一種規模化篩選微生物耐堿相關基因的方法

專利名稱：一種規模化篩選微生物耐堿相關基因的方法
技術領域：
本發明屬于微生物工程領域，涉及一種規模化篩選微生物耐堿相關基因的方法。
背景技術：
在國際上，大腸桿菌缺陷株E被用于從微生物中克隆耐鹽相關基因。其做法是提取純培養微生物的DNA，用限制性內切酶對其進行部分酶切，將酶切片段連接到適當的載體，并用連接產物轉化大腸桿菌缺陷株E，然后，在含一定濃度NaCl或LiCl的固體培養基上對轉化子進行篩選，從而獲得攜帶耐鹽相關基因的重組子。實際上，還可以用大腸桿菌缺陷株E克隆耐堿相關基因。所謂耐堿相關基因，是指與細胞內的pH穩態相關的基因。但截至目前，還沒有人采用該菌株從微生物中規模化克隆耐堿相關基因。

發明內容
本發明的目的是從堿性環境微生物樣品中克隆得到大量的耐堿相關基因，實現對微生物耐堿相關基因克隆的高通量和規模化。
一種規模化篩選微生物耐堿相關基因的方法，經過樣品采集、宏基因組DNA的粗提、宏基因組DNA的純化三個步驟，再通過陽性克隆的篩選、測序和亞克隆等步驟，獲得耐堿相關單一基因，并對基因進行功能鑒定。其特征是1.樣品采集從鹽堿湖和鹽堿地等多元化的地域環境中采集土壤樣品，樣品采集后，-70℃--80℃保存備用。
2.采用CTAB-SDS-凍融法粗提宏基因組DNA宏基因組DNA是指特定環境樣品中所有微小生物的DNA總和。CTAB-SDS-凍融法(即十六烷基三甲基溴化銨-十二烷基硫酸鈉-凍融法)粗提宏基因組DNA的詳細步驟為(1)稱取1g土樣于15mL離心管中(如果需要大量提取宏基因組DNA，可稱取3-10g土樣于50mL離心管中，相應試劑的用量按比例增加)，加入2-10mL經35-37℃預熱的DNA提取液、50-200mg PVPP(交聯聚乙烯吡咯烷酮)、10-100μL(約20-200個活性單位)溶菌酶和5-20粒滅菌玻璃珠，在35-37℃、200-300r/min條件下振蕩30-90min。然后加入0.2-1.0mL濃度為20％的SDS(十二烷基硫酸鈉)，上下用力顛倒，使之混勻；DNA提取液的配方包括100mmol/L Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸)，100mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，100mmol/L Na3PO4(磷酸三鈉)，1.5mol/L NaCl，濃度為1-3％ CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，pH7.8-8.2。
(2)50-65℃水浴1-2小時(每隔10-30min上下輕輕顛倒離心管2-4次，切勿振蕩！！)。水浴完畢，冷卻至室溫，然后加5-50μL(約10-100個活性單位)蛋白酶K，35-37℃溫度下搖動30-60min；(3)置于-20℃冷凍20min-40min，然后50-65℃凍融、35-37℃溫育30-60min；
0-10℃、8,000-12,000r/min離心5-20min，得到上清1和沉淀物1；(4)將得到的上清1轉移至另一離心管中，然后向沉淀物1中加入0.9-2.7mL DNA提取液和0.1-0.3mL 20％SDS，混勻，50-65℃水浴1-2小時。然后于-20℃冷凍，50-65℃解凍，冰浴冷卻；再冷凍和融化各1次，0-10℃、8,000-12,000r/min離心5-20min，得到上清2；將所得到的上清2吸出，并與上清1合并，所得上清液為上清3；(5)抽提向上清3中加入與上清3等體積預冷的氯仿∶異戊醇(體積比為24∶1)，上下輕輕顛倒離心管，使充分混合，然后0-10℃、8,000-12,000r/min離心5-20min，得到上清4；小心吸取上清液4至另一離心管，加入體積相當于上清液4的0.1倍的預冷的1mMEDTA-3M NaAc溶液(含有1mM乙二胺四乙酸與3M醋酸鈉的試劑，pH5.2)和相當于上清液4體積0.6倍的預冷異丙醇。