骨髓再生調控蛋白brrg-2、其編碼基因及其應用的制作方法

專利名稱：骨髓再生調控蛋白brrg-2、其編碼基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和醫學領域；具體地說，本發明涉及一種新的具有促進骨髓再生功能的蛋白，以及編碼該蛋白的基因，本發明還涉及該蛋白的用途和制備方法。

背景技術：
骨髓是造血的主要器官，富含多能干細胞。目前，骨髓移植已成為許多疾病的唯一治療方法，骨髓移植除了可以根治白血病以外，還能治療其它種類的一些血液病，如再生障礙性貧血、地中海貧血、異常骨髓細胞增生癥、遺傳性紅細胞異常癥、血漿細胞異常癥等以及淋病系統惡性腫瘤、遺傳性免疫缺陷癥、重癥放射病等。近年來世界上接受骨髓移植的病患逐年增加，顯示骨髓移植已經成為目前治療的趨勢。
骨髓再生和分化一直是臨床上骨髓移植，腫瘤放化療，以及將來利用骨髓移植進行一些遺傳病治療都要面臨的問題。然而，本領域目前對于骨髓再生、分化和遷移的分子機制的了解還不夠深入，對于調節骨髓再生、分化和遷移的基因的研究也鮮有報導。
因此，本領域需要進一步了解骨髓再生過程所涉及的基因，從而可以為臨床治療疾病提供新的解決方案。


發明內容
本發明的目的在于提供一種新的具有促進骨髓再生功能的蛋白及其編碼基因和應用。
在本發明的第一方面，提供一種分離的多肽，該多肽選自下組 (a)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽； (b)將SEQ ID NO2所示氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進骨髓再生功能的由(a)衍生的多肽。
在本發明的另一優選例中，該多肽是具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組 (i)編碼所述多肽的多核苷酸； (ii)與多核苷酸(i)互補的多核苷酸。
在本發明的另一優選例中，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在本發明的另一優選例中，該多核苷酸具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。
在本發明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，所述宿主細胞 含有所述的載體；或 基因組中整合有所述的多核苷酸。
在本發明的第五方面，提供一種制備所述的多肽的方法，該方法包含 (1)在適合表達的條件下，培養所述的宿主細胞；和 (2)從培養物中分離出所述的多肽。
在本發明的第六方面，提供一種所述多肽的用途，用于 篩選促進骨髓再生的藥物；或 制備促進骨髓再生的藥物。
在本發明的第一方面，提供一種藥物組合物，所述的藥物組合物包含有效量的所述的多肽，以及藥學上可接受的載體。
本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。



圖1顯示了電轉正常小鼠后，brrg-2基因對正常小鼠外周血白細胞數(A)、外周血小板數(B)、骨髓細胞數(C)的作用的統計數據曲線圖。
圖2顯示了電轉5-氟尿嘧啶抑制小鼠后，brrg-2基因對5-氟尿嘧啶抑制小鼠外周血白細胞數(A)、外周血小板數(B)、骨髓細胞數(C)的作用的統計數據曲線圖。
圖3顯示了brrg-2基因電轉后，正常小鼠(A)、5-氟尿嘧啶抑制小鼠(B)集落形成試驗結果。

具體實施例方式 在本發明中，術語“BRRG-2蛋白”、“BRRG-2多肽”或“骨髓再生調控蛋白BRRG-2”可互換使用，都指具有骨髓再生調控蛋白BRRG-2氨基酸序列(SEQ IDNO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的骨髓再生調控蛋白BRRG-2。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的BRRG-2蛋白或多肽”是指BRRG-2多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化BRRG-2蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。BRRG-2多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸(Met)殘基。
本發明還包括BRRG-2蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的天然BRRG-2蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發明中，術語“BRRG-2多肽”指具有BRRG-2蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術語還包括具有與BRRG-2蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括BRRG-2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與BRRG-2的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗BRRG-2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其它種類的多肽，如包含BRRG-2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了BRRG-2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有BRRG-2多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。
