專利名稱：一種炭疽桿菌γ噬菌體裂解酶的表達方法
技術領域：
本發明涉及一種表達炭疽桿菌Y噬菌體裂解酶的方法
背景技術：
炭疽桿菌是一種能形成芽胞的革蘭氏陽性大桿菌，由它感染引起的炭疽病是危害人類的 致死性重大傳染病。炭疽桿菌在有氧條件下形成大量芽胞，芽胞被人體吸入后在肺泡周圍的 淋巴細胞中萌發，其繁殖體和毒素進入血液，可致99%以上的未防護人群死亡。
芽胞生存力強，在干燥土壤中存活40年以上仍具有感染力，當前新發突發細菌病原體不 斷出現，抗生素抗性越來越高，且在世界范圍內普遍存在，裂解酶由于殺滅細菌的作用機制 與抗生素不同，裂解細菌細胞壁使之致死，細菌不會產生抗性，而Y噬菌體裂解酶專性裂解 炭疽桿菌，與炭疽桿菌結合力強，可替代抗生素，殺滅清除炭疽桿菌繁殖體與芽孢，具有開 發成藥物的潛力。
2002年，Schuch (Nature ，2002 ，418(8) :884 - 889)等人首次證實了 Y噬菌體裂解酶(命 名為plyG)可快速裂解生長中的炭疽桿菌并可有效地殺死感染炭疽桿菌小鼠中的病原菌。炭 疽桿菌Y噬菌體裂解酶由233個氨基酸殘基組成，是N—乙酰胞壁酸一L一丙氨酸酰胺酶，通 過破壞炭疽桿菌細胞壁中的N—乙酰胞壁酸和L一丙氨酸之間的交聯而使其裂解。體外試驗表 明plyG可特異性裂解炭疽桿菌各株型的細菌和芽孢，而對與其非常接近的蠟樣芽孢桿菌、蘇 云金芽孢桿菌則沒有殺滅效果。對其它如枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌、 短小芽孢桿菌也沒有作用。
Y噬菌體裂解酶對炭疽菌及芽孢的快速殺滅效果與高靈敏度，作為炭疽菌診斷試劑、炭 疽菌污染環境的洗消劑及炭疽治療藥物，具有開發潛力。因此本項目用基因工程的方法表達 Y噬菌體裂解酶，作為炭疽環境污染檢測試劑、炭疽洗消劑與炭疽治療藥物的用途。
根據已有文獻報道，美國的RaymondSchuch (2002)對Y噬菌體裂解酶做功能鑒定時用 了大腸桿菌表達系統獲得具有活性的plyG，國內軍事醫學科學院生物工程研究所(2005)也 用大腸桿菌表達系統獲得Y噬菌體裂解酶plyG。該種方法表達純化的plyG量雖然較大，但該 系統的內毒素及熱源問題使其應用仍有一定的局限性。
發明內容
本發明的目的是提供一種能在畢赤酵母菌中高效表達炭疽桿菌Y噬菌體裂解酶基因的方法。
本發明所提供的表達炭疽桿菌Y噬菌體裂解酶的方法，是將上述PlyG基因插入真核細胞 表達載體，經線性化后電轉化受體菌，獲得重組蛋白的宿主菌，經過隨機挑選和加壓篩選，獲得生產菌株G6，使Y噬菌體裂解酶在畢赤酵母工程菌P/c^'apo^w^ G6上清中獲得高表達， 且表達產物不含多余氨基酸。
所述真核細胞表達載體可為PPIC9K等商業酵母分泌型表達載體。
所述真核細胞表達載體為pMEX9K。
所述PlyG插入到pMEX9K的feci和酶切位點間。
所述宿主菌為巴斯德畢赤酵母P!'c/n'a pc^on's GS115。
所述工程菌為巴斯德畢赤酵母尸/c/z/aG6。
上述方法中，所述表達為誘導表達，所用的誘導劑為甲醇，誘導濃度為終體積0. 51 所述工程菌的培養溫度為28-3(TC，優選為28。C。
本發明使Y噬菌體裂解酶在畢赤酵母工程菌P!'cWa; flWw^ G6上清中獲得高表達，且表 達產物不含多余氨基酸。活性測定本發明表達的Y噬菌體裂解酶的活性達1200U/mg。
通過離心、過濾等方法除去菌體和大顆粒雜質；再通過超濾的方法除去小分子的色素和 鹽，并且濃縮體積，將發酵液調整為合適的緩沖液，經過離子交換層析、疏水層析、凝膠過 濾層析三步層析純化后，蛋白回收率為46%，原液純度可達95%以上。
圖1為Y噬菌體裂解酶基因PlyG的電泳圖(702bp) 圖2為所用的表達載體pMEX9K
圖3為畢赤酵母轉化子表達產物plyG的SDS-PAGE分析圖譜。泳道1、泳道2、泳道3、 泳道5、泳道6為誘導后轉化子的表達上清。泳道4為誘導前轉化子的表達上清。M為蛋白 分子量標準。目的蛋白27KD。
圖4為PlyG純化產物SDS-PAGE分析。泳道1為柱前產物，泳道2為一次純化產物， 泳道3為二次純化產物，泳道4為三次純化產物。
具體實施例方式
實施例中的方法如無特別說明，均為常規方法。
1、 PlyG基因的獲得
診斷用炭疽桿菌噬菌體由蘭州生物制品研究所惠贈。提取噬菌體基因組，以基因組為模 板擴增噬菌體裂解酶基因。噬菌體基因組的提取方法參照入噬菌體(也為dsDNA型)DNA的 提取方法。 (1)噬菌體平板培養1) 用SM液10倍梯度稀釋噬菌體原種。
2) 取0.1ml各梯度稀釋離心到一消毒微量離心管中，加0.2ml新鮮培養的宿主菌，加麥芽 糖(0.2%)， MgS04 (lOmm)， 37。C溫育20min，使噬菌體顆粒吸附于細菌。