輕混勻后冰浴10-30min、或者在-20℃下放置1-24小時，使DNA沉淀；0-10℃、8000-12000r/min離心5-20min，得到上清5和沉淀物2；(6)倒掉上清5，然后向沉淀物2中加入1-10mL經0-10℃預冷的70％乙醇，冰浴或者置4℃冰箱至少30min，然后0-10℃、8,000-12,000r/min離心10-20min，得到上清6和沉淀物3；(7)去上清6，用真空干燥機對沉淀物3進行干燥后，向所得粉末狀宏基因組DNA中加入20-150μL的ddH2O(滅菌雙蒸水)，-20℃保存備用(短時間保存可置4℃冰箱)。
3.宏基因組DNA的純化采用試劑盒對經粗提獲得的宏基因組DNA進行純化，詳細操作方法見Promega公司的DNA凝膠回收試劑盒。用紫外分光光度計測定DNA的純度和濃度。
對經過純化的宏基因組DNA進行陽性克隆的篩選依次按以下步驟進行。
4.陽性克隆的篩選(1)宏基因組DNA的部分酶切預實驗。用10mM Tris-HCl(pH8.0)稀釋宏基因組DNA至900μl，加入100μl 10×酶切緩沖液充分混勻，10×酶切緩沖液成分為500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇，1000mM NaCl，所得溶液為宏基因組DNA稀釋液；準備10個離心管，依次編號；用切去尖端的移液器吸頭，向1號離心管加入30μl宏基因組DNA稀釋液，向2-10號離心管中各加入15μl宏基因組DNA稀釋液，并將1-10號離心管置于冰上；向1號離心管中加入3μl(約0.06U)Sau3AI(分離自金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus 3A菌株的第一種限制性內切酶)，并溫和混勻，然后從1號離心管中吸出15μl轉移至2號離心管中，溫和混勻，并吸取15μl轉移至3號離心管中，依次類推，直至第10號離心管。將所有離心管于37℃溫育60min。酶切消化結束后，快速置70-75℃加熱10-20min，以滅活限制性內切酶。待樣品降至室溫后，用0.6-0.8％的瓊脂糖進行凝膠電泳，以檢測宏基因組DNA部分酶切的效果。酶切消化完全、且酶切產物集中在4-10kb范圍的內切酶Sau3AI用量為最適酶量，其大致范圍為0.001-0.006個活性單位/管。
(2)宏基因組DNA部分酶切產物的大規模制備。根據宏基因組DNA部分酶切預實驗所確定的最適Sau3AI用量擴大酶切反應體系，用0.012-0.05個活性單位的Sau3AI對500-2,000ng的宏基因組DNA消化1小時，然后用酚∶氯仿小心抽提部分酶切產物兩次；用相當于部分酶切產物2倍體積、經0-10℃預冷的無水乙醇進行沉淀，并將沉淀溶于30-200μl的ddH2O中，得到部分酶切產物；用0.6-1.0％的瓊脂糖對部分酶切產物進行凝膠電泳，然后用DNA凝膠回收試劑盒回收4-10kb范圍的DNA片段，并將回收的4-10kb范圍的DNA片段置-20℃保存；(3)pGEM3Zf(+)載體的酶切和去磷酸化。對pGEM3Zf(+)載體依次用BamHI完全酶切以及牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)去磷酸化處理；(4)用經回收的宏基因組DNA部分酶切片段與pGEM3Zf(+)載體按6∶1-1∶4的比例進行連接，直接用獲得的連接產物電轉化大腸桿菌缺陷株E，然后在pH8.0-9.0的堿性條件下對重組子進行篩選，獲得陽性克隆。所有陽性克隆均攜帶耐堿相關基因；(5)挑取陽性克隆依次進行質粒的快速檢測、質粒提取和測序鑒定。