發明還提供BRRG-2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然BRRG-2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如可通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，“BRRG-2蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。
表1 本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼BRRG-2蛋白的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的編碼BRRG-2蛋白的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優選用于獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，并可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或BRRG-2蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列來表達或生產重組的BRRG-2多肽。一般來說有以下步驟 (1).用本發明的編碼BRRG-2多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞； (2).在合適的培養基中培養的宿主細胞； (3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，brrg-2多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限于pcDNA載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含BRRG-2編碼序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的BRRG-2蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)用于促進骨髓再生或促進骨髓抑制后恢復；用于篩選促進或抑制(優選促進)BRRG-2蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組BRRG-2蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激(優選促進)BRRG-2蛋白功能的多肽分子。
一般在腫瘤放化療之后會發生骨髓抑制現象，鑒于本發明的BRRG-2蛋白具有促進骨髓抑制后恢復的功能，因此可在受試者放化療之后給予BRRG-2蛋白，從而有利于盡可能的保護已受損的骨髓細胞，提高其對抗毒副作用的能力。
另一方面，本發明還包括對brrg-2DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于brrg-2基因產物或片段。較佳地，指那些能與brrg-2基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制BRRG-2蛋白的分子，也包括那些并不影響BRRG-2蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的brrg-2基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的brrg-2基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達BRRG-2蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷BRRG-2蛋白功能的抗體以及不影響BRRG-2蛋白功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用brrg-2基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與brrg-2基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗BRRG-2蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的BRRG-2蛋白。
本發明中的抗體可用于治療或預防與BRRG-2蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷BRRG-2蛋白的產生或活性。
抗體也可用于設計成針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如BRRG-2蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅BRRG-2蛋白陽性的細胞。
