專利名稱：一種分枝桿菌噬菌體的保存方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域和微生物制品領域，具體涉及一種新的噬菌體保存 方法。
背景技術：
隨著分子生物學技術的發展，噬菌體已廣泛應用于疾病的診斷，并用于疾病 治療的研究。在耐多藥結核病(MDR-TB)成為結核病第三次大流行的原因之一 時，快速診斷結核病、快速藥物敏感性試驗和結核病的新療法已成為當今研究熱 點。利用噬菌體生物擴增法(PhaB assay)以及熒光素酶報告噬菌體(Luciferase reporter phage)的方法快速檢測結核菌和藥物敏感性試驗在最近得到開發，亦有 人認為有必要將細菌的天敵——噬菌體作為治療耐藥細菌感染性疾病的手段。隨 著噬菌體技術用于疾病快速診斷以及噬菌體作為一種有希望治療細菌感染性疾 病的生物武器，尤其在耐多藥結核菌不斷增加的形勢下，研究分枝桿菌噬菌體的 擴增和保存方法十分重要。
發明內容
本發明提供了一種分枝桿菌噬菌體的新型保存方法，所述的方法是以無細胞 恥垢分枝桿菌菌苗作為保護劑，真空冷凍干燥后保存。
將噬菌體采用真空凍干后4'C和室溫保存后比較，總體上4'C優于室溫；而 采用不同保護劑時，保存效果相差較大，當采用噬菌體宿主菌破碎制成的無細胞 恥垢分枝桿菌菌苗作為保護劑時，凍干后室溫或4"C保存，28周內效價均只下 降101，保存效果理想。同時，用無細胞恥垢分枝桿菌疫苗作為保護劑保存的分 支桿菌噬菌體因含有無細胞恥垢分枝桿菌疫苗而具有良好的免疫刺激作用，利于 分枝桿菌噬菌體對結核病的治療。
圖1液體法用不同保護劑、保存溫度對噬菌體效價的影響
A—E分別代表不同保護劑7H9 (10%0ADC) +30%甘油、7H9 (10%OADC) +lmmol/L
CaCl2、 7H9 (10%OADC) +10%甘油+1咖01/^&(:12+0. 05%疊氮化鈉、SM、 4%小牛血
清白蛋白；1代表保存溫度為4°。， 2代表保存溫度為-7(TC。
圖2凍干法用不同保護劑、保存溫度對噬菌體效價的影響
A—G分別代表不同保護劑10%滅菌脫脂牛奶、7H9 (10%0ADC) +lmraol/L CaCl2 、
4%小牛血清白蛋白、SM、 7%無細胞恥垢分枝桿菌菌苗(MS)蛋白、3.5% MS蛋
白、1.75。/。MS蛋白；1代表4。C保存，2代表室溫保存。
圖3無細胞恥垢分枝桿菌菌苗免疫小鼠的脾臟T淋巴細胞體外培養產生的IFN-Y (N. S指生理鹽水對照組，M.S指恥垢分枝桿菌菌苗免疫組)
*:指脾臟T淋巴細胞體外以PPD剌激時，恥垢組與對照組比較p〈0.0具體實施例方式
到現在為止，巳經給出了本發明的一般性描述。借助于下列實施例，參 照特定的實施方案，以下給出更詳細的說明，目的是為了更好地理解本發明 的目的、特征、優點和操作方法。然而，無意于將本發明的范圍限定在此范 圍內。在如下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常 規方法。
實施例l:分枝桿菌噬菌體的增殖和收集方法
本實施例詳細說明了噬菌體的具體增殖和收集方式。 1. 1增殖方式
分別采用單層和雙層Dubos瓊脂培養基，單層培養基與雙層培養基的上層
均含有10epFU噬菌體和lmg恥垢分枝桿菌。37。C培養24、 48h后，分別取上層 培養基于研磨器中加9 mlSM (鎂鹽液)液研磨，然后4。C 4000rpm離心20min， 上清再用0.2 um無菌濾器過濾，得到的噬菌體擴增液進行效價檢測。1.2.不同噬菌體/宿主菌比例對增殖效率的影響
采用瓊脂雙層法，培養基上層加不同比例的噬菌體(PFU) /宿主菌(CFU):
ioVio9、 io5/5xio8、 io5/io8、 io7io9、 10V5xi08、 io5/io8、 io7io9、 107/5
X108、 107108、 107109。 37。C培養48h后采用孵育-過濾法收集擴增的噬菌體，
并進行效價檢測。
1.3噬菌體的收集
孵育-過濾法擴增平皿中加9ml SM液，37i:孵育lh后回收全部液體，用 0.2um無菌濾器過濾收集的液體，檢測效價。
實施例2:分枝桿菌噬菌體的保存方法
本實施例詳細說明了噬菌體的具體保存方法，包括不同保護劑、保存溫度對 分枝桿菌噬菌體穩定性的影響。