5.目的基因的亞克隆和再轉化(1)根據陽性克隆攜帶重組質粒的序列比對結果，設計一對特異引物，通過常規的PCR方法，對耐堿相關基因的全長(包含推測的啟動子和終止子)進行亞克隆，并將亞克隆基因連接到pGEM3Zf(+)載體(一種常用的克隆載體)獲得重組質粒，然后用獲得的重組質粒再次轉化大腸桿菌缺陷株E，獲得僅攜帶耐堿相關單一基因或基因簇的重組子。
(2)重組子在不同鹽濃度下的生長能力測試分別在pH7.0-9.5的培養基中培養攜帶耐堿相關單一基因的大腸桿菌缺陷株E重組子，從而確定耐堿相關基因提高E缺陷株耐堿性的能力。
6.翻轉膜(1)翻轉膜的制備培養并收集各重組子和陰性對照菌株的菌體，用法式細胞破碎儀(French Press)以1,200-2,500p.s.i.的系統壓力破碎細胞，然后80,000-100,000×g超速離心1-2小時，所得沉淀即為翻轉膜，將獲得的翻轉膜置-70--80℃保存備用。
(2)翻轉膜的性質鈉離子輸出蛋白的活性測定采用熒光分光光度計法測定翻轉膜中耐堿相關蛋白在pH4.5-9.5下的活性，測定方法即利用吖啶橙作為熒光探針，向含有翻轉膜的反應體系中添加Tris-L-乳酸鉀或Tris-L-乳酸至終濃度為5-10mM，使熒光強度逐漸猝滅，并通過熒光分光光度計監控跨膜pH梯度的變化。熒光監測參數為激發光(EX)波長430-505nm，發射光(EM)波長510-530nm。當熒光強度下降至穩態時，向反應體系加入終濃度為2-10mM的NaCl、LiCl或KCl。如果翻轉膜具有單價陽離子轉運活性，則熒光強度開始恢復。根據熒光強度的恢復程度判斷并表示翻轉膜中Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向轉運蛋白活性的大小以及轉運單價陽離子的特異性。
表觀Km(米氏常數)和Vmax(最大反應速度)的測定在最適pH條件下，使用不同濃度的NaCl、LiCl或KCl分別測定翻轉膜中的Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向轉運蛋白活性。然后，以底物濃度和熒光強度作雙倒數圖，并由此計算耐堿相關蛋白對Na+、Li+和K+的表觀Km值和Vmax值，獲得新基因編碼蛋白的動力學參數及轉運單價陽離子的能力等特征信息。
采用本發明，可以從堿性環境微生物樣品中克隆得到大量的耐堿相關基因，實現對微生物耐堿相關基因克隆的高通量和規模化。
具體實施例方式
以下實施例將對本發明作進一步說明。
從采集自新疆堿湖的土壤樣品中克隆微生物耐堿相關基因。其詳細步驟為1.用樣品采集器沿堿湖四周采集約20cm深的沉積土樣，然后分裝于滅菌的50ml離心管中。樣品帶回實驗室后，-80℃保存備用。
2.土壤微生物宏基因組的提取。具體方法是(1)稱取1g土樣于15mL離心管中，加約50mg的PVPP和2.7mL預熱的DNA提取液，再加入50μL溶菌酶，37℃、250r/min振蕩30min；(2)加入0.3mL 20％的SDS，上下用力顛倒幾次，使之混合均勻；(3)65℃水浴2小時(每隔20min左右上下輕輕顛倒離心管幾次，切勿振蕩！)。水浴完畢，冷卻至室溫，然后加20μL蛋白酶K，37℃溫和搖動30-60min；(4)置于-20℃冷凍30min(或更長時間)，然后65℃凍融10min，37℃溫育30min4℃、10,000r/min離心10min，得到上清1和沉淀物1，收集上清1轉移至另一離心管中；(5)向(4)步得到的沉淀中加入0.9mL DNA提取液和0.1mL 20％ SDS，混勻，65℃水浴30min。