專利名稱：系統置換多聚酶鏈反應的制作方法
技術領域：
本發明涉及多聚酶鏈反應PCR基因擴增技術的進一步發展，分子檢測應用的一種新PCR途經，尤其是將基因檢測PCR系統置換成數十套獨立的DNA指示PCR系統輪換使用。
背景技術：
在1983年的一個晚上，K.B.Mullis不經意間創造了PCR的奇思妙想(The unusual originof the polymerase chain reaction，Sci，Am.26256，1990)，并經PE-Cetus公司許多改進而實用。隨著從嗜熱水細菌來源的熱穩定DNA聚合酶的應用(Saiki R.K.，et.al，Science 239487-491，1988)，PCR技術逐漸成熟、高效、自動化。廣泛應用于基因克隆、測序、分子檢測等眾多領域，奠定了現代分子生物學的堅實基礎。并逐漸衍生了眾多PCR應用技術及改良操作(Molecular Cloning，3rd Edit)。
隨著人類等各種基因組測序的完成，并進入功能蛋白組時代，分子PCR檢測應用越來越廣泛，已滲透到生物學的每一個領域。尤其自1989年開始運用于臨床檢驗以來，PCR以其簡便、快速、靈敏的優勢成為臨床實驗診斷學的技術熱點，已應用于肝炎、肺部感染和性病等傳染性疾病及遺傳病、腫瘤、優生優育等領域。然而PCR的基因指數式擴增方式太過于靈敏，模板2的20次冪就大約擴增一百萬倍。臨床應用亟待解決擴增基因產物再污染的假陽性問題。目前一般通過單獨的PCR實驗室，紫外照射的超凈工作臺，使用一次性手套和一次性過濾Tip頭來控制；進一步也可通過加尿嘧啶N-糖基化酶切割用dU代替dT的PCR產物中的尿嘧啶糖苷鍵來降解PCR產物防止再污染(Hartley J.L.et.al，1993 PCR Methods App1.3s10-s14)，但只能切割降解大部分PCR產物；這些措施對高靈敏度PCR而言難以完全有效。
發明內容
為了克服PCR檢測易污染，假陽性高的不足。本發明提供一種系統置換多聚酶鏈反應(System Substitute Polymerase Chain Reaction，ssPCR)，通過置換PCR工作系統規避PCR擴增產物的再污染。
系統置換多聚酶鏈反應，其特征在于通過部分互補序列的雜交，將待測PCR的擴增轉換成包括一套以上的指示PCR系統擴增，所述每套指示PCR系統擴增的是無關的指示模板與待測模板中不同區域保留序列所形成的雜交互補序列，所述指示模板的基因序列是與待測模板無關的基因序列(6-8base堿基以上連續相同為相關，反之無關)。
所述待測模板為雙鏈DNA、單鏈RNA或DNA-RNA雜交雙鏈，所述單鏈RNA包括mRNA，所述待測模板保留序列長度為20-200bp。
所述待測模板保留序列長度優選為30-50bp。
所述指示模板為雙鏈DNA，序列長度為80-1000bp。
所述指示模板序列長度優選為80-150bp。
該反應還包括熒光分子信標，所述熒光分子信標序列與待測模板保留序列雜交或與指示模板序列雜交。
本發明根據現有的PCR系統，設計了一種新的多聚酶鏈反應途徑即系統置換多聚酶鏈反應(ssPCR)(見圖1)，該系統中包括有數十套指示PCR系統，以指示PCR系統來替換待測的PCR系統工作。系統置換多聚酶鏈反應的原理及操作如下以待測標本的基因為待測模板；選取一段無關的基因序列(約80-150bp)作為指示模板1，另一段無關序列為指示模板2，……以此類推指示模板3，指示模板4，……等等。待測模板除留一小段序列(30-50bp)作為雜交保留序列外絕大部分序列置換成指示模板序列。PCR擴增的只是指示模板全序列和待測模板保留的30-50bp的雜交序列。每套指示PCR系統選取待測模板不同區域作為保留序列，即每套指示PCR選取的保留序列是互不相同的。所以每套指示PCR系統的基因序列是完全各不相同、相互獨立的。
待測模板根據長短不同選取一系列的長30-50bp的較保守沒有立體結構的序列作為保留雜交序列，保留序列1對應指示模板1，保留序列2對應指示模板2，……以此類推，等等。每個保留序列又分成斷開的左半部分L和右半部分R。右半部分R序列(以有意義鏈序列)3’末端加在指示模板5’端20bp序列前面合成指示模板擴增5’端引物，左半部序列(以反意義鏈序列)3’末端加在指示模板3’端20bp序列后面合成指示模板擴增3’端引物。以此對引物和用pfu酶擴增平末端的無關序列的指示模板生成兩端包含部分待測模板保留序列的指示模板加尾DNA，并用PCR產物純化柱純化。