3) 取熔化(47°C) 0.7Q/。瓊脂LB固體培養基3ml與上述管混勻，立即倒入預備<2-4天) 的含凝固1.5y。瓊脂LB固體培養基的平板內，輕輕晃動平板使均勻分布。
4) 37'C培養6-8hr后，觀察噬斑形成。
5) 用剪去部分頭部的吸頭挖取單個噬斑到0.5ml的SM液中，加0.05ml氯仿，震蕩。37 。C溫育10min。
6) 重復l) 一4)，獲得單個噬斑滴度。
(2) 噬菌體液體培養
1) 取2ml新鮮培養的宿主菌，離心，0.4mlLB培養基重懸，加噬菌體0.1ml (新鮮獲得 的單個噬斑，依滴度使之與宿主菌比約1/500-1000)。
2) 加麥芽糖(0.2%)， MgS04 (10mM), 37。C溫育20min，使噬菌體顆粒吸附于細菌。
3) 加到lOOml LB液體培養基中，加麥芽糖(0.2%), MgS04 (10mM)， 37。C搖震培養 9-12hr后可見裂解發生。
4) 加0.1ml氯仿，37'C繼續搖震培養10-20min。
(3) 噬菌體DNA提取
1)將上述裂解液轉移至離心管，離心8000gX10min,去細菌碎片，取上清液。
2) 力卩RNase A、 DNaseI至1 P g/ml， 37。C溫育30min。
3) 加9.3gPEG8000， 5.8gNaCl，搖勻至溶解，冰浴lhr或4。C過夜。
4) 4。C離心10000gX20min，去上清液。
5) 加2ml SM液，充分洗溶管壁及沉淀，移到新微量離心管，加20u 1 10%SDS， 20n 1 0.5M EDTA， 68。Cl5min。
6) 加等體積苯酚/氯仿/異戊醇(25: 24: 1)，混勻，離心12000gX5min，取上層液到一 新微量離心管，加等體積氯仿/異戊醇(24: 1)，混勻，離心12000gX5min。
7) 取上層液到一新微量離心管，加等體積異丙醇，混勻，-2(rClhr，4i:離心12000gX10min， 去上清液。
8) lml預冷的70。/。乙醇洗漆沉淀l-2次，4'C離心8000gX7min，棄上清，將沉淀室溫下 晾干。9)沉淀溶于20ulTE， -20^保存備用。
(4)以基因組為模板擴增噬菌體裂解酶基因。在目的基因兩端加入SacI和五coi I酶切位點， 設計引物如下
UPPER: 5-TGGAGCTCGAAATCCAAAAGAAATTAGTTGATC-3
LOWER: 5-GGGAATTC TTATTTAACTTCATACCACCAACCTTT-3
以2ul基因組DNA為模板，加入引物各liig，進行PCR擴增，PCR程序如下U)94。C， 5min; (2) 94°C 30sec， 52°C lmin, 72°C lmin， 30循環；(3) 72°C， 7min。將產物進行凝 膠電泳回收，電泳圖譜如圖l， PlyG基因為702bp。
實施例2、重組表達質粒的構建
用SacI及&oi I酶切PCR產物，與經同樣酶切處理的分泌型酵母表達載體pMEX9K (圖2) 連接，TSS法轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆提取質粒。送Takara公司測序，測序結果表 明該702bp大小的片段為PlyG基因，核苷酸兩個位點發生突變，但均為同義突變，氨基酸序列 經比對完全一致，表達載體構建成功，重組質粒命名為pMEXplyG。
實施例3、 PlyG基因在酵母中的高效表達
提取重組質粒pMEXplyG DNA，然后經Sac I酶切使之線性化，分離純化后用電轉化法 轉化畢赤酵母GS115。轉化后的GS115經MD平板篩選得到HIS+重組克隆，將MD平板上 生長的克隆接種YPD--G418平板，置于3(TC溫箱培養。將MD平板與不同G418濃度YPD 平板篩選出的重組克隆分別接種于5ml BMGY中，30°C300r/min培養至ODmo為2.0 6.0; 室溫4 000r/min離心4min。收集的菌體用BMMY懸浮并稀釋至OD6。。為1.0后，30°C 300r/min 誘導。每1211補加甲醇至0.5%。誘導48h后收集培養上清，SDS-PAGE檢測蛋白表達(圖3)， 并測定其生物活性。選取培養上清中表達量高的菌株G6作為生產菌株。將G6同時點種于 MD、 MM平板，3(TC培養2 3d，確定菌株的Mut表型為Mut+。
實施例4、三步層析純化PlyG蛋白
層析純化方法主要包括離子交換層析、疏水相互作用層析、親和層析以及凝膠過濾層析 等方法。本發明中，PlyG分泌表達在發酵上清液中，通過離心、過濾等方法除去菌體和大顆 粒雜質；再通過超濾的方法除去小分子的色素和鹽，并且濃縮體積，將發酵液調整為合適的 緩沖液，利于下步的層析純化。