然后于-20℃冷凍，65℃凍融10min，冰浴冷卻；4℃、10,000r/min離心10min，得到的上清2，上清2與上清液1合并得到上清3；(6)抽提向上清3中加入與上清3等體積預冷的氯仿∶異戊醇(24∶1)，上下輕輕顛倒離心管，使充分混合，然后4℃、10000r/min離心20min得到上清4；小心吸取上清液4至另一離心管，加入0.1倍體積預冷的1mM EDTA-3M NaAc(pH5.2)和0.6倍體積預冷的異丙醇，輕混勻，然后冰浴15min、或者-20℃放置1h，使DNA沉淀；4℃、10,000r/min離心20min，得到上清5和沉淀物2；(7)倒掉上清5，向沉淀物2中加入5mL經過4℃預冷的70％乙醇，冰浴30min，然后4℃、10000r/min離心20min得到上清6和沉淀物3；倒掉上清6，用真空干燥機對沉淀物3進行干燥后，向所得粉末狀宏基因組DNA中加入20-150μL滅菌ddH2O，-20℃保存備用。
3.宏基因組部分酶切預實驗用10mM Tris-HCl(pH8.0)稀釋宏基因組DNA至900μl，加入100μl 10×酶切緩沖液，充分混勻，所得溶液為宏基因組DNA稀釋液；準備10個離心管，用切去尖端的移液器吸頭，向1號離心管加入30μl宏基因組DNA稀釋液，向2-10號離心管中各加入15μl宏基因組DNA稀釋液，并將1-10號離心管置于冰上；向1號離心管中加入3μl(約0.048U)Sau3AI，并溫和混勻，然后從1號離心管中吸出15μl轉移至2號離心管中，溫和混勻，并吸取15μl轉移至3號離心管中，依次類推。將所有離心管于37℃溫育60min；酶切消化結束后，將上述10個離心管置70℃加熱15min，以滅活Sau3AI。待反應溫度降至室溫后，用0.8％的瓊脂糖對酶切產物進行凝膠電泳，以檢測宏基因組DNA部分酶切的效果。酶切消化完全、且酶切產物集中在4-10kb范圍的內切酶Sau3AI用量為最適酶量，最適酶量用量為0.0018個活性單位/管。
4.宏基因組部分酶切產物的大規模制備根據宏基因組DNA部分酶切預實驗所確定的最適Sau3AI用量擴大酶切反應體系，用0.024個活性單位的Sau3AI對1000ng的宏基因組DNA消化1小時，然后用酚∶氯仿小心抽提兩次，用相當于部分酶切產物2倍體積、經4℃預冷的無水乙醇沉淀部分酶切產物，并將所得沉淀溶于200μl的ddH2O中；用0.8％的瓊脂糖對部分酶切產物進行凝膠電泳，然后用DNA凝膠回收試劑盒回收4-10kb范圍的DNA片段，并將回收產物置-20℃保存；5.pUC18載體的酶切和去磷酸化對pUC18載體(是一種常用的克隆載體)依次用BamHI完全酶切以及CIAP去磷酸化處理，得到線性化的pUC18載體。其中，BamHI為分離自Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢桿菌)H菌株的第一種限制性內切酶，CIAP為牛小腸堿性磷酸酶。
pUC18載體的酶切和去磷酸化反應體系如表1。
表1 pUC18載體的酶切和去磷酸化體系和反應條件

6.pUC18載體與基因組DNA部分酶切片段的連接將經過酶切和去磷酸化后產生的線性pUC18載體與經Sau3AI部分酶切的宏基因組DNA以1∶1的摩爾比進行連接，形成連接產物。連接體系如表2。
表2 pUC18與宏基因組部分酶切片段的連接體系和反應條件

7.陽性克隆的篩選
