫苗，其包含用上述表達系統(tǒng)所生產的重組蛋白質。本發(fā)明可提供核酸序列，尤其是編碼本發(fā)明重組蛋白質的DNA序列。在另一些實施例中，該DNA序列可由適于染色體外復制的載體所攜帶，該等載體諸如噬菌體、病毒、質體、噬質體(phagemid)、黏質體(cosmid)、酵母菌人造染色體YAC或附加體(episome)。更特定而言，編碼所期望的重組蛋白質的DNA載體有助于本文所述的制備方法的實施及得到顯著量的重組蛋白質。該DNA序列可被插入適當載體(即含有被插入的蛋白質-編碼序列的轉錄及翻譯所需的單元的載體)。各種宿主-載體系統(tǒng)可被用于表達蛋白質-編碼序列。這些包括用病毒感染的哺乳動物細胞系統(tǒng)；用病毒感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；微生物諸如含酵母菌載體的酵母菌，或用噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA轉入的細菌。視所用的宿主-載體系統(tǒng)，可使用許多適當?shù)霓D錄及翻譯單元之一。例如，該載體可含有啟動子諸如細菌T7啟動子及可誘導的操縱子(operator)諸如lac操縱子以調控轉錄。其它載體及構建體包括染色體DNA序列、非染色體DNA序列及合成DNA序列，例如SV40的衍生物；細菌性質體；噬菌體DNA;桿狀病毒；酵母菌質體；酵母菌人造染色體(YACs);衍生自質體與噬菌體DNA的組合的載體；衍生自質體與病毒DNA的組合的穿梭載體(shuttlevectors);病毒DNA諸如牛痘病毒(vaccinia)、腺病毒(adenovirus)、禽流感病毒(Avianinfluenzavirus)及假性狂犬病病毒(pseudorabies)。不過,任何其它載體只要在所需宿主細胞中可以復制及存活，即可用于制備核酸表達構建體。該核酸序列可于側面相接許多供分離及選殖入任何期望載體的限制核酸內切酶部位。亦加入蛋白質鑒定或純化用標簽諸如EE、6XHis、HA或MYC，以促進重組蛋白質接下來的純化。此外，該核酸表達構建體亦可含有轉錄終止子。例如，該載體可含有終止核酸序列之轉錄用的T7終止子。依據(jù)本發(fā)明的特定實施例，重組蛋白質可通過使用包含SEQIDNO:2的核苷酸序列、編碼Hsp40-J結構域的核苷酸序列及編碼目的蛋白質的核苷酸序列的表達載體而產生。在另一實施例中，該表達載體可包括SEQIDNO:2的核苷酸序列、SEQIDNO:4的核苷酸序列及編碼目的蛋白質的核苷酸序列，連同與該表達載體中的核苷酸序列，其可運作地連接在宿主特異性轉錄及翻譯調控單元。攜帶本發(fā)明的重組分子的載體可有效率地轉導入目的細胞或這些細胞群中。轉導效率可通過一種不同策略或不同策略的組合來監(jiān)測及定量。舉例來說，涉及試管內檢定的途徑測量重組蛋白質被細胞攝入的量。該檢定包括用例如放射活性原子、熒光、磷光或冷光標示物(例如熒光素、若單明、FITC)可偵測性地標記重組蛋白質，然后測量經(jīng)標記的重組蛋白質的攝入量。另一選擇為將該重組蛋白質用能形成可脫離標記的酶諸如山葵過氧化酶、卩-半乳糖苷酶、氯霉素乙?；D移酶或熒光素酶來標記。攝入量可通過數(shù)種公知方法來測量，這些公知方法諸如在標準細胞篩選器(例如FACS)中通過熒光顯微鏡檢法或放射自顯影法來定量經(jīng)標記的細胞。如上文所總述，宿主細胞可用于制備目的以增殖編碼所期望的重組蛋白質的核酸。因此宿主細胞可為較高等的真核細胞諸如哺乳動物細胞或較低等的真核細胞諸如酵母菌細胞；或者宿主細胞可為原核細胞諸如細菌細胞。根據(jù)本發(fā)明的適當宿主細胞之代表例包括，但非限于，細菌細胞諸如大腸桿菌、鏈霉菌(5^epto附y(tǒng)ce^、傷寒沙門氏菌(5W/mowe〃a^p/z/附wWww);真菌細胞，諸如酵母菌；昆蟲細胞，諸如果蠅(Dmso;;w7")S2及夜蛾(5^ocfo;fera)Sf9;動物細胞，諸如MDCK、Hep-2、CHO或COS;人類細胞，諸如Jurkat或293細胞；腺病毒；植物細胞，或者任何已適應于在試管中增殖或原樣再生之其它細胞。所屬領域的技術人員可通過本文的教示明白適當宿主細胞的選擇。此外，編碼所需重組蛋白質的核酸可通過轉染細胞的標準技術引進宿主細胞。術語「轉染」意指包含將核酸引進宿主細胞的所有公知技術，這些公知技術包括磷酸鈣共沉淀法、由DEAE葡聚糖介導的轉染、脂質轉染法、電穿孔、顯微注射、病毒轉導及/或整合。本發(fā)明還提供一種生產分離所需重組蛋白質的方法。在該方法中，將引入與調控序列可運作地連接的編碼所需蛋白質的核酸的宿主細胞(例如酵母菌、真菌、昆蟲、細菌或動物細胞)，在存在該重組蛋白質以刺激編碼所需重組蛋白質的核苷酸序列轉錄下，在培養(yǎng)基中以生產的規(guī)模培養(yǎng)。