層析純化的第一步采用陽離子交換介質SP Sepharose XL， SP Sepharose XL介質具有高載 量，快流速和易處理等特點，能快速有效地將plyG從超濾液中捕獲。上樣結束后，考慮到有利于下面的純化，采用20 mmol/L PB洗滌SP Sepharose XL層析柱步驟，再用20 mmol/L PB 1 mol/LNaCl洗脫蛋白。
層析第二步通過疏水相互作用介質Phenyl Sepharose除去SP Sepharose XL洗脫蛋白峰中 殘留的雜質和色素。用20 mmol/L PB 0.15 mmol/L NaCl 50%乙二醇可以有效從Phenyl Sepharose介質上洗脫目的蛋白。
層析第三步利用凝膠層析Superdex 75除去少量的雜質，并將緩沖液調整為磷酸鹽緩沖 液。經過三歩層析純化后，回收率為46%，原液純度可達到95%以上(圖4)。進行N端氨 基酸序列測定，序列測定結果表明N端氨基酸序列為MEIQK，與天然蛋白一致。
實施例5、 Y噬菌體裂解酶的活性檢測
將純化好的PlyG用Lowry法測蛋白濃度進行定量，并取部分樣品進行梯度稀釋。無毒炭 疽桿菌A15R用肉湯培養12h左右，制作吸光度標準曲線，測定最適吸收波長為0D6。。。取過夜 培養的無毒炭疽桿菌，離心收集菌體，1 XPBS(pH6)洗后重懸，并用l XPBS(pH6)稀釋，等 體積分裝，測定其初始0De。。。分別加入不同濃度的酶液，觀察其0De。。的下降情況，檢測對炭 疽桿菌的裂解情況。酶活性單位定義為以濃度lmg/mL的蛋白為標準，按l :1在同體積的菌 液中加入同體積不同稀釋倍數的酶液，37°C，搖床溫育20min后，0D,下降至原值-半時的 酶液的稀釋倍數。酶的比活性約為1200U/mg。
權利要求
1、一種表達炭疽桿菌γ噬菌體裂解酶的方法。其特征在于以畢赤酵母作表達系統，將炭疽桿菌γ噬菌體裂解酶基因插入酵母表達載體，構建成新的表達質粒，經線性化后電轉化宿主菌，經過隨機挑選和加壓篩選，獲得生產菌株G6，使γ噬菌體裂解酶在畢赤酵母工程菌Pichia pastoris G6上清中獲得表達，且表達產物不含多余氨基酸。
2、 含有權利要求1所述的表達載體、宿主菌、工程菌。
3、 根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述真核細胞表達載體為pMEX9K。
4、 根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述炭疽桿菌Y噬菌體裂解酶基因插入到pMEX9K的Sad和五co及I酶切位點間。
5、 根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于所述工程菌為巴斯德畢赤酵 母尸/c/z/a戸加r/51 G6。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中，所述表達為誘導表達，所用的誘導劑為甲醇，誘導濃度為終體積的0.5%。
7、 根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述工程菌的培養溫度為30'C， 誘導溫度為28-30°C。
8、 根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述工程菌的誘導時間為48-60h。
全文摘要
本發明公開了一種表達炭疽桿菌γ噬菌體裂解酶的方法。本發明采用畢赤酵母表達體系，利用已有知識產權的表達載體pMEX9K(ZL02117906.9)，將炭疽桿菌噬菌體基因與pMEX9K連接，構建成新的表達質粒pMEXplyG，經線性化后電轉化宿主菌巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris GS115，經過隨機挑選和加壓篩選，獲得生產菌株G6，使γ噬菌體裂解酶在畢赤酵母工程菌Pichia pastoris G6上清中獲得表達，且表達產物不含多余氨基酸。經離心、超濾、離子交換層析、疏水層析、凝膠層析獲得純度高于95％的γ噬菌體裂解酶。該酶對炭疽桿菌及萌發時的芽孢有裂解活性，可用于炭疽洗消劑、炭疽治療藥物的開發。
文檔編號C12N1/19GK101319195SQ200710105978
公開日2008年12月10日 申請日期2007年6月5日 優先權日2007年6月5日
發明者玲 付, 候利華, 宋小紅, 張曉鵬, 曹曉梅, 曼 李, 李建民, 董大勇, 薇 陳 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所;北京愛柯森倫生物工程科技有限公司