多克隆抗體的生產可用BRRG-2蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發明蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與BRRG-2蛋白發生相互作用的物質，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量(如0.00001-20wt％)的本發明BRRG-2蛋白或其激動劑、拮抗劑(優選激動劑)以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的BRRG-2蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
BRRG-2蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。例如，重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的BRRG-2蛋白，以抑制內源性的BRRG-2蛋白活性。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將BRRG-2基因轉移至細胞內。構建攜帶BRRG-2基因或其變異體的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組brrg-2基因或其變異體可包裝到脂質體中，然后再轉移至細胞內。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
能與BRRG-2蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對BRRG-2蛋白分子進行標記。
本發明還涉及定量和定位檢測BRRG-2蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的BRRG-2蛋白水平，可以用作解釋BRRG-2蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷BRRG-2蛋白起作用的疾病。
一種檢測樣品中是否存在BRRG-2蛋白的方法是利用BRRG-2蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與BRRG-2蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在BRRG-2蛋白。
BRRG-2蛋白的多聚核苷酸可用于BRRG-2蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，BRRG-2蛋白的多聚核苷酸可用于檢測BRRG-2蛋白的表達與否或在疾病狀態下BRRG-2蛋白的異常表達。如BRRG-2DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷BRRG-2蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法、Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用BRRG-2蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測BRRG-2蛋白的轉錄產物。
檢測BRRG-2基因的突變也可用于診斷BRRG-2蛋白相關的疾病。BRRG-2蛋白突變的形式包括與正常野生型BRRG-2DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
在本發明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本發明的多核苷酸是從小鼠骨髓抑制與再生模型獲取總RNA，將總RNA反轉錄獲得的cDNA中分離出的。其cDNA序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為558個堿基(不含終止密碼子)，編碼全長為186個氨基酸的BRRG-2蛋白。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1基因的獲得及制備 本發明人運用基因芯片分析方法，對5-氟尿嘧啶注射引發的小鼠骨髓抑制與再生模型進行了動態基因表達譜檢測，成功獲得了一張能夠反映小鼠骨髓再生過程基因表達的“全景圖”。通過這張“全景圖”，結合Affymetrix網站免費提供的專用分析軟件(http://www.affymetrix.com/support/developer/tools/affytools.affx)，總共找到了31條表達分泌型蛋白的新基因，這些基因的功能都不清楚，但在骨髓抑制和再生的整個過程中，它們的表達水平發生變化。
接著，在前述找到的新基因中，本發明對其中的2號基因進行了重點研究，該基因的cDNA序列如SEQ ID NO1所示，本發明人將之稱為brrg-2基因。
本發明人用250mg/kg量的5-氟尿嘧啶注射小鼠，從小鼠骨髓抑制最低點的第7天抽取骨髓細胞總RNA，常規方法反轉錄為cDNA。接著，利用引物 5’-ccggaattcaccatgttgcagcagctgtg-3’(SEQ ID NO3)， 5’-cgcggatcccaagtcttctcgtttccgaag-3’(SEQ ID NO4)。
進行PCR，獲得5’-端攜帶EcoR I，3’-端攜帶BamH I酶切位點的brrg-2基因。
用EcoR I/BamHI酶切前述獲得的brrg-2基因，克隆入經過同樣酶切的pcDNA3.1myc/his tag(-)A質粒(購自Invitrogen)中，獲得重組質粒pCDNA3.1/brrg-2；將該重組質粒轉化入大腸桿菌DH5α宿主細胞，擴增后大量制備純化的pcDNA3.1/brrg-2質粒，用于以下的基因活體功能驗證。