接著，可將所需的重組蛋白質從所得的宿主細胞或從培養(yǎng)基中分離出。標準蛋白質純化技術可被用于從培養(yǎng)基或從所得的細胞分離所需的蛋白質。特定而言，這些純化技術可使用各種設備(包括滾瓶、旋轉燒瓶、組織培養(yǎng)盤、生物反應器或發(fā)酵器)大規(guī)模(其量至少以毫克計)表達及純化所需重組蛋白質。本發(fā)明的重組蛋白質可通過已知技術的適當組合而分離及純化。這些方法包括，例如，利用溶解度的方法諸如鹽沉淀及溶劑沉淀、利用分子量差異的方法諸如透析、超過濾、凝膠過濾及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；利用電荷差異的方法諸如離子交換管柱層析法；利用特異性親和性的方法諸如親和性層析；利用疏水性差異的方法諸如逆向高效液相層析法；以及利用等電點差異的方法諸如等電點聚焦電泳法、金屬親和性管柱諸如Ni-NTA。因此，根據(jù)另一實施例，本發(fā)明提供一種在宿主細胞中生產具提高產率及免疫原性的重組目的蛋白質的方法。該方法包含構建包含表達載體，該表達載體包含主要由SEQIDNO:l的蛋白質轉導結構域的核苷酸序列、編碼Hsp40-J結構域的核苷酸序列及編碼目的蛋白質的核苷酸序列所組成的核酸片段，其中該核酸片段可運作地連接在宿主細胞-特異性轉錄及翻譯調控單元；在該宿主細胞中轉入該表達載體；以及從該宿主細胞中收集及分離該重組目的蛋白質。依據(jù)另一實施例，該方法尚包含用該重組蛋白質使生物免疫的步驟。該重組蛋白質的免疫原性可用經(jīng)標記的抗體測定，該經(jīng)標記的抗體可與轉漬在受試膜上的重組蛋白質的抗原決定部位結合。再者，通過在試管內的抗原表達之分析以及測定活體內抗體反應的誘導及以抗原性多肽進行皮下激發(fā)免疫測試，來比較該重組蛋白質與其它多肽的免疫原性。抗原性多肽可包括，但非限于，HSP肽、生長因子、病毒受體結合性結構域、病毒核心蛋白質或其組合。舉例來說，能引起對宿主的免疫反應的其它蛋白質或肽亦可包含于本發(fā)明中?，F(xiàn)參照下列特別的非限定性實施例更詳細地說明本發(fā)明。實施例1:pET22b-PTDl-Jl-Ag表達載體的構建使用pET22b質體(Novagen,Madison，Wis.)建立pET22b-PTD-Jl載體，其包括SEQIDNO:1的蛋白質轉導結構域的核苷酸序列、SEQIDNO:3的Hsp40-J結構域的核苷酸序列及編碼目的蛋白質的核苷酸序列，其中該核酸片段與在宿主細胞中表達重組目的蛋白質的宿主-特異性轉錄及翻譯調控單元可運作地連接。編碼大腸桿菌用的PTD的最適化密碼子的寡核苷酸通過使用下表一所列的SEQIDNO:5及SEQIDNO:6的引物而化學合成。該二寡核苷酸的5'端在黏接(annealing)成雙股形式之前通過聚核苷酸激酶而被磷?；圆迦胍延肗del及BamHI消化且通過牛腸堿性磷酸酯酶(CIAP)去磷?；膒ET22b質體，形成pET22b-PTDl。表一<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>HSP40基因的J結構域通過使用表二所示的SEQIDNO:7至SEQIDNO:16的寡核苷酸的集合式PCR而合成。這些寡核苷酸被設計用來擴增大腸桿菌用的最適化密碼子。將PCR產物選殖入pGEM-TEasy載體(Promega)中以進行單一群落選擇及DNA測序。具有編碼DNA序列的正確J結構域的質體用BamHI及EcoRI—起消化，以從pGEM-TEasy載體除去0.2kb插入的DNA片段。然后將該DNA片段插入通過BamHI/EcoRI及CIAP處理的pET22b-PTDl載體，以建立pET22b-PTDl-Jl表達載體。表二<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>EcoRIRlcgaattcgcaccaccagaaccacctttcagaccttc(SEQIDNO:13)R2agaaccacctttcagaccttcttcaccgtaacggtcgaagatttcacg(SEQIDNO:14)R3gtaacggtcgaagatttcacgtttacgtggategetcagaacgtcgta(SEQIDNO:15)R4tggategetcagaacgtcgtatgcttctgcgatetc(SEQIDNO:16)通常將一種或多種由pET22b-PTDl-Jl載體表達的重組多肽或抗原性(Ag)多肽轉入成具有最適化大腸桿菌密碼子的DNA。該一種或多種重組多肽編碼區(qū)亦通過PCR擴增。在下列實施例中，這些編碼多肽的DNA側面與EcoRI及Xhol部位接合，以便于插入pET22b-PTDl-Jl載體中。