(1)從-80℃冰箱取出大腸桿菌缺陷株E的感受態細胞放入電激杯，冰上凍融，同時冰浴電激杯；(2)向感受態細胞中加入5μl連接產物，輕旋離心管以混勻內容物，然后冰浴5min；調節基因導入儀參數V＝1.6kV，R＝250Ω，電容25μF；(3)將感受態細胞和重組質粒的混合物轉入電激杯，將電激杯推入電激槽，然后啟動電脈沖；(4)取出電激槽，向電激杯內加入500μl經37℃預熱的LBK液體培養基(LBK液體培養基的配制方法10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5-6.5g氯化鉀，用去離子水定容至1000mL，121℃滅菌20min)，并抽吸3-5次；將杯內菌懸液移至離心管，37℃、180rpm溫育1小時；(5)將菌懸液涂布于pH8.0的LBK固體培養基(即在LBK液體培養基中添加1.5-2.0％的瓊脂粉和100μg ml-1氨芐青霉素)，37℃培養20小時，由此獲得陽性克隆。所有陽性克隆均攜帶耐堿相關基因。
8.對陽性克隆依次進行質粒的提取以及測序鑒定。
質粒的提取按照上海生工生物技術公司的質粒提取試劑盒的說明操作，序列測定在上海英俊廣州分公司進行。
9.耐堿相關基因的亞克隆用于亞克隆的PCR反應體系及條件如表3所示。
表3 目的基因的亞克隆體系及反應條件

10.亞克隆基因的再轉化將亞克隆基因連接到pGEM3Zf(+)載體，然后用獲得的重組質粒再次轉化大腸桿菌E菌株，用獲得的僅攜帶耐堿相關單一基因的重組子進行目的基因的功能研究，且均以攜帶空載體的大腸桿菌缺失株K/pGEM3Zf(+)作為陰性對照。
11.重組子在不同條件下的生長能力測試功能性表達的耐堿相關基因能不同程度地提高大腸桿菌缺陷株E的耐堿能力。分別在pH7.0-9.5的培養基中對大腸桿菌E重組子進行堿耐受性實驗。
12.翻轉膜的制備及性質測定(1)翻轉膜的制備培養并收集各重組子和陰性對照菌株的菌體，用French Press方法以1,500p.s.i.的系統壓力破碎細胞，然后100,000×g超速離心1小時，將獲得的翻轉膜置-80℃保存備用。
(2)翻轉膜的性質耐堿相關基因編碼蛋白的活性測定采用熒光分光光度計法測定翻轉膜中耐堿相關基因編碼蛋白在不同pH下的活性，即利用吖啶橙(AO)作為熒光探針，首先，向含有翻轉膜的反應體系中添加Tris-L-乳酸鉀或Tris-L-乳酸至終濃度為5mM，使熒光強度逐漸猝滅，并通過熒光分光光度計監控跨膜pH梯度的變化。熒光監測參數為激發光(EX)波長495nm，發射光(EM)波長530nm。當熒光強度下降至穩態時，向反應體系加入NaCl、LiCl或KCl至終濃度為10mM。如果翻轉膜具有單價陽離子轉運活性，則熒光強度開始恢復。根據熒光強度的恢復程度判斷并表示翻轉膜中Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向轉運蛋白活性的大小以及轉運單價陽離子的特異性。
表觀Km值和Vmax測定分別測定翻轉膜中的Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向轉運蛋白活性。然后，以底物濃度和熒光強度作雙倒數圖，并由此計算耐堿相關基因編碼蛋白對Na+、Li+和K+的表觀Km值和Vmax，獲得新基因編碼蛋白的動力學參數及轉運單價陽離子的能力等特征信息。
權利要求
1.一種規模化篩選微生物耐堿相關基因的方法，經過樣品采集、宏基因組DNA的粗提、宏基因組DNA的純化三個步驟，再通過陽性克隆的篩選、測序和亞克隆，獲得與耐堿相關的單一基因或基因簇，并對目的基因進行功能鑒定；其特征是樣品采集自鹽堿湖和鹽堿地多元化的地域環境，樣品采集后保存溫度為-70℃--80℃；提取宏基因組DNA的詳細步驟為(1)稱取1g土樣于15mL離心管中，加入2-10mL經過35-37℃預熱的DNA提取液和50-200mgPVPP及10-100μL溶菌酶和5-20粒滅菌玻璃珠，在35-37℃、200-300r/min條件下振蕩30-90min，加入0.2-1.0mL濃度為20％的SDS，10-100μL溶菌