待測模板一指示模板雜交連接酶反應指示模板PCR與純化的待測標本雜交，如有陽性模板則通過其保留序列與指示模板加尾DNA兩頭末端序列雜交，使指示模板兩側5’末端和3’末端因結合待測模板雜交序列而相互首尾銜接，并經T4連接酶修復缺口而生成環狀指示模板。而未雜交的雙鏈指示模板PCR鏈的首尾平末端的連接效率較雙鏈中單鏈的缺口修復效率低太多，并因加入過量的平端8-16bp無關序列的雙鏈Oligo寡聚物而幾乎全被抑制。結果只有陽性標本模板有雜交序列幫助的指示模板才能形成環狀DNA，而陰性標本則只存在線性指示模板DNA。
環狀指示模板反向PCR用指示模板正中間的序列作為工作指示PCR引物，向外延伸反向擴增環狀模板，間接指示待測模板的存在與多少。而非環狀模板DNA則反向中間斷開而擴增不出。PCR產物用Agarose凝膠檢測分析或熒光定量分析。
本發明系統置換多聚酶鏈反應可應用于基因點突變和大片段變異檢測中。待測基因一小部分序列與指示模板加尾DNA兩側末端序列雜交并經T4連接酶使其首尾相連，再反向擴增指示模板，雜交必須序列互補匹配才能連接并擴增，通過設置指示模板DNA首尾兩端的序列，適用檢測基因的變異，包括基因點突變和大片段變異的檢測。
操作流程(一)待測標本的純化(1)DNA樣本的純化等量酚-氯仿抽提，商業DNA純化柱純化(詳細步驟按Qiagen說明書進行)1)加100-200ul樣本于1.5ml EP管中加等量的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提，漩渦振蕩，臺式離心機離心最高速5分鐘。
2)上清100-200ul轉移至新EP管中，加等量氯仿，振蕩，離心。
3)上清加4倍的Qiagen結合緩沖液移至純化柱，洗滌緩沖液洗柱兩次，加50uldH2O洗脫收集純化的樣本。
(2)RNA樣本的純化異硫氰酸胍一步法提取總RNA(Chomczynski，P.et，al.1987 Anal.Biochem.Vol 162，156)。
樣本于EP管中加1ml的Trizole(1ml 4M異硫氰酸胍，1ml酚，0.1ml 2M醋酸鈉PH4.0)變性液裂解，強烈漩渦振蕩或用針頭反復抽吸，再加200ul氯仿振蕩，離心5分鐘，取上清加等量0.5ml異丙醇置-20℃2小時再離心沉淀，70％乙醇洗滌一次，加50ul DEPC處理的dH2O溶解。
Oligo(dT)順磁珠純化mRNA一般沒有必要純化mRNA，如需要更純的模板，按Promega說明書進行。
(二)指示模板加尾DNA PCR的準備a)合成指示PCR引物5’端引物首先待測模板保留雜交序列右半部分有意義鏈15-25base，再加指示模板5’端最開始的20base有意義鏈序列。
3’端引物首先待測模板保留雜交序列左半部分反意義鏈15-25base，再加指示模板3’端最開始的20base反意義鏈序列。
b)PCR擴增指示模板并用商業PCR產物純化柱純化。
無關序列指示DNA1ul5’端指示引物Primer(5uM) 1ul3’端指示引物Primer(5uM) 1ul10×pfu buffer 5ul10mM dNTP 1ulpfu1uldH2O 40ul50ul95℃變性5分鐘，25個循環，94℃30秒，52℃30秒，72℃30秒。25個循環后72℃10分鐘。
Qiagen PCR產物純化試劑盒純化。
(三)合成平端雙鏈抑制Oligo寡聚物Blast search搜尋一段與待測模板和指示DNA都無關((4base堿基以上連續相同為相關，反之無關)的短序列，合成一段8-16base單鏈Oligo，再合成一段與之序列互補反意義鏈的8-16base單鏈Oligo，雙鏈Oligo(100uM)混合，90℃加熱5分鐘，冷卻至室溫貯存。
(四)合成反向PCR引物取指示DNA正中間約40bp長的序列，右半部分20base長的有意義鏈序列作為5’端反向PCR引物，左半部分20base長的反意義鏈作為3’端反向PCR引物。
(五)待測標本與指示模板加尾DNA雜交純化的待測樣本 2ul純化的指示模板加尾DNA10ulT4連接酶緩沖液 5ul抑制Oligo(100uM) 1uldH2O32ul50ul95℃變性5分鐘再55℃10分鐘。
(六)連接酶反應取上述(五)雜交反應液50ul加T4連接酶1ul，16℃溫育10分鐘-2小時。
(七)反向PCR雜交連接酶反應液2ul(或純化待測樣本1ul+指示模板加尾DNA 9ul)
5’端反向引物Primer 1ul3’端反向引物Primer 1ul10mM dNTP 1ul10×Taq buffer 5ulTaq 1uldH2O 39ul/30ul50ul94℃變性5分鐘，20-30個循環，94℃30秒，52℃30秒，72℃30秒。25個循環后72℃10分鐘。