結果，構建成pET22b-PTDl-Jl-Ag表達載體(以下簡稱為pET22b-PTD-J-Ag)。組合式PCR利用寡核苷酸套組合成密碼子經(jīng)最適化的cDNA。在PCR反應混合物中調整成0.5^MF1及R1以及0.05pM的F2、F3、R3、R2等等。反應條件為94。C歷2分鐘，繼而20個循環(huán)的94。C歷20秒/40°C歷40秒/72°C歷20秒以及于72°C進行延長歷5分鐘。將PCR產物選殖入供質體DNA分離及DNA測序用的pGEM-TEasy。實施例2:PTDl-Jl-Ag重組蛋白質的表達將pET22b-PTDl-Jl-Ag載體轉入入大腸桿菌羅塞塔菌株(Novagen)勝任細胞。對于氨芐青霉素(ampicimn)及氯霉素具抗性的大腸桿菌群落在用ImMIPTG誘導之前，于TYD培養(yǎng)基(10g胰蛋白胨/20g酵母菌萃取物/5gNaCl/2g葡萄糖/公升，pH7.2)中培養(yǎng)及擴增至OD600=0.3。依所列的時間表收集細胞樣本。將0.3OD600單位的大腸桿菌的全部蛋白質樣本在30的2xSDS-PAGE加載緩沖液中溶裂。這些蛋白質樣本以沸水浴處理5分鐘后，通過12.5%或15%SDS-PAGE而分離。該蛋白質帶通過在SDS-PAGE凝膠上進行考馬斯亮藍R250染色而顯色。實施例3:免疫小鼠通過皮下注射用TiterMAX金佐劑乳化的50pg多肽而免疫。每隔二個星期進行劑量追加。收集小鼠的血清以取得對抗該多肽的抗體。印跡雜交法(Dotblotting)將經(jīng)系列稀釋的重組蛋白質或合成多肽點加在PVDF膜上。將該膜用在TBSN(25mMTris-HCl，pH7.4/150mMNaCl/0.02%Tween20)中的5%脫脂乳封阻1小時。用TBSN沖洗4次后，將該膜浸在經(jīng)1000倍稀釋的小鼠抗血清中進行整夜培養(yǎng)。未經(jīng)結合的原發(fā)性抗體(Ab)通過用TBSN沖洗4次而移除，然后施用結合有HRP的山羊抗小鼠二次抗體(經(jīng)2000倍稀釋)歷4小時。將經(jīng)沖洗膜上的經(jīng)標記蛋白質以化學發(fā)光套組(Pierce)按照廠商說明書所述進行測定。實施例4:人類HSPA1A肽I的表達將集合式PCR所用的寡核苷酸列于表三中。利用這些來合成SEQIDNO:17的密碼子經(jīng)最適化的cDNA,該cDNASEQIDNO:18的HAPAIA肽(SSSTQASLEIDSLFEGIDFYTSITRARFEELCSDLFRSTLEPVEKALRDAKLDKAQI)。將該密碼子經(jīng)最適化的cDNA序列插入依照實施例1構建的表達載體pET22b-PTDl-Jl中。表三<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>TTCAAAACGCGCACGGGT(SEQIDNO:22)I國r2CATCACGCAGCGCTTTTTCCACCGGTTCCAGGGTGCTACGAAACAGATC(SEQIDNO:23)Xho-I-rlCTCGAGAATCTGCGCTTTATCCAGTTTCGCATCACGCAGCGCTTTTTC(SEQIDNO:24)將具有編碼重組PTD-J-HSPAIA肽I的核酸片段的表達載體引進實施例2所述的大腸桿菌中。定量該重組PTD-J-HSPAIA肽I的表達并以重組PTD-J-HSPAIA肽I在所有蛋白質中所占的重量百分率來表示。參照圖1,在最初6小時，該重組PTD-J-HSPA1A肽I的重量百分率在65%至92%的范圍內。16小時后，該重組PTD-J-HSPA1A肽1的重量百分率為77%。實施例5:人類HSPA1A肽II的表達將集合式PCR所用的寡核苷酸列于表四中。利用這些來合成SEQIDNO:25的密碼子經(jīng)最適化的cDNA，該cDNASEQIDNO:26的HAPAIA肽II(NVTATDKSTGKANKITITNDKGRLSKEEIERMVQEAEKYKAEDEVQRERVSAKNALESYAF)。將密碼子經(jīng)最適的cDNA序列插入依照實施例l構建的表達載體中。表四Ri隱n國flGAATTCTAACGTAACCGCTACTGACAAATCCACTGGTAAAGCTAACAAG(SEQIDNO:27)II國GTCCACTGGTAAAGCTAACAAGATCACCATCACCAACGACAAAGGTCGTC(SEQIDNO:28)n國f3ATCACCAACGACAAAGGTCGTCTGTCCAAGGAAGAGATCGAGCGTATGG(SEQIDNO:29)n-f4AAGGAAGAGATCGAGCGTATGGTTCAGGAAGCTGAAAAGTACAAG(SEQIDNO:30)II-r3ACGCTGAACTTCGTCTTCAGCCTTGTACTTTTCAGCTTCCTGAACC(SEQIDNO:31)17<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>將具有編碼重組PTD-J-HSPAIA肽III的核酸片段的表達載體如實施例2所述引進大腸桿菌中。