酶合20-200個活性單位；(2)50-65℃水浴1-2小時，每隔10-30min上下顛倒離心管；水浴完畢，冷卻至室溫，然后加5-50μL蛋白酶K，35-37℃溫度下搖動30-60min，5-50μL蛋白酶K合10-100個活性單位；(3)置于-20℃冷凍20min-40min，然后50-65℃凍融、35-37℃溫育30-60min；0-10℃、8,000-12,000r/min離心5-20min，得到上清1和沉淀物1；(4)將得到的上清1轉移至另一離心管中，然后向沉淀物1中加入0.9-2.7mL DNA提取液和0.1-0.3mL 20％SDS，混勻，50-65℃水浴1-2h，然后于-20℃冷凍，50-65℃解凍，冰浴冷卻；重復冷凍和融化1次，0-10℃、8,000-12,000r/min離心5-20min，得到上清2；將所得到的上清2吸出，并與上清1合并，所得上清液為上清3；(5)抽提向上清3中加入與上清3等體積預冷的氯仿和異戊醇，氯仿與異戊醇體積比為24∶1，上下顛倒離心管，然后0-10℃、8,000-12,000r/min離心5-20min，得到上清4；吸取上清液4至另一離心管，加入體積相當于上清液4的0.1倍的預冷的pH5.2的1mMEDTA-3MNaAc和體積相當于上清液4的0.6倍的預冷的異丙醇，混勻后冰浴10-30min、或者在-20℃下放置1-24小時使DNA沉淀；0-10℃、8,000-12,000r/min離心5-20min，得到上清5和沉淀物2；(6)倒掉上清5，然后向沉淀物2中加入1-10mL經0-10℃預冷的70％乙醇，冰浴或者置4℃冰箱至少30min，然后0-10℃、8,000-12,000r/min離心10-20min，得到上清6和沉淀物3；(7)去上清6，用真空干燥機對沉淀物3進行干燥后，向所得粉末狀宏基因組DNA中加入20-150μL滅菌ddH2O，-20℃保存備用；對于大量提取宏基因組DNA，則土樣的稱取數量和相應試劑的用量要按比例增加。
2.如權利要求1所述的一種規模化篩選微生物耐堿相關基因的方法，其特征是對經過純化的宏基因組DNA進行部分酶切，并將部分酶切片段連接到pGEM3Zf(+)載體，得到連接產物，依次按以下步驟進行(1)宏基因組DNA部分酶切預實驗準備10只離心管，用切去尖端的移液器吸頭向1號離心管加入30μl宏基因組DNA稀釋液，向2-10號離心管各加入15μl宏基因組DNA稀釋液，然后采用2倍稀釋法，對加入酶切反應體系的Sau3AI進行梯度稀釋，于37℃溫育1小時，酶切消化結束后，將離心管快速置70-75℃加熱10-20min，以滅活限制性內切酶；待反應體系降至室溫后，用濃度為0.6％的瓊脂糖對部分酶切產物進行凝膠電泳，以檢測酶切效果，酶切消化完全、且酶切產物集中在4-10kb范圍的內切酶Sau3AI用量為最適酶量，最適酶量范圍為0.001-0.006個活性單位/管；(2)宏基因組DNA部分酶切產物的大規模制備根據宏基因組DNA部分酶切預實驗所確定的最適Sau3AI用量擴大酶切反應體系，用0.012-0.05個活性單位的Sau3AI對500-2,000ng的宏基因組DNA消化1小時，然后用酚氯仿對部分酶切體系進行兩次抽提，用相當于抽提液2倍體積、0-10℃預冷的無水乙醇沉淀DNA，并將所得沉淀即部分酶切產物溶于30-200μl的ddH2O；用濃度為0.6-1.0％的瓊脂糖對部分酶切產物進行凝膠電泳，然后用DNA凝膠回收試劑盒回收4-10kb范圍的DNA片段，并將回收的4-10kb范圍的DNA片段置-20℃保存；(3)載體的酶切和去磷酸化對pGEM3Zf(+)質粒依次用BamHI完全酶切以及CIAP去磷酸化處理；(4)用經回收的宏基因組DNA部分酶切片段與pGEM3Zf(+)載體按6∶1-1∶4的比例進行連接，獲得連接產物。