實施例2brrg-2基因具有促進骨髓再生功能 利用前面制備獲得的重組質粒pCDNA3.1/brrg-2注射Balb/c小鼠(周齡介于8-12周，雌雄混合)，每只小鼠脛前肌的質粒注射量為50μg。用微量注射器緩慢注射，然后插入針間距5mm的雙針電極電轉(美國BTX公司ECM63BTX細胞電穿孔儀)，電轉參數為100V、8次脈沖，每次間隔20ms，脈沖間隔200ms。
并且，設置陽性對照組、空質粒對照組、生理鹽水對照組作為比較。其中，陽性對照為電轉kit-ligand-pcDNA3.1myc/his tag(-)A質粒(質粒購自Invitrogen；kit-ligand的序列參見GenBank登錄號GI7305266或者NM_013598，用EcoRI/BamHI酶切后克隆入pcDNA3.1myc/his tag(-)A中)；空質粒對照為電轉pcDNA3.1myc/his質粒；電轉質粒總量為50μg；生理鹽水對照為電轉50μL生理鹽水。5-氟尿嘧啶抑制小鼠組的5-氟尿嘧啶注射量為250mg/kg，電轉時間定在5-氟尿嘧啶注射后第1天。
小鼠外周血采自眼底靜脈叢，在MEK6300型全自動血細胞計數儀(日本光電公司)上計數外周血白細胞和血小板數，在血球計數板上計數骨髓細胞，骨髓細胞計數前用0.8％氯化銨破碎紅細胞。每只計數細胞的小鼠都預留了股骨和血清，以備在篩查到陽性結果情況下，繼續深入檢測。如果導入brrg-1基因后，小鼠外周血白細胞數、外周血小板數，骨髓細胞數發生增加，說明brrg-1基因促進骨髓細胞的增殖，分化和/或遷移，反之則抑制骨髓細胞的增殖，分化和/或遷移。
表2和表3列出了brrg-2基因、陽性對照、空質粒對照、生理鹽水對照在功能篩查中的細胞計數比較情況。其中，表2為正常小鼠組質粒電轉后細胞計數，外周血白細胞數(A)、外周血小板數(B)、骨髓細胞數(C)在各個時間節點的變化。表3為5-氟尿嘧啶抑制小鼠組質粒電轉后細胞計數，外周血白細胞數(I)、外周血小板數(II)、骨髓細胞數(III)在各個時間節點的變化。
圖1和圖2分別是brrg-2基因對正常小鼠和5-氟尿嘧啶抑制小鼠作用的統計數據曲線圖，以便于直觀比較。統計方法為單尾等方差T檢驗。
表2 A
B
C
表3 I
II
III
根據統計結果來看，在正常小鼠組，陽性對照第5天外周血白細胞數(8250±1880)顯著高于空質粒(5283±584，p＜0.01)和生理鹽水(6016±1413，p＜0.05)陰性對照，外周血小板數未見顯著差異；骨髓細胞數在第17天(28400000±6096667)和第27天(24700000±3013736)均高于兩陰性對照組(空質粒對照、生理鹽水對照)，且在第27天和空質粒對照(13800000±3488756，p＜0.01)有顯著性差異。在5-氟尿嘧啶抑制小鼠組，陽性對照的骨髓細胞數在第14天外周血白細胞數(6966±4149)和血小板數(317±82)恢復程度都好于空質粒對照(4016±1010，p＝0.06；240±126，p＝0.11)和生理鹽水對照(5400±2313，p＝0.12；208±48，p＜0.01)。
brrg-2基因電轉正常小鼠后未見到外周血白細胞，血小板和骨髓細胞數目發生顯著變化，但第27天的外周血白細胞數(7985±1533)和骨髓細胞數(24000000±3406930)與空質粒對照(5916±2240，p＜0.05；13800000±3488756，p＜0.01)和生理鹽水對照(7033±2537，p＝0.21；20400000±7140361，p＝0.13)相比有增高的趨勢(圖1)；這種趨勢在基因電轉5-氟尿嘧啶抑制小鼠后第11天和第14天表現得較為充分第11天和第14天外周血白細胞數(3916±733；6857±1877)與空質粒對照(1550±1306，p＜0.01；4016±1010，p＜0.01)和生理鹽水對照(2083±2394，p＝0.05；5400±2313，p＝0.07)相比，具有明顯恢復較快趨勢；而外周血小板數在第11天(150±64)與空質粒對照(62±60，p＜0.05)和生理鹽水對照(63±36，p＜0.01)相比，明顯恢復得好，統計有顯著性差異；同樣，第11天和第14天的骨髓細胞數水平(11000000±4497499，20900000±9137158)與空質粒對照(5360000±5263475，p＜0.05；14500000±6257968，p＝0.08)和生理鹽水對照(4970000±7044265，p＝0.05；16400000±7876790，p＝0.11)相比，亦具有恢復較好趨勢。
上述結果提示，brrg-2基因具有促進骨髓抑制后恢復的作用，也即可促進骨髓的再生。
實施例3集落形成試驗 為了印證以上體內實驗的初步結果，本發明人隨即對第10天和第17天的正常小鼠，以及第7天和第14天的5-氟尿嘧啶抑制小鼠做了集落形成試驗。實驗分組和基因電轉方法仍然同前，在相應天數處死小鼠，70％酒精浸泡小鼠5分鐘以上，無菌條件下沖出股骨骨髓細胞，0.8氯化銨破碎紅細胞，計數骨髓有核細胞總數，按10000個細胞/3.5cm平皿鋪板，甲基纖維素濃度1.05％，在37℃，5％CO2，飽和濕度條件下培養7天后計數集落。所用細胞因子組合為rhG-CSF10ng+rhEP03U+rmIL-310ng+rmFLt-310ng/平皿。
集落形成試驗結果見表4。其中，表4A為正常小鼠組的結果，表4B為5-氟尿嘧啶抑制小鼠組的結果。