2. 1保存工藝研究
將效價為101QPFU/ml的噬菌體分別用10%滅菌脫脂牛奶、含10%0ADC的7H9 (OADC，牛血清復合物)+lmraol/L CaCl2 、 4%小牛血清白蛋白、SM、 7%無細胞 恥垢分枝桿菌菌苗(MS)蛋白、3.5y。MS蛋白、1.75G/。MS蛋白等不同的液體保護 劑進行10倍稀釋，再分裝于冷凍管中，分別保存于4'C、 -70°C。真空冷凍干燥 方法則是將效價為101Q PFU/ml的噬菌體分別用不同的凍干保護劑進行10倍稀 釋，再分裝于安瓶中，每支0.5ml。 -30°<:預冷過夜、真空干燥后封閉安瓶口。制 備的凍干制品分別保存于4'C、室溫(22°C~25°C)、 37°C。分別在0、 2、 4、 8、 12、 20、 28周，采用雙層瓊脂法檢測不同保藏方法保存的噬菌體的效價。 2. 2不同保存方法對噬菌體穩定性的影響
采用不同保護劑分別在不同條件下進行液體保存與凍干保存，28周內的效價 變化見圖1和圖2。
從圖1可知，當噬菌體以液體形式4'C保存時，無論保護劑是什么，噬菌體 的效價在28周內均未降低10i數量級以上，穩定性好，操作方便，不需要特殊 設備，如低溫冰箱、凍干機等，-7(TC保存效果不如4nC保存。
噬菌體真空干燥后37"C保存效果均較差(結果未列示)。從圖2可以看出，噬菌體采用真空凍干后4'C、室溫保存，總體上4'C優于室溫；不同保護劑保存
效果相差較大，當釆用噬菌體的宿主菌破碎制成的無細胞恥垢分枝桿菌菌苗作為
保護劑時，凍干后室溫或4'C保存，28周內效價均只下降101，較為理想。
以上結果表明，所用噬菌體以液體4t:保存28周具有較好的穩定性，但凍干 保存更適合于試劑盒中微生物的保存和運輸。-7(TC保存和真空冷凍干燥保存符 合菌種的低溫保藏原則，但保存噬菌體效果并不理想，對保護劑有較強的選擇性。 本研究發現采用一種以噬菌體宿主菌為主要成分的無細胞恥垢分枝桿菌菌苗作 為凍干保護劑時，室溫或4'C保存，噬菌體28周內均保持較好的穩定性。
實施例3:無細胞恥垢分枝桿菌菌苗的免疫刺激作用
以不同劑量的無細胞恥垢分枝桿菌菌苗免疫小鼠，同時以等體積的生理鹽水
注射另一組小鼠作為對照。末次免疫后l周，無菌取出脾臟淋巴細胞，調整細胞
濃度分別為2.0X107ml，分裝24孔板，每孔lral，并添加100 u 1ConA或PPD，
37°C、 5%0)2全濕潤培養72h后離心，取上清，-30。C保存。用小鼠IFN-Y ELISA
試劑盒測定脾淋巴細胞培養上清中IFN-Y的含量。測定值經統計學處理，結果
見圖3。
此例結果說明無細胞恥垢分枝桿菌菌苗免疫小鼠IFN-Y的表達量，具有上 調Thl類應答的免疫刺激作用，由此可以推測以無細胞恥垢分枝桿菌菌苗作保護 劑的分支桿菌噬菌體具有較好的免疫刺激作用，利于其用于結核病的治療。
權利要求
1、一種分枝桿菌噬菌體的保存方法，包括以半固體培養方式培養噬菌體，離心過濾收集噬菌體，取無細胞恥垢分枝桿菌菌苗作為保護劑，真空冷凍干燥后保存。
2、 根據權利要求1所述的方法，所述真空冷凍干燥保存包括下列 步驟向噬菌體液中加入蛋白濃度為3. 5 ~ 7%的無細胞恥垢分枝桿 菌菌苗，真空冷凍干燥后，在室溫或4。C保存。
3、 根據權利要求1所述的方法，其中過濾膜的孔徑為0. 2 jam。
4、 根據權利要求2所述的方法，其中所述的無細胞恥垢分枝桿菌 菌苗的蛋白終濃度為3. 5~7%。
5、 一種根據權利要求1所述的保存方法制備的分枝桿菌噬菌體。
6、 根據權利要求5所述的分枝桿菌噬菌體，具有無細胞恥垢分枝 桿菌菌苗的免疫刺激作用。
全文摘要
本發明提供一種分枝桿菌噬菌體的保存方法，該方法采用半固體培養基擴增分枝桿菌噬菌體，過濾法收集噬菌體，采用無細胞恥垢分枝桿菌菌苗作為保護劑，真空冷凍干燥法后室溫或4℃保存。該方法工藝簡單，穩定性好，保存效果佳，所保存的噬菌體在作生物治療時兼具免疫刺激作用。
文檔編號C12N7/00GK101302498SQ200710097800
公開日2008年11月12日 申請日期2007年5月9日 優先權日2007年5月9日
發明者麗 彭, 苗 徐, 李恪梅, 沈小兵, 王國治, 城 蘇, 陳保文 申請人:中國藥品生物制品檢定所