3.如權利要求1所述的一種規模化篩選微生物耐堿相關基因的方法，其特征是陽性克隆的篩選(1)從-70--80℃冰箱取出大腸桿菌缺陷株E的感受態細胞放入電激杯，冰上凍融，同時冰浴電激杯；(2)向感受態細胞中加入0.5-5.0μl連接產物，輕旋離心管以混勻內容物，然后冰浴5min；調節基因導入儀參數V＝1.6-2.0kV，R＝200-500Ω，電容25-50μF；(3)將感受態細胞和重組質粒的混合物轉入電激杯，將電激杯推入電激槽，然后啟動電脈沖；(4)取出電激槽，向電激杯內加入500-800μl經過35-37℃預熱的LBK液體培養基，并抽吸混勻；將杯內菌懸液移至離心管，35-37℃、150-300rpm溫育30-60min；(5)將菌懸液涂布于pH8.0的LBK固體培養基，內含50-100μg ml-1氨芐青霉素，35-37℃培養16-24小時，由此獲得陽性克隆。
4.如權利要求1所述的一種規模化篩選微生物耐堿相關基因的方法，其特征是目的基因的亞克隆和再轉化根據陽性克隆攜帶重組質粒的序列比對結果，設計一對特異引物，通過常規的PCR方法，對耐堿相關基因的全長進行亞克隆，并將亞克隆基因連接到pGEM3Zf(+)載體，由此獲得重組質粒，然后用獲得的重組質粒再次轉化大腸桿菌缺陷株E，獲得僅攜帶耐堿相關單一基因或基因簇的重組子。
5.如權利要求1所述的一種規模化篩選微生物耐堿相關基因的方法，其特征是翻轉膜的制備培養并收集各重組子和陰性對照菌株的菌體，用法式細胞破碎儀以1,200-2,500p.s.i.的系統壓力破碎細胞，然后80,000-100,000×g超速離心1-2小時，即獲得翻轉膜，獲得的翻轉膜要在-70--80℃下保存。
6.如權利要求1所述的一種規模化篩選微生物耐堿相關基因的方法，其特征是耐堿相關基因編碼蛋白的活性測定在pH4.5-9.5下，利用吖啶橙作為熒光探針，向含有翻轉膜的反應體系中添加Tris-L-乳酸鉀或Tris-L-乳酸至終濃度為5-10mM，使熒光強度逐漸猝滅，并通過熒光分光光度計監控跨膜pH梯度的變化；熒光監測參數為激發光EX波長430-505nm，發射光EM波長510-530nm；當熒光強度下降至穩態時，向反應體系加入NaCl、LiCl或KCl至終濃度為2-10mM，根據熒光強度的恢復程度判斷并表示翻轉膜中耐堿相關基因編碼蛋白Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向轉運蛋白活性的大小以及轉運單價陽離子的特異性；然后，在pH4.5-9.5條件下，使用不同濃度的NaCl、LiCl或KCl分別測定翻轉膜中耐堿相關基因編碼蛋白的Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向轉運蛋白活性；以底物濃度和熒光強度作雙倒數圖，并由此計算耐堿相關基因編碼蛋白對Na+、Li+和K+的表觀Km值和Vmax值。
全文摘要
本發明屬于微生物工程領域，涉及一種規模化篩選微生物耐堿相關基因的方法。特點是采集典型的堿性環境土壤樣品，通過粗提和純化獲得土壤樣品的宏基因組DNA，然后用宏基因組DNA部分酶切片段與載體之間的連接產物電激轉化大腸桿菌缺陷株E，通過篩選獲得陽性克隆，并對陽性克隆攜帶的耐堿相關基因進行亞克隆和功能鑒定。本發明可以規模化克隆微生物的耐堿相關基因，用于耐堿作物和微生物的分子育種，進而充分開發和利用鹽堿地以及進行高(鹽)堿環境的污染修復。
文檔編號C12P19/34GK101063174SQ20071009967
公開日2007年10月31日 申請日期2007年5月28日 優先權日2007年5月28日
發明者楊禮富, 王真輝 申請人:中國熱帶農業科學院橡膠研究所