結果顯示陽性對照(Kit-Ligand)電轉正常小鼠第10天和第17天的骨髓細胞集落形成能力與空質粒對照和生理鹽水對照相比均無顯著性差異(p＞0.05，表4A)，但第17天集落數均數(53±15)高于空質粒對照和生理鹽水對照(42±14；37±14)，反映的趨勢與前面骨髓細胞計數一致；這種一致的趨勢同樣在5-氟尿嘧啶抑制小鼠第7天和第14天的集落形成個數上得到更為清楚的體現(表4B)陽性對照第7天(46±14)和第14天(204±82)集落均數都高出空質粒對照(34±21，p＝0.12；134±16，p＝0.07)和生理鹽水對照(36±11，p＝0.20；118±34，p＝0.08)，這種高的趨勢與前面骨髓計數的情況一致。
brrg-2基因電轉正常小鼠第10天和第17天的骨髓細胞集落形成能力與對照組相比沒有明顯不同，與在正常小鼠相同天數骨髓細胞計數結果一致(圖3A)；但brrg-2基因電轉5-氟尿嘧啶抑制小鼠第7天(57±13)的集落形成能力與空質粒對照(34±21，p＝0.05)和生理鹽水對照(36±11，p＜0.05)相比，具有明顯增高的趨勢，這種趨勢到了第14天(230±76vs 134±16，p＜0.05；230±76vs118±34，p＜0.05)表現為統計有顯著性增高(圖3B)，與在5-氟尿嘧啶抑制小鼠外周血細胞和骨髓細胞變化趨勢完全相符。
上述結果進一步提示，brrg-2基因具有明顯促進骨髓抑制后恢復的功能，也即可促進骨髓的再生。
表4 A
B
得到這樣的結果后，本發明人根據實驗記錄收集到的brrg-2基因電轉5-氟尿嘧啶抑制小鼠第14天死亡率為8.3％(1/12)，陽性對照為12.5％(1/8)，空質粒和生理鹽水對照均為14.3％(1/7)，也即brrg-2基因電轉后可顯著降低5-氟尿嘧啶抑制小鼠的死亡率。該結果進一步反映出brrg-2基因具有促進骨髓抑制后恢復的功能，也即可促進骨髓的再生。
實施例5BRRG-2蛋白變異體 采用常規的定點突變技術，本發明人將SEQ ID NO2所示的BRRG-2氨基酸序列的第80位的Val殘基變異為Ala，構成BRRG-2蛋白變異體(BRRG-2-M)。如前所述類似的方法，在BRRG-2-M蛋白的編碼基因的兩端加上EcoRI/Bam HI酶切位點，將該基因克隆入經過同樣酶切的pcDNA3.1myc/his中，獲得重組質粒pCDNA3.1/brrg-2-m。
接著，通過如實施例3所述的集落形成試驗驗證BRRG-2-M是否也有促進骨髓的再生的功能。
結果顯示，brrg-2-m基因電轉正常小鼠和5-氟尿嘧啶抑制小鼠后的集落形成能力也顯著增高，說明BRRG-2-M保留了BRRG-2的功能，也具有促進骨髓抑制后恢復的功能。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表
<110>再生醫藥有限公司
<120>骨髓再生調控蛋白BRRG-2、其編碼基因及其應用
<130>071848
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>558
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(558)
<400>1
atg gtt gca gct gtg gcg acg gcg tgg ctg ctc ctg tgg gcc gcg gcc48
Met Val Ala Ala Val Ala Thr Ala Trp Leu Leu Leu Trp Ala Ala Ala
1 5 10 15
tgc gcg caa tcc gag cag gac ttc tac gac ttc aag gcg gtc aac atc96
Cys Ala Gln Ser Glu Gln Asp Phe Tyr Asp Phe Lys Ala Val Asn Ile
20 25 30
cgg ggc aag ctg gtg tcg ctg gag aag tac cgt ggc tcg gtt tcc ctg 144
Arg Gly Lys Leu Val Ser Leu Glu Lys Tyr Arg Gly Ser Val Ser Leu
35 40 45
gtg gtg aac gta gct agc gaa tgt ggc ttc aca gac cag aac tac cga 192
Val Val Asn Val Ala Ser Glu Cys Gly Phe Thr Asp Gln Asn Tyr Arg
50 55 60
gcc ttg cag cag ctg cag cgg gac ctg ggc ccc cat cat ttt aat gtg 240
Ala Leu Gln Gln Leu Gln Arg Asp Leu Gly Pro His His Phe Asn Val
65 70 75 80
ctt gcc ttc cct tgc aac cag ttt ggc caa cag gaa cca gac acc aac 288
Leu Ala Phe Pro Cys Asn Gln Phe Gly Gln Gln Glu Pro Asp Thr Asn
85 90 95
agg gag att gag aac ttt gcc cgc cgc acc tac agt gtc tct ttt ccc 336
Arg Glu Ile Glu Asn Phc Ala Arg Arg Thr Tyr Ser Val Ser Phe Pro
100 105 110
atg ttt agc aag atc gca gtc act ggc act ggt gcc cac cct gcc ttc 384
Met Phe Ser Lys Ile Ala Val Thr Gly Thr Gly Ala His Pro Ala Phe
115 120 125
aag tac cta acc cag act tct ggg aag gag ccc acc tgg aac ttc tgg432