定量該重組PTD-J-HSPAIA肽III的表達并以重組PTD-J-HSPAIA肽m在所有蛋白質中所占的重量百分率來表示。參照圖3，在最初5小時，該重組PTD-J-HSPAIA肽III的重量百分率在10%至33%的范圍內。實施例7:雞IGF-I的表達將集合式PCR所用的寡核苷酸列于表六中。使用這些寡核苷酸合成SEQIDNO:43的密碼子經(jīng)最適化的cDNA，該cDNASEQIDNO:44的雞IGF-I(GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFSKPTGYGSSSAALHHKGIVDECCFQSCDLRRLEMYCAPIKPPKSA)。將密碼子經(jīng)最適化的cDNA序列插入依照實施例1構建的表達載體中。表六<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>F4GGTTATGGTAGCTCTAGCCGTCGTCTGCATCACAAAGGTATTGTGGATG(SEQIDNO:48)F5CACAAAGGTATTGTGGATGAATGTTGCTTTCAGAGCTGTGATCTGCGTCG(SEQIDNO:49)R2GATTGGTGCACAGTACATTTCCAGACGACGCAGATCACAGCTCTG(SEQIDNO:50)Xho-RlCTCGAGTGCGCTTTTCGGTGGTTTGATTGGTGCACAGTACATTTCC(SEQIDNO:51)將具有編碼重組PTD-J-雞IGF-I的核酸片段的表達載體如實施例2所述引進大腸桿菌中。定量該重組PTD-J-雞IGF-I的表達并以重組PTD-J-雞IGF-I在所有蛋白質中所占的重量百分率表示。參照圖4，在最初6小時，該重組PTD-J-雞IGF-I的重量百分率在74%至90%的范圍內。實施例8:禽流感病毒HA(H5)受體結合性結構域(RBD)的表達將PCR所用的引物對列于表七中。利用這些引物合成SEQIDNO:52的原生性病毒cDNA，該原生性病毒cDNASEQIDNO:53的HA-RBD。將cDNA序列插入依照實施例1構建的表達載體中。表七<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>將具有編碼重組PTD-J-HARBD的核酸片段的表達載體如實施例2所述引進大腸桿菌中。定量該重組PTD-J-HARBD的表達及以重組PTD-J-HARBD在所有蛋白質中所占的重量％表示。參照圖5，在最初7小時，該重組PTD-J-HARBD的重量百分率在12%至38%的范圍內。16小時后重組PTD-J-HARBD的重量百分率為實施例9:C型肝炎病毒(HCV)核心蛋白質的表達將PCR所用的引物對列于表八中。利用這些引物合成SEQIDNO:56的原生性病毒cDNA，該原生性病毒cDNASEQIDNO:57的HCV核心蛋白質。將該cDNA序列插入依照實施例1構建的表達載體中。表八<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>將具有編碼重組PTD-J-HCV核心蛋白質的核酸片段的表達載體如實施例2所述引進大腸桿菌中。定量該重組PTD-J-HCV核心蛋白質的表達并以PTD-J-HCV核心蛋白質在所有蛋白質中所占的重量百分率表示。參照圖5，在最初6小時，該重組PTD-J-HCV核心蛋白質的重量百分率的范圍為11%至39%。從上述實施例的結果顯然可知使用該具有最適化密碼子的pET22b-PTD-J表達載體所產生的重組蛋白質的重量百分率己證明為全部蛋白質的約90%。另一方面，若使用原生性cDNA,重組蛋白質在全部蛋白質中所占的重量百分率為約40%。因此本發(fā)明的表達載體可生產具有提高產率的重組蛋白質。實施例10:增加嗜中性白血球肽-l(NP-l)的免疫原性合成編碼NP-1的密碼子經(jīng)最適化的cDNA序列并將其插入依照實施例1所述的方法構建的表達載體pET22b-PTD-J。將具有編碼重組pET22b-PTD-J-NP-l的核酸片段的表達載體如實施例2所述引進大腸桿菌中。收集重組NP-l及將其從大腸桿菌中分離。小鼠依照實施例3通過皮下注射重組NP-1而被免疫，以激發(fā)抗重組NP-1的抗體產生。然后從小鼠收集血清。使用實施例3所述的墨點檢定法測定NP-1的免疫原性。當使用重組NP-1做為抗原時，產生高滴度的血清。該血清可檢測320pg的抗原，但不會與PTDl-Jl-核心重組蛋白質交叉反應，此表示該血清會如圖7a及圖7b所示強力且特異性地對抗NP-l區(qū)域。所屬領域的技術人員當知道可在不偏離廣義的本發(fā)明概念下修飾上述具體實施例。應了解本發(fā)明不局限于所揭示的特定具體實施例，而意欲涵蓋如權利要求所界定的本發(fā)明的精神及范圍內的修飾。序列表<110〉康泰生醫(yī)科技股份有限公司/財團法人臺灣動物科技研究所<120>具有提高產率及免疫原性的重組蛋白質表達系統(tǒng)<130>7P04089-TW<160>59<170>Patentlnversion3.3<210>1<211〉11<212>PRT<213>大腸桿菌<400>1TyrGlyArgLysLysArgArgGinArgArgArg1510<210>2<211>33<212>DNA<213>大腸桿菌<400>2tatggtcgt3sgaaacgtcgtcagcgtcgtcgt33<210>3<211>72<212>PRT<213>人類(Homosapiens)<400>3GlyLysAspTyrTyrGinThrLeuGlyLeuAlaArgGlyAlaSerAsp151015AspGlulieLysArgAlaTyrArgArgGinAlaLeuArgTyrHisPro202530AspLysAsnLysGluProArgAlaGluGluLysPheLysGlulieAla354045TyrAspValLeuSerAspProArgLysArgLysArgGluliePheAsp505560ArgTyrGlyGluGluGlyLeuLys6570<210>4<211>216<212>DNA<213〉人類(Homosapiens)<400>4ggtaaagstt3ctaccsgactcacggtctcgctcgtggtgcatctgstgstgaaatcaaa60cgtgcttaccgtcgtcaggcactgcgttaccatccagacaaaaacaaagaaccgcgtgca120gaagagaaattcaaagagatcgcagaagcatacgacgttctgagcgatccacgtaaacgt180gaaatctccgsccgttacggtgssgsaggtctgsas216<210>5<211>39<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>5t3tgtaitggtcgtatsgsssicgtcgtcsgcgtcgtcgtgg39<210>6<211>41<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>6gatcccacgacgacgctgacgacgtttcttacgaccataca<210>7<211>39<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>7tggatcctgggtaaagattactaccagactcacggtctc<210〉8<211>48<212>DMA<213>人工合成<220〉<223>寡核苷酸<400>8tactaccagactcacggtctcgctcgtggtgcatctgatgatgaaatc<210>9<211>48<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400〉9ggtgcatctgatgatgaaatcaaacgtgcttaccgtcgtcaggcactg<210>10<211>48<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>10gcttaccgtcgtcaggcactgcgttaccatccagacaaaaacaaagaa48<210>11<211>45<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>11taccatccagacaaaaacsaagaaccgggtgcagaagagaaattc45<210>12<211>48<212>DNA<213>人工合成<220><223〉寡核苷酸<400>12ccgggtgcagaagagaaattcsaagagatcgcagaagcatacgacgtt48<210>13<211〉36<212>D肌<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>13cgasttcgcaccsccsgasccacctttcagaccttc36200710107917.1<210><211><212><213>1448DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>14agaaccacctttcagaccttcttcsccgtaacggtcgaagatttcacg48<210>15<211>48<212>DNA<213><213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400〉15gtaacggtcgaagatttcacgtttacgtggatcgctcagsacgtcgta48<210〉16<211>36<212>DNA<213><213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>16tggatcgctcagaacgtcgtatgcttctgcgatctc36<210>17<211>171<212>D肌<213>人類(Homosapiens)<400>17agcagcagcacccaggcgagcctggaaattgatagcctgtttgaaggcattgatttttat60accagcattacccgtgcgcgttttgaagaactgtgcagcgatctgtttcgtagcaccctg120gaaccggtggaasaagcgctgcgtgatgcgssactggatasagcgcsgatt171<210>18<211>57<212>PRT<213>人類(Homosapiens)<400>18SerSerSerThrGinAlaSer15lieAspPheTyrThrSerlie20SerAspLeuPheArgSerThr35AspAlaLysLeuAspLysAla5055<210>19<211>49<212>DMA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>19gaattctagcagcagcacccaggcgagcctggaaattgatagcctgttt49<210>20<211>48<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸L>euGlulieAspSerLeuPheGluGly1015ThrArgAlaArgPheGluGluLeuCys2530LeuGluProValGluLysAlaLeuArg4045Ginlie<400>20agcctggaaattgatagcctgtttgaaggcattgatttttataccagc<210>21<211>49<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>21gtttgaaggcattgatttttataccsgcattacccgtgcgcgttttgas<210>22<211>49<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>22gggtgctacgaaacagatcgctgcacagttcttcaaaacgcgcacgggt<210>23<211>49<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>23catcacgcagcgctttttccaccggttccagggtgctacgaaacagatc<210>24<211>48<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula><211>49<212>DNA<213>人工合成<220><223〉寡核苷酸<400>27gaattctaacgtaaccgctactgacaaatccactggtaaagctaacaag49<210>28<211>49<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>28tccactggtaaagctaacaagatcaccatcaccaacgacaaaggtcgtc49<210>29<211>49<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<徹>29atcaccaacgacasaggtcgtctgtccaaggaagagatcgagcgtatgg49<210>30<211>45<212〉DNA<213>人工合成<220><223〉寡核苷酸<400>30aaggaagagatcgagcgtatggttcaggaagctgaaaagtacaag45<210>31<211>46<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>31acgctgaacttcgtcttcagccttgtacttttcagcttcctgaacc46<210>32<211>45<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>32agcgttcttagcggaaacacgttcacgctgaacttcgtcttcagc45<210>33<211>49<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>33ctcgaggaaagcgtaggattccagagcgttcttagcggaaacacgttca49<210>34<211>183<212>DNA<213>人類(Homosapiens)<400>34gaagatgaaggcctgaaaggcaaaattagcgaagcggataagaaaaaggtgctggataaa60tgccaggaagtgattagctggctggatgcgaacaccctggcggaaaaagatgaatttgsa120cataaacgtaaagaactggaacaggtgtgcaacccgattattagcggcctgtatcagggc180gcg183<210>35<211>61<212>PRT<213>人類(Homosapiens)<400>35GluAspGluGlyLeu15ValLeuAspLysCys20LeuAlaGluLysAsp35ValCysAsnProlie50<210>36<211>46<212>DNA<213>人工合成<220><223>弓l物<400>36gaattctgaagatgaaggcctgaasggcasaattagcgaagcggst46<210>37<211>48LysGlyLyslieSerGluAlaAspLysLysLys1015GinGluVallieSerTrpLeuAspAlaAsnThr2530GluPheGluHisLysArgLysGluLeuGluGin4045lieSerGlyLeuTyrGinGlyAla5560<212>DNA<213>人工合成<220><223>弓l物<400>37ggcaaaattagcgaagcggataagsaaaaggtgctggataaatgccag48<210>38<211>49<212>DNA<213>人工合成<220><223>弓l物<40p>38ggtgctggatsaatgccaggaagtgattagctggctggatgcgsacacc49<210>39<211>49<212>DNA<213>人工合成<220><223>弓l物<400>39gctggatgcgaacaccctggcggaaaaagatgaatttgaacataaacgt49<210>40<211>45<212>DNA<213>人工合成<220><223>弓l物<400>40ttccagttctttacgtttatgttcaaattcatctttttccgccag45<210>41<211>48<212>DNA<213>人工合成<220><223>弓l物<400>41cgggttgcacacctgttccagttctttacgtttatgttcaaattcatc48<210>42<211>48<212>DNA<213>人工合成<220><223>弓l物<400>42ctcgagcgcgccctgatacaggccgctaataatcgggttgcacacctg48<210>43<211>210<212>DNA<213>雞(Chicken)<400>43ggtccagaaaccctgtgtggtgcagaactggttgatgcactgcagttcgtgtgtggtgat60cgtggtttctacttcagcaaaccgactggttatggtagctctagccgtcgtctgcatcac120aaaggtattgtggatgaatgttgctttcagagctgtgatctgcgtcgtctggaaatgtac180tgtgcaccaatcaaaccaccgaaaagcgca210<210>44<211>70<212>PRT<213>雞<400>44GlyProGluThrLeuCysGlyAlaGluLeuValAspAlaLeuGinPhe151015ValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheSerLysProThrGlyTyrGly202530SerSerSerAlaAlaLeuHisHisLysGlylieValAspGluCysCys354045PheGinSerCysAspLeuArgArgLeuGluMetTyrCysAlaProlie505560LysProProLysSerAla6570<210>45<211>58<21.2>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>45gaattctggtccagaaaccctgtgtggtgcagaactggttgatgcactgcagttcgtg58<210>46<211>48<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>46gaactggttgatgcactgcagttcgtgtgtggtgatcgtggtttctac48<210>47<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223〉寡核苷酸<400>47ggtgatcgtggtttctacttcagcaaaccgactggttatggtagctctagc51<210>48<211>49<212>DMA<220><213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>48ggttatggtagctctagccgtcgtctgcatcacaaeiggtattgtggatg49<210〉49<211>50<212>DNA<213>人工合成<220〉<223>寡核苷酸<400>49cacaaaggtattgtggatgaatgttgctttcagagctgtgatctgcgtcg50<210>50<211>45<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>50gattggtgcacagtacatttccagacgacgcagatcacagctctg45<210>51<211>46<212>DNA<213>人工合成<220><223>寡核苷酸<400>51ctcgagtgcgcttttcggtggtttgattggtgcacagtscatttcc46<210>52<211〉489<212>DNA<213>禽流感病毒(Avianinfluenzavirus)<400>52aaacacctattgagcagaataaaccattttgagaaaattcagstcatccccaaasgttct60tggtccagtcatgaagcctcattaggggtgagctcagcatgtccataccagggaaagtcc120tcctttttcagaaatgtggtatggcttstcaaaasgascagtacatacccsacsstaaag180aggagctscaataataccaaccaagaagatcttttggtactgtgggggattcaccatcct240astgatgcggcagagcagacaaagctctatcaaaacccaaccacctstatttccgttggg300acatcsacactaisaccagsgeittggtsicceiagsstagctactsgatccgaagtaascggg360caaagtggaaggatggagttcttctggacaattttaaaaccgaatgatgcastcaacttc420gagagtaatggaaatttcattgctccagaatatgcatacaaaattgtcaagaaaggggac480tcaacaatt48938<210〉53<211>163<212〉PRT<213>禽流感病毒(Avianinfluenzavirus<〉53LysHisLeu!LeuSerArg15ProLysSerSerTrpSer20AlaCysProTyrGinGly35IjeulieLysLysAsnSer50AsnThrAsnGinGluAsp6570AsnAspAlaAlaGluGin85lieSerValGlyThrSer100AlaThrArgSerGluVal115TrpThr工leLeuLysPro130AsnPhe工leAlaProGlu145150SerThrlie<210>54<211>32<212>DMA<213>人工合成<220><223>弓l物<400>54tgaattcgaaacacctsttgagcagsatsaac32lieAsnHisPheGluLys工leGin工lelieSerHisLysThr55LeuSer40TyrAsnAsn135TyrGly120AspGlu25Ser10AlaSerLeuGlyPhePheArgProThr工leLeuValLeuThrLysLeuThrLeuAsn105GinTyr90GinSerTrp75GinArgGlyAlaTyrLyslie155!Lys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