如果此步驟(七)再加入1ul耐熱連接酶和抑制Oligo，可省去步驟(五)，(六)雜交連接酶反應。
(八)PCR產物分析1.5％瓊酯糖凝膠agarose電泳分析或在反向PCR液中加1ul熒光分子信標，熒光PCR擴增實時檢測。
本發明系統置換多聚酶鏈反應(ssPCR)優點(1)能避免PCR擴增產物的再污染，待測標本的有限幾次PCR轉換成數十套互不相同的指示PCR系統輪換使用。一套污染了就換一套工作。
(2)簡化RNA分子檢測，RNA不需要逆轉錄成cDNA就可直接置換成指示DNA擴增工作，特別適合大量RNA病毒的分子檢測。
(3)尤其適合基因突變遺傳病檢測，因為標本保留序列與指示模板加尾DNA雜交的缺口兩側要完全匹配才能修復。如果指示模板加尾DNA 5’端和3’端設置為突變序列就只能擴增突變了的基因。較檢測基因突變的連接酶鏈反應LCR技術更靈敏、簡便。
(4)較Southern和Northern Blot分子雜交靈敏、簡便將分子標記探針雜交檢測轉換成指示PCR，擴增更靈敏，省去了電泳、轉移等操作，更簡便。
圖1本發明系統置換多聚酶鏈反應示意圖(1)待測模板示意圖左側長直線代表模板，粗線為有意義鏈或RNA，細線為反意義鏈。
(2)指示模板右圖上斷開的雙環代表一套指示模板加尾DNA，包括環線代表的一段與待測基因無關的序列和兩端的與待測模板互補的保留序列(短直線部分)。
(3)左側代表陽性反應待測模板與指示模板加尾DNA序列雜交后經T4連接修復缺口，形成環狀指示DNA，并被反向PCR擴增。
(4)右側代表陰性反應缺口指示DNA被過量平端雙鏈Oligo競爭抑制，不能被T4連接酶環化，沒有擴增。
圖2本發明在乙型肝炎HBsAg基因檢測中的擴增結果其中，1為陰性對照，2為陽性，其余為標本。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
實施例.乙型肝炎HBsAg基因檢測(1)臨床11例標本DNA的純化(按Qiagen說明書進行)1)加100-200ul樣本于1.5ml EP管中加等量的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提，漩渦振蕩，臺式離心機離心最高速5分鐘。
2)上清100-200ul轉移至新EP管中，加等量氯仿，振蕩，離心。
3)上清加4倍的Qiagen結合緩沖液移至純化柱，洗滌緩沖液洗柱兩次，加50ul dH2O洗脫收集純化的樣本。
(2)指示模板加尾DNA PCR的準備1)選取乙型肝炎病毒HBs Ag aa124-138基因序列5’-gc acg att cct gct caa gga acc tct atg ttt ccc tct tg-3’3’-cg tgc taa ggt cga gtt cct tg-5’作為保留序列。
2)選取血吸蟲谷氨酸S轉移酶GST基因起始100bp序列5’-cctatac taggttattg gaaaattaag ggccttgtgc aacccactcg acttcttttg gaatatcttg aagaaaaata tgaagagcatttgtatgagc gcg-3’作為指示模板序列。
3)合成指示模板5’端引物待測模板保留序列右半部分有意義鏈18base加指示模板5’端最開始的18base有意義鏈序列。
5’-c tct atg ttt ccc tct tg cctatac taggttattg g-3’4)合成指示模板3’端引物待測模板保留序列左半部分反意義鏈22base加指示模板3’端最開始的19base反意義鏈序列。
5’-gt acc ttg agc tgg aat cgt gc cgc gctcatacaa atgctc-3’
5)PCR擴增指示加尾模板并用商業PCR產物純化柱純化。
pGEX-2T質粒(0.5ug/ul)1ul5’端指示引物Primer(5uM) 1ul3’端指示引物Primer(5uM) 1ul10×pfu buffer 5ul10mM dNTP1ulpfu 1uldH2O40ul50ul95℃變性5分鐘，25個循環，94℃30秒，52℃30秒，72℃30秒。25個循環后72℃10分鐘。
PCR產物50ul加4倍的200ul Qiagen結合緩沖液移至純化柱，洗滌緩沖液洗柱兩次，加50ul dH2O洗脫收集純化的指示PCR DNA。