Lys Tyr Leu Thr Gln Thr Ser Gly Lys Glu Pro Thr Trp Asn Phe Trp
130 135 140
aag tac cta gtg gac cca gac gga aag gtg gtg gga gca tgg gac ccc480
Lys Tyr Leu Val Asp Pro Asp Gly Lys Val Val Gly Ala Trp Asp Pro
145 150 155 160
act gtg cca gtg gcg gag atc aag ccc cgt att aca gag cag gtg atg528
Thr Val Pro Val Ala Glu Ile Lys Pro Arg Ile Thr Glu Gln Val Met
165 170 175
aaa ctc atc ctt cgg aaa cga gaa gac ttg558
Lys Leu Ile Leu Arg Lys Arg Glu Asp Leu
180 185
<210>2
<211>186
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>2
Met Val Ala Ala Val Ala Thr Ala Trp Leu Leu Leu Trp Ala Ala Ala
1 5 10 15
Cys Ala Gln Ser Glu Gln Asp Phe Tyr Asp Phe Lys Ala Val Asn Ile
20 25 30
Arg Gly Lys Leu Val Ser Leu Glu Lys Tyr Arg Gly Ser Val Ser Leu
35 40 45
Val Val Asn Val Ala Ser Glu Cys Gly Phe Thr Asp Gln Asn Tyr Arg
50 55 60
Ala Leu Gln Gln Leu Gln Arg Asp Leu Gly Pro His His Phe Asn Val
65 70 75 80
Leu Ala Phe Pro Cys Asn Gln Phe Gly Gln Gln Glu Pro Asp Thr Asn
85 90 95
Arg Glu Ile Glu Asn Phe Ala Arg Arg Thr Tyr Ser Val Ser Phe Pro
100 105 110
Met Phe Ser Lys Ile Ala Val Thr Gly Thr Gly Ala His Pro Ala Phe
115 120 125
Lys Tyr Leu Thr Gln Thr Ser Gly Lys Glu Pro Thr Trp Asn Phe Trp
130 135 140
Lys Tyr Leu Val Asp Pro Asp Gly Lys Val Val Gly Ala Trp Asp Pro
145 150 155 160
Thr Val Pro Val Ala Glu Ile Lys Pro Arg Ile Thr Glu Gln Val Met
165 170 175
Lys Leu Ile Leu Arg Lys Arg Glu Asp Leu
180 185
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>3
ccggaattca ccatgttgca gcagctgtg29
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>4
cgcggatccc aagtcttctc gtttccgaag 30
權利要求
1.一種分離的多肽，其特征在于，該多肽選自下組
(a)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽；
(b)將SEQ ID NO2所示氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進骨髓再生功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組
(i)編碼如權利要求1所述多肽的多核苷酸；
(ii)與多核苷酸(i)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞
含有權利要求6所述的載體；或
基因組中整合有權利要求3所述的多核苷酸。
8.一種制備權利要求1所述的多肽的方法，其特征在于，該方法包含
(1)在適合表達的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；和
(2)從培養物中分離出權利要求1所述的多肽。
9.一種權利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于
篩選促進骨髓再生的藥物；或
制備促進骨髓再生的藥物。
10.一種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包含有效量的權利要求1所述的多肽，以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明公開了一種分離的蛋白BRRG-2，該蛋白具有促進促進骨髓再生的功能。本發明還公開了編碼所述蛋白的多核苷酸，生產所述蛋白的方法以及所述蛋白的用途。
文檔編號C12P21/02GK101289505SQ200710101388
公開日2008年10月22日 申請日期2007年4月20日 優先權日2007年4月20日
發明者毛文偉, 偉 韓, 遷 梁 申請人:再生醫藥有限公司