(3)合成平端雙鏈抑制Oligo寡聚物取一段與待測模板和指示DNA都無關的人造短序列5’-GCGGTACCGG-3’，合成一段單鏈Oligo，再合成一段與之序列互補反意義鏈的5’-CCGGTACCGC-3’單鏈Oligo，雙鏈Oligo(100uM)混合，90℃加熱5分鐘，冷卻至室溫貯存。
(4)合成反向PCR引物取GST起始100bp指示DNA正中間的序列5’-gtgc aacccactcg acttcttttg gaatatcttg-3’3’-cacg ttgggtgagc tgaag-5’右半部分19base長的有意義鏈序列作為5’端反向PCR引物5’-cttcttttg gaatatcttg-3’；左半部分19base長的反意義鏈作為3’端反向PCR引物5’-gaagt cgagtgggtt gcac-3’。
(5)待測標本與指示模板加尾DNA雜交純化的待測乙型肝炎樣本 2ul純化的指示模板加尾DNA10ulT4連接酶緩沖液 5ul抑制Oligo(100uM) 1uldH2O32ul50ul95℃變性5分鐘再55℃10分鐘。
(6)連接酶反應取上述(5)雜交反應液50ul加T4連接酶1ul，16℃溫育2小時。
(7)反向PCR雜交連接酶反應液2ul5’端反向引物Primer 1ul3’端反向引物Primer 1ul10mM dNTP 1ul10×Taq buffer 5ulTaq 1uldH2O 39ul50ul94℃變性5分鐘，30個循環，94℃30秒，52℃30秒，72℃30秒。25個循環后72℃10分鐘。
(8)PCR產物分析PCR產物經1.8％瓊酯糖凝膠agarose電泳分析，結果見附圖2，實驗結果為3，6，9，11，12，13號標本陽性擴增。
實驗對照取上述11例臨床血液標本，經科華公司ELISA抗體檢測試劑盒檢測6例抗HBs Ag抗體陽性，5例陰性，結果見表1。1號為陰性對照，2號為陽性對照。其余為實驗標本。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 0.005 1.853 1.241 0.012 0.025 2.213 0.053 0.004 0.876 0.022 0.785 0.941B 1.235 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000從上述實驗結果看，附圖2與附表一ELISA檢測結果一致。
權利要求
1.系統置換多聚酶鏈反應，其特征在于通過部分互補序列的雜交，將待測PCR的擴增轉換成包括一套以上的指示PCR系統的擴增，所述每套指示PCR系統擴增的是無關的指示模板與待測模板中不同區域保留序列所形成的雜交互補序列，所述指示模板的基因序列是與待測模板無關的基因序列。
2.根據權利要求1所述的系統置換多聚酶鏈反應，所述待測模板為雙鏈DNA、單鏈RNA或DNA-RNA雜交雙鏈，所述單鏈RNA包括mRNA，所述待測模板保留序列長度為20-200bp。
3.根據權利要求2所述的系統置換多聚酶鏈反應，所述待測模板保留序列長度為30-50bp。
4.根據權利要求1所述的系統置換多聚酶鏈反應，所述指示模板為雙鏈DNA，序列長度為80-1000bp。
5.根據權利要求4所述的系統置換多聚酶鏈反應，所述指示模板序列長度為80-150bp。
6.根據權利要求1所述的系統置換多聚酶鏈反應，其特征在于該反應還包括熒光分子信標，所述熒光分子信標序列與待測模板保留序列雜交或與指示模板序列雜交。
7.權利要求1-6任一所述系統置換多聚酶鏈反應在基因點突變和大片段變異檢測中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種“系統置換多聚酶鏈反應”，其特征在于待測PCR系統置換成一套以上的指示PCR系統，所述每套指示PCR系統擴增的是無關的指示模板與待測模板中不同區保留的一小部分雜交序列，所述指示模板的基因序列是與待測模板無關不同源的序列。將待測標本PCR轉換成數十套互不干擾獨立的指示PCR系統輪換使用，一套污染了就換一套工作，避免PCR產物的再污染。指示DNA既可與待測DNA雜交也可與待測RNA雜交直接擴增，適用于RNA標本的直接檢測，而且雜交匹配依賴性修復擴增使其適合基因突變遺傳病的檢測。與熒光分子信標(Molecular beacon)聯用還適用于待測模板的定量測定。
文檔編號C12Q1/68GK101063159SQ200710107828
公開日2007年10月31日 申請日期2007年5月17日 優先權日2007年5月17日
發明者江洪, 江必勝, 廖同兵 申請人:北京萬達因生物醫學技術有限責任公司 被以